Композиция микроорганизмов (варианты) - RU2291899C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комбинации пробиотиков, при этом указанная комбинация включает в себя лактобактерии, пропионовокислые бактерии и/или бифидобактерии в различных сочетаниях. Пробиотики, предпочтительно, объединяют с подходящими пребиотиками, получая синбиотик. Комбинация согласно настоящему изобретению может употребляться как таковая или в сочетании с подходящей пищей, такой как молочный продукт или напиток, и она характеризуется терапевтической полезностью, например, с точки зрения стимуляции иммунной системы и, в целом, улучшения состояния здоровья.

Предпосылки создания изобретения

Пробиотики представляют собой живые микроорганизмы, которые при введении их в организм человека или животного способствуют жизнедеятельности организма хозяина за счет улучшения баланса кишечной микрофлоры (Fuller, R. Probiotics in man and animals, 1989, J. Appl. Microbiol. 66: 365-378). Наиболее изученные пробиотики включают в себя L. rhamnosus LGG, L. johnsonii LAI, L. casei Shirota и Bifidobacterium lactis Bbl2. Кроме того, в соответствующей научной литературе описано множество других пробиотиков (см., например, M.E. Sanders & J.H. in't Veld 1999. Antonie van Leeuwenhoek 76: 293-315, Kluwer Academic Publishers). Оздоравливающее действие пробиотиков подразумевает приведение в баланс и дальнейшее поддержание кишечной флоры, стимуляцию иммунной системы и антиканцерогенную активность. Полезное воздействие пробиотиков на кишечник человека основано на нескольких факторах, определяемых живыми бактериальными клетками, их клеточными структурами и метаболическими продуктами. Пробиотики обычно вводят в составе пищевых продуктов или в виде капсул.

Бактерия может рассматриваться как пробиотик, если она, по существу, удовлетворяет следующим критериям (Lee, Y-K, and Salmien, S. 1995. The coming age of probiotics. Trend Food Sci Tehnol. 6: 241-245): она остается жизнеспособной в жестких условиях, характерных для пищеварительного тракта (низкий pH в желудке, наличие кислот пищеварительной системы и т.п.), прикрепляется к стенкам кишечника, способна осуществлять метаболизм в кишечнике, технологически применима (подвергается обработке), демонстрирует клинически подтвержденные и задокументированные оздоравливающие эффекты и безопасна для потребления.

Пребиотики представляют собой неперевариваемые пищевые ингредиенты, которые улучшают здоровье человека за счет селективного стимулирования роста и активности одной или нескольких пробиотических бактерий ободочной кишки (Gibson, G.R. and Roberfroid, M.B. 1995. Dietary modulation of the human colonic micribiota-introducing a concept of prebiotics, J. Nutr. 125: 1401-1412). Пребиотик обычно представляет собой неперевариваемый углеводород (олиго- или полисахарид) или сахарный спирт, который не разлагается или не всасывается в верхнем отделе пищеварительного тракта. Известные пребиотики, используемые в коммерческих продуктах, включают в себя инулин (фруктоолигосахарид, или ФОС), трансгалактоолигосахариды (ГОС или ТОС).

Синбиотик определяют как комбинацию пребиотика и пробиотика, при этом пребиотик улучшает жизнеспособность добавленного микроорганизма и его прикрепление к кишечнику, оказывая тем самым оздоравливающий эффект (Gibson and Roberfroid 1995, указано выше). В том случае, когда неперевариваемые углеводы, которые проходят через тонкий кишечник, подвергаются ферментации в ободочной кишке, образуются, например, короткоцепочечные жирные кислоты, другие органические кислоты, спирты, водород и двуокись углерода (Gibson and Roberfroid 1995, указано выше). Основные жирные кислоты, продуцируемые в ходе ферментации, включают в себя уксусную кислоту, масляную кислоту и пропионовую кислоту (Cummings, J.H. Short-chain fatty acids, в: Human Colonic Bacteria: Role in Nutrition, Physiology and Pathology, G.R. Gibson and G.T. Macfarlane (eds.), pp. 101-130, CRC Press, Boca Raton, 1995). Увеличение количества короткоцепочечных жирных кислот, в целом, рассматривается как благоприятное действие. Неперевариваемые углеводы представляют собой основной субстрат для микроорганизмов толстого кишечника, хотя они могут также включать в себя соединения, которые при ферментации в кишечнике дают нежелательные продукты (Gibson and Roberfroid 1995, указано выше).

Пищеварительный тракт человека является средой обитания для множества бактерий, которые живут в симбиозе с организмом хозяина. Имеются огромные различия в уровне микроорганизмов между различными частями тракта, при этом примерно 95% всех кишечных бактерий находится в ободочной кишке, которая является наиболее важной частью кишечника. Подсчитано, что в ободочной кишке выживает около 400 видов бактерий. Кроме того, кишечник содержит микроорганизмы, известные как временные бактерии (G.R. Gibson and M.B. Roberfroid (eds.) Colonic Microbiota; Nutrition and Health, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1999). В число доминирующих видов входят следующие: Bacteroides, Bifidobacterium, Coprococcus, Peptostreptococcus, Eubacterium и Ruminococcus. Такие виды, как Lactobacillus, Streptococcus, Fusobacterium, Veillonella, Propionibacterium и Enterobacteriaceae, представлены в несколько меньшем количестве. Некоторые из указанных видов представляют собой полезные микроорганизмы, тогда как другие могут быть даже вредными. Средний уровень микробной обсемененности фекалий составляет 10¹² КОЕ/г (на сухой вес). Бактерии разлагают и ферментируют те пищевые ингредиенты в ободочной кишке, которые не абсорбировались в тонком кишечнике, при этом продукты ферментации всасываются в кишечнике для последующего использования организмом. Микробный баланс в ободочной кишке важен не только для питания, но имеет также огромное значение и для общего состояния здоровья человека (Tannock, G.W. 1998. Studies of the intestinal microflora: A prerequisite for the development of probiotics, Int. Dairy J. 8: 527-533). Изменение в составе кишечной флоры или резкое снижение ее количества (в связи с сильной диареей, лечением антибиотиками и т.п.) повышает инфекционность условно патогенных видов, что может иметь серьезные последствия (развитие аллергий, кишечных заболеваний, рака).

Считается, что продуцируемые кишечными бактериями β-глюкуронидазные ферменты вносят вклад, например, в образование канцерогенных продуктов. Стероиды и другие канцерогенные соединения метаболизируются в печени и затем конъюгируют с глюкуроновой кислотой. Желчь доставляет конъюгированное глюкуроновое соединение в тонкий кишечник, и оттуда соединение идет дальше в ободочную кишку, где глюкуронидазные ферменты гидролизуют соединение, высвобождая при этом токсичные соединения в ободочную кишку (Rowland, I.R. 1995. Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora, в: Human Colonic Bacteria, Role in nutrition, physiology, and pathology. Editors: Gibson G.R. and Macfarlane G.T. pp. 155-174, Boca Raton: CRC Press). Считается, что виды Eubacterium, Bacteroides и Clostridium высвобождают большее количество таких вредных ферментов в кишечник, чем репрезентативные виды Bifidobacterium и Lactobacillus. Данный факт указывает на одну из причин, объясняющих, почему полезно, чтобы кишечная флора состояла из бифидобактерий и лактобактерий.

Кроме того, гликозиды, поступающие, например, из овощей и чая, не всасываются в тонком кишечнике, а проходят в ободочную кишку, где они могут быть гидролизованы β-глюкозидазами с образованием токсичных или мутагенных агликоновых соединений (Goldin, B.R. 1990. Intestinal Microflora: metabolism of drugs and carcinogens. Annals of Medicine 22: 43-48).

Кроме того, кишечная флора продуцирует фермент уреазу, который разлагает мочевину с образованием аммиака. Высокие количества аммиака могут быть токсичны для эпителиальных клеток кишечника (Mobley, H.L.T. and Hausinger, R.P. 1989. Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiological Reviews 53: 85-108).

Кишечная флора человека формируется в первые годы жизни, и в ее составе впоследствии не происходит серьезных изменений. Могут иметь место лишь незначительные изменения в видовом составе (например, по содержанию бифидобактерий).

Проводимые исследования, ведя к растущему пониманию важности кишечной флоры, в то же время уделяют большое внимание выявлению тех факторов, которые могут быть использованы для воздействия на состав микрофлоры и ее функционирование (жизнеспособность) таким образом, чтобы полезные бактериальные виды могли быть усилены, а вредные, соответственно, снижены. Считается, что функционирование микроорганизмов может быть усилено пребиотиками, которые стимулируют полезные бактерии. Были проведены обширные исследования с использованием галактоолигосахаридов (ГОС), которые представляют собой ди-, три-, тетра-, пента- и гексасахариды и которые в основном содержат галактозные единицы. Их получают энзиматически из лактозы, и содержание конечного продукта зависит от вида используемого фермента (Matsumoto, K. et al., 1993. Galactooligosaccharides, в: Oligosaccharides. Production, properties and application. Ed. Nakakuki, T., Japanese Technology Reviews. Vol. 3. No. 2., pp. 90-116, Gordon and Breach Science Publishers, Switzerland, Australia). Ранее было показано, что ГОС проявляют, например, бифидогенные свойства, т.е. приводят к усилению роста бифидобактерий (Ito, M. et al., 1990. Effect of administration of galactooligosaccharides on the human faecal microflora, stool weight, and abdominal sensation. Microb. Ecol. Health Dis. 3: 285-292).

Уровень техники

В литературе на достигнутом уровне техники широко освещены как продукты, содержащие индивидуальный штамм пробиотиков, так и сочетание множества различных пробиотиков. Синбиотики также описаны в соответствующей научной литературе.

Так, например, в публикации EP 904784 (N.V. Nutricia) описан пробиотический продукт, содержащий Bifidobacterium, Enterococcus faecium и Lactobacillus. Кроме того, продукт может содержать пребиотики, такие как полисахарид или неразлагаемый крахмал, а также иммуноглобулины, витамины и т.п. Согласно данной публикации продукт оказывает оздоравливающий эффект за счет того, что он, например, стимулирует иммунную систему. Эффект, однако, не был продемонстрирован в клинических тестах, и, более того, не были изучены какие-либо другие виды биологической активности.

В заявке WO 00/33854 (N.V. Nutricia) описан продукт, включающий в себя пробиотик и олигосахариды. Пробиотики, в частности, относятся к Lactobacillus и Bifidobacterium, хотя также упоминаются Pediococcus, Propionibacterium, Leuconostoc и Saccharomyces. Использованные пребиотики включают в себя трансгалактоолигосахариды (ТОС) и фруктоолигосахариды (ФОС). Согласно данной публикации особенно полезные комбинации включают в себя Lactobacillus rhamnosus и трансгалактоолигосахаридный продукт или продукт гидролиза картофельного галактана, причем указанная комбинация и процедура ее получения были пояснены на примерах. Согласно данной публикации продукт оказывает оздоравливающий эффект и, в частности, полезен при лечении расстройств кишечника. Однако его активность не была продемонстрирована каким-либо образом.

В заявке WO 97/34615 (Университет Нового Южного Уэльса (University of New South Wales)) описана пробиотическая композиция, включающая в себя, вдобавок к одному или большему числу пробиотиков, резистентный (недеградируемый) крахмал и олигосахарид, синергический эффект которой достигается за счет трех компонентов. Рассматриваемые пробиотики включают в себя Saccharomyces, Bifidobacterium, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus и Lactobacillus, и олигосахариды включают, в числе множества других, фрукто- и галактоолигосахариды. Приведенные примеры свидетельствуют о синергическом эффекте бифидобактерий, кукурузного крахмала и фруктоолигосахаридов на количество бифидобактерий. Однако какого-либо терапевтического эффекта не было обнаружено.

В патенте США US 5895648 (Sitia-Yomo S.p.A.) описана пробиотическая композиция, содержащая лиофилизованную форму живых бактерий, включая, по меньшей мере, два вида бифидобактерий и, по меньшей мере, два вида лактобактерий или стрептококков, объединенных с одним или большим числом олигосахаридов. Композиция включает в себя, в целом, 4-20 вес. ч. пробиотиков и 5-22 вес. ч. олигосахаридов, в числе которых особо отмечаются, например, галакто- и фруктоолигосахариды, и в частности, инулин. Рассматриваемые пробиотики включают в себя Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus и Streptococcus faecium. Согласно данной публикации смесь, содержащая пробиотики и пребиотики, может быть добавлена к молочным десертам, молоку или сокам для достижения сбалансированной работы кишечника. Однако какой-либо биологической активности указанной комбинации не было обнаружено.

В публикации Милхвиссеншафта (Milchwissenschaft (1998) Vol. 53. No. 11, pp. 603-605) описывается PAB-молоко, которое содержит три бактериальных штамма: Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii MTCC 1371, Lactobacillus acidophilus R. и Bifidobacterium bifidum NDRI. Пребиотики не добавляются к продукту. Согласно данной публикации PAB-молоко подходит для питания младенцев и детей, а также лиц, у которых отсутствует толерантность к лактозе.

В заявке WO 99/10476 описывается стимулирующий эффект определенных бактериальных штаммов, т.е. Lactobacillus rhamnosus HN001 (NM97/09514) и HN067 (NM97/01925) и Lactobacillus acidophilus HN017 (NM97/09515) и Bifidobacterium lactis HN019 (NM97/09513), на иммунную систему, проявляющийся в усилении фагоцитоза. Указанные штаммы могут использоваться сами по себе или могут быть добавлены к молочным продуктам или фармацевтическим препаратам.

В патенте США 5902578 (Abbott Laboratories) рассматривается способ профилактики и лечения диареи с использованием смеси Lactobacillus reuterii, Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium infantis, причем указанную смесь получают в виде порошка, жидкости или пилюль.

Биологическое и терапевтическое действие пробиотиков и синбиотиков указанного выше типа также описано на достигнутом ранее уровне техники. В качестве примеров можно отметить работу Галлагхера (Gallagher, D. et al., Journal of Nutrition (1996) Vol. 126. No. 5, pp. 1362-1371), который описывает действие бифидобактерий и Lactobacillus acidophilus на рак ободочной кишки у крыс, указывая, что наилучшие результаты были получены при использовании бактерий вместе с фруктоолигосахаридами, а также работу Кирьявайнена (Kirjavainen, P. et al. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (Nov 1999) Vol. 6, No. 6, pp. 799-802), в которой описывается положительный эффект двух отдельно изученных штаммов молочнокислых бактерий, Lactobacillus rhamnosus GG и Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS, на уровень лимфоцитов и, в этой связи, на иммунную реакцию мышей. Комбинация двух указанных бактерий не была описана или изучена.

Сочетание пробиотиков с другими веществами, обладающими терапевтическим действием, также описано в соответствующей научной литературе. Так, например, в заявках WO 97/29762 и WO 97/29763 (Procter & Gamble Company) описывается использование лактобактерий и бифидобактерий в сочетании с галакто- или фруктоологосахаридами и вместе с растением рода Ericaceae или его экстрактом для лечения инфекций мочеполового тракта и расстройств кишечника, а в заявке WO 00/29007 (Reddy) описано сочетание пробиотиков, таких как Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Propionibacterium, Brevibacterium, Penicillium и Saccharomyces, с травными натуральными продуктами и веществами, близкими к лекарственным агентам.

Несмотря на то, что пробиотики и синбиотики достаточно полно изучены, в значительной мере хорошие и коммерчески надежные продукты все еще недоступны. Следовательно, имеется явная потребность в разработке для потребителей новых продуктов, обладающих выраженными пробиотическими эффектами и получаемых в форме, которая позволяет использовать их как удобный компонент пищи или как добавку, например, к ежедневной диете.

Краткое описание изобретения

В связи с вышесказанным объектом настоящего изобретения является разработка нового продукта, содержащего пробиотик, пробиотический эффект которого должен быть четко показан и который был бы приятным для использования потребителем и оказывал бы на него оздоравливающее действие.

Указанные цели достигаются за счет новой комбинации согласно настоящему изобретению, которая включает в себя множество пробиотиков. Настоящее изобретение, таким образом, основано на новой комбинации, содержащей 2 штамма лактобактерий, пропионовокислую бактерию и/или бифидобактерию. Кроме того, комбинация, предпочтительно, включает в себя пребиотик, поддерживающий рост указанных выше микроорганизмов.

Согласно настоящему изобретению используют в основном два штамма лактобактерий, то есть Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103) и Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061). Пропионовокислая бактерия обычно представляет собой Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067). Бифидобактерия может представлять собой любую бифидобактерию, оказывающую пробиотический эффект, обычно используют штаммы, относящиеся к видам Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis.

Обычно в комбинацию включают, по меньшей мере, три указанных бактерии, и предпочтительно, она включает в себя Lactobacillus rhamnosus LGG и/или Bifidobacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS.

Наиболее предпочтительная комбинация представляет собой смесь четырех штаммов: Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) и Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692). Однако в комбинацию, если желательно, может быть включена любая бифидобактерия (такая как Bbl2). Используемый пребиотик предпочтительно, является галактоолигосахаридом (ГОС).

Другая предпочтительна композиция представляет собой комбинацию бифидобактерий и пропионовокислых бактерий, в составе которой может использоваться любая бифидобактерия вместе с Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067).

Новая комбинация может использоваться как таковая или как часть продукта, такого как фармацевтический или пищевой продукт. Комбинация согласно настоящему изобретению оказывает благоприятный эффект на баланс кишечника человека в том плане, что он повышает продукцию энтеролактона и снижает нежелательно высокий показатель pH. Комбинация также влияет на иммунную реакцию за счет повышения количеств лимфоцитов и γ-интерферона (IFN) и за счет снижения образования канцерогенных веществ. Комбинация согласно настоящему изобретению полезна, таким образом, для предупреждения и лечения расстройств кишечника, аллергии и рака, а также для улучшения, в целом, состояния здоровья.

Так, согласно настоящему изобретению, указанная комбинация может применяться как терапевтическое средство и для целей получения лекарственных веществ.

Подробное описание изобретения

Из тех штаммов, которые были использованы в настоящем изобретении, на достигнутом уровне техники описаны Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 и Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS). Bifidobacterium infantis Bbi99, который может быть включен в данную комбинацию, является новым штаммом и ниже будет более детально охарактеризован.

Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) описан, например, в патенте США 5032399 (Gorbach & Goldin). Штамм выделен из фекалий человека, он способен хорошо расти при pH 3 и выживает при еще более низких значениях pH, а также при высоком содержании желчных кислот. Штамм проявляет великолепную адгезию и к слизистой оболочке, и к эпителиальным клеткам. Выход молочной кислоты из глюкозы хороший: при росте на MRS-бульоне штамм продуцирует 1,5-2% молочной кислоты. Штамм не ферментирует лактозу и, в этой связи, не может образовывать молочную кислоту из лактозы. Данный штамм использует следующие углеводы: D-арабинозу, рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, рамнозу, дульцит, инозит, маннит, сорбит, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, мелезитозу, гентибиозу, D-тагатозу, L-фукозу и глюконат. Штамм хорошо растет при температуре +15-45°С, и оптимальной является температура 30-37°С. Lactobacillus rhamnosus GG депонирован в американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection) под номером ATCC 53103.

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 описан более детально в патенте FI 92498 (Valio Oy). LC705 представляет собой грамположительную короткую палочку, способную образовывать цепочки, она является гомоферментативной бактерией, обладает слабым протеолитическим действием, хорошо растет в температурном диапазоне +15°С-45° С, не образует аммиак из аргинина, является отрицательной по каталазе и при росте на MRS-бульоне (LAB M) штамм продуцирует 1,6% молочной кислоты, имеющей оптимальную активность в L(+)-конфигурации, штамм разлагает цитрат (0,169%), образуя при этом диацетил и ацетоин, штамм ферментирует, по меньшей мере, следующие углеводы (сахара, сахарные спирты): рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, L-сорбозу, рамнозу, маннит, сорбит, метил-D-глюкозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, мелезитозу, гентиобиозу, D-туранозу и D-тагатозу. LC705 слабо прикрепляется к клеткам слизистой оболочки, но достаточно умеренно - к эпителиальным клеткам. Штамм характеризуется хорошей жизнеспособностью при низких значениях pH и при высоком содержании желчных кислот. Штамм хорошо выживает при 5% засоленности и достаточно хорошо - при 10% содержании солей. Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC705 депонирован в германской коллекции культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM) под номером DSM 7061.

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS) также очень подробно описана в патенте FI 92498 (Valio Oy). PJS представляют собой грамположительную короткую палочку. Она способна ферментировать глюкозу, фруктозу, галактозу и лактозу, а также хорошо ферментирует лактат, оптимальный рост наблюдается при температуре 32°С. Жизнеспособность штамма при низком значении pH и высоком содержании желчных кислот превосходная. Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS депонирована в германской коллекции микроорганизмов (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM) под номером DSM 7067.

Bifidobacterium infantis Bbi99 была выделена из фекалий здоровых новорожденных детей. B. infantis Bbi99 представляет собой грамположительную плейоморфную палочку. Штамм является отрицательным по каталазе, положительным по фруктозо-6-фосфатфосфокетолазе (Ф6ФФК) и положительным по α- и β-галактозидазе, а также по α- и β-глюкозидазе. B. infantis Bbi ферментирует следующие углеводы: рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, метил-D-маннозу, N-ацетилглюкозамин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, мелибиозу и гентибиозу. Оптимальная температура для роста составляет +30-40°С и pH 6,5-7,0. При росте на бульонах, содержащих гексозу, штамм продуцирует L-молочную кислоту и уксусную кислоту (в соотношении 2:3). Содержание Г+Ц в ДНК составляет 55-67 моль.%. Bifidobacterium infantis Bbi99 депонирована 28 августа 2000 года в германской коллекции микроорганизмов (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM), в соответствии с Будапештским договором, под номером DSM 13692.

Комбинация согласно настоящему изобретению может также включать в себя другие микроорганизмы, такие как микроорганизмы и пробиотики, содержащиеся в заквасках, используемых в молочной промышленности. Имеется множество хорошо описанных штаммов заквасок, которые коммерчески доступны от производителей, таких как Hansen A/S, Дания, и Danisco/Wiesby GmbH, Германия.

Для получения комбинаций согласно настоящему изобретению микроорганизмы культивируют с использованием традиционных в данной области техники процессов и способов. Они могут культивироваться в виде чистых культур или в виде различных смешанных культур. Культуры могут использоваться как таковые, или они могут быть при желании обработаны, например, посредством очистки, концентрирования, лиофилизации или путем изготовления на их основе различных препаратов.

Для достижения желательного пробиотического эффекта в комбинацию вводят достаточное количество пробиотиков. Количество каждого пробиотика можно, таким образом, варьировать в широком диапазоне, в зависимости от используемых штаммов, от их числа, от общего количества клеток пробиотика, от суммарной дневной дозы и от других свойств и ингредиентов продукта. Ежедневная доза комбинации обычно включает в себя примерно 10⁶-10¹⁰ КОЕ пробиотиков.

Предпочтительно, к комбинации добавляют один или более пребиотиков с получением синбиотика. Пребиотик выбирают в соответствии с природой микроорганизмов, которые включают в комбинацию, так, чтобы данный пребиотик поддерживал рост введенных микроорганизмов. Подходящие пребиотики могут содержать, например, олигосахариды, в частности галактоолигосахарид (ГОС), палатинозоолигосахарид, соевый олигосахарид, гентиоолигосахарид, ксилоолигомеры, недеградируемый крахмал, лактосахарозу, лактулозу, лактит, мальтит, полидекстрозу или др. Для достижения пребиотического эффекта к образуемому синбиотику добавляют достаточное количество пребиотика. Каково достаточное количество, определяют, например, в соответствии с природой рассматриваемого штамма, количеством включаемого пребиотика и другими факторами, определяемыми содержимым и конкретным применением данного продукта. В этой связи количество также варьирует в широком диапазоне, оно может составлять, например, от 0,5 до 5 г в составе ежедневной дозы.

Включение пребиотика не является обязательным для получения комбинации. В зависимости от конечного продукта и от целей его использования может быть лучше употреблять пребиотик отдельно, хотя примерно в то же самое время, что и пробиотическую комбинацию. В некоторых случаях может быть достаточно употреблять только пробиотическую комбинацию, тогда как пребиотик может быть совсем не нужен. В качестве такого примера можно указать случай, когда условия кишечника организма хозяина приемлемы для роста пробиотиков без добавления пребиотика, который не требуется, и когда пребиотик содержится в нормальной диете (если он потребляется, например, в виде овсяной каши или ржаного хлеба).

Было показано, что микроорганизмы, используемые согласно настоящему изобретению, удовлетворяют всем критериям, установленным для пробиотика: они хорошо выживают в жестких условиях пищеварительного тракта, хорошо прикрепляются к стенкам кишечника и хорошо размножаются в кишечнике. Было показано также, что они проявляют великолепное биологическое действие: например, они повышают число микроорганизмов, желательных с точки зрения оздоровления и снижения количества вредных микроорганизмов в кишечнике, они снижают активность вредных ферментов и, тем самым, образование вредных и даже канцерогенных веществ, а также оказывают стимулирующий эффект на иммунную систему.

Комбинация согласно настоящему изобретению может использоваться как таковая в виде капсул, пилюль или таблеток, производимых, например, в рамках традиционных процессов получения фармацевтических продуктов. Комбинация согласно настоящему изобретению может также добавляться к различным съедобным продуктам, таким как пища, напитки или кондитерские продукты, оздоравливающие продукты, натуральные продукты и т.п. В контексте настоящего изобретения предпочтительны продукты, содержащие комбинацию согласно изобретению, такие как молочные продукты, в особенности йогурты и другие ферментированные молочные продукты, сыры и пасты, детское питание, соки и супы, а также капсулы. Продукт в виде капсул обычно содержит только пробиотическую комбинацию, а пребиотик употребляется отдельно.

Готовые продукты получают традиционными способами, при этом композицию добавляют либо в ходе изготовления продукта, либо позже, на завершающей стадии изготовления продукта.

Изобретение описывается более детально со ссылкой на приведенные ниже примеры, которые служат лишь целям иллюстрации и никоим образом не ограничивают его объем.

Пример 1

Получение комбинации

Комбинацию получают из бактериальной смеси с добавкой при желании галактоолигосахарида (ГОС) в качестве пребиотика. Бактериальную смесь получают из бактериальных культур (концентратов лиофилизованных порошков четырех штаммов, то есть Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii PJS (DSM 7067) и Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692).

LGG и бифидобактерию культивируют отдельно.LGG культивируют в среде, содержащей 5,0% сывороточного пермеата (Valio Oy), 0,5% гидролизата казеина (Valio Oy), 0,5% технических дрожжей и 0,0015% MnSO₄·Н₂O. Компоненты среды растворяют в воде, и среду стерилизуют (в течение 20 минут при 120°С). Культивирование проводят при температуре 37°С и значении pH, равном 5,8 (значение рН доводят с помощью NH₄OH), в течение 18 часов со скоростью перемешивания 100 об/мин. После культивирования бактериальные клетки концентрируют, промывают и лиофилизуют с использованием 10 объемн.% защитной добавки, такой как 46% сахарозный бульон, или аналогичная альтернативная добавка, известная специалистам в данной области техники. Окончательное содержание бактерий составляет >1·10⁹ КОЕ/мл в среде для культивирования, >1·10¹⁰ КОЕ/г в концентрации и >1·10¹¹ КОЕ/г в лиофильно высушенном порошке.

Ростовая среда для бифидобактерий имеет следующий состав: сывороточный пермеат - 4% (Valio Ltd.), гидролизат казеина - 1,0% (Valio Ltd.), экстракт технических дрожжей - 1,0% (LAB M), цистеин-HCl - 0,03% (Merck, Darmstadt, Германия). Другие ингредиенты среды вначале растворяют в воде, затем добавляют цистеин-HCl, и среду стерилизуют (в течение 20 минут при 120°С). Культивирование проводят примерно в течение 18-20 часов при температуре 37°С и значении pH 6,7 (значение рН доводят с помощью NH₄OH) со скоростью перемешивания 100 об/мин. Содержание бактерий составляет >1·10⁹ КОЕ/мл. После культивирования бактериальные клетки концентрируют, промывают и лиофилизуют с использованием 10 объемн.% защитной добавки, такой как 46% сахарозный бульон, или аналогичная альтернативная добавка, известная специалистам в данной области техники. Содержание бактерий в концентрате составляет >1·10¹⁰ КОЕ/г и в лиофильно высушенном порошке >1·10¹¹ КОЕ/г.

LC705 и PJS культивируют совместно путем инокулирования бактериальных клеток в ростовой бульон на основе сыворотки в соотношении 1:2. Содержащий сыворотку ростовой бульон включает в себя 3,5-5% сывороточного пермеата (Valio Oy), 1,0% гидролизата казеина и 1,0% дрожжевого экстракта (Valio Oy). Штаммы культивируют в течение 3 дней при 30°С, поддерживая значение pH 4,5 с помощью автоматизированного корректора pH. После культивирования содержание каждого бактериального штамма составляет >1·10⁹ КОЕ/мл. После культивирования бактериальные клетки концентрируют, промывают и лиофилизуют с использованием 10 объемн.% защитной добавки, такой как 46% сахарозный бульон или аналогичная альтернативная добавка, известная специалистам в данной области техники. Содержание каждой из бактерий в концентрате составляет >1·10¹⁰ КОЕ/г и в лиофильно высушенном порошке >1·10¹¹ КОЕ/г.

Штаммы могут также культивироваться отдельно. В таком случае LC705 культивируют, как было описано выше для случая совместного культивирования, только время культивирования составляет 1 день при 30°С. PJS культивируют в ростовой среде на основе сыворотки, содержащей 2% сывороточного пермеата, 1,0% гидролизата казеина и 1% дрожжевого экстракта. Штамм культивируют в течение 3 дней при 30°С, поддерживая значение pH 6,3, после чего процесс проводят, как указано выше.

Концентраты порошков смешивают в соотношении 1:1:1. В том случае, когда LC705 и PJS культивируют отдельно, коэффициент соотношения в смеси составляет 1:1:1:1. Полученную смесь концентратов лиофильно высушенных порошков используют в качестве пробиотической части при различных вариантах использования комбинаций продукта. Смесь добавляют к продукту, подлежащему применению, с получением следующего содержания бактерий в продукте:

При желательности добавляют ГОС (Valio Oy) в виде отдельного компонента к подлежащему применению продукту с достижением концентрации ГОС в продукте примерно 0,5-5 г/дозу.

Пример 2

Адгезивные свойства штаммов и их толерантность к условиям кишечника

Адгезию, или прикрепление пробиотических штаммов к слизистой, определяют по методу Увеханда с соавт. (Ouwehand, A.C., Kirjavainen, P.V., Grönlund M.M., Isolauri, E., and Salminen, S.J. 1999. Adhesion of probiotic microorganisms to intestinal mucus. Int. Dairy J. 9: 623-630). LGG и пропионовая бактерия PJS прекрасно прикрепляются к слизистой кишечника, Bbi99 прикрепляются с умеренной силой и LC705 прикрепляются слабо. Адгезия является необходимым условием для оказания микроорганизмам полезного эффекта в кишечнике. С другой стороны, известно, что LC705, как и LGG, хорошо прикрепляется к эпителиальным клеткам (Lehto, E. and Salminen S. 1997. Adhesion of two lactobacillus strains, one lactococcus strain, and one propionibacterium strain to cultured human intestinal CaCO-2 cell lines. Bioscience Microflora 16: 13-17). Указанное свойство является полезным в том случае, когда имеется дисбаланс в кишечнике и ослаблена защитная слизистая оболочка.

Тесты in vitro показывают, что штаммы хорошо выживают при физиологическом содержании желчных солей и при значении pH в желудке.

Штаммы тестируют при различных значениях pH в MRS-бульонах, значение pH которых доводят с помощью молочной кислоты до pH 4, pH 3 и pH 2. Исследуемый штамм (свежая культура) инокулируют в 1% бульон и растят при 37°С в течение 3 часов, после чего определяют количество живых клеток с использованием подходящего для данного штамма агара (см. таблицу 5). Штаммы великолепно сохраняют свою жизнеспособность в течение 3-часового процесса при значении pH 3. Пропионовая бактерия остается жизнеспособной даже при pH 2. В данном тесте бактерии не подвергают защите компонентами пищи (такими, как жир), и в этой связи, можно полагать, что они сохраняются еще лучше в случае употребления in vivo вместе с пищей.

С целью изучения толерантности к желчным солям штаммы тестируют в MRS-бульонах, содержащих 0,3% и 0,5% желчной соли Oxgal (Sigma), путем инокуляции 1% свежей культуры в исследуемый MRS-бульон с желчной солью. Штаммы культивируют в бульонах при 37°С в течение 3 часов, после чего определяют содержание живых клеток с использованием агара, подходящего для данного штамма (см. таблицу 5). Все штаммы прекрасно выживают при данной обработке.

Пример 3

Выбор пребиотика, подходящего для комбинации

Альтернативные пребиотики изучают с использованием индивидуальных штаммов путем культивирования каждого штамма в бессахарном MRS-бульоне, к которому добавляют 1% исследуемого пребиотика. Каждый штамм культивируют в течение 1-2 дней при оптимальной для него температуре. Рост бактерий определяют в ходе теста путем измерения на спектрофотометре мутности культуральной среды. Как видно из таблицы 4, наилучшее усиление роста всех четырех штаммов обнаруживает добавка 1% галактоолигосахарида (ГОС).

Пример 4

Получение готового продукта

Используют функциональный напиток (по-фински "техойюома" 'tehojuoma'; Valio Oy) в качестве основы для получения соков (дозировка 65 мл/день), к которому добавляют 0,1 г лиофильно высушенной смеси бактерий/дозу (=65 мл) и 3,8 г 70% сиропа ГОС/дозу (=65 мл). Соответствующий сок, в который не добавляют сироп ГОС или бактериальную смесь, используют в качестве контроля.

В готовом соке имеется следующее количество бактерий:

Продукт используют в следующих клинических тестах, в которых pro=сок+пробиотическая добавка и syn=сок+пробиотик+пребиотик.

Пример 5

Клинические эффекты комбинаций согласно настоящему изобретению

Описанный в примере 4 напиток, который содержит указанную выше пробиотическую комбинацию (Pro) или пробиотическую комбинацию и пребиотик (Syn), подвергают клиническому исследованию на 20 мужчинах. Испытуемые принимают ежедневно напиток в соответствии с планом исследования, в ходе которого им не разрешается принимать другие продукты, содержащие пробиотик. Схема исследования составлена таким образом, что тест начинают с периода подготовки, затем идет период приема пробиотиков в течение 2 недель, и далее фаза приема синбиотиков заканчивается фазой, известной, как период промывки.

В конце каждого периода испытуемые сдают образец кала и образец крови для анализа (=N).

Образец кала анализируют на наличие микроорганизмов и ряда ферментов, а в образце крови определяют содержание энтеролактона и уровень иммунной реакции.

5.1. Микроорганизмы

Количество микроорганизмов

С использованием известных в технике методов и на основе параметров, показанных в таблице 5, определяют суммарное содержание молочнокислых бактерий, LGG, LC705, суммарное содержание пропионовокислых бактерий, PJS и суммарное содержание

бифидобактерий.

Влияние на содержание бактериальных клеток в кишечнике in vivo

Содержание LGG, LC795 и PJS значительно повышается в образцах у испытуемых в фазе использования продукта, содержащего пробиотик (таблица 6). Поскольку содержание бифидобактерий было высоким с самого начала теста, изменения имеют место преимущественно только внутри двух других видов.

Добавление синбиотика в потребляемые продукты в тесте на потребление повысило жизнеспособность добавленных пробиотиков в кишечнике. Данные изменения видны, например, по повышению содержания LGG в фазе приема синбиотика.

Влияние не величину pH

Уровень pH у лиц, имеющих исходный уровень pH свыше 7, снижается в группах, принимавших пробиотическую смесь и синбиотик, тогда как у лиц с исходным pH ниже 7 такого снижения не наблюдалось (таблица 7).

5.2. Ферменты

Образцы фекалий обрабатывают по методу Линга с соавт. (Ling, W-H, Korpela, R., Mykkanen, H., Salminen, S., and Hanninen, O. 1994. Lactobacillus GG supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive activities in healthy female adults. Journal of Nutrition 124, 18-24).

Ферменты β -глюкуронидаза и β-глюкозидаза определяют по методу Фримана (Freeman, H.J. 1986. Effects of differing purified cellulose pectin, and hemicellulose fibre on faecal enzymes in 1, 2-dimethyl-hydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Cancer Research 46: 5529-5532), а уреазу определяют по методике производителя (Boehringer Mannheim cat. No. 542946).

В процессе тестирования отмечается снижение содержания β-глюкуронидазы, уреазы и β-глюкозидазы в фазе приема пробиотиков и в фазе приема синбиотиков (таблица 8). После приема уровень ферментов возвращается к нормальному состоянию. Синбиотик оказывает более сильный снижающий эффект на уровень ферментов, чем пробиотическая смесь.

Метаболизм под действием глюкозидазы и глюкуронидазы приводит к образованию канцерогенных соединений. Значительное снижение активности фермента, создаваемое комбинациями пробиотика и синбиотика согласно настоящему изобретению, четко демонстрирует положительный эффект с точки зрения снижения образования канцерогенных веществ.

5.3. Содержание энтеролактона

Содержание энтеролактона определяют по методу Адлеркройтца с соавт. (Adlercreutz, H., Fostis, T., Lampe, J., Wähälä, K., Mäkelä, T., Brunov, G. and Hase, T. 1993. Quantitative determination of lignans and isoflavonoids in plasma of omnivorous and vegetarian women by isotope dilution gas-chromatography mass-spectrometry. Scan J. Clin Lab Invest 53: 5-18).

Уровни энтеролактона у испытуемых, имевших исходный уровень энтеролактона <10 нмоль/л, значительно повышаются в результате приема синбиотиков (до уровня 11,2).

В ходе испытания не отмечается каких-либо изменений в содержании энтеролактона и у людей, которые имеют нормальное содержание энтеролактона в сыворотке (10

Было показано, что содержание энтеролактона тесно коррелирует с риском развития рака: чем выше содержание, тем ниже риск. Указанный результат также свидетельствует о благотворном влиянии пробиотической и синбиотической комбинаций согласно настоящему изобретению на снижение риска развития рака.

5.4. Иммунологические исследования

Влияние на функцию лимфоцитов

Функцию лимфоцитов исследуют до начала приема синбиотического продукта и через 4 недели после начала приема.

Функцию лимфоцитов исследуют следующим образом:

Лимфоциты выделяют из периферической крови с использованием центрифугирования в градиенте Фиколла. Лимфоциты стимулируют РНА-митогеном (Sigma) в бульоне для культивирования RPMI (Национальный институт здравоохранения, отдел питательных бульонов), который содержит 5% инактивированного AB+сыворотки (Финский красный крест) и L-глутамин. Через 48 часов собирают культуральную среду для определения цитокина из четырех смежных культуральных ячеек, имеющих плотность клеток 200000 клеток на 200 мкл культурального бульона в ячейке, при наличии или в отсутствие митогена. Клетки собирают через 16 часов после добавления тимидина и измеряют включение радиоактивного тимидина в ДНК (имп/мин). В бульонах с клеточной культурой определяют содержание цитокинов IL-4, IL-5, TGF-β1 IFN-γ с использованием метода ELISA.

В ходе наблюдения не обнаруживается каких-либо изменений в содержании IL-4, IL-5 и TGF-β1, секретируемых лимфоцитами. Содержание IFN-γ, секретируемого стимулированными PHA лимфоцитами, значительно повышается в ходе наблюдений (p=0,009, тест Вилкоксона, см. фиг.1). В ходе наблюдений отмечается увеличение как спонтанной, так и РНА-стимулированной пролиферации лимфоцитов (р=0,0002 в обоих случаях, тест Вилкоксона, фиг.1 и 2).

Из результатов исследования видно, что использование синбиотичееского продукта повышает пролиферацию лимфоцитов и секрецию цитокина IFN-γ у испытуемых лиц. IFN-γ принадлежит к группе, известной как Th1-цитокины, которые усиливают цитотоксическую функцию лимфоцитов и являются антагонистами цитокинов IL-4 и TGF-β 1. Сообщалось о низкой секреции IFN-γ у испытуемых, склонных к аллергии. Кроме того, дети с предрасположенностью к атопии и аллергическим реакциям, страдали от медленного нарастания секреции IFN-γ. Значительный стимулирующий эффект комбинаций согласно настоящему изобретению на секрецию IFN-γ подтверждает, таким образом, их эффективность по профилактике и лечении аллергий.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и касается композиции микроорганизмов для использования в качестве пробиотика. Композиция микроорганизмов включает в себя Lactobacillus rhamnosus LGG (ATCC 53103), Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii PJS (DSM 7067) и бифидобактерию. Композиция микроорганизмов включает в себя Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii PJS (DSM 7067) и бифидобактерию, предпочтительно Bifidobacterium infantis Bbi99 (DSM 13692). Указанные композиции используют в пищевой промышленности, фармацевтической промышленности или в производстве оздоравливающих или натуральных продуктов. Изобретение оказывает благоприятный эффект на баланс кишечника человека за счет повышения продукции энтеролактона и снижает нежелательно высокий показатель рН. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл.

Формула