Улучшение целостности интестинального барьера - RU2402240C2

Чертежи

Описание

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу улучшения целостности интестинального барьера и композиции, подходящей для использования в таком способе.

Предшествующий уровень техники

Эпителиальная ткань желудочно-кишечного тракта в норме функционирует как селективный барьер, позволяющий всасывать питательные вещества, электролиты и воду и предохраняющий от воздействия пищевых и микробных агентов, включая пищевые аллергены. Эпителиальная ткань желудочно-кишечного тракта ограничивает прохождение в большой круг кровообращения антигенов, которые могут являться причиной воспалительных реакций, например аллергических реакций. Ввиду роста распространенности аллергии, в частности пищевой аллергии, многие исследовательские группы ведут поиск (профилактических) средств против этих заболеваний.

В ЕР 1272058 описывается композиция, содержащая неусвояемые олигосахариды, улучшающие непроницаемую перегородку, для снижения кишечной проницаемости и снижения аллергических реакций. Композиция может содержать LC-PUFA`s (длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты).

В ЕР 745001 описывается комбинация неусвояемых олигосахаридов и n-3 и n-6 жирных кислот для лечения язвенных колитов.

Usami et al. (Clinical Nutrition 2001, 20(4): 351-359) описывает воздействие эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА) на проницаемость непроницаемой перегородки монослоя клеток желудочно-кишечного тракта. Было установлено, что ЕРА повышает проницаемость, что указывает на непригодность ЕРА для улучшения целостности интестинального барьера.

Композиции, известные из предшествующего уровня техники, не являются оптимально подходящими для улучшения целостности барьера.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к комбинации выбранных длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (LC-PUFA`s) и выбранных олигосахаридов. Настоящая комбинация LC-PUFA`s и олигосахаридов эффективно улучшает целостность барьера посредством синергетического улучшения кишечной проницаемости и слизеобразования и особенно подходит для улучшения целостности барьера у грудных детей.

Неожиданно было обнаружено, что выделенные LC-PUFA`s эффективно снижают эпителиальную параклеточную проницаемость. В противоположность тому, что было опубликовано Usami et al. (Clinical Nutrition 2001, 20(4): 351-359), авторы настоящего изобретения обнаружили, что С₁₈ и С₂₀ полиненасыщенные жирные кислоты, особенно эйкозапентаеновая кислота (ЕРА), докозагексаеновая кислота (DHA) и арахидоновая кислота (APA), способны эффективно сокращать проницаемость непроницаемой кишечной перегородки.

Кроме LC-PUFA`s настоящая композиция содержит олигосахариды. Выбранные олигосахариды улучшают целостность барьера посредством стимуляции слизеобразования, в результате чего увеличивается толщина слоя слизи. Считается, что этот эффект вызван воздействием отдельных олигосахаридов на продуцирование короткоцепочечных жирных кислот (SCFA). Таким образом, при энтеральном введении млекопитающему настоящая комбинация LC-PUFA и неусваиваемых олигосахаридов синергетически улучшает целостность барьера и/или синергетически снижает интестинальную проницаемость посредством одновременного снижения проницаемости непроницаемой перегородки и стимуляции слизеобразования.

В другом аспекте объект настоящего изобретения - композиция - улучшает качество слизистого слоя кишечника. Слизистый слой содержит муцины. Муцины являются гликопротеинами с высокой молекулярной массой, которые синтезируются и секретируются бокаловидными клетками. Они образуют гелеподобный слой на поверхности слизистой оболочки, таким образом, улучшая целостность барьера. Слизистый слой содержит различные типы муцинов, например кислые, нейтральные муцины и сульфированные муцины. Считается, что повышенная гетерогенность слизистого слоя улучшает функциональность барьера.

Предпочтительно настоящая композиция содержит, по крайней мере, два различных олигосахарида, которые влияют на строение слизистой и преимущественно воздействуют на гетерогенность муцина слизистого слоя как непосредственно, так и за счет изменения кишечной флоры. Считается, что каждый отдельный выделенный олигосахарид оказывает различное воздействие на количество и качество слизи. Кроме того, два отдельных олигосахарида способны стимулировать качество слизи, которое находит отражение в степени сульфирования, через их синергетическую стимуляцию продуцирования SCFA. Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что смесь двух различных олигосахаридов согласно настоящему изобретению синергетически стимулирует образование ацетата. Также авторами настоящего изобретения было обнаружено, что слизеобразование зависит от образования ацетата.

Кроме того, композиция предпочтительно улучшена за счет того, что она имеет как длинноцепочечные, так и короткоцепочечные олигосахариды. В результате использования цепочек различной длины происходит стимуляция слизеобразования в различных частях подвздошной и толстой кишки. Считается, что короткоцепочечные олигосахариды (обычно со степенью полимеризации (СП) 2, 3, 4 или 5) стимулируют слизеобразование в проксимальной части толстой кишки и/или дистальной части подвздошной кишки, тогда как длинноцепочечные олигосахариды (предпочтительно со степенью полимеризации более чем от 5 до 60) стимулируют слизеобразование в большей мере в дистальной части толстой кишки.

Таким образом, дальнейшее улучшение может быть достигнуто одновременным применением, по крайней мере, двух различных олигосахаридов как короткоцепочечных, так и длинноцепочечных. Все эти предпочтительные варианты воплощения изобретения вносят вклад в дальнейшее улучшение целостности барьера по всей длине подвздошной кишки и/или толстой кишки.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что EPA, DHA и APA были способны сокращать вредные воздействия интерлейкина 4 (IL-4) на интестинальную проницаемость. IL-4 является цитокином, который секретируется в большом количестве Т-клетками слизистой у определенных пациентов и индуцирует интестинальную проницаемость. Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ лечения и/или предотвращения заболеваний, при которых интестинальная концентрация IL-4 повышена, таких как аллергия, в частности атопический дерматит.

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к питательной композиции, включающей:

а) EPA, DHA и APA, где содержание длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот с 20 и 22 атомами углерода не превышает 15 мас.% от общего содержания жира, и

b) по крайней мере, два отдельных олигосахарида, где два отдельных олигосахарида имеют гомологию моносахаридных единиц менее 90%.

Эта композиция может быть преимущественно использована в способе стимуляции целостности интестинального барьера, указанный способ включает введение указанной композиции млекопитающему.

Полиненасыщенные жирные кислоты

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эйкозапентаеновая кислота (ЕРА, n-3), докозагексаеновая кислота (DHA, n-3) и арахидоновая кислота (ARA, n-6) эффективно снижают проницаемость кишечной перегородки. Таким образом, настоящая композиция, которая особенно подходит для улучшения целостности интестинального барьера, включает ЕРА, DHA и ARA.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что пониженная концентрация LC-PUFA`s эффективно снижает проницаемость перегородки (см. Примеры vs. Usami et al.). Таким образом, содержание LC-PUFA с 20 и 22 атомами углерода в настоящей композиции предпочтительно не превышает 15 мас.% от общего содержания жира, предпочтительно не превышает 10 мас.% от общего содержания жира, еще более предпочтительно не превышает 5 мас.% от общего содержания жира. Предпочтительно настоящая композиция включает, по крайней мере, 0,1 мас.%, предпочтительно, по крайней мере, 0,25 мас.%, более предпочтительно, по крайней мере, 0,5 мас.%, еще более предпочтительно, по крайней мере, 075 мас.% LC-PUFA с 20 и 22 атомами углерода от общего содержания жира. По той же причине содержание ЕРА предпочтительно не превышает 5 мас.% от общего содержания жира, более предпочтительно не превышает 1 мас.% от общего содержания жира, но более предпочтительно не превышает 0,05 мас.% от общего содержания жира, более предпочтительно не превышает 0,1 мас.% от общего содержания жира. Содержание DHA предпочтительно не превышает 5 мас.% от общего содержания жира, более предпочтительно не превышает 1 мас.% от общего содержания жира, но, по крайней мере, не превышает 0,1 мас.% от общего содержания жира. Поскольку было обнаружено, что ARA особенно эффективно сокращает проницаемость перегородки, настоящая композиция включает относительно высокое содержание, предпочтительно, по крайней мере, 1 мас.%, даже более предпочтительно, по крайней мере, 0,25 мас.%, более предпочтительно, по крайней мере, 0,5 мас.% от общего содержания жира. Содержание ARA предпочтительно не превышает 5 мас.% от общего содержания жира, более предпочтительно не превышает 1 мас.% от общего содержания жира. В настоящей энтеральной композиции, содержащей ARA, EPA и DHA, преимущественно введены для баланса воздействия ARA, например, для сокращения потенциального потенцирующего воспаление действия метаболитов ARA. Избыток метаболитов ARA может быть причиной воспаления. Таким образом, настоящая композиция включает ARA, EPA и DHA, где массовое соотношение ARA/DHA предпочтительно составляет приблизительно 0,25, предпочтительно составляет приблизительно 0,5, еще более предпочтительно составляет приблизительно 1. Предпочтительно соотношение составляет ниже 25. Массовое соотношение ARA/DHA предпочтительно составляет от 1 до 100, более предпочтительно составляет от 5 до 20.

Настоящая композиция предпочтительно включает полиненасыщенные жирные кислоты в количестве от 5 до 75 мас.% от общего содержания жира, предпочтительно от 10 до 50 мас.%.

Если настоящую композицию использовать как сухую смесь для грудных детей (например, способ вскармливания грудных детей, указанный способ включает введение настоящей композиции грудному ребенку), содержание, особенно LC-PUFA с 20 и 22 атомами углерода, предпочтительно не превышает 3 мас.% от общего содержания жира, как описано для заменителя грудного человеческого молока, насколько это возможно. По той же причине содержание омега-3 LC-PUFA предпочтительно не превышает 1 мас.% от общего содержания жира; омега-6 LC-PUFA предпочтительно не превышает 2 мас.% от общего содержания жира; содержание ARA (омега-6) предпочтительно составляет менее 1 мас.% от общего содержания жира и/или массовое соотношение EPA/DHA составляет предпочтительно 1 или ниже, более предпочтительно ниже 0,5.

LC-PUFA с 20 и 22 атомами углерода могут находиться как свободные жирные кислоты, в форме триглицерида, в фосфолипидной форме или как смесь одной или нескольких, описанных выше. Настоящая композиция предпочтительно, по крайней мере, включает одну ARA и DHA в фосфолипидной форме.

Также предпочтительно настоящая питательная композиция содержит омега-9 (n-9) жирную кислоту (предпочтительно, олеиновую кислоту, 18:1) для обеспечения достаточной питательности. Предпочтительно настоящая композиция содержит, по крайней мере, 15 мас.% n-9 жирной кислоты от общей массы содержания жирных кислот, более предпочтительно, по крайней мере, 25 мас.%. Содержание n-9 жирных кислот предпочтительно составляет ниже 80 мас.%.

Олигосахариды

Подходящими олигосахаридами согласно настоящему изобретению являются сахариды, которые имеют степень полимеризации (СП), по крайней мере, 2 моносахаридные единицы, которые не переварены или только частично переварены в кишечнике под воздействием кислот или пищеварительных ферментов, присутствующих в верхней части пищеварительного тракта (тонкий кишечник и желудок), но которые ферментируются при помощи кишечной флоры человека. Термин «моносахаридные единицы» относится к единицам, обладающим или имеющим закрытую кольцевую структуру, предпочтительно гексозу, например, в форме пиранозы или фуранозы. Степень полимеризации олигосахарида, как правило, составляет менее 60 моносахаридных единиц, предпочтительно менее 40, еще более предпочтительно менее 20.

Настоящая композиция содержит, по крайней мере, два различных олигосахарида, где гомология олигосахаридов составляет приблизительно менее 90%, предпочтительно менее 50%, еще более предпочтительно менее 25%, наиболее предпочтительно менее 5%. Термин «гомология», использованный в настоящем изобретении, является суммарным процентным соотношением одинаковых моносахаридных единиц в различных олигосахаридах. Например, олигосахарид 1 (OL1), имеющий структуру fruc-fruc-glu-gal, таким образом, содержит 50% fruc, 25% gal и 25% glu. Олигосахарид 2 (OL2), имеющий структуру fruc-fruc-glu, таким образом, содержит 66% fruc и 33% glu. Таким образом, различные олигосахариды имеют гомологию 75% (50% fruc+25% glu).

В предпочтительном варианте воплощения изобретения настоящая композиция содержит галактоолигосахариды и, по крайней мере, один олигосахарид, выбранный из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов и инулина.

Каждый из присутствующих олигосахаридов предпочтительно содержит, по крайней мере, 66%, более предпочтительно, по крайней мере, 90% моносахаридных единиц, выбранных из группы, состоящей из маннозы, арабинозы, фруктозы, фукозы, рамнозы, галактозы, β-D-галактопиранозы, рибозы, глюкозы, ксилозы, уроновой кислоты и их производных, рассчитанных на общее число моносахаридных единиц, содержащихся в них.

Согласно другому варианту воплощения настоящего изобретения, по крайней мере, один из олигосахаридов настоящей композиции выбран из группы, состоящей из фруктанов, фруктоолигосахаридов, перевариваемых декстринов, галактоолигосахаридов (включая трансгалактоолигосахариды), ксилоолигосахаридов, арабиноолигосахаридов, глюкоолигосахаридов, манноолигосахаридов, фукоолигосахаридов, кислых олигосахаридов (см. ниже, например, олигосахариды уроновой кислоты, такие как гидролизат пектина) и их смесей. Предпочтительно настоящая композиция содержит, по крайней мере, один, предпочтительно, по крайней мере, два олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов или инулина, галактоолигосахаридов и гидролизата пектина.

Для улучшения количества и качества слизи настоящая композиция предпочтительно содержит, по крайней мере, один олигосахарид, который содержит, по крайней мере, 66% галактозы или фруктозы в качестве моносахаридной единицы. В предпочтительном варианте изобретения композиция содержит, по крайней мере, один олигосахарид, который содержит, по крайней мере, 66% галактозы в качестве моносахаридной единицы и, по крайней мере, один олигосахарид, который содержит, по крайней мере, 66% фруктозы в качестве моносахаридной единицы. В наиболее предпочтительном варианте воплощения изобретения настоящая композиция содержит галактоолигосахарид и олигосахарид, выбранный из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов и инулина. Фруктоолигосахариды стимулируют продуцирование сульфомуцинов в дистальной части толстого кишечника крыс с флорой человека (Kleessen et al. (2003). Brit J. Nutr 89:597-606) и галактоолигосахариды стимулируют продуцирование кислых муцинов (Meslin et al. Brit. J. Nutr (1993), 69:903-912).

Для дальнейшего улучшения наращивания толщины слизистого слоя по всей поверхности толстой кишки, по крайней мере, 10 мас.% олигосахаридов настоящей композиции имеют CG от 2 до 5 (например, 2, 3, 4 и/или 5) и, по крайней мере, 5 мас.% имеют СП от 10 до 60. Предпочтительно, по крайней мере, 50 мас.%, более предпочтительно, по крайней мере, 75 мас.% олигосахаридов имеют СП от 2 до 9 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и/или 9), потому что предполагается, что эти олигосахариды работают по всей длине подвздошной кишки и в проксимальной и средней частях толстой кишки, и поэтому сокращено массовое процентное соотношение олигосахаридов, которые необходимо ввести в композицию для достижения желаемого эффекта.

Предпочтительны массовые соотношения:

А. (олигосахариды с СП от 2 до 5):(олигосахариды с СП 6, 7, 8 и/или 9)> 1 и

В. (олигосахариды с СП от 10 до 60):(олигосахариды с СП 6, 7, 8 и/или 9)> 1 - оба составляют приблизительно 1.

Предпочтительно оба массовых соотношения составляют приблизительно 2, еще более предпочтительно - около 5.

Для дальнейшего улучшения толщины слизистого слоя и его качества по всей поверхности толстой кишки предпочтительно каждый из, по крайней мере, двух различных олигосахаридов имеет различную длину цепочки, предпочтительно, по крайней мере, 10 мас.% каждого олигосахарида от общей массы соответствующего олигосахарида имеет СП от 2 до 5 (например, 2, 3, 4 и/или 5) и, по крайней мере, 5 мас.% имеют СП от 10 до 60. Предпочтительно, по крайней мере, 50 мас.%, более предпочтительно, по крайней мере, 75 мас.% олигосахаридов от общей массы этих олигосахаридов имеют СП от 2 до 10, потому что предполагается, что эти олигосахариды работают по всей длине тонкой кишки и в проксимальной и средней частях толстой кишки.

Кислые олигосахариды

Для дальнейшего улучшения целостности барьера настоящая композиция предпочтительно включает кислые олигосахариды с СП от 2 до 60. Термин «кислые олигосахариды» относится к олигосахаридам, содержащим, по крайней мере, одну кислотную группу, выбранную из группы, состоящей из N-ацетилнейраминовой кислоты, N-гликоилнейраминовой кислоты, свободной или этерифицированной карбоновой кислоты, сернокислой группы и фосфорнокислой группы. Кислые олигосахариды предпочтительно включают единицы уроновой кислоты (например, полимер уроновой кислоты), более предпочтительно единицы галактуроновой кислоты. Кислый олигосахарид может быть гомологичен или гетерологичен углеводу. Подходящими примерами являются гидролизаты пектина и/или альгинаты. В желудочно-кишечном тракте полимеры уроновой кислоты гидролизованы до мономеров уроновой кислоты, которые стимулируют продуцирование интестинального ацетата, который, в свою очередь, стимулирует секрецию интестинальной слизи (Barcelo et al., Gut 2000; 46:218-224).

Предпочтительно кислый олигосахарид имеет структуру I, приведенную ниже, где конечная гексоза (слева) предпочтительно включает двойную связь. Гексозные единицы отличаются от конечной(ных) гексозной(ных) единиц(ы) и являются предпочтительно единицами уроновой кислоты, еще более предпочтительно галактуроновой кислоты. Карбоксильные группы на этих единицах могут быть свободны или (частично) этерифицированы и предпочтительно, по крайней мере, 10% метилированы (см. ниже).

Структура I: полимер кислого олигосахарида

где R является предпочтительно выбранной из группы, состоящей из водорода, гидроксильной или кислотной группы, предпочтительно гидроксильной; и, по крайней мере, одна выбрана из группы, состоящей из R₂, R₃, R₄ и R₅, представляющей собой N-ацетилнейраминовую кислоту, N-гликоилнейраминовую кислоту, свободную или этерифицированную карбоновую кислоту, сернокислую группу и фосфорнокислую группу, и оставшиеся из R₂, R₃, R₄ и R₅ представляют собой гидроксильную группу и/или водород. Предпочтительно одна выбрана из группы, состоящей из R₂, R₃, R₄ и R₅, представляющей собой N-ацетилнейраминовую кислоту, N-гликоилнейраминовую кислоту, свободную или этерифицированную карбоновую кислоту, сернокислую группу и фосфорнокислую группу, и оставшиеся представляют собой гидроксильную группу и/или водород. Еще более предпочтительно одна выбрана из группы, состоящей из R₂, R₃, R₄ и R_5, представляющей собой свободную или этерифицированную карбоновую кислоту и фосфорнокислую группу, и оставшиеся из R₂, R₃, R₄ и R₅представляют собой гидроксильную группу и/или водород;

n является целым числом и относится к количеству гексозных единиц (смотрите также степень полимеризации ниже), которое может быть любой гексозной единицей. Подходящее n является целым от 1 до 5000, предпочтительно гексозная(ые) единица(ы) являются единицами уроновой кислоты.

Наиболее предпочтительно R₁, R₂, и R₃ представляют собой гидроксильную группу, R₄ представляет собой водород, R₅ представляет собой карбоксильную группу, n является любым числом от 1 до 250, предпочтительно от 1 до 10, и гексозная единица представляет собой галактуроновую кислоту.

Определение, измерение и анализ предпочтительных кислых олигосахаридов, использованных в настоящем способе, даны в более ранних патентных заявках, относящихся к кислым олигосахаридам, например WO 0/160378.

Для дальнейшего улучшения наращивания толщины слизистого слоя по всей поверхности толстой кишки, по крайней мере, 10 мас.% кислых олигосахаридов настоящей композиции имеют СП предпочтительно от 2 до 5 (например, 2, 3, 4 и/или 5) и, по крайней мере, 5 мас.% кислых олигосахаридов имеют СП от 10 до 60. Указанные мас.% исчисляются от общей массы олигосахаридов.

Кислые олигосахариды, использованные в изобретении, являются предпочтительно полученными из пектина, пектата, альгината, хондроитина, гиалуроновых кислот, гепарина, гепарана, бактериальных углеводов, сиалогликанов, фукоидана, фукоолигосахаридов или каррагинана, более предпочтительно из пектина и/или альгината.

Содержание олигосахаридов

Настоящая композиция, как готовая к употреблению жидкая форма, включает от 0,2 до 100 грамм неусвояемых олигосахаридов на литр, более предпочтительно от 0,5 до 50 грамм на литр, еще более предпочтительно от 1 до 25 грамм на литр. Слишком высокое содержание олигосахаридов может являться причиной дискомфорта из-за избыточной ферментации, в то время как очень низкое содержание может привести к недостаточному слизистому слою.

Массовое соотношение, по крайней мере, двух различных олигосахаридов, предпочтительно составляет от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 5. Эти массовые соотношения оптимально стимулируют различные типы слизеобразования в различных местах кишечника.

Согласно изобретению олигосахарид включен в настоящую композицию в количестве, превышающем 0,1 мас.%, предпочтительно превышающем 0,2 мас.%, более предпочтительно превышающем 0,5 мас.% и еще более предпочтительно превышающем 1 мас.% от общей сухой массы композиции. Предпочтительно содержание олигосахарида в настоящей композиции составляет менее 20 мас.%, более предпочтительно менее 10 мас.%, еще более предпочтительно менее 5 мас.%.

Введение нуклеотидов и/или нуклеозидов в настоящую композицию еще более улучшает барьерную функцию слизистой пищеварительного канала, особенно подавляет и/или сокращает влияние бактериальной транслокации и снижает травмируемость кишечника. Таким образом, настоящая композиция также предпочтительно включает нуклеозиды и/или нуклеотиды в количестве от 1 до 500 мг на 100 грамм сухой смеси, еще более предпочтительно от 5 до 100 мг.

Применение

Настоящая композиция может быть использована преимущественно в способе улучшения целостности барьера у млекопитающих, особенно у людей. Также настоящая композиция может быть преимущественно использована в способе лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением целостности барьера, указанный способ включает введение млекопитающему настоящей композиции. Предпочтительно настоящая композиция вводится орально.

Для больных грудных детей настоящая композиция предпочтительно смешана со всеми питательными веществами, включая белки, углеводы и жиры. Настоящая композиция преимущественно вводится грудным детям в возрасте от 0 до 2 лет. Композиция может быть введена пациентам, которые страдают от сниженной целостности барьера, и здоровым пациентам. Настоящая композиция преимущественно применяется в способе для удовлетворения потребности в питательных веществах недоношенных детей (ребенок, рожденный до 37-ой недели беременности).

Также настоящая композиция преимущественно может быть использована в способе лечения и/или профилактики поражений кишечника введением настоящей композиции пациенту перед или после медицинского лечения, которое может явиться причиной поражений кишечника. Таким медицинским лечением может быть хирургическое или энтеральное медицинское лечение (например, антибиотики, анальгетики, NSAID, химиотерапевтические агенты и т.п.).

Также настоящая композиция преимущественно может быть использована для лечения или профилактики заболеваний, при которых нарушение интестинального барьера лежит в основе заболеваний, например в способе лечения или профилактики хронических воспалительных заболеваний, особенно воспалительных заболеваний кишечника (IBD), синдрома раздраженной кишки (IBS), глютеиновой болезни, панкреатитов, гепатитов, артритов или диабетов. Кроме того, изобретение может быть использовано в способе обеспечения питательными веществами пациентов, которые перенесли или переносят абдоминальное хирургическое вмешательство, и пациентов, которые испытывают постоперационную дисфункцию пищеварительного канала, и/или пациентов с недостаточностью питания.

В другом варианте воплощения изобретения настоящая композиция преимущественно вводится пациентам, страдающим синдромом приобретенного иммунодефицита (AIDS), и/или пациентам, которые инфицированы вирусом иммунодефицита человека (HIV), например, в способе лечения AIDS и/или HIV инфекции. Указанный способ включает оральное введение настоящей композиции, предпочтительно в комбинации с питательными веществами, выбранными из группы, состоящей из углеводов, белков и жиров.

Кроме того, изобретение может быть использовано для лечения или профилактики осложнений, вызванных снижением целостности барьера, особенно в способе лечения и/или профилактики диареи, особенно диареи у грудных детей. Ввиду уменьшения возникновения у грудных детей диареи настоящая композиция также может быть преимущественно использована для уменьшения опрелостей.

Настоящая композиция снижает прохождение антигенов, поступающих с пищей, и микробных антигенов, особенно пищевых аллергенов, из желудочно-кишечного тракта в слизистую или большой круг кровообращения и таким образом может быть преимущественно использована в способе лечения или профилактики аллергии и/или аллергической реакции, особенно в способе лечения или профилактики пищевой аллергии, например аллергической реакции, возникающей в результате приема внутрь пищевых продуктов.

Авторами настоящего изобретения также было обнаружено, что EPA, DHA и/или ARA способны снижать воздействие, оказываемое IL-4 на интестинальную проницаемость. Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является способ лечения и/или профилактики заболеваний, при которых повышен уровень интестинальной концентрации IL-4 (например, аллергические заболевания), указанный способ включает введение LC-PUFA, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из EPA, DHA и ARA, предпочтительно в комбинации с настоящими выделенными олигосахаридами. Таким образом, настоящая композиция также может быть преимущественно использована в способе лечения атопического дерматита.

В связи с тем, что у новорожденных детей барьерная функция не полностью развита, настоящая композиция может быть преимущественно введена новорожденным грудным детям, например грудным детям в возрасте от 0 до 6 месяцев. Композиция может быть введена грудному ребенку в форме сухой смеси для детского питания без женского грудного молока или с добавлением женского грудного молока. Таким образом, объектом настоящего изобретения также является сухая смесь для вскармливания, включающая женское грудное молоко и настоящую композицию. Композиции, содержащие женское грудное молоко и настоящую композицию, особенно подходят для вскармливания недоношенных грудных детей.

Предпочтительно настоящая композиция находится в форме расфасованного порошка или в форме расфасованной, готовой к употреблению, сухой смеси. Для предотвращения порчи продукта размер расфасовки, готовой к употреблению сухой смеси, не превышает одной порции, например предпочтительно не превышает 500 мл, и размер расфасовки настоящей композиции в сухой форме предпочтительно не превышает 250 порций. Подходящий размер расфасовки в сухой форме составляет 2000 грамм или менее, предпочтительно 1000 грамм или менее.

В объем настоящего изобретения входят расфасованные продукты, снабженные этикетками, которые в явной или неявной форме указывают потребителю, для чего использовать указанный продукт в соответствии с одним или более указанным выше или ниже целевым назначением. Такие этикетки, например, могут ссылаться на настоящий способ профилактики аллергической реакции на пищевые аллергены посредством включения формулировок, подобных «сокращает пищевую чувствительность», «улучшает интестинальную сопротивляемость», «улучшает пищевую толерантность», или подобные формулировки. Аналогичная ссылка на настоящий способ лечения и/или профилактики аллергии может быть введена терминологией, эквивалентной «улучшает резистентность» или «уменьшает чувствительность».

Рецептура

Было обнаружено, что настоящая композиция может быть преимущественно включена в питание, такое как детское питание и лечебное питание. Такое питание преимущественно включает липиды, белки и углеводы и вводится предпочтительно в жидкой форме. Термин «жидкая форма пищевого продукта», использованный в настоящем изобретении, включает пищевой продукт в сухой форме (например, порошки), который сопровождается инструкцией, в которой описано, каким образом смешивать указанный пищевой продукт в сухой форме с подходящей жидкостью (например, водой).

Таким образом, настоящее изобретение также относится к питательной композиции, которая предпочтительно включает от 5 до 50% энергетических липидов, от 5 до 50% энергетических белков, от 15 до 90% энергетических углеводов и комбинации олигосахаридов и LC-PUFA`s. Предпочтительно настоящая питательная композиция содержит предпочтительно от 10 до 30% энергетических липидов, от 7,5 до 40% энергетических белков и от 25 до 75% энергетических углеводов (% представляет собой относительное количество каждого компонента, участвующего в общей калорийной ценности препарата).

Предпочтительно использована комбинация растительных липидов и, по крайней мере, одного масла, выбранного из группы, состоящей из рыбьего жира и растительного масла, содержащего омега-3, масла из морских водорослей или бактериального масла.

Использованные в питательном препарате белки предпочтительно выбраны из группы, состоящей из не принадлежащих человеку животных белков (таких как молочные белки, белки мяса и белок яиц), растительные белки (такие как соевые белки, белки пшеницы, белки риса и белки гороха), свободные аминокислоты и их смеси. Коровье молоко является источником азота, особенно белки коровьего молока, особенно предпочтительны такие белки, как казеин и белки молочной сыворотки.

В состав питательной смеси может быть введен источник неусвояемых углеводов. Он предпочтительно обеспечивает приблизительно от 40% до 80% энергетической ценности питательной композиции. Может быть использован любой подходящий (источник) углеводов, например сахароза, лактоза, глюкоза, фруктоза, сухая кукурузная патока, мальтодекстрины и их смеси.

Настоящая композиция предпочтительно используется как детская сухая смесь и предпочтительно обеспечивает от 7,5 до 12,5% энергетических белков от 40 до 55% энергетических углеводов и от 35 до 50% энергетических жиров. Настоящая композиция подходит для использования в качестве композиции для уменьшения аллергической реакции у грудных детей, белок детской сухой смеси предпочтительно выбран из группы, состоящей из гидролизованного молочного белка (например, гидролизованного казеина или гидролизованного сывороточного белка), растительного белка и/или аминокислот. Применение этих белков дополнительно снижает аллергические реакции у грудных детей.

Нарушения стула (например, твердый стул, стул с недостаточным объемом, диарея) являются основной проблемой большинства детей и больных, вынужденных принимать жидкую пищу. Было установлено, что проблемы со стулом могут быть уменьшены введением настоящих олигосахаридов в жидкую пищу, которая имеет осмоляльность (осмотическую концентрацию раствора) от 50 до 500 мосм/кг, более предпочтительно от 100 до 400 мосм/кг.

Принимая во внимание вышесказанное, важно отметить, что жидкая форма пищевого продукта не обладает излишней калорийностью, однако в то же время обеспечивает достаточную калорийность для питания субъекта. Таким образом, калорийность жидкой формы пищевого продукта составляет от 0,1 до 2,5 ккал/мл, еще более предпочтительно калорийность составляет от 0,5 до 1,5 ккал/мл, наиболее предпочтительно от 0,6 до 0,8 ккал/мл.

Примеры

Пример 1: влияние LC-PUFA на целостность барьера

Монослои (МС) интестинальных эпителиальных клеточных линий Т84 (American Type Culture Collection (ATTC), Manassas, USA) были культивированы на хорошо пропускающих фильтрах (Cornind, Costar BV, The Netherlands), позволяющих проводить испытание как образцов слизистой, так и серозных образцов и стимуляцию интестинальных эпителиальных клеток человека. Через две недели после слияния монослои были инкубированы в люминальной камере с полиненасыщенными жирными кислотами ARA (арахидоновая кислота; 5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота), DHA (цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота), EPA (эйкозапентаеновая кислота) или контроль - с пальмитиновой кислотой (С 16:0) (Palm) (Sigma, St. Louis, USA). Дальнейшая процедура была изменена имитацией введения in vivo питательных компонентов. Клетки были инкубированы с ARA, DHA, EPA или пальмитиновой кислотой в течение 0, 24, 48 и 72 часов в различных концентрациях (10 мкМ и 100 мкМ). Эксперименты были проведены с целью оценки базисной целостности барьера. Эпителиальная барьерная функция была определена посредством измерения трансэпителиальной резистентности (TER, Ω см²), измеренной с помощью эпителиального вольтметра (EVOM; World Precision Instruments, Germany) и проницаемости для 4 кДа FITC-декстрана (маркер параклеточной проницаемости, Sigma, USA). Резистентность (эпителиальная проницаемость для 4 кДа FITC-декстрана) была определена, как указанно далее. Перед добавлением декстрана среда была обновлена культуральной средой без фенолового красного в течение одного часа с последующим введением 5 мкл (исходный раствор 100 мг/мл) 4 кДа FITC-декстрана в люминальную камеру. После инкубации 100 мкл был взят образец из серозной камеры и измерен с помощью флюоресцентного сигнала при излучении длины волны 485 нм и эмиссии 520 нм (FLUOstar Galaxy®, BMG Labtechnologies, USA). Добавление FITC-декстрана было рассчитано как пмоль FITC-декстрана /см²/час. Статистический анализ был проведен с использованием ANOVA (SPSS version 10).

Результаты непосредственного воздействия жирных кислот (100 мкМ) на целостность барьера после 72 часов инкубации приведены в Таблице 1. Таблица 1 демонстрирует, что LC-PUFA`s ARA, EPA и DHA уменьшают молекулярный поток и улучшают эпителиальную резистентность. Наоборот, контрольные эксперименты показали, что пальмитиновая кислота обладает противоположным воздействием, а именно нарушает целостность барьера. Эти результаты демонстрируют преимущества использования EPA, DHA и ARA и особенно ARA в композиции согласно настоящему изобретению для использования в способе согласно настоящему изобретению, например в способе улучшения целостности барьера. Кроме того, эти результаты подтверждают синергетический эффект настоящей комбинации жирных кислот и неусвояемых олигосахаридов.

Фигура 1 демонстрирует время и дозозависимые эффекты (10 мкМ и 100 мкМ) различных жирных кислот (пальмитиновая кислота, DHA, GLA и AA) на базисную целостность барьера (TER). Фигура 1 демонстрирует, что PUFA`s АА, DHA и GLA улучшают эпителиальную целостность барьера, что выражается в повышении резистентности (TER). Эти результаты демонстрируют преимущества использования EPA, DHA, GLA и ARA и особенно ARA в композиции согласно настоящему изобретению для использования в способе согласно настоящему изобретению, например в способе улучшения целостности барьера. Кроме того, эти результаты подтверждают синергетический эффект настоящей комбинации жирных кислот и неусвояемых олигосахаридов.

Пример 2: влияние LC-PUFA на разрушение барьера,

связанное с IL-4

Монослои (МС) интестинальных эпителиальных клеточных линий Т84 (ATTC, USA) были культивированы на хорошо пропускающих фильтрах (Cornind, Costar BV, The Netherlands), позволяющих проводить испытание как образцов слизистой, так и серозных образцов и стимуляцию интестинальных эпителиальных клеток человека. Через две недели после слияния монослои были инкубированы в присутствии IL-4 (2 нг/мл, серозная камера, Sigma, USA) с или без полиненасыщенных жирных кислот ARA, DHA, GLA, EPA, или контроль с пальмитиновой кислотой (10 мкМ или 100 мкМ, слизистая камера, Sigma, St. Louis, USA). Клетки были предварительно инкубированы с ARA, DHA, EPA или пальмитиновой кислотой в течение 48 часов перед инкубацией с IL-4. Совместная инкубация PUFA`s и пальмитиновой кислоты с IL-4 длилась в течение следующих 48 часов; в то время как культуральная среда и добавки заменялись каждые 24 часа. Эпителиальная барьерная функция была определена посредством измерения трансэпителиальной резистентности (TER) и проницаемость была определена, как было описано в Примере 1. Статистическая оценка была проведена, как описано в Примере 1.

Результаты влияния ARA, DHA, EPA и пальмитиновой кислоты (100 мкМ) на разрушение барьера, связанное с IL-4, приведены в Таблице 2. Таблица 2 демонстрирует, что LC-PUFA`s ARA, EPA и DHA подавляют возрастание потока, вызванного IL-4. Наоборот, контрольные эксперименты показали, что пальмитиновая кислота обладает губительным эффектом и (но) уменьшает разрушение барьера по сравнению с контролем. Эти результаты демонстрируют преимущества использования ARA, DHA и EPA в лечебных и детских питательных смесях для профилактики или снижения разрушения барьера, связанного с IL-4, например, в случае возникновения пищевой аллергии или аллергии на коровье молоко. Кроме того, эти результаты подтверждают синергетический эффект настоящей комбинации жирных кислот и неусвояемых олигосахаридов.

Фигура 2 демонстрирует время и дозозависимые эффекты (10 мкМ и 100 мкМ) протективного воздействия различных FA's (пальмитиновая кислота, DHA, GLA и AA) на разрушение барьера, связанное с IL-4 (Flux). Фигура 2 демонстрирует, что АRА, DHA и GLA защищают от разрушения барьера, связанного с IL-4, что выражается в понижении 4 кДа потока декстрана. Эти результаты демонстрируют преимущества использования ARA, DHA и GLA в лечебных и детских питательных смесях для профилактики и уменьшения разрушения барьера, связанного с IL-4, например, в случае возникновения пищевой аллергии или аллергии на коровье молоко. Кроме того, эти результаты подтверждают синергетический эффект настоящей комбинации жирных кислот и неусвояемых олигосахаридов.

Пример 3: влияние олигосахаридов на образование ацетата

Микроорганизмы были получены из свежих фекалий искусственно вскармливаемых детей. Свежий фекальный материал был получен от детей в возрасте от 1 до 4 месяцев, он был промыт и помещен в консервирующую среду на 2 часа. В качестве субстрата были использованы смеси пребиотиков: TOS; смесь TOS/инулин (НР) в соотношении 9/1 (масса/масса); инулин; смесь олигофруктоза(OS)/инулин в соотношении 1/1 (масса/масса) или без пребиотиков (blanc). Трансгалактоолигосахариды (TOS) были получены от Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, The Netherlands, и включены в качестве неусвояемых олигосахаридов: 33 мас.% дисахаридов, 39 мас.% трисахаридов, 18 мас.% тетрасахаридов, 7 мас.% пентасахаридов и 3 мас.% гекса-, гепта- еноктасахаридов. Инулин (НР) Orafti active food ingredients, Tienen, Belgium, например, Raftiline HP®, с числом СП 23. Среда: среда McBain & MacFarlane, забуференная пептонной водой 3,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, муцин (щеточная кайма) 0,8 г/л, триптон 3,0 г/л, L-Cysteine-HCl 0,4 г/л, соли желчных кислот 0,05 г/л, K₂HPO₄·3H₂O 2,6 г/л, NaHCO₃ 0,2 г/л, NaCl 4,5 г/л, MgSO₄· 7H₂O 0,5 г/л, CaC_l2 0,228 г/л, FeSO₄·7H₂O 0,005 г/л. Сосуды Скотта на 500 мл были наполнены средой и стерилизованы в течение 15 минут при 121°С. Буферная среда: K₂HPO₄·3H₂O 2,6 г/л, NaHCO₃ 0,2 г/л, NaCl 4,5 г/л, MgSO₄·7H₂O 0,5 г/л, CaC_l2 0,228 г/л, FeSO₄·7H₂O 0,005 г/л. Уровень pH приведен к 6,3±0,1 с K₂HPO₄·3H₂O или NaHCO₃. Сосуды Скотта на 500 мл были наполнены средой и стерилизованы в течение 15 минут при 121°С.

Консервирующая среда: забуференный пептон 20,0 г/л, L-Cysteine-HCl 0,5 г/л, меркаптоуксусный натрий 0,5 г/л, 1 таблетка резазурина на литр. Уровень pH приведен к 6,7±0,1 с 1М NaHCO или HCl. Доведена до кипения в микроволновой печи. Емкости для сыворотки были наполнены 25 мл среды и стерилизованы в течение 15 минут при 121°С.

Свежие фекальные образцы были смешаны с консервирующей средой и сохранены в течение нескольких часов при температуре 4°С. Консервированный раствор фекалий был центрифугирован при 13,000 об/мин в течение 15 минут, супернатант был удален и фекалии смешали со средой McBain & MacFarlane в массовом соотношении 1:5. 3 мл этой фекальной суспензии были смешаны с 85 мг глюкозы или пребиотика или без добавления последних (blanc) в емкость и тщательно перемешаны. Образец t=0 был удален (0,5 мл). 2,5 мл полученной в результате суспензии были помещены в диализную камеру в 60 миллилитровой емкости, наполненной 60 мл буферной средой. Емкость была плотно закупорена и инкубирована при температуре 37°С. Образцы были извлечены из диализной камеры (0,2 мл) или диализного буфера (1 мл) с помощью шприца для подкожного введения после 3, 24 и 48 часов и немедленно помещены на лед для остановки ферментации. Эксперимент был проведен с использованием следующих образцов:

1) 85 мг TOS,

2) 85 мг инулина,

3) 85 мг TOS/85 мг инулина в соотношении 9/1 (масса/масса) и

4) 85 мг OS/ инулина в соотношении 1/1 (масса/масса).

SCFA (ацетат, пропионат, бутират) были подвергнуты количественному анализу с использованием газового хроматографа (GC) Varian 3800 (Varian Inc., Walnut Greek, USA), оснащенного плазменным ионизатором. Образец 0,5 мкл был введен при 80°С в колонну (Stabilwax, 15х0,53 мм, толщина слоя 1,00 мкм, Restek Co., USA) с использованием гелия в качестве газа-носителя (3,0 фунт/кв. дюйм). После введения образца термостат был нагрет до температуры 160°С со скоростью 16°С/мин с последующим нагреванием до температуры 220°С со скоростью 20°С/мин и затем выдержан при температуре 220°С в течение 1,5 минут. Температура инжектора и детектора составила 200°С. В качестве внутреннего стандарта была использована 2-этилмасляная кислота.

Фигура 3 демонстрирует абсолютный (Фигура 3а) и относительный (Фигура 3b) профиль SCFA, полученный в результате ферментации различных олигосахаридов. Фигура 3а демонстрирует, что смесь двух различных олигосахаридов (TOS/инулин), где два различных олигосахарида имеют гомологию моносахаридных единиц менее 90 и различную длину цепи, значительно и синергетически повышает количество SCFA (особенно ацетата) на грамм волокон по отношению к однокомпонентному веществу. Фигура 3b демонстрирует, что введение комбинации TOS/инулин способствует более высокой доле полезного ацетата (В). Образование ацетата in vivo ведет к улучшению продуцирования муцина бокаловидными клетками и показателя толщины интестинального слизистого слоя (см. Пример 4). Эти результаты демонстрируют преимущества использования настоящей композиции.

Пример 4: влияние SCFA на слизеобразование

Монослои интестинальных эпителиальных клеточных линий Т84 (ATTC, USA) были культивированы на 24- или 96-луночных пластинках для выращивания культур тканей (Corning B.V.). Т84 были инкубированы с ацетатом короткоцепочечных жирных кислот пропионатом и бутиратом (SCFA, Merck, USA) в течение 24 часов в концентрации 0,025-4,0 мМ. Были собраны супернатанты и/или клетки и определена экспрессия MUC-2 (муцин). Для определения экспрессии культур клеток MUC-2 применяли способ дот-блот анализа, так как муцины являются очень крупными гликопротеинами (более 500 кДа), что делает затруднительным проведение анализа способом вестернблоттинга. Способ был подтвержден применением преиммунной сыворотки (негативно окрашенные Т84), CCD-18Co (АТСС, USA) клеток негативного контроля и альбумина бычьей сыворотки (BSA). Образцы клеток были собраны в Laemmli (буфер для выделения белка), и определение белка было проведено с использованием анализа методом микропротеина (Biorad, USA) согласно протоколу обработки. Образцы (0,3-0,7-1,0 мкг/2 мкл) на нитроцеллюлозных мембранах были обозначены точками (Schleicher & Schuell, Germany). Мембраны были заблокированы в TBST/5% Protivar (Nutricia, The Netherlands) с последующим инкубированием в течение 1 часа с антителом против MUC-2 (любезно подарено Dr. Einerhand, Erasmus University, Rotterdam, The Netherlands). После промывки блоты были инкубированы c антикроличьей HRP козы (Santacruz Biotechnology, USA) и для детектирования субстрата был использован ECL (Roche Diagnostics, The Netherlands). Денситометрия была проведена с использованием Lumi-Imager (Boehringer Mannheim B.V. The Netherlands), и сигнал был выражен в световых единицах (BLU). В BLU`s также были выражены контрольные инкубации (%BLU). Для сравнения стимулирующего воздействия SCFA на экспрессию MUC-2 были измерены уровни экспрессии MUC-2.

Фигура 4 демонстрирует различные воздействия SCFA (ацетат, пропионат, бутират) на экспрессию MUC-2 в интестинальных эпителиальных клетках (МС Т84) и совместно культивированных мезенхимных эпителиальных клетках (СС Т84). Также Фигура 4 демонстрирует, что ацетат оказывает более сильное воздействие на стимуляцию экспрессии MUC-2 (слизеобразование) по сравнению с пропионатом и бутиратом. Таким образом, настоящая комбинация олигосахаридов, которая продемонстрировала повышение выработки ацетата (см. Пример 3), особенно эффективна для стимуляции слизеобразования и может быть преимущественно использована в способе стимуляции целостности барьера.

Пример 5: рецептура I детской молочной смеси

Ингредиенты (на 1 литр), калорийность 672 ккал: белок 15 г; соотношение сыворотка:казеин 60:40; жир 36 г; углеводы 72 г; витамин А 750 RE; смесь натуральных каротинов 400 МЕ; витамин D 10,6 мкг; витамин F 7,4 мкг; витамин К 67,0 мкг; витамин В₁ (тиамин) 1000 мкг; витамин В₂ (рибофлавин) 1500 мкг; витамин В₆ (пиридоксин) 600 мкг; витамин В₁₂ (цианкобалaмин) 2,0 мкг; ниацин 9,0 мкг; фолиевая кислота 80 мкг; пантотеновая кислота 3000 мкг; биотин 90 мкг; витамин С (аскорбиновая кислота) 90 мг; холин 100 мг; инозитол 33 мг; кальций 460 мг; фосфор 333 мг; магний 64 мг; железо 8,0 мг; цинк 6,0 мг; марганец 50 мкг; медь 500 мкг; йод 100 мкг; натрий 160 мг; калий 650 мг; хлор 433 мг и селен 14 мкг, где содержание жира обеспечено включением 3 г рыбьего жира и 3 г масла арахидоновой кислоты (DSM Food Specialties, Delft, Netherlands), кроме того, включено 4 г трансгалактоолигосахаридов Elix`or™ (Borculo Domo Ingredients, Netherlands) и 4 г Raftiline™ (Orafti Active Food Ingredients, Belgium).

Дополнительный пример

Питательная композиция:

Применение композиции

Указанная композиция пригодна для стимуляции целостности интестинального барьера у субъекта.

Композиция предназначена для применения при лечении или для предупреждения аллергии, диареи и хронических воспалительных заболеваний.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Для стимуляции целостности интестинального барьера используют питательную композицию, включающую эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА), докозагексаеновую кислоту (DHA) и арахидоновую кислоту (ARA), по крайней мере, два различных олигосахарида с гомологией в моносахаридных единицах менее 90% и необязательно кислые олигосахариды, а также необязательно нуклеозиды и/или нуклеотиды в количестве от 1 до 500 мг на 100 г сухого состава. Содержание длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот с 20 и 22 атомами углерода не превышает 15 мас.% от общего содержания жира. Кислые олигосахариды включают, по меньшей мере, одну кислотную группу, выбранную из группы, состоящей из N-ацетилнейраминовой кислоты, N-гликолоилнейраминовой кислоты, свободной или этерифицированной карбоновой кислоты, группы серной кислоты и группы фосфорной кислоты. Указанную композицию используют для изготовления композиции для введения младенцам в возрасте от 0 до 2 лет. Также указанную композицию применяют для изготовления лекарственных средств, используемых в способах лечения или предотвращения аллергии или диареи, или хронических воспалительных заболеваний. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

Формула