Способ получения ингибиторов дипептидил iv - RU2006140134A

Реферат

1. Способ получения частично очищенных концентратов фенилаланиндегидрогеназы и/или формиатдегидрогеназы (PDH/FDH), который включает следующие стадии:

a. получение культуральной жидкости микроорганизма, способного продуцировать фенилаланиндегидрогеназу и/или формиатдегидрогеназу;

b. подвергание культуральной жидкости микрофлюидизации для высвобождения ферментативной активности из клеток и получения микрофлюидизированной культуральной жидкости, обладающей PDH и/или FDH активностью,

с. очистка культуральной жидкости путем обработки ее флокулирующим агентом, чтобы скоагулировать клеточный дебрис и удалить ДНК и нежелательные белки;

d. фильтрование очищенной культуральной жидкости и

е. концентрирование культуральной жидкости с получением частично очищенного ферментного концентрата, обладающего PDH/FDH активностью, с PDH активностью, по крайней мере, около 400 МЕ/мл и FDH активностью, по крайней мере около 20 МЕ/мл.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость подвергают микрофлюидизации под давлением от около 12000 до около 20000 пси.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что культуральную жидкость подвергают микрофлюидизации при поддержании температуры культуральной жидкости ниже приблизительно 25°С.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что температуру культуральной жидкости поддерживают ниже приблизительно 25°С.

5. Способ по п.1, отличающийся те, что фенилаланиндегидрогеназу получают из родов Sporosarcina, Thermoactinomyces.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фенилаланиндегидрогеназу получают из Thermoactinomyces intermedius.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что фенилаланиндегидрогеназу получают из Thermoactinomyces intermedius ATCC 33205, экспрессируемого в Escherichia coli или Pichia pastoris.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроорганизм представляет собой Escherichia coli JM110 (pBMS 2000-PPDFDH-mod).

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что очищенную культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации.

10. Способ получения амина структурной формулы

который включает стадии

а. обработки водного раствора кетокислоты структурной формулы

формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенной смесью ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы (PDH/FDH); и

b. поддержания рН реакционной смеси гидроксидом натрия с получением желаемого амина, который практически не содержит нежелательного избытка ионов аммония.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что используют частично очищенную смесь ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, полученных способом по п.1.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что водный раствор 3-гидрокси-α -оксотрицикло [3.3.1.1^3,7] декан-1-уксусной кислоты, формиата аммония, никотинамидадениндинуклеотида, дитиотрептола и частично очищенной смеси ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы нагревают до температуры в пределах от около 35 до около 40°С и поддерживают рН в пределах от около 7,8 до около 8,2 в течение от около 24 до около 48 часов для получения указанного амина.

13. Способ получения ВОС-защищенного амина структурной формулы

который включает стадии

а. получения водного раствора аминокислоты (aS)-α-амино-3-гидрокситрицикло [3.3.1.1^3,7] декан-1-уксусной кислоты структурной формулы

путем использования частично очищенной смеси ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы при восстановительном аминировании кетокислоты

согласно указанному в п.12 и

b. обработки вышеуказанного водного раствора дитрет-бутилдикарбонатом с получением ВОС-защищенного амина.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что рН смеси водного раствора (αS)-α-амино-3-гидрокситрицикло [3.3.1.1^3,7] декан-1-уксусной кислоты и дитрет-бутилдикарбоната поддерживают в пределах от около 8,5 до около 12,5.

15. Способ по п.13, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадии выделения ВОС-защищенного амина из реакционной среды и его кристаллизации.

16. Частично очищенная смесь ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, полученная способом по п.1.

17. Частично очищенная смесь фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы, характеризующаяся тем, что она обладает PDH и FDH активностью.

18. Способ получения ВОС-защищенного амина формулы

который включает стадии

а. получения частично очищенного концентрата ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы;

b. обработки водного раствора кетокислоты структурной формулы

формиатом аммония, никотинамидадениндинуклеотидом, дитиотреитолом и частично очищенным концентратом ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы;

с. поддержания рН реакционной смеси с помощью гидроксида натрия с получением желаемого амина

который практически свободен от нежелательных избыточных ионов аммония; и

d. обработку вышеуказанного водного раствора дитрет-бутилдикарбонатом без выделения промежуточной аминокислоты с получением ВОС-защищенного амина структурной формулы

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что частично очищенную смесь ферментов фенилаланиндегидрогеназы и формиатдегидрогеназы получают путем:

а. получения культуральной жидкости микроорганизма, способного продуцировать фенилаланиндегидрогеназу и/или форматдегидрогеназу;

b. подвергания культуральной жидкости микрофлюидизации для высвобождения ферментативной активности из клеток и получения микрофлюидизированной культуральной жидкости, обладающей PDH и/или FDH активностью,

с. очистки культуральной жидкости путем обработки ее флокулирующим агентом, чтобы скоагулировать клеточный дебрис,

d. фильтрования очищенной культуральной жидкости и

е. концентрирования культуральной жидкости с получением частично очищенного ферментного концентрата, обладающего PDH/FDH активностью, с PDH активностью, по крайней мере, около 400 МЕ/мл и FDH активностью, по крайней мере, около 20 МЕ/мл.

20. Способ получения соединения в виде свободного основания формулы

который предусматривает получение ВОС-защищенного соединения формулы

согласно способу по п.13,

обработку ВОС-защищенного соединения мезилхлоридом и Hunig основанием и соединением формулы J

и 1-гидроксибензотриазолом (НОВТ) с получением ВОС-защищенного промежуточного соединения структуры К

дегидратирование промежуточного К в присутствии пиридина и трифторуксусного ангидрида, последующий гидролиз продукта реакции в присутствии сильного основания с получением соединения L

и обработку соединения L соляной кислотой с получением соответствующей солянокислой соли L'

обработку соединения L' соляной кислотой и гидроксидом натрия с получением соединения М' в виде свободного основания.