Штамм lactobacillus crispatus для лечения или профилактики половых и урогенитальных инфекций, таких как вагиноз и кандидоз, и его применение - RU2661102C2
Код документа: RU2661102C2
Чертежи
Описание
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новому специфическому штамму Lactobacillus crispatus, выделенному из образцов здоровой ткани, и к любому штамму, имеющему те же характеристики, а также к композициям, включающим упомянутые штаммы.
У здоровой женщины урогенитальная микрофлора включает около 50 различных видов микроорганизмов. 95% популяции этих микроорганизмов состоит из различных штаммов лактобацилл (молочнокислых бактерий), включая «палочки Дедерлейна». Эти лактобациллы способствуют защите от патогенных микроорганизмов с помощью различных механизмов, включая продуцирование перекиси водорода, молочной кислоты и бактериоцинов, ингибирование адгезии и распространения патогенных микроорганизмов. В частности, эти лактобациллы поддерживают кислый рН, производя молочную кислоту из гликогена, присутствующего во влагалищной слизи. Поэтому ингибируется рост многочисленных патогеннных микроорганизмов в микрофлоре влагалища, таких как вагинальная гарднерелла Gardnerella vaginalis, превотелла Prevotella bivia, гонококк Neisseria gonorrhoeae, микоплазма Mycoplasma, мобилункус Mobiluncus, а также дрожжеподобный грибок кандида альбиканс Candida albicans.
Таким образом, нормальная микрофлора влагалища в основном состоит из лактобацилл, образующих защитную биопленку на поверхности слизистой оболочки. Среди лактобацилл, которые часто наблюдаются во влагалище, особенно заметны Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus inners и Lactobacillus gasseri.
Вульвовагинальный кандидоз поражает 70-75% женщин в репродуктивном возрасте, по меньшей мере, один раз, а примерно у 40-50% бывает повторно. Частота рецидивов вульвовагинального кандидоза (определяемая как, по меньшей мере, 4 приступа в год, включая два приступа, подтвержденных микологическим исследованием) была оценена в 5-8%. Это доброкачественное заболевание имеет весьма негативное влияние на качество жизни пациентов и вызывает значительные расходы на медицинское обслуживание. Такая патология трудно поддается лечению ввиду многофакторного патогенеза этой болезни.
Традиционная поддерживающая терапия с использованием пероральных или вагинальных противогрибковых препаратов должна продолжаться, по меньшей мере, 6 месяцев, однако частота рецидивов остается высокой, причем 60-70% женщин имеют рецидив в течение двух месяцев после прекращения лечения. Кроме того, противогрибковые препараты имеют частые побочные эффекты и их длительное применение может способствовать возникновению бактериального вагиноза.
Бактериальный вагиноз является следствием качественного и количественного дисбаланса нормальной микрофлоры влагалища, который может привести к практически полному исчезновению лактобацилл в пользу анаэробной микрофлоры, а также к появлению таких бактерий, как Gardnerella vaginalis и Atopobium vaginae, вызывающих бактериальный вагиноз.
Бактериальный вагиноз является одной из наиболее частых вагинальных инфекций с частотой случаев от 10 до 15. Это доброкачественное заболевание может быть опасным для женщин во время беременности, поскольку способно привести к преждевременным родам, рождению детей с низким весом и самопроизвольным абортам.
Бактериальный вагиноз и другие виды дисбаланса микрофлоры влагалища обычно лечат при помощи антибактериальной терапии. Это лечение имеет типичные недостатки лечения антибиотиками и оказывается все менее эффективным. Кроме того, оно направлено на устранение патогенной микрофлоры, но также нарушает нормальную полезную микрофлору.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Для поддержания здоровья влагалища и лечения половых инфекций было описано пероральное или вагинальное введение полезных лактобацилл. В частности, патентные заявки WO 84/04675, WO 2000/035465, US 2002/0044926 и WO 2006/045475 описывают пероральное или вагинальное введение молочнокислых бактерий для поддержания здоровья влагалища и предупреждения рецидивов вульвовагинального кандидоза.
Предпочтительными лактобациллами являются Lactobacillus rhamnosus и палочки Дедерлейна (Lactobacillus acidophilus vaginalis). Патенты US 6093394, US 6468526 и US 7807440, а также патентная заявка US 2010/0151026 описывают введение специфических штаммов Lactobacillus crispatus.
Среди этих штаммов можно упомянуть следующие штаммы Lactobacillus crispatus:
- штаммы Lactobacillus crispatus, депонированные в DSMZ (Немецкий банк микроорганизмов и клеточных культур, Германия) под регистрационными номерами DSM 16735, 16736, 16738, 16739, 16740, 16741, 16742 и 16743, как описано в патентной заявке ЕР 1824500; эти штаммы способны колонизировать слизистые оболочки влагалища и тем самым способствовать здоровью влагалища; они также имеют хорошие характеристики адгезии к эпителиальным клеткам;
- штаммы Lactobacillus crispatus, депонированные в CNCM (Национальная коллекция культур микроорганизмов, Франция) под регистрационными номерами I-3483, I-3484 и I-3486, как описано в заявке на патент ЕР 1812023; эти штаммы были выбраны за их способность адгезии к эпителиальным клеткам; они обладают хорошей резистентностью к кислому рН внутрижелудочной среды, а также доказанным антипатогенным действием;
- штамм Lactobacillus crispatus, депонированный в BCCM/LMG (Бельгийская координированная коллекция микроорганизмов, Бельгия) под регистрационным номером Р-20558, как описано в патенте ЕР 1427808 В1; этот штамм применяют в сочетании с другими штаммами молочнокислых бактерий, вводя с помощью тампона; данный штамм обладает способностью колонизировать полость влагалища, в том числе во время менструации; и
- штамм Lactobacillus crispatus, депонированный в АТСС (Американская коллекция типовых культур, США) под регистрационным номером 202225, как описано в патенте ЕР 1011721 В1; этот штамм обладает хорошей адгезией к эпителиальным клеткам, продолжительной жизнеспособностью, в частности, в присутствии защитной матрицы, описанной в данном документе, а также значительным продуцированием молочной кислоты и H2O2;
- штамм Lactobacillus crispatus Р-17631, как описано в патентной заявке ЕР 949330, способный ферментировать гликоген и ингибировать рост Candida.
Большинство этих пробиотических штаммов, выделенных из образцов влагалищного содержимого здоровых женщин, не могут выжить в среде с кислым рН или при длительном контакте с желчью.
Уровень рН влагалища является параметром, который значительно меняется в течение жизни женщины: физиологический рН равен 7 у девочек в препубертатном периоде, падает до уровня 3,8 у женщин в период половой зрелости и составляет более 5,5 в период менопаузы при отсутствии гормональной заместительной терапии. Эти изменения связаны с множеством факторов, таких как наличие эстрогена и колонизация лактобациллами.
Поэтому для пробиотических штаммов, вводимых экзогенно, важно быть способным противостоять физиологическому кислому рН полости влагалища, а кроме того, быть способным выдерживать рН полости желудка при пероральном введении.
Кроме того, некоторые из этих штаммов не могут использовать гликоген в качестве источника углерода, получаемого брожением (Martin R. et al., 2008). Однако, это свойство является преимуществом, так как слизистая оболочка влагалища обычно не содержит глюкозы, а продуцирование молочной кислоты пробиотическим штаммом может быть достигнуто только в присутствии источника углерода, получаемого брожением.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому выделенному штамму Lactobacillus crispatus, идентифицированному как IP174178, депонированному в CNCM 22 июня 2012 года под регистрационным номером CNCM I-4646, а также к любому штамму L. crispatus, имеющему те же характеристики.
В настоящем описании, следующем ниже, любая ссылка на Lactobacillus crispatus IP174178 будет относиться к этому штамму, а также к любому штамму L. crispatus, имеющему те же характеристики.
Этот новый штамм IP174178 имеет следующие структурные характеристики:
- растет в аэробно-анаэробных условиях;
- его профиль, полученный при помощи rep-ПЦР (ПЦР повторяющихся экстрагенных палиндромов), представлен на Фигуре 1;
- последовательность его гена 16S рибосомальной ДНК, представлена в SEQ IDNO: 1.
Его основные функциональные характеристики:
- высокая степень продуцирования H2O2 и молочной кислоты (более 7 г/л);
- способность расти на гликогене в качестве единственного углеродсодержащего субстрата;
- резистентность к желчи;
- резистентность к кислому рН (в частности, рН между 2,5 и 4);
- способность ингибировать развитие патогенных микроорганизмов мочеполовой области.
Штамм Lactobacillus crispatus IP174178 обладает, в частности, резистентностью к кислому рН.
Более конкретно, штамм Lactobacillus crispatus IP174178 обладает резистентностью к желчи и к кислым значениям рН.
Более конкретно, штамм Lactobacillus crispatus IP174178 обладает резистентностью к желчи и к кислым значениям рН, а также способен метаболизировать гликоген.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, 109 KOE данного штамма Lactobacillus crispatus IP174178, одного или в комбинации с другими пробиотическими штаммами или другими активными ингредиентами.
Изобретение также относится к применению этого штамма IP174178 для профилактики и лечения рецидивирующих или нерецидивирующих половых и урогенитальных инфекций.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новому выделенному штамму Lactobacillus crispatus, идентифицированному как IP174178 и депонированному в CNCM под регистрационным номером I-4646, и любому выделенному штамму L. crispatus, имеющему те же характеристики, что и упомянутый выделенный штамм.
Термин «лактобациллы» относится ко всем бактериям Lactobacillus, грамположительным бактериям, неподвижным, различных размеров и форм, факультативным анаэробам. Большинство лактобацилл превращает лактозу и другие простые сахара в молочную кислоту. Эти бактерии находятся во влагалище и желудочно-кишечном тракте и представляют собой важный компонент микрофлоры кишечника и влагалища.
Lactobacillus crispatus является одним из преобладающих видов микрофлоры влагалища в Европе, Соединенных Штатах и Японии (Antonio, MAD et al., 1999).
Выделенный штамм Lactobacillus crispatus IP174178 имеет следующие функциональные характеристики:
- высокий уровень продуцирования H2O2 и молочной кислоты (более 7 г/л);
- способность расти на гликогене, эндогенном субстрате, секретирующимся слизистой оболочкой влагалища;
- резистентность к кислому рН и желчи;
- способность ингибировать развитие патогенных микроорганизмов;
- адгезию к эпителиальным клеткам влагалища.
Способность расти на гликогене является относительно редкой и особенно предпочтительной для штаммов, предназначенных для развития в половых путях, где глюкоза часто отсутствует и единственным источником углерода является гликоген. Таким образом, продуцирование молочной кислоты этим штаммом сохраняется даже в отсутствие глюкозы (см. Таблицу 5).
Способность выдерживать кислый рН является особенно предпочтительной характеристикой, так как она позволяет штамму по настоящему изобретению, с одной стороны, выдерживать рН желудка при пероральном введении, а с другой стороны, воспроизводиться в женских половых путях даже в случае чрезмерно кислых выделений.
Способность резистенции к желчи дает возможность предусмотреть пероральное, а не только вагинальное введение этого штамма.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей штамм Lactobacillus crispatus IP174178.
В композиции по настоящему изобретению число бактерий на грамм композиции предпочтительно больше, чем 108, и, в частности, находится в диапазоне от 108 до 1010. В соответствии с характерным аспектом настоящего изобретения композиция включает, по меньшей мере, 109 KOE штамма Lactobacillus crispatus. Термин «KOE» означает «колониеобразующие единицы» и является единицей измерения, общепризнанной специалистами в данной области техники для того, чтобы определять количество бактерий, способных основать колонию.
Предпочтительно, чтобы штамм Lactobacillus crispatus был лиофилизирован. Штамм может быть единственным лиофилизированным элементом композиции, но предпочтительно, чтобы штамм был лиофилизирован в среде, включающей дополнительные компоненты, добавленные до или после стадии лиофилизации.
В соответствии с другим характерным аспектом настоящего изобретения, фармацевтическая композиция дополнительно включает защитную матрицу и/или наполнители, хорошо известные специалистам в данной области техники и, возможно, другие активные ингредиенты, обладающие дополнительным действием.
В соответствии с характерным аспектом изобретения, композиция находится в форме порошка, который может быть помещен в капсулу, или может быть интегрирован в любой подходящий тип носителя, такой как крем или нутрицевтическая композиция.
В частности, эта композиция может включать в себя следующие активные ингредиенты: гормоны и/или противовоспалительные вещества и/или бактерицидные вещества и/или противогрибковые средства. Специалисты в данной области техники смогут сами определить, какие активные ингредиенты могут быть предпочтительны в сочетании со штаммом Lactobacillus crispatus IP174178.
В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения композиция включает тиосульфат натрия, предпочтительно в концентрации, по меньшей мере, 100 мг на грамм порошка, включающего от 108 до 1010 KOE Lactobacillus crispatus IP174178. Приведенные ниже примеры иллюстрируют композицию под названием «препарат А», которая включает 113 г/л тиосульфата натрия до лиофилизации, а окончательно 230 мг тиосульфата натрия на грамм порошка. Наличие тиосульфата натрия дает возможность усиливать антипатогенное действие штамма IP174178 (см. Таблицу 6С).
Композиция по настоящему изобретению может также включать другие штаммы Lactobacillus.
В соответствии с настоящим изобретением фармацевтическая композиция может быть приготовлена для вагинального введения или для перорального введения. В частности, бактерии, предназначенные для перорального введения, испытывали на их резистентность к желчи, резистентность к кислому рН и способность расти в присутствии желчи. Штамм IP174178 по настоящему изобретению имеет характеристики, позволяющие ему быть вводимым перорально.
Подходящими лекарственными формами фармацевтических композиций для перорального введения являются, в частности, таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы и суспензии для перорального введения.
Подходящими лекарственными формами фармацевтических композиций для вагинального введения являются, в частности, крема, капсулы и вагинальные суппозитории, а также тампоны.
Композиция по настоящему изобретению, в частности, предназначена для применения в лечении половых и урогенитальных инфекций, таких как вагиноз и кандидоз.
Термин «вагиноз» относится к дисбалансу микрофлоры влагалища. Он характеризуется исчезновением лактобацилл и размножением патогенных бактерий, таких как те, что перечислены выше.
Термин «кандидоз» относится к инфекции влагалища, вызванной дрожжами рода Candida.
Эти инфекции связаны с наличием возбудителей, в частности, принадлежащих к видам Candida albicans, Gardnerella vaginalis, микоплазмам или роду Mobiluncus.
Candida albicans является наиболее важным и наиболее известным видом дрожжей рода Candida. Он вызывает грибковые инфекции (кандидиаз, также называемый кандидоз), в основном слизистых оболочек органов пищеварения и половых органов.
Gardnerella vaginalis представляет собой бактерию в форме плеоморфной палочки или коккобактерии. Она является бактерией, часто встречающейся в случаях вагиноза (неспецифического вагинита), либо в качестве единственной патогенной бактерии, либо в комбинации с другими бактериями. Она производит перфорирующий токсин, который действует только на клетки человека.
Термин «микоплазмы» относится к семейству более 100 видов бактерий, чувствительных к группам антибиотиков, мишенью которых являются клеточные стенки (пенициллин или бета-лактамы). В частности, Mycoplasma genitalium ответственна за половые и урогенитальные инфекции (уретрит, цервицит, вагинит, сальпингит) и проблемы бесплодия.
Mobiluncus представляет собой анаэробную грамположительную бактерию, часто ассоциированную с Gardnerella vaginalis при бактериальном вагинозе.
Изобретение также относится к нутрицевтической композиции, включающей штамм Lactobacillus crispatus IP174178, или штаммы, имеющие аналогичные характеристики. Такая нутрицевтическая композиция будет предусмотрена в форме пищевой композиции или пищевой добавки.
Пищевая композиция будет состоять из штамма Lactobacillus crispatus IP174178, предпочтительно лиофилизированного, смешанного с продуктами питания, такими как молочные продукты, жиры, зерносодержащие продукты, кондитерские изделия или напитки.
В контексте настоящего изобретения пищевая добавка может быть, в частности, представлена в форме капсул или мягких капсул из желатина или растительного материала.
Изобретение также относится к медицинскому средству (устройству), включающему одну из описанных выше композиций, в частности, медицинского средства в виде вагинального тампона, шпателя, гигиенической прокладки, мыла для интимной гигиены и т.д.
Изобретение также относится к применению выделенного штамма Lactobacillus crispatus IP174178 для профилактики и лечения половых и урогенитальных инфекций, таких как вагиноз и кандидоз.
Оптимальные способы введения, схемы дозирования и лекарственные формы и композиции по настоящему изобретению могут быть определены в соответствии с критериями, как правило, принимающимися во внимание при установлении подходящего для пациента медикаментозного лечения, такими, например, как возраст пациента или его масса, тяжесть общего состояния пациента, переносимость лечения и наблюдаемые побочные эффекты. Выделенный штамм Lactobacillus crispatus IP174178 будет применяться как для местного (вагинальное введение), так и для перорального введения, оба типа введения предусматриваются по отдельности или в комбинации.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения выделенный штамм Lactobacillus crispatus IP174178 применяют для поддержания полезной микрофлоры влагалища женщины в отсутствие инфекции.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения выделенный штамм Lactobacillus crispatus IP174178 применяется для восстановления полезной микрофлоры влагалища после проведения лечения антибиотиками.
Таким образом, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей выделенный штамм Lactobacillus crispatus IP174178, для применения с целью поддержания или восстановления полезной микрофлоры влагалища.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1: Графическое представление сравнения генотипических профилей, определенных с помощью rep-ПЦР, в виде дендрограммы.
Фигура 2: Графическое представление сравнения генотипических профилей, определенных с помощью rep-ПЦР, в виде матрицы подобия.
Фигура 3: Испытание адгезии штамма IP174178 к эпителиальным клеткам влагалища.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. Выделение и селекция штамма L. crispatus IP174178.
С десятью штаммами, выделенными от здоровых женщин и подвергнутыми предварительной селекции по их способности продуцировать перекись водорода (H2O2), проводили семь испытаний. Эти испытания представляют собой: рост в модифицированной среде MRS (Man JC et al., 1960), способность продуцировать H2O2, способность продуцировать молочную кислоту, адгезия к клеткам линии клеток влагалища, способность подавлять некоторые патогеные микроорганизмы половых органов (метод дисков для определения чувствительности микроорганизмов) и резистентность к метронидазолу.
После этих первых испытаний три штамма, определенные как представляющие особый интерес, в частности, ввиду высокого продуцирования ими H2O2 и молочной кислоты, подвергали испытанию на рост в присутствии гликогена, причем только штамм IP174178 способен использовать в качестве источника углерода гликоген, который является эндогенным субстратом, секретирующимся слизистой оболочкой влагалища. Кроме того, этот штамм обладает лучшим ростом в присутствии желчи.
Получены следующие результаты:
Пример 2. Биохимический профиль.
Биохимические профили получали с помощью микробиологического анализатора VITEK II Compact system (bioMerieux), представляющего собой автоматизированную систему для идентификации бактерий путем сравнения их способности ферментировать определенные сахара. Получили следующий биохимический профиль: 11033303414010.
Пример 3. Генотипический профиль.
Генотипический профиль штамма IP174178 устанавливали на системе DiversiLab system (bioMerieux). Он соответствует продуктам амплификации ДНК между повторяющимися последовательностями в геномной ДНК. Расположение и размер таких фрагментов является уникальным для каждого штамма и, таким образом, позволяет создать уникальные профили для каждого из них (см. Фигуру 1).
Затем авторы изобретения сравнивали этот профиль, полученный при помощи rep-ПЦР, с профилем 26 штаммов Lactobacillus crispatus, в том числе 11 штаммов, хранящихся в Институте Пастера, в целях проверки уникального характера штамма (Фигура 2). В каждом из этих случаев штамм IP174178 содержал множество отличий как доказательство его уникальности.
Кроме того, штамм IP174178 способен расти на одном гликогене, что является преимуществом при его внедрении в слизистую оболочку влагалища, а также имеет высокую степень продуцирования H2O2 и молочной кислоты.
Пример 4. Секвенирование и определение специфических олигонуклеотидов.
Секвенирование штамма IP174178 проводили с использованием оборудования Roche 454. После этого исследования проводили аннотацию. В результате ее были идентифицированы 1982 гена, кодирующих белки.
Операция секвенирования позволила провести дополнительное молекулярно-биологическое исследование штамма для определения специфических пар ПЦР-праймеров.
В результате его были выбраны три ПЦР-праймера, являющихся специфическими для штамма на стадии амплификации, состоящей из 30 циклов. Эти праймеры позволяют легко и с высокой специфичностью идентифицировать штамм L. crispatus IP174178, например, в биологическом образце.
Пример 5. Приготовление «препарата А»
Штамм IP174178 культивировали в следующей культуральной среде: 116 г/л молока, 15 г/л декстрозы, 10 г/л автолизированных дрожжей, 2 мл/л Твина.
После инокуляции культуральной среды поддерживали ферментацию при температуре 37°С с помощью подходящего термостатически регулируемого устройства в течение периода от 48 до 72 часов. После завершения ферментации культуру, число бактерий в которой становилось более или равно 108 KOE/мл, переливали в емкость для смешивания. Культуру быстро встряхивали, чтобы разрушить творог и после лиофилизации добавляли адъюванты: 110 г/л молока, 101,5 г/л фруктоолигосахаридов (ФОС), 9,5 мл/л глутамата натрия, 5,25 г/л аскорбиновой кислоты, 113 г/л тиосульфата натрия.
Затем проводили лиофилизацию в соответствии со стандартными условиями, хорошо известными специалистам в данной области техники: бактерии распределяли в асептических условиях на лотках из нержавеющей стали, быстро замораживали при -40°С, а затем подвергали операции сублимации при -22°С. После этого проводили инкубацию при 37°С.
Образовавшийся продукт измельчали и фильтровали в контролируемой атмосфере. Предпочтительно, чтобы полученный порошок мог быть смешан с 1% стеарата магния для того, чтобы облегчить заполнение капсул.
Полученный таким образом порошок распределяли в капсулы размером «0» в количестве 350 мг порошка на капсулу.
Пример 6. Функциональные характеристики штамма IP174178 и «препарата А»
Штамм, идентифицированный как IP174178, испытывали параллельно, один и в составе «препарата А», как представлено в Примере 5, для определения его функциональных характеристик.
В приведенных ниже примерах выражение «чистый штамм» или «один штамм» или «штамм 1Р174178» относится к штамму IP174178, полученному из выделенных на агаре колоний после консервации в криогенных флаконах в стандартной среде для консервации, в отсутствие каких-либо адъювантов и, в частности, в отсутствие компонентов препарата А.
Противомикробная активность
Демонстрация продуцирования перекиси водорода:
Молочнокислые бактерии культивировали на агаризованной среде MRS с добавлением витамина В12, пероксидазы и тетраметилбензидина. После инкубации в течение 48 часов в анаэробных условиях культуральные чашки помещали в контакт с атмосферным кислородом, и колонии, продуцирующие перекись водорода, быстро становились синими. Для того, чтобы указать значение интенсивности продуцирования H2O2, использовали произвольную шкалу от 0 до 5.
Результаты, представленные выше, показывают, что:
- продуцирование перекиси водорода максимально в соответствии с используемой произвольной шкалой;
- штамм использует практически аналогичным образом, как с глюкозой, так и с гликогеном, метаболические пути, обеспечивающие синтез D- и L-лактатов. Поскольку гликоген является одним из основных источников углерода в среде влагалища, данный штамм обладает свойствами, необходимыми для продуцирования молочной кислоты в естественных условиях.
Ингибирование роста С.albicans и G. vaginalis
Цель: оценить способность штаммов Lactobacillus ингибировать рост патогенного штамма Candida albicans; для G. vaginalis применяется тот же протокол, адаптированный к этому патогенному микроорганизму.
Описание протокола:
Измеряют рост патогенных микроорганизмов, одних и в присутствии культуры штамма Lactobacillus с определением титра в период времени от Т0 до Т=28 ч.
Питательные среды, используемые для приготовления инокулята и для определения титров:
- бульон Сабуро и агар Сабуро для Candida albicans (при 37°С).
- бульон/агар MRS для штаммов Lactobacillus.
Использующийся для испытания культуральный бульон представляет собой однородную смесь культуральной среды патогенного микроорганизма и культуральной среды пробиотика.
Подготовка испытания:
Подготовка инокулята:
- Candida albicans: 0,3 мл культуры помещали в 30 мл бульона Сабуро при температуре 37°С на 48 часов.
- Пробиотический штамм:
Препарат А: 0,35 г порошка препарата А вносили в 10 мл бульона MRS и помещали в инкубатор при 37°С на 48 часов.
Чистый штамм IP174178: 0,2 мл чистого штамма, полученного из выделенных на агаре колоний после консервации в криогенных флаконах в стандартной среде для консервации, вносили в 10 мл бульона MRS и помещали в инкубатор при 37°С на 48 часов.
Подготовка контроля Candida:
Для получения контроля Candida 5 мл бульона Сабуро, инокулированного патогенным штаммом (титр около 1×108 KOE/мл), помещали в 5 мл бульона MRS, не подвергнутого инокуляции.
Помещение инокулятов в контакт друг с другом:
Помещали 5 мл патогенного штамма к 5 мл штамма по настоящему изобретению в различных конфигурациях.
Отбор проб и определение титров проводили в точках Т0, Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч. Результаты выражали в KOE/мл. Концентрация в единицах KOE при Т0, безусловно, не является одинаковой во всех трех сравниваемых случаях (из-за условий проведения испытания), однако значения в Т0 имеют один и тот же порядок величины, и, таким образом, это различие не имеет никакого влияния на результат.
В этой таблице результаты выражены в виде десятичного логарифма (log™) снижения числа KOE между подсчетами количества бактерий в точке Т0 и в других точках отбора проб (Т=4 ч, Т=24 ч и Т=28 ч)
Результаты, представленные выше, в Таблицах 6А-6С показывают, что:
- ингибирование роста патогенного микроорганизма С.albicans отмечается по прошествии 24 часов и для чистого штамма, и для штамма в препарате А. Однако, только препарат А позволяет добиться полного ингибирования через 24 часа;
- ингибирование роста патогенного микроорганизма G. vaginalis происходит после 24 часов совместного культивирования в присутствии одного штамма или в присутствии штамма в виде препарата А; тем не менее, ингибирование роста патогенного микроорганизма происходит быстрее в присутствии штамма в виде препарата А (через 4 часа);
- Присутствие тиосульфата натрия в препарате А позволяет усилить антипатогенное действие штамма IP174178. Действительно, чем выше концентрация тиосульфата натрия, тем большее ингибирование наблюдается в точке 24 часа.
Резистентность к среде желудка
В зависимости от индивидуальных особенностей и особенно от времени суток, рН желудка колеблется между 2,5 и 5. Резистентность штамма IP174178, одного или в препарате А, испытывали в средах при рН=2,5; 3 и 4. Результаты выражали как снижение количества бактерий в зависимости от времени.
Результаты показывают, что через 90 минут при рН=3 или 4 потеря бактерий мала, меньше, чем один log™. Резистентность при рН=2,5 ниже, особенно, когда штамм используют в виде препарата А.
Также была протестирована резистентность к желчи в зависимости от времени (60, 120, 180 и 240 минут) в присутствии 3% желчи. Результаты выражены путем сравнения количества выживших бактерий в желчи, в контрольной среде, не содержащей желчи, и в среде, содержащей 3% желчи.
Через 240 минут (4 часа) разница между контролем, культивированным без желчи и в среде с желчью составляет менее одного десятичного логарифма, а это означает, что рост бактерий штамма IP174178 мало зависит от присутствия желчи.
Резистентность к антибиотикам
Следующие гены, известные в качестве участвующих в резистентности к антибиотикам и перечисленные в Таблице 10 ниже, были идентифицированы как экспрессирующиеся в штамме L. crispatus:
Адгезия к эпителиальным клеткам CRL-2616
Результаты представлены на Фигуре 3 и относятся только к одному штамму IP174178.
Со течением времени процент адгезии бактерий IP174178 к клеткам CRL-2616 увеличивается и достигает 15% через 3 часа, когда множественность заражения становится равна 10 или 1.
ССЫЛКИ
Патентные документы
WO 84/04675
WO 2000/035465
WO 2006/045475
US 2002/0044926
US 6,093,394
US 6,468,526
US 7,807,440
US 2010/0151026
ЕР 0949330
ЕР 1824500
ЕР 1812023
ЕР 1427808
ЕР 1011721
Научная литература
Martín R, Soberón N, Vaneechoutte M, Flórez AB, Vázquez F, Suárez JE. Characterization of indigenous vaginal lactobacilli from healthy women as probiotic candidates. Int Microbiol. 2008 Dec;11(4):261-6.
Antonio, MAD, SE Hawes, and SL Hillier. The identification of vaginal Lactobacillus species and the demographic and microbiologic characteristics of women colonized by these species. J. Infect. Dis. (1999) 180: 1950-1956.
Man J.C., de Rogosa M. and Sharpe, ME. A medium for the cultivation of Lactobacilli, Appl. Bact. (1960) 23, 130-135.
Реферат
Группа изобретений относится к выделенному штамму Lactobacillus crispatus и его применению. Предложен штамм Lactobacillus crispatus, идентифицированный как IP174178 и депонированный в CNCM под регистрационным номером I-4646. Штамм предназначен для лечения или профилактики половых и урогенитальных инфекций, таких как вагиноз и кандидоз. Указанный штамм используют в эффективном количестве как активное вещество в фармацевтической и нутрицевтической композициях. Предложено также медицинское устройство для лечения или профилактики половых и урогенитальных инфекций, таких как вагиноз и кандидоз, содержащее фармацевтическую композицию, включающую указанный штамм. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 10 табл., 6 пр.
