Способы приготовления интенсивных подсластителей - RU2767792C2

Чертежи

Показать все 47 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам, системам и композициям для получения соединений со сладким вкусом, а также композиций, содержащих соединения со сладким вкусом.

Предшествующий уровень техники

Система вкуса обеспечивает сенсорную информацию о химическом составе внешнего мира. Вкусовая трансдукция является одной из самых сложных форм вызванных химическими веществами ощущений у животных. Вкусовая сигнальная система встречается по всему животному царству, от простых многоклеточных до самых сложных позвоночных. Считается, что млекопитающие имеют пять основных вкусовых модальностей: сладкий, горький, кислый, соленый и умами (вкус глутамата натрия, или пикантный вкус).

В течение столетий различные природные и неприродные композиции и/или соединения добавляли к потребляемым композициям, включая продукты питания и напитки, и/или перорально вводимым лекарственным композициям для улучшения их вкуса. Хотя давно известно, что существует только несколько основных типов «вкусов», биологическая и биохимическая основа восприятия вкуса была плохо понята, и большинство улучшающих вкус или модифицирующих вкус веществ были обнаружены в основном с помощью простых процессов проб и ошибок.

Что касается сладкого вкуса, диабет и сердечно - сосудистые заболевания являются проблемами со здоровьем, рост которых отмечается во всем мире, но в Соединенных Штатах растет угрожающими темпами. Сахар и калории являются ключевыми компонентами, которые могут быть ограничены для оказания положительного пищевого воздействия на здоровье. Интенсивные подсластители могут обеспечить сладость сахара с различными вкусовыми качествами. Поскольку они во много раз слаще сахара, для его замены требуется гораздо меньше подсластителя.

Интенсивные подсластители имеют широкий спектр химически отличных структур и, следовательно, обладают различными свойствами, такими как, без ограничения указанным, запах, вкус, вкусовое впечатление и послевкусие. Хорошо известно, что эти свойства, в частности вкус и послевкусие, изменяются во время дегустации, так что каждый временной профиль зависит от подсластителя.

Недавно был достигнут значительный прогресс в определении полезных природных вкусовых агентов, таких как, например, подсластители, такие как сахароза, фруктоза, глюкоза, эритрит, изомальт, лактит, маннит, сорбит, ксилит, некоторые известные природные терпеноиды, флавоноиды или белковые подсластители. См., например, Kinghom, et al., “Noncariogenic Intense Natural Sweeteners,” Med. Res. Rev. 18 (5) 347-360 (1998) (где обсуждаются обнаруженные природные материалы, которые намного более сладкие, чем обычные натуральные подсластители, такие как сахароза, фруктоза и т.п.). Аналогичным образом, в последнее время достигнут прогресс в идентификации и коммерциализации новых искусственных подсластителей, таких как аспартам, сахарин, ацесульфам-К, цикламат, сукралоза и т.п. См., например, Ager, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37, 1802-1817 (1998). Все содержание источников, указанных выше, полностью включено в настоящий документ ссылкой.

Подсластители, такие как сахарин и калиевая соль 6-метил-1,2,3-оксатиазин-4 (3H) -он-2,2-диоксида (ацесульфам калия), обычно характеризуются как имеющие горькие и/или металлические привкусы. Утверждается, что продукты, приготовленные с 2,4-дигидроксибензойной кислотой, проявляют пониженное нежелательное послевкусие, связанное с подсластителями, и делают это при концентрациях ниже тех концентраций, при которых ощущаются их собственные вкусы. Также сообщается, что интенсивные подсластители, такие как сукралоза и аспартам, имеют проблемы с доставкой сладости, то есть с задержкой наступления ощущения сладости и ее поддержания. См. S. G. Wiet, et al., J. Food Sci., 58(3):599-602, 666 (1993).

Существует потребность в новых подслащивающих соединениях, усилителях сладкого вкуса и композициях, содержащих такие соединения и усилители, обладающих улучшенными вкусом и характеристиками доставки. Кроме того, существует потребность в пищевых продуктах, содержащих новые подслащивающие соединения и/или усилители сладкого вкуса с такими желательными характеристиками.

Сущность изобретения

Предлагаемое в данном документе включает способ получения Соединения 1, имеющего структуру:

В некоторых воплощениях способ включает контакт могрозида IIIe с первым ферментом, способным катализировать получение соединения 1, из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях контакт могрозида III_E с первым ферментом включает контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая включает первый ген, кодирующий первый фермент. Первый ген может быть, например, гетерологичным по отношению к рекомбинантной клетке-хозяину.

В некоторых воплощениях Могрозид IIIe контактирует с первым ферментом в рекомбинантной клетке-хозяине, которая содержит первый полинуклеотид, кодирующий первый фермент. Могрозид III_E может, например, предоставлен рекомбинантной клетке, присутствовать в рекомбинантной клетке-хозяине, получен с помощью рекомбинантной клетки-хозяина, или любой их комбинации. В некоторых воплощениях способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируется первый фермент. Первый фермент может быть, например, одним или несколькими из числа UDP-гликозилтрансфераз, цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз (ЦГТаза), гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой ЦГТазу. В некоторых воплощениях ЦГТаза включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательностью любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях ЦГТаза включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях ЦГТаза состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154.

В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой декстрансукразу. Например, декстрансукраза может включать аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156, 159-162 и 896. В некоторых воплощениях декстрансукраза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 104, 105, 157, 158 и 895.

В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой трансглюкозидазу. Например, трансглюкозидаза может включать аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательностью любой из SEQ ID NO: 163-291 и 723. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 163-291 и 723.

В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой бета-глюкозидазу. Например, бета-глюкозидаза может включать аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей последовательности, указанной в любом из SEQ ID NO: 102, 292, 354-374 и 678-741.

В некоторых воплощениях способ включает контакт могрозида II_A с ферментом, способным катализировать выработку могрозида IIIE из могрозида IIA. В некоторых воплощениях контакт могрозида IIA с ферментом включает контакт могрозида IIA с рекомбинантной клеткой-хозяином для продуцирования могрозида IIIE_, и в котором рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий фермент, способный катализировать выработку могрозида IIIE из могрозида IIA. Могрозид IIA может быть, например, предоставлен рекомбинантной клетке-хозяину, продуцироваться рекомбинантной клеткой-хозяином, присутствовать в рекомбинантной клетке-хозяине, или представлен в любой их комбинации. Фермент, способный катализировать выработку могрозида IIIE из могрозида IIA может быть, например, один или несколько из UDP гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой уридин дифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). Например, UGT может представлять собой UGT73C3 (SEQ ID NO: 4), UGT73C6 (SEQ ID NO: 5), UGT 85C2 (SEQ ID NO: 6), UGT73C5 (SEQ ID NO: 7), UGT73E1 (SEQ ID NO: 8), UGT98 (SEQ ID NO: 9 или 407), UGT1576 (SEQ ID NO: 15), UGT SK98 (SEQ ID NO: 16), UGT430 (SEQ ID NO: 17), UGT1697 (SEQ ID NO: 18), UGT11789 (SEQ ID NO: 19). В некоторых воплощениях UGT включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 4-9, 15-19, 125, 126, 128, 129, 293-307, 407, 409, 411, 413, 439, 441 и 444. В некоторых воплощениях UGT кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из последовательностей, указанных в UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13), UGT10391 (SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 116-124, 127, 130, 408, 410, 412, 414, 440, 442, 443 и 445.

В некоторых воплощениях способ включает контакт могрола с одним или более ферментов, которые способны катализировать выработку могрозида IIIE и/или IIE из могрола. В некоторых воплощениях контакт могрола с одним или несколькими ферментами включает контакт могрола с рекомбинантной клеткой-хозяином для получения могрозида IIIE и/или могрозида IIE, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать выработку Могрозида IIIE и/или Могрозида IIE из Могрола. Могрол может быть, например, предоставлен рекомбинантной клетке - хозяину, получен с помощью рекомбинантной клетки-хозяина, присутствовать в рекомбинантной клетке-хозяине, или любой их комбинации.

В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один из одного или нескольких ферментов, способных катализировать выработку могрозида IIE и/или могрозида IIIE из могрола содержит последовательность, имеющую, или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из последовательностей, указанных в или закодированных последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из последовательностей в SEQ ID NO: 315, 316, 420 422, 424, 426, 430, 431, 446, 871, 845-949 и 951-1012. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов, способных катализировать выработку могрозида IIIE из могрола, включают одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях, по меньшей мере, один из одного или нескольких ферментов представляет собой уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). Например, UGT может представлять собой UGT73C3, UGT73C6, 85C2, UGT73C5, UGT73E1, UGT98, UGT1495, UGT1817, UGT5914, UGT8468, UGT10391, UGT1576, UGT SK98, UGT119 или UGT169, UGT119, UGT119 или UGT119, имеющие, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 4- 9, 15-19, 125, 126, 128, 129, 293-307, 405, 406, 407, 409, 411, 413, 439, 441 и 444.

В некоторых воплощениях способ включает контакт соединения могрозида с одним или более ферментами, способными катализировать выработку могрозида IIIE из соединения могрозида для получения могрозида IIIe, в котором соединение могрозида представляет собой одно или более из числа могрозида IA1, могрозида IE1 могрозида IIA1, могрозида IIE, могрозида IIA, могрозида IIIA1, могрозида IIIA2, могрозида III, могрозида IV, могрозида IVA, могрозида V и сиаменозида. В некоторых воплощениях контакт соединения могрозида с одним или несколькими ферментами, способными катализировать продукт могрозида IIIE из соединения могрозидов, включает контакт соединения могрозида с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит один или несколько генов, кодирующих один или более ферментов, способных катализировать выработку могрозида IIIE из соединения могрозида. Соединение могрозида может быть, например, предоставлено рекомбинантной клетке-хозяину, продуцировано рекомбинантной клеткой-хозяином, присутствовать в рекомбинантной клетке-хозяине, и любой их комбинации. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов, способных катализировать продуцирование могрозида IIIE из соединения могрозидов, включают одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях изобретения соединение могрозида представляет собой Могрозид IIE.

В некоторых воплощениях один или несколько ферментов, способных катализировать продуцирование могрозида IIIE из соединения могрозида включает аминокислотную последовательность, имеющую, или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 106-109, 147, 154, 163-303, 405 411, 354-405, 447-723, 770, 776 и 782. В некоторых воплощениях изобретения соединение могрозида представляет собой моргрозид IIA или Могрозид IIE. В некоторых воплощениях контакт с одним или несколькими ферментами приводит к образованию одного или нескольких из числа могрозида IIIA, могрозида IVE и могрозида V.

В некоторых воплощениях один или несколько ферментов включает аминокислоты имеющие, или имеющие, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 304, 405, 411, 872, 874, 978, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 8 92, 894 и 896. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов кодируются последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми два из этих значений идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 305, 406, 412, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893 и 895.

В некоторых воплощениях способ включает контакт могрозида IA1 с рекомбинантной клеткой-хозяином, в которой рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий фермент UGT98 или UGT SK98. В некоторых воплощениях фермент UGT98 или UGT SK98 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 9, 407, 16 или 306. В некоторых воплощениях UGT98 кодируется последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 307. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию могрозида IIA в клетке.

В некоторых воплощениях способ включает контакт 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол с рекомбинантной клеткой-хозяином, в котором рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий эпоксидгидролазу. В некоторых воплощениях 11-гидрокси-24,25 эпоксикукурбитадиенол предоставляется рекомбинантной клетке-хозяину, присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине, продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином, и любой их комбинацией.

В некоторых воплощениях способ включает контакт 11-гидрокси-кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, в котором рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий цитохром Р450 или эпоксидгидролазу. 11-гидроксикукурбитадиенол может быть предоставлен, продуцирован и/или присутствовать в рекомбинантной клетке-хозяине.

В некоторых воплощениях способ включает контакт 3,24,25-триокси кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, в котором рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий цитохром Р450. В некоторых воплощениях 3,24,25-тригидрокси-кукурбитадиенол предоставляется рекомбинантной клетке-хозяину, присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине, продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином или любой их комбинацией. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию могрола в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях цитохром P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 20, 49, 308, 315, 430, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 889 и 892; или цитохром P450 кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 890 и 891.

В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, или имеющий, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 21-30 и 309-314; или эпоксидгидролаза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 114 и 115.

В некоторых воплощениях способ включает контакт кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, в котором рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий цитохром Р450. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению 11-гидроксикукурбитадиенола. В некоторых воплощениях кукурбитадиенол предоставляется, продуцируется в и/или присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях цитохром P450 кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889 и 892. В некоторых воплощениях цитохром P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 20, 31, 49, 308, 315, 430, 872, 874, 876, 878, 880, 88 2, 884, 886, 888, 890 и 891. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт одного или нескольких из числа 2,3-оксидосквалена, диоксидосквалена и диэпоксисквалена с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы.

В некоторых воплощениях способ включает контакт промежуточного продукта могрозида с рекомбинантной клеткой-хозяином, в которой рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий полипептид, обладающей активностью кукурбитадиенолсинтазы. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, представляет собой слитый белок, содержащий один или несколько слитых доменов, слитых с кукурбитадиенолсинтазой. В некоторых воплощениях слитый белок содержит слитый домен, слитый с N-концом, C-концом или обеими сторонами кукурбитадиенолсинтазы. В некоторых воплощениях слитый домен имеет длину от около 3 до около 1000 аминокислот. В некоторых воплощениях слитый домен имеет длину от около 5 до около 50 аминокислот. В некоторых воплощениях слитый домен представляет собой существенную часть или всю последовательность функционального белка.

В некоторых воплощениях слитый полипептид, имеющий активность кукурбитадиенолсинтазы, включает аминокислотную последовательность, имеющую, или имеющий, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 417, 420, 422, 4 24, 426, 446, 902, 904 или 906. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905.

В некоторых воплощениях, контакт приводит к выработке кукурбитадиенола. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален и диэпоксисквален поставляются, продуцируются и/или присутствуют в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях один или несколько из 2,3-оксидосквалена и диэпоксисквалена получают ферментом, содержащим последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99 %, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 898 или 900. В некоторых воплощениях получение одного или нескольких из числа 2,3-оксидосквалена, диэпоксисквалена и диэпоксисквалена включает фермент, кодируемый нуклеотидной последовательностью, имеющий или имеющий, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 897 или 899. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327, 329-333, 420 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях полипептид, содержащий активность кукурбитадиенолсинтазы, кодируется геном, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905.

В некоторых воплощениях, 11-гидрокси-кукурбитадиенол предоставляется, продуцируется, и/или присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях 11-гидроксикукурбитадиенол экспрессируется в клетке (например, рекомбинантной клетке-хозяине), содержащей ген, кодирующий белок CYP87D18 и/или белок SgCPR. В некоторых воплощениях белок CYP87D18 или SgCPR включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 872 или 874. В некоторых воплощениях белок CYP87D18 или SgCPR кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 871 или 873.

В некоторых воплощениях способ включает контакт сквален с рекомбинантной клетки-хозяина, в которой рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий скваленэпоксидазы. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению 2,3-оксидосквалена. В некоторых воплощениях сквален предоставляется, продуцируется в и/или присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 или 335. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 335.

В некоторых воплощениях способ включает контакт фарнезилпирофосфата с рекомбинантной клеткой-хозяином, в котором рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий скваленсинтазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к образованию сквалена. В некоторых воплощениях фарнезилпирофосфат предоставляется, продуцируется в и/или присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях скваленсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 69 и 336. В некоторых воплощениях скваленсинтаза кодируется последовательностью, включающей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 337.

В некоторых воплощениях способ включает контакт геранил-ПФ с рекомбинантной клеткой-хозяином, в которой рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий фарнезил-ПФ-синтазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению фарнезил-ПФ. В некоторых воплощениях геранил-ПФ предоставляется, продуцируется в и/или присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 338. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей или имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей SEQ ID NO: 339.

В некоторых воплощениях один или несколько генов, кодирующих (1) первый фермент, способный катализировать выработку Соединения I из могрозида IIIE_, (2) фермент, способный катализировать выработку могрозида IIIE из могрозида IIA_, (3) эпоксидгидролазу, (4) цитохром P450, (5) полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, (6) скваленэпоксидазу, (7) фарнезил-ПФ-синтазу функционально связан с гетерологичным промотором. В некоторых воплощениях гетерологичный промотор представляет собой промотор CMV, EF1a, SV40, PGK1, бета-актин человека, CAG, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, Ptac, pL или их комбинацию. В некоторых воплощениях промотор является индуцибельным, репрессируемым или конститутивным промотором. В некоторых воплощениях в рекомбинантной клетке-хозяине положительно регулируется выработка одного или нескольких из числа пирувата, ацетил-КоА, цитрата и промежуточных соединений цикла трикарбоновых кислот. В некоторых воплощениях цитозольная локализация была активирована в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого гена содержат, по меньшей мере, одну последовательность, кодирующую саморасщепляющийся пептид 2А.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку растения, двустворчатых, рыбы, грибов, бактерий или млекопитающих. В некоторых воплощениях растение выбрано из группы, состоящей из Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicagogra, Betula, Betula, Betula, Betula, Betula, Betula, Betula Jatropha, Camellia, Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia и Morus. В некоторых воплощениях гриб выбирают из группы, состоящей из Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix, Metarhizium, Aspergillus, Yarrowia и Lipomyces. В некоторых воплощениях гриб представляет собой Aspergillus nidulans, Yarrowia lipolytica или Rhodosporin toruloides. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях дрожжи выбраны из группы, состоящей из Candida, Sacccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Coniochaeta, Rhodosporidium и Microboryomycetes. В некоторых воплощениях бактерии выбраны из группы, состоящей из Frankia, Actinobacteria, Streptomyces и Enterococcus. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку Saccharomyces cerevisiae или клетку Yarrowia lipolytica. В некоторых воплощениях один или несколько генов первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятогогенов являются кодон-оптимизированным геном для экспрессии в клетке бактерий, млекопитающих, растений, грибов и/или насекомых. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого гена содержат функциональную мутацию, повышающую активность кодируемого фермента. В некоторых воплощениях культивирование рекомбинантной клетки-хозяина включает мониторинг культивирования на pH, уровень растворенного кислорода, уровень азота или их комбинацию условий культивирования.

В некоторых воплощениях изобретения способ включает выделение соединения 1. В некоторых воплощениях изобретения выделение Соединения 1 включает лизис рекомбинантной клетки-хозяина и/или выделение Соединения 1 из культуральной среды. В некоторых воплощениях способ включает очистку соединения 1. В некоторых воплощениях очистка соединения 1 включает ВЭЖХ, твердофазную экстракцию или их комбинацию. В некоторых воплощениях очистка включает сбор рекомбинантных клеток-хозяев; сохранение надосадочной жидкости; и лизис рекомбинантных клеток-хозяев. В некоторых воплощениях лизис включает воздействие на клетки сдвигового усилия или детергентов, в результате чего получается лизат. Сдвиговое усилие может быть выбрано, например, из способа обработки ультразвуком, клеточных дезинтеграторов высокого давления или гранул. В некоторых воплощениях лизат подвергают стадиям фильтрации и очистки. В некоторых воплощениях лизат фильтруют и очищают твердофазной экстракцией.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт первого могрозида с одной или более гидролазой, чтобы получить Могрозид IIIe перед контактом могрозида IIIe с первым ферментом. Гидролаза может представлять собой, например, β-глюкан-гидролазу. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой EXG1 или EXG2. В некоторых воплощениях гидролазы включают аминокислотную последовательность, содержащую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO. 292, 366-368, 372, 376-398, 447-520, 524-845, 1013, 1014 и 1023.

В некоторых воплощениях первый Могрозид - это Могрозид IV, Могрозид V, Могрозид VI или их комбинация. В некоторых воплощениях изобретения первый могрозид - это Могрозид V, сиаменозид I, Могрозид IVE, Могрозид VI, Могрозид IVA или их комбинация.

В некоторых воплощениях контакт первого могрозида с одной или несколькими гидролазами включает контакт первого могрозида с клеткой-хозяином, которая содержит ген, кодирующий гидролазу. В некоторых воплощениях первый могрозид связывается с одной или несколькими гидролазами в клетке-хозяине, которая содержит ген, кодирующий гидролазу, и ген, кодирующий фермент, способный катализировать выработку Соединения 1. Клетка-хозяин может представлять собой рекомбинантную клетку-хозяина, которая включает первый ген, кодирующий первый фермент, способный катализировать выработку соединения 1 из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях клетка-хозяин не является рекомбинантной клеткой-хозяином, содержащей первый ген, кодирующий первый фермент, способный катализировать выработку соединения 1 из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях первый могрозид предоставляется, продуцируется и/или присутствует в клетке-хозяине. Ген, кодирующий гидролазу, может быть гетерологичным или гомологичным клетке-хозяину. В некоторых воплощениях ген, кодирующий гидролазу, экспрессируется на нормальном уровне в клетке-хозяине. В некоторых воплощениях ген, кодирующий гидролазу, сверхэкспрессируется в клетке-хозяине.

В некоторых воплощениях рекомбинантной клетка-хозяин содержит оксидоскваленциклазу, такую как циклоартенол-синтазу или бета-амирин-синтазу или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую оксидоскваленциклазу, такую как циклоартенол-синтазу или бета-амирин-синтазу, и в котором оксидоскваленциклазу, циклоартенолсинтазу или бета-амиринсинтазу модифицируют для получения кукурбитадиенола или эпоксикукурбитадиенола. Оксидоскваленциклаза может, например, включать или состоят из последовательности, имеющей по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 341, 343 и 346-347.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит цитохром Р450 - редуктазу или ген кодирующий цитохром Р450 - редуктазу. В некоторых воплощениях цитохром P450 редуктаза содержит или состоит из последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 318.

Раскрытие в данном документе включает соединение, имеющее структуру Соединения 1

где соединение получают любым из способов, раскрытых в данном документе.

Раскрытое в данном документе, включает клеточный лизат, содержащий соединение 1, имеющее структуру:

Кроме того, раскрытое в данном документе, включает рекомбинантную клетку, включающую: соединение 1,

имеющее структуру: (1), и ген, кодирующий фермент, способный катализировать получение соединения 1, из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях ген является гетерологичным геном для рекомбинантной клетки.

Раскрытие в данном документе включает рекомбинантную клетку, содержащую первый ген, кодирующий первый фермент, способный катализировать выработку Соединения 1, имеющего структуру:

из могрозида IIIE. Первым ферментом может быть, например, одна или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз (ЦГТаз), гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой ЦГТазу. Например, ЦГТаза может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях ЦГТаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой декстрансукразу. Например, декстрансукраза может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей любой из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях декстрансукраза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 104, 105, 157, 158 и 895. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой трансглюкозидазу. Трансглюкозидаза может, например, включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательностью любой из SEQ ID NO: 163-291 и 723. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 3, 95-102 и 163-291 и 723. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой бета-глюкозидазу. В некоторых воплощениях бета-глюкозидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 102, 292, 354-376 и 678-741.

В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает второй ген, кодирующий уридин дифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). В некоторых воплощениях UGT включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 4-9, 15-19, 125, 126, 128, 129, 293-307, 407, 409, 411, 413, 439, 441 и 444. В некоторых воплощениях UGT кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 116-124, 127, 130, 408, 410, 412, 414, 440, 442, 443 и 445. В некоторых воплощениях UGT кодируется последовательностью, изложенной в UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13), или UGT10391 (SEQ ID NO: 14). В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает третий ген, кодирующий UGT98 или UGT SK98. В некоторых воплощениях UGT98 или UGT SK98 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 9, 407, 16 или 306. В некоторых воплощениях UGT98 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 307.

В некоторых воплощениях клетка включает четвертый ген, кодирующий эпоксид-гидролазу. В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 21-30 и 309-314; или кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 114 и 115.

В некоторых воплощениях клетка включает пятую последовательность, кодирующую P450. В некоторых воплощениях P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 20, 49, 308, 315, 430, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890 и 891; или кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889 и 892. В некоторых воплощениях P450 кодируется геном, содержащим или состоящим из последовательности, изложенной в любой из SEQ ID NO: 31-48, 316 и 318.

В некоторых воплощениях клетка включает шестую последовательность, кодирующую полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, представляет собой слитый белок. В некоторых воплощениях слитый белок содержит один или несколько слитых доменов, слитых с N-концом, C-концом или обоими концами кукурбитадиенолсинтазы. Длина слитого домена может варьировать, например, от около 3 до около 1000 аминокислот или от около 5 до около 50 аминокислот. В некоторых воплощениях слитый домен представляет собой существенную часть или всю последовательность функционального белка. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 417, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904, 906. 906, 851, 854, 856, 1024, 859, 862, 865, 867, 915, 920, 924, 928, 932, 936, 940, 944, 948, 952, 956, 959, 964, 967, 971, 975, 979, 983, 987, 991, 995, 999, 1003, 1007 и 1011. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 70% с любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905.

В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает седьмой ген, кодирующий скваленэпоксидазу. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 и 335. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 335.

В некоторых воплощениях клетка включает восьмой ген, кодирующий скваленсинтазу. В некоторых воплощениях скваленсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 69 или 336. В некоторых воплощениях скваленсинтаза кодируется последовательностью, содержащей, или состоящей из, последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 337.

В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает девятый ген, кодирующий фарнезил-ПФ-синтазу. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 338. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 339.

В некоторых воплощениях клетка представляет собой клетку млекопитающих, растений, бактерий, грибов или насекомых. Например, клетка может быть дрожжевой клеткой. В некоторых воплощениях дрожжи выбраны из Candida, Saccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Coniochaeta и Microboryomycetes. В некоторых воплощениях растение выбрано из группы, состоящей из Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicagogra, Betula, Betula, Betula, Betula, Betula, Betula, Betula Jatropha, Camellia, Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia и Morus. В некоторых воплощениях гриб выбран из Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix и Metarhizium.

В некоторых воплощениях клетка включает ген, кодирующий, по меньшей мере, один фермент, способный к гидролизу могрозида V. В некоторых воплощениях соединение 1 демонстрирует толерантность к гидролитическим ферментам в рекомбинантной клетке, в которой гидролитические ферменты проявляют способности гидролизовать Могрозид VI, Могрозид V, Могрозид IV до Могрозид IIIE.

В некоторых воплощениях рекомбинантной клетка включает оксидоскваленциклазу, такую как циклоартенол-синтазу или бета-амирин-синтазу или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую оксидоскваленциклазу, такую как циклоартенол-синтазу или бета-амирин-синтазу, и в котором оксидосквален циклаза, циклоартенолсинтаза или бета-амиринсинтаза модифицированы для выработки кукурбитадиенола или эпоксикукурбитадиенола.

В некоторых воплощениях оксидосквален-циклаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательность с любой из SEQ ID NO: 341, 343 и 346-347. В некоторых воплощениях клетка включает цитохром-редуктазу P450 или ген, кодирующий цитохром-редуктазу P450. В некоторых воплощениях цитохром P450 редуктаза регенерирует активность цитохрома P450. В некоторых воплощениях редуктаза цитохрома P450 содержит последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 318.

В некоторых воплощениях клетка включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 897, 899, 909, 911, 913, 418, 421, 423, 425, 427, 871, 873, 901, 903 и 905. В некоторых воплощениях клетка включает фермент, содержащий последовательность, представленную или кодируемую любой последовательностью SEQ ID NO: 315, 316, 420, 422, 424, 426, 430, 431, 446, 871, 845-949. и 951-1012.

В некоторых воплощениях клетка включает ген, кодирующие гидролазу, способную гидролизовать первый могрозид для получения могрозида IIIe. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой β-глюкан гидролазу. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой EXG1 или EXG2. В некоторых воплощениях гидролаза включает аминокислотную последовательность, содержащую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO. 292, 366-368, 372, 376-398, 447-520, 524-845, 1013, 1014 и 1023.

В некоторых воплощениях первый могрозид - это Могрозид IV, Могрозид V, Могрозид VI или их комбинация. В некоторых воплощениях изобретения первый могрозид - это Могрозид V, сиаменозид I, Могрозид IVE, Могрозид VI, Могрозид IVA или их комбинация.

Ген, кодирующий гидролазу, может быть гетерологичным или гомологичным рекомбинантной клетке-хозяину. Ген, кодирующий гидролазу, может экспрессироваться на нормальном уровне или сверхэкспрессироваться в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях клетка представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях клетка представляет собой Saccharomyces cerevisiae или Yarrowia lipolytica.

Кроме того, раскрытое в данном документе, включает способ получения соединения 1, имеющую структуру:

В некоторых воплощениях способ включает: контакт первого могрозида с одной или несколькими гидролазами для получения могрозида IIIE; и контакт могрозида IIIE с ферментом, способным катализировать образование соединения 1 из могрозида IIIE.

В некоторых воплощениях гидролаза является β-глюкан-гидролазой. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой EXG1, например, EXG1 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1012 или 1014. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой EXG2, например, EXG2 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1023.

В некоторых воплощениях первый могрозид - это Могрозид IV, Могрозид V, Могрозид VI или их комбинация. В некоторых воплощениях изобретения первый могрозид - это Могрозид V, сиаменозид I, Могрозид IVE, Могрозид VI, Могрозид IVA или их комбинация.

В некоторых воплощениях контакт первого Могрозид с одной или несколькими гидролазами включает контакт первого могрозида с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая включает первый ген, кодирующий гидролазу, и второй ген, кодирующий фермент, способный катализировать продуцирование соединения 1. В некоторых воплощениях первый Могрозид связывается с одной или несколькими гидролазами в рекомбинантной клетке-хозяине, которая включает первый ген, кодирующий гидролазу, и второй ген, кодирующий фермент, способный катализировать выработку соединения 1. В некоторых воплощениях первый могрозид продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях первый ген относится к рекомбинантной клетке-хозяину. В некоторых воплощениях первый ген экспрессируется на нормальном уровне. В некоторых воплощениях первый ген является гетерологичным по отношению к рекомбинантной клетке-хозяину. В некоторых воплощениях первый ген сверхэкспрессирован. В некоторых воплощениях второй ген является гетерологичным по отношению к рекомбинантной клетке-хозяину. В некоторых воплощениях фермент, способный катализировать выработку Соединения 1, представляет собой одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз (ЦГТаз), гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Раскрытое в настоящее описание включает рекомбинантную клетку, содержащую: первый ген, кодирующие гидролазы, способные гидролизовать первый могрозид для получения могрозида IIIE; и второй ген, кодирующий фермент, способный катализировать образование соединения 1 из Могрозида III_E, где соединение 1 имеет структуру:

В некоторых воплощениях гидролаза - это β-глюкан-гидролаза. Например, гидролазой может быть EXG1 или EXG2. В некоторых воплощениях белок EXG2 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1023. В некоторых воплощениях первый Могрозид представляет собой Могрозид IV, Могрозид V, Могрозид VI или их комбинацию. В некоторых воплощениях изобретения первый Могрозид представляет собой Могрозид V, сиаменозид I, Могрозид IVE, Могрозид VI, Могрозид IVA или их комбинацию. Первый ген может быть гетерологичным или гомологичным рекомбинантной клетке-хозяину. Первый ген может быть сверхэкспрессирован или экспрессирован на нормальном уровне в клетке-хозяине. Клеткой может быть, например, дрожжевая клетка. В некоторых воплощениях клетка представляет собой Saccharomyces cerevisiae или Yarrowia lipolytica.

Кроме того, раскрытое в данном документе, включает слитый полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, где слитый полипептид содержит слитый домен слитый с кукурбитадиенолсинтазой. Этот слитый домен может быть слит с N-концом, C-концом или обоими концами кукурбитадиенолсинтазы. Слитый домен может быть, например, от около 3 до около 1000 аминокислот, или от около 5 до около 50 аминокислот в длину. В некоторых воплощениях слитый домен содержит существенную часть или всю последовательность функционального белка. В некоторых воплощениях слитый домен представляет собой существенную часть или всю последовательность функционального белка. В некоторых воплощениях слитый домен содержит часть или всю последовательность дрожжевого белка. В некоторых воплощениях слитый домен представляет собой часть или всю последовательность дрожжевого белка. В некоторых воплощениях слитый полипептид включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 851, 854, 856, 1024, 859, 862, 865, 867, 915, 920, 924, 928, 932, 936, 940, 944, 948, 948, 952, 956, 959, 964, 967, 971, 975, 979, 983, 987, 991, 995, 999, 1003, 1007 и 1011. В некоторых воплощениях слитый полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 851, 854, 856, 1024, 859, 862, 865, 867, 915, 920, 924, 928. 932, 936, 940, 944, 948, 952, 956, 959, 964, 967, 971, 975, 979, 983, 987, 991, 995, 999, 1003, 1007 и 1011. В некоторых воплощениях слитый домен слитого полипептида включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 866, 870, 917, 921, 925, 929, 933, 937, 941, 945, 949, 953, 957, 961, 968, 972, 972, 976, 980, 984, 988, 992, 996, 1000, 1004, 1008 и 1012. В некоторых воплощениях слитый домен слитого полипептида содержит или состоит из последовательности, изложенной в любой из SEQ ID NO: 866, 870, 917, 921, 925, 929, 933, 937, 941, 945, 949 953, 957, 961, 968, 972, 976, 980, 984, 988, 992, 996, 1000, 1004, 1008 и 1012.

В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327, 329-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях изобретения кукурбитадиенолсинтаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327, 329-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется геном, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется геном, содержащим или состоящим из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905.

Раскрытие в настоящем документе включает рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из слитых полипептидов, раскрытых в настоящем документе, и обладающих активностью кукурбитадиенолсинтазы. Раскрытие в данном документе включает рекомбинантную клетку, содержащую любое из числа слитого полипептида, раскрытого в настоящем документе, и обладающего активностью кукурбитадиенолсинтазы, и/или любые рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, раскрытые в данном документе, кодирующие слитый полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы. Также раскрыто в настоящем документе, включает способ применения любого слитого полипептида, раскрытого в настоящем документе, и обладающего активностью кукурбитадиенолсинтазы. Способ может включать контакт субстрата для кукурбитадиенолсинтазы с слитым полипептидом, обладающим активностью кукурбитадиенолсинтазы. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию куркурбитадиенола, 24,25-эпокси куркурбитадиенола или их комбинации. В некоторых воплощениях изобретения субстрат для кукурбитадиенолсинтазы содержит один или несколько из числа 2,3-оксидосквалена, диоксидосквалена и диэпоксисквалена. В некоторых воплощениях контакт включает контакт субстрата с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид. Рекомбинантная клетка-хозяин может, например, экспрессировать слитый полипептид. В некоторых воплощениях субстрат предоставляется, присутствует в и/или продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) выработки соединения 1 после обработки Могрозида IIIE с помощью ЦГТаза.

На фигуре 2 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) выработки Соединения 1 после обработки Могрозида IIIE с помощью декстрансукразы Streptococcus mutans Clarke ATCC 25175.

На фигуре 3 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) реакции гликозилирования могрозида после обработки Целлюкластом в присутствии ксилана.

На фигуре 4 и 5 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) реакции гликозилирования могрозида после обработки UDP-гликозилтрансферазой.

На фигуре 6 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) Могрола после обработки UDP-гликозилтрансферазой UGT73C6 до Могрозида I.

На фигурах 7-9 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) Могрола после обработки UDP-гликозилтрансферазой (338) (SEQ ID NO: 405) в продукты Могрозида I, Могрозида IIA и в 2 различных продукта Могрозида III.

На фигуре 10 и 11 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) Могрозида III_E после обработки UDP-гликозилтрансферазой для получения продуктов Сиаменозида I и Могрозида V.

На фигурах 12-14 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) продуктов реакции Могрола, Сиаменозида I или Соединения 1 после обработки UDP-гликозилтрансферазой (339) (SEQ ID NO: 409) с получением Могрозида I, Изомогрозида V и производного соединения 1, соответственно.

На фигурах 15-20 показаны данные ВЭЖХ и данные масс-спектроскопии (вставка) Могрозида IIIA, Могрозида IVE, Могрозида V, соответственно, которые были получены обработкой Могрозида IIA, Могрозида IIE, Могрозида IIIE, Могрозида IVA или Могрозида IVE с помощью UDP- гликозилтрансферазы (330) (SEQ ID NO: 411).

На фигурах 21 и 22 показаны профиль масс-спектроскопии продуктов реакции Могрозида IVE и Могрозида V.

На фигуре 23 показана выработка кукурбитадиенола с помощью кукурбитадиенолсинтазы (SgCbQ) (SEQ ID NO: 417).

На фигуре 24 показано получение кукурбитадиенола с использованием фермента Cpep2 (SEQ ID NO: 420).

На фигуре 25 показано получение кукурбитадиенола с использованием фермента Cpep4 (SEQ ID NO: 422).

На фигуре 26 показано получение дигидроксикукурбитадиенола в результате катализа эпоксидгидролазой (SEQ ID NO: 428).

Фигуры 27А-В показывают устойчивость Соединения 1 к гидролизу микробными ферментами.

На фигуре 28 показана хроматограмма UPLC смеси изомеров α-могрозида из Hilic_80_20_method.

На фигуре 29 показана чистота образца из анализа UPLC на Hilic_80_20_method.

На фигуре 30 показана блок-схема, демонстрирующая неограничивающий примерный путь получения Соединения 1.

На фигуре 31 показано поглощение ультрафиолета диэпоксискваленом стадии 1, показанной на фигуре 30, для усиления выработки оксидосквалена.

На фигуре 32 показано получение кукурбитадиенола на стадии 2 с использованием ферментов из Cucumis melo и Cucurbita maxima.

На фигуре 33 показано получение кукурбитадиенола на стадии 2 с использованием фермента из Pisum sativum.

На фигуре 34 показано продуцирование кукурбитадиенола на стадии 2 с использованием фермента из Dictyostelium sp.

На фигуре 35 показаны промежуточные соединения стадии 3 пути, показанного на фигуре 30.

На фигуре 36 показаны данные масс-спектроскопии промежуточных продуктов стадии 4 пути, показанного на фигуре 30, синтеза могрола.

На фигуре 37 показаны промежуточные соединения стадии 7 пути, показанного на фигуре 30, синтеза Соединения 1.

Фигура 38 представляет собой схематическую иллюстрацию, показывающую продуцирование гипергликозилированных могрозидов с помощью ферментов гликозолирования, которые затем могут гидролизоваться обратно в Могрозид IIIE.

Фигура 39 представляет собой схематическую иллюстрацию, показывающую, как гидролиз может быть использован для гидролиза гипергликозилированных могрозидов с получением Могрозида IIIE_, который затем может быть превращен в Соединение 1.

На фигурах 40А-В показано, что после 2 дней инкубации практически все могрозиды превращались в Могрозид IIIE в S. cerevisiae или Y. lipolytica.

На фигуре 41 показано, что продукт гидролиза соединения 1 не был обнаружен в S. cerevisiae или Y. lipolytica.

На фигуре 42 показано получение соединения 1 в S. cerevisiae, модифицированных для сверхэкспрессии декстрансукразы (DexT).

На фигуре 43 показаны ферментативные реакции, катализируемые ферментом 311 (UDP-гликозилтрансферазой).

Подробное описание

Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит данное описание. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации включены ссылкой в полном объеме. В случае, когда существует множество определений термина в данном документе, определения в этом разделе имеют преимущественную силу, если не указано иное.

Термин «сольват» относится к соединению, образованному взаимодействием растворителя и соединения, описанного в данном документе, или его соли. Подходящими сольватами являются физиологически приемлемые сольваты, включая гидраты.

Используемый в данном документе термин «подсластитель», «подслащивающий агент», «объект сладкого вкуса», «сладкое соединение» или «соединение со сладким вкусом» относится к соединению или его физиологически приемлемой соли, которое вызывает обнаруживаемый сладкий вкус у объекта.

Используемый в данном документе термин «функционально связанный» используется для описания связи между регуляторными элементами и геном или его кодирующей областью. Как правило, экспрессия гена находится под контролем одного или нескольких регуляторных элементов, например, без ограничения указанным, конститутивных или индуцибельных промоторов, тканеспецифических регуляторных элементов и энхансеров. Считается, что ген или кодирующая область «функционально связаны с» или «эффективно связаны с» или «функционально ассоциированы с» регуляторными элементами, что означает, что ген или кодирующая область контролируются или находятся под влиянием регуляторного элемента. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор осуществляет транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.

Термины «регуляторный элемент» и «элемент контроля экспрессии» используются взаимозаменяемо и относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут влиять на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Эти термины широко используются и охватывают все элементы, которые способствуют или регулируют транскрипцию, включая промоторы, последовательности энхансеров, респонсивные элементы, сайты распознавания белка, индуцибельные элементы, последовательности связывания белка, 5'- и 3'-нетранслируемые области (UTR), сайты начала транскрипции, последовательности терминации, последовательности полиаденилирования, интроны, основные элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, вышестоящие элементы, энхансеры, респонсивные элементы (см., например, Lewin, «Genes V» (Oxford University Press, Oxford), стр. 847- 873) и любые их комбинации. Типичные регуляторные элементы в прокариотах включают промоторы, операторные последовательности и сайты связывания рибосом. Регуляторные элементы, которые используются в эукариотических клетках, могут включать, без ограничения указанным, транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка, элемент входа в рибосому (IRES), последовательности 2A, и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности и/или продуцирование кодированного полипептида в клетке-хозяине. В некоторых воплощениях в настоящем документе рекомбинантная клетка, описанная в настоящем документе, содержит гены, функционально связанные с регуляторными элементами.

При использовании в данном документе, последовательности или элементы 2А относятся к небольшим пептидам, введенным в качестве линкера между двумя белками, что позволяет осуществляться автономному внутририбосомному самопроцессированию полипротеинов (см., например, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Эти короткие пептиды позволяют коэкспрессировать несколько белков из одного вектора. Многие элементы 2А известны в данной области. Примеры последовательностей 2А, которые можно использовать в раскрываемых в данном документе способах и системах, без ограничения указанным, включают последовательности 2А из вируса ящура (F2A), вируса лошадиного ринита A (E2A), вируса Thosea asigna (T2A), и свиного тешовируса-1 (P2A), как описано в публикации патента США № 20070116690.

При использовании в данном описании, термин «промотор» представляет собой нуклеотидную последовательность, которая позволяет связывание РНК - полимеразы и направляет транскрипцию гена. Как правило, промотор расположен в 5'-некодирующей области гена, проксимально к стартовому сайту транскрипции гена. Элементы последовательности в промоторах, которые функционируют при инициации транскрипции, часто характеризуются консенсусными нуклеотидными последовательностями. Примеры промоторов включают, без ограничения указанным, промоторы из бактерий, дрожжей, растений, вирусов и млекопитающих (включая людей). Промотор может быть индуцибельным, репрессируемым и/или конститутивным. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции ДНК под их контролем в ответ на некоторые изменения условий культивирования, таких как изменение температуры.

В используемом в данном описании термин «энхансер» относится к типу регулирующего элемента, который может повысить эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации энхансера по отношению к сайту инициации транскрипции.

При использовании в данном описании, термин «трансген» относится к любой нуклеотидной последовательности или ДНК, которая интегрирована в один или несколько хромосом клетки - мишени путем вмешательства человека. В некоторых воплощениях трансген содержит полинуклеотид, который кодирует представляющий интерес белок. Кодирующий белок полинуклеотид, как правило, функционально связан с другими последовательностями, которые полезны для получения желаемой экспрессии представляющего интерес гена, такими как последовательности регуляции транскрипции. В некоторых воплощениях трансген может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту или другую молекулу(ы), которая используется для маркировки хромосомы, в которую он интегрирован.

Термин «процент (%) идентичности последовательностей» в отношении полинуклеотидных или полипептидных последовательностей используется в данном документе как процент оснований или аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны основаниям или аминокислотным остаткам в другой последовательности после выравнивания двух последовательностей. В выравнивание последовательности могут быть введены разрывы, если необходимо достичь максимальной процентной идентичности последовательности. Консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента (%) идентичности последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных методов и программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN, FASTA (доступны в пакет Genetics Computing Group (GCG) из Мэдисона, штат Висконсин, США) или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

Например, значение процента (%) идентичности аминокислотных последовательностей, может быть получено с помощью компьютерной программы WU-BLAST-2 описанной, например, Altschul et al., Methods in Enzymology, 1996, 266:460-480. Многие параметры поиска в компьютерной программе WU-BLAST-2 могут быть отрегулированы специалистами в данной области техники. Например, некоторые из настраиваемых параметров могут быть установлены со следующими значениями: диапазон перекрытия = 1, доля перекрытия = 0,125, порог слова (T) = 11 и матрица оценки = BLOSUM62. Когда используется WU-BLAST-2, значение % идентичности аминокислотных последовательностей определяется путем деления (а) числа совпадающих идентичных аминокислотных остатков между аминокислотной последовательностью первого представляющего интерес белка и аминокислотной последовательностью второго представляющего интерес белок, определяемого с помощью WU-BLAST-2 на (b) общее количество аминокислотных остатков первого представляющего интерес белка.

Процент идентичности аминокислотной последовательности также может быть определен с помощью программы сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 описанной, например, Altschul и др, Nucleic Acids Res, 1997, 25: 3389-3402. Программа сравнения последовательностей NCBI-BLAST2 может быть загружена с http://www.ncbi.nlm.nih.gov или иным образом получена из Национального института здравоохранения, Бетесда, Мэриленд. NCBI-BLAST2 использует несколько настраиваемых параметров поиска. Значениями по умолчанию для некоторых из этих настраиваемых параметров поиска являются, например, демаскирование = да, цепь = все, ожидаемые вхождения = 10, минимальная длина низкой сложности = 15/5, e-значение для нескольких проходов = 0,01, константа для нескольких проходов = 25, выпадение окончательного выравнивания с разрывами = 25 и оценочная матрица = BLOSUM62.

В тех случаях, когда NCBI-BLAST2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А к, с или по отношению к данной аминокислотной последовательности В (которые в альтернативном варианте могут быть сформулированы в виде данная аминокислотная последовательность A, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности, с или против данной аминокислотной последовательности B), рассчитывается следующим образом:

100 умножить на дробь X/Y

где X - количество аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей NCBI-BLAST2 в этой программе выравнивания A и B, и где Y - общее количество аминокислотных остатков в B. Понятно, что где длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, % идентичности аминокислотной последовательности от A к B не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности B к A.

При использовании в данном описании термин «выделенный» означает, что указанное соединение не было отделено от своей естественной среды, таким образом, что одно или более других соединений, или биологических агентов, присутствующих с соединением в его естественном состоянии больше не присутствуют.

При использовании в данном документе, «очищенный» означает, что указанное соединение присутствует в большем количестве по сравнению с другими соединениями, обычно обнаруживаемыми с указанным соединением (например, в своей естественной среде). В некоторых воплощениях относительное количество очищенного соединения увеличивается более чем на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 300%, 400% или 1000%. В некоторых воплощениях очищенное соединение присутствует с массовым процентным содержанием более 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, 98%, 99% или 99,5% относительно других соединений, связанных с соединением. В некоторых воплощениях соединение 1, полученное из воплощений в настоящем документе, присутствует с массовым процентным содержанием более 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. 90%, 95%, 98%, 99% или 99,5% по отношению к другим соединениям, связанным с соединением после получения.

Термин «очистка», в соответствии с описанием в данном документе, может относиться к способам извлечения соединения 1 из клеточного лизата и/или надосадочной жидкости, где клетка выделяет продукт соединения 1. «Лизат», как описано в настоящем документе, включает клеточное содержимое клетки после разрушения клеточной стенки и клеточных мембран и может включать, например, белки, сахара и могрозиды. Очистка может включать осаждение сульфатом аммония для удаления белков, высаливание для удаления белков, гидрофобное разделение (ВЭЖХ) и использование аффинной колонки. Принимая во внимание продукты, полученные способами по настоящему изобретению, предполагается, что аффинная среда предназначена для удаления специфических могрозидов с помощью адсорбирующей смолы.

«ВЭЖХ», в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой форму жидкостной хроматографии, которая может быть использована для разделения соединений, которые растворены в растворе. Без ограничения указанным, приборы ВЭЖХ могут содержать резервуар с подвижной фазой, насос, инжектор, разделительную колонку и детектор. Соединения не могут быть разделены путем введения смеси образцов в колонку. Различные компоненты в прогоне смеси могут проходить через колонку с разными скоростями из-за различий в их распределении между подвижной жидкой фазой и неподвижной фазой. Есть несколько колонок, которые можно использовать. Без ограничения указанным колонки могут представлять собой колонки с обычной фазой, колонки с обращенной фазой, колонки для гель-фильтрации и колонки для ионного обмена.

Кроме того, предполагается применение твердофазной экстракции и фракционирования, которые являются полезным для обессоливания образцов белков и сахаров. Другие способы могут включать использование ВЭЖХ, жидкостной хроматографии для анализа образцов и экстракции жидкость-жидкость, описанных в Auréa Andrade-Eiroa et al. (TrAC Trends in Analytical Chemistry Volume 80, June 2016, Pages 641-654; полностью включенного в настоящее описание ссылкой.

«Твердофазная экстракция» (SPE) для очистки, как описано в настоящем документе, относится к процессу подготовки образца, в котором соединения, которые растворены или суспендированы в жидкой смеси, отделяются от других соединений в смеси в соответствии с их физическими и химическими свойствами. Например, аналитические лаборатории могут использовать твердофазную экстракцию для концентрирования и очистки образцов для анализа. Твердофазная экстракция может также использоваться для выделения представляющих интерес аналитов из широкого спектра матриц, включая, например, мочу, кровь, воду, напитки, почву и ткани животных. В воплощениях настоящего изобретения соединение 1, которое находится в клеточном лизате или в клеточной среде, может быть очищено твердофазной экстракцией.

SPE использует аффинность веществ, растворенных или взвешенных в жидкости (известной в качестве подвижной фазы) к твердому веществу, через которое пропускают образец (известный в качестве стационарной фазы) для разделения смеси на желательные и нежелательные компоненты. SPE также может быть использован и применен непосредственно в газо-твердой фазе и жидко-твердой фазе или косвенно к твердым образцам с использованием, например, термодесорбции с последующим хроматографическим анализом. Это может привести к тому, что желаемые интересующие аналиты или нежелательные примеси в образце останутся на стационарной фазе. Часть, которая проходит через стационарную фазу, может быть собрана или выброшена в зависимости от того, содержит ли она требуемые аналиты или нежелательные примеси. Если часть, удерживаемая на стационарной фазе, включает требуемые аналиты, их можно затем удалить из стационарной фазы для сбора на дополнительной стадии, на котором стационарную фазу промывают подходящим элюентом.

Способы, которыми может быть выполнена твердофазная экстракция, не ограничены. Без ограничения указанным, процедуры могут включать: процедуру SPE с нормальной фазой, SPE с обращенной фазой, SPE с ионным обменом, SPE с анионным обменом, катионный обмен и твердофазную микроэкстракцию. Твердофазная экстракция описана у Sajid et al. И Płotka-Wasylka J et al. (Anal Chim Acta. 2017 May 1;965:36-53, Crit Rev Anal Chem. 2017 Apr 11:1-11; включены ссылкой в полном объеме).

В некоторых воплощениях соединение 1, которое продуцируется клеткой, очищают с помощью твердофазной экстракции. В некоторых воплощениях чистота соединения 1, например очищенного путем твердофазной экстракции, составляет 70%, 80%, 90% или 100% чистоты или любого уровня чистоты, определенного любыми вышеупомянутыми значениями.

«Ферментация», как описано в настоящем документе, в широком смысле относится к массовому росту клеток-хозяев в среде-хозяине для получения специфического продукта. В приведенных в данном документе воплощениях конечным продуктом является соединение 1. Это может также включать способы, которые проводятся с воздухом или без него и могут быть выполнены, например, в анаэробной среде. Целые клетки (рекомбинантные клетки-хозяева) могут находиться в ферментационном бульоне или в реакционном буфере.

Соединение 1 и промежуточное соединение могрозида для получения соединения 1, могут быть выделены путем сбора промежуточных соединений могрозидов и соединения 1 из лизатов рекомбинантных клеток или из надосадочной жидкости. Лизат может быть получен после сбора клеток и лизиса клеток посредством силы сдвига (клеточная дезинтеграция высокого давления или обработка ультразвуком) или обработкой детергентом. Затем лизат можно отфильтровать и обработать сульфатом аммония для удаления белков и фракционировать на ВЭЖХ C18 (колонка Atlantis Prep T3 OBD 5 × 10 см, 5 мкм, Waters) путем инъекций с использованием градиента A/B (A = вода B = ацетонитрил) от 10 → 30% B в течение 30 минут, с промывкой 95% B, с последующим повторным уравновешиванием при 1% (общее время прогона = 42 минуты). Прогоны могут быть собраны в тарированные пробирки (12 фракций/планшет, 3 планшета на серию) в количестве 30 мл/фракция. Лизат также может быть центрифугирован для удаления твердого вещества и взвешенных частиц.

Затем планшеты могут быть высушены в Genevac HT12/HT24. Ожидается, что желаемое соединение будет элюировано во фракции 21 вместе с другими изомерами. Объединенные фракции могут быть дополнительно фракционированы в 47 прогонах на фторфенильной ВЭЖХ-колонке (3 × 10 см, колонка Xselect fluoro-phenyl OBD, 5 мкм, Waters) с использованием градиента A/B (A = вода, B = ацетонитрил) 15 ± 30% в течение 35 минут, с промывкой 95% B, с последующим повторным уравновешиванием при 15% (общее время пробега = 45 минут). Каждый прогон собирали в 12 тарированных пробирок (12 фракций/планшет, 1 планшет на серию) по 30 мл/фракция. Фракции, содержащие желаемый пик с желаемой чистотой, могут быть объединены на основе анализа UPLC и высушены при пониженном давлении, с получением беловатого порошкообразного твердого вещества. Чистое соединение может быть повторно суспендировано/растворено в 10 мл воды и лиофилизировано для получения чистоты, по меньшей мере, 95%.

Используемый в данном документе термин «гликозидная связь» относится к ковалентной связи, соединяющей две фуранозные и/или пиранозные группы вместе. Как правило, гликозидная связь представляет собой связь между аномерным углеродом одного фрагмента фуранозы или пиранозы и кислородом другого фрагмента фуранозы или пиранозы. Гликозидные связи названы с использованием нумерации связанных атомов углерода и ориентации альфа/бета. α- и β-Гликозидные связи различаются на основании относительной стереохимии аномерного положения и стереоцентра, наиболее удаленного от С1 в кольце. Например, сахароза представляет собой дисахарид, состоящий из одной молекулы глюкозы и одной молекулы фруктозы, связанных через гликозидную связь альфа 1-2, как показано ниже.

Пример бета 1-4 гликозидной связи можно найти в целлюлозе:

При использовании в описании и прилагаемой формуле изобретения, слова, употребляемые в единственном числе, также включают и множественное число, если контекст явно не указывает иное. Так, например, ссылка на «ароматическое соединение» включает смеси ароматических соединений.

Часто диапазоны выражаются в данном документе как от «около» одного конкретного значения и/или до «около» другого конкретного значения. Когда такой диапазон выражен, другое воплощение включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Точно так же, когда значения выражены в виде аппроксимаций с использованием предшествующего «около», будет понятно, что конкретное значение образует другое воплощение. Далее будет понятно, что конечные точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки.

«Оптимизация кодонов», в соответствии с описанием в данном документе, относится к процессу замены кодонов на кодоны, о которых известно, что они увеличивают максимальную эффективность экспрессии белка. В некоторых альтернативах описана оптимизация кодонов для экспрессии в клетке, где оптимизация кодонов может быть выполнена с использованием алгоритмов, известных специалистам в данной области техники, для создания синтетических генетических транскриптов, оптимизированных для высокого выхода мРНК и белка у людей. Например, кодоны могут быть оптимизированы для экспрессии белка в бактериальной клетке, клетке млекопитающего, дрожжевой клетке, клетке насекомого или растительной клетке. Программы, содержащие алгоритмы оптимизации кодонов у людей, легко доступны. Такие программы могут включать, например, алгоритмы OptimumGene™ или GeneGPS®. Кроме того, оптимизированные по кодонам последовательности могут быть получены коммерчески, например, от Integrated DNA Technologies. В некоторых воплощениях настоящего изобретения рекомбинантная клетка для продуцирования соединения 1 содержит гены, кодирующие ферменты для синтеза, где гены кодон-оптимизированы для экспрессии. В некоторых воплощениях гены кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках бактерий, дрожжей, грибов или насекомых.

Используемые в данном описании термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты» и «полинуклеотид» являются взаимозаменяемыми и относятся к любой нуклеиновой кислоте, независимо от того, состоят они из фосфодиэфирных связей или из модифицированных связей, таких как фосфотриэфир, фосфорамидат, силоксан, карбонат, карбоксиметил эфир, ацетамидат, карбамат, тиоэфир, мостиковый фосфорамидат, мостиковый метиленфосфонат, мостиковый фосфорамидат, мостиковый фосфорамидат, мостиковый метиленфосфонат, фосфоротиоат, метилфосфонат, фосфородитиоат, мостиковый фосфоротиоат или сультоновые связи, а также комбинации таких связей. Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» также в частности включают нуклеиновые кислоты, состоящие из оснований, отличных от пяти биологически встречающихся оснований (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).

Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) или рибонуклеиновые кислоты (РНК), олигонуклеотиды, фрагменты, генерируемые с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и фрагменты, полученные любым из числа лигирования, расщепления, действия эндонуклеазы и действия экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновых кислот могут состоять из мономеров, которые представляют собой встречающиеся в природе нуклеотиды (такие как ДНК и РНК), или аналогов встречающихся в природе нуклеотидов (например, энантиомерных форм встречающихся в природе нуклеотидов) или их комбинации. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения в сахарных фрагментах и/или в пиримидиновых или пуриновых основаниях. Модификации сахара включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, алкильными группами, аминами и азидогруппами, или сахара могут быть функционализированы в виде простых или сложных эфиров. Кроме того, весь сахарный фрагмент может быть заменен стерически и электронно-подобными структурами, такими как аза-сахара и карбоциклические аналоги сахара. Примеры модификаций в основной части включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновых кислот могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфоранилидат, фосфорамидат и т.п. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» также включает так называемые «пептидные нуклеиновые кислоты», которые включают природные или модифицированные основания нуклеиновых кислот, присоединенные к основной цепи полиамида. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. В некоторых альтернативах предоставляется последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок. В некоторых альтернативах нуклеиновая кислота представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота содержит любую из SEQ ID NO: 1-1023.

«Кодирование» или «кодирующий» используются в данном документе и относятся к свойству специфических последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза других макромолекул, таких как определенная последовательность аминокислот. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, продуцирует белок в клетке или другой биологической системе. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается рекомбинантная клетка, в которой рекомбинантная клетка включает гены, кодирующие ферменты, такие как декстрансукраза, UDP-гликозилтрансферазы, ЦГТазы, гликотрансферазы, декстрансукразы, целлюлазы, β-глюкозидазы, амилазы, трансглюкозидазы, пектиназы, декстраназы и/или UGT. В некоторых воплощениях трансглюкозидазы включают аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях ЦГТаза кодируются или имеют последовательность любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 147 и 154. В некоторых воплощениях гены, кодирующие ферменты, такие как декстрансукраза, UDP-гликозилтрансферазы, ЦГТазы, гликотрансферазы, декстрансукразы, целлюлазы, β-глюкозидазы, амилазы, трансглюкозидазы, пектиназы, декстраназы и/или UGT, кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках-хозяевах. «Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид» включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность.

Оптимизация также может быть выполнена для уменьшения появления вторичной структуры в полинуклеотиде. В некоторых альтернативах способа также может быть выполнена оптимизация последовательностей в векторе для уменьшения общего отношения GC/AT. Строгая оптимизация кодонов может привести к нежелательной вторичной структуре или нежелательно высокому содержанию GC, которое приводит к вторичной структуре. Как таковые, вторичные структуры влияют на эффективность транскрипции. Такие программы, как GeneOptimizer, можно использовать после оптимизации использования кодонов, для избежания вторичной структуры и оптимизации содержимого GC. Эти дополнительные программы можно использовать для дальнейшей оптимизации и устранения неполадок после первоначальной оптимизации кодонов, чтобы ограничить вторичные структуры, которые могут возникнуть после первого раунда оптимизации. Альтернативные программы для оптимизации легко доступны. В некоторых альтернативах способа вектор содержит последовательности, которые оптимизированы для избегания вторичной структуры, и/или последовательности оптимизированы для уменьшения общего отношения GC/AT, и/или последовательности оптимизированы для экспрессии в бактериальной или дрожжевой клетке.

«Вектор», «вектор экспрессии» или «конструкция» представляет собой нуклеиновую кислоту, используемую для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетку, которая имеет регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гетерологичных нуклеиновых кислот в клетке. Векторы включают, без ограничения указанным, плазмиду, мини-кольца, дрожжи и вирусные геномы. В некоторых альтернативах векторами являются плазмида, мини-кольца, дрожжи или геномы. В некоторых альтернативах вектор предназначен для экспрессии белка в бактериальной системе, такой как E.coli. В некоторых альтернативах вектор предназначен для экспрессии белка в бактериальной системе, такой как E.coli. В некоторых альтернативах вектор предназначен для экспрессии белка в дрожжевой системе. В некоторых воплощениях вектор для экспрессии представляет собой вирусный вектор. В некоторых воплощениях вектор представляет собой рекомбинантный вектор, содержащий промоторные последовательности для повышения экспрессии генов. «Регуляторные элементы» могут относиться к нуклеиновой кислоте, которая имеет нуклеотидные последовательности, которые могут влиять на инициацию и скорость транскрипции или трансляции, стабильность и подвижность продукта транскрипции или трансляции.

«Рекомбинантный хозяин» или «рекомбинантная клетка-хозяин», в соответствии с описанием в данном документе, представляет собой хозяина, геном которого был увеличен, по меньшей мере, одной встроенной последовательностью ДНК. Указанная включенная последовательность ДНК может представлять собой гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько полипептидов. Такие последовательности ДНК включают, без ограничения указанным, гены, которые не присутствуют в природе, последовательности ДНК, которые обычно не транскрибируются в РНК или не транслируются в белок («экспрессируются»), и другие гены или последовательности ДНК, которые желательно ввести в нерекомбинантного хозяина. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин используется для предотвращения проблем с экспрессией, таких как смещение кодонов. Существуют коммерческие хозяева для экспрессии белков, например, клетки BL21-CodonPlus™, тРНК-дополненные штаммы-хозяева для экспрессии гетерологичных генов, компетентные штаммы Rosetta™ (DE3) для усиления экспрессии белков и коммерческие дрожжевые системы экспрессии в родах Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula и Yarrowia.

Рекомбинантный хозяин может представлять собой коммерчески доступные клетки, такие как клетки Rosetta для экспрессии ферментов, которые могут иметь редкие кодоны.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка включает рекомбинантный ген для выработки полипептида цитохрома Р450, содержащего аминокислотную последовательность любого из CYP533, CYP937, CYP1798, CYP1994, CYP2048, CYP2740, CYP3404, CYP3968, CYP4112, CYP4149, CYP4491, CYP5491, CYP6479, CYP7604, CYP8224, CYP8728, CYP10020 и CYP10285. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется генами, содержащими любую из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, и 891.

В некоторых воплощениях ферменту P450 помогает, по меньшей мере, один активатор CYP, такой как CPR4497. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает ген, кодирующий CPR4497, где ген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 112. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает ген, кодирующий CPR4497, где аминокислотная последовательность CPR4497 изложена в SEQ ID NO: 113.

В некоторых воплощениях изобретения, где рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, рекомбинантная клетка имеет делецию гена EXG1 и/или ген EXG2, чтобы предотвратить снижение активности глюканазы, которые могут привести к дегликозилированию могрозидов.

Тип клетки-хозяина может варьировать. Например, клетка-хозяин может быть выбрана из группы, состоящей из Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, corynebacterium, Escherichia, Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomyces, Yarrowia, Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma, Xanthophyllomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi, Candida utilis, Yarrowia lipolytica, Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicago, Betula, Astragalus, Jatropha, Camellia, Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia, and Morus, Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix, Metarhizium, Aspergillus, Yarrowia, Lipomyces, Aspergillus nidulans, Yarrowia lipolytica, Rhodosporin toruloides, Candida, Sacccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Coniochaeta, Rhodosporidium, и Microboryomycetes, Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, и Rhodobacter capsulatus.. Способы увеличения выхода продукта были описаны, например, для S. cerevisiae. Известны способы получения рекомбинантных микроорганизмов.

Способы получения рекомбинантных клеток-хозяев из Aspergillus spp. описывается в WO2014086842, полностью включенной в данный документ ссылкой. Нуклеотидные последовательности геномов могут быть получены из общедоступных библиотек данных генов, что позволяет рационально конструировать и модифицировать пути для увеличения и улучшения выхода продукта.

«Культуральные среды», как описано в настоящем документе, могут представлять собой питательный бульон для роста и поддержания клеток в процессе их фазы образования продукта. Дрожжевая культура для поддержания и размножения различных штаммов может требовать специальных составов сложных сред для применения в клонировании и экспрессии белка и может быть оценена специалистами в данной области. Коммерчески доступные культуральные среды могут быть использованы, например, из ThermoFisher. Среда может быть бульоном YPD или может содержать дрожжевую азотистую основу. Дрожжи можно выращивать в YPD или синтетических средах при 30°C.

Лизогенный бульон (LB) обычно используется для бактериальных клеток. Бактериальные клетки, используемые для роста ферментов и могрозидов, могут обладать устойчивостью к антибиотикам для предотвращения роста других клеток в культуральной среде и контаминации. Клетки могут иметь кассеты генов антибиотиков для устойчивости к антибиотикам, таким как, например, хлорамфеникол, пенициллин, канамицин и ампициллин.

При описании в данном документе, «слитый белок» представляет собой белок, который создан путем соединения двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, которые первоначально закодированных на части или всей аминокислотной последовательности отдельных белков. Например, слитый белок может содержать функциональный белок (например, фермент (включая, без ограничения указанным, кукурбитадиенолсинтазу) и один или несколько слитых доменов. Слитый домен, в соответствии с описанием в данном документе, может быть полноразмерным или частью/фрагментом белка (например, функционального белка, включающего, без ограничения указанным, фермент, фактор транскрипции, токсин и фактор трансляции). Расположение одного или нескольких слитых доменов в слитом белке может варьировать. Например, один или несколько слитых доменов могут находиться на N- и/или C-концевых участках (например, на N- и/или C-концах) слитого белка. Один или несколько слитых доменов также могут находиться в центральной области слитого белка. Слитый домен не обязательно должен быть расположен на конце слитого белка. Область слияния может быть выбрана так, чтобы придать желаемое свойство. Например, слитый домен может влиять (например, увеличивать или уменьшать) ферментативную активность фермента, с которым он слит, или влиять (например, увеличивать или уменьшать) стабильность белка, с которым он слит. Слитый домен может быть мультимеризирующим (например, димеризующим и тетрамеризирующим) доменом и/или функциональными доменами. В некоторых воплощениях слитый домен может усиливать или уменьшать мультимеризацию белка, с которым он слит. В качестве неограничивающего примера, слитый белок может содержать полноразмерный белок А и слитый домен, слитый с N-концевой областью и/или С-концевой областью полноразмерного белка А. В некоторых примерах слитый белок содержит частичную последовательность белка А и слитого домена, слитого с N-концевой областью и/или С-концевой областью (например, с N-концом и С-концом) частичной последовательности белка А. Слитый домен может быть например, частью или всей последовательностью белка А, или частью или всей последовательностью белка, отличного от белка А. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов подходящих для применения в способах, системах и композициях, раскрытых в данном документе могут быть слитым белком. В некоторых воплощениях слитый белок кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательностей с одной из последовательностей нуклеиновой кислоты, перечисленных в таблице 1. В некоторых воплощениях слитый белок включает аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательностей, по меньшей мере, на 70, 80, 90, 95 или 99% с одной из аминокислотных последовательностей, перечисленных в таблице 1. В некоторых воплощениях слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности, по меньшей мере, на 80, 90, 95 или 99% с одной из аминокислотных последовательностей, перечисленных в таблице 1, и слитый домен в N-, C- или обоих концевых областях слитого белка. В некоторых воплощениях слитый белок содержит одну из аминокислотных белковых последовательностей, перечисленных в таблице 1, и слитый домен, расположенный в N-, C- или обеих терминальных областях слитого белка.

Длина слитого домена может изменяться, например, от 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 или диапазон между любым из этих двух чисел, аминокислот. В некоторых воплощениях слитый домен составляет около 3, 4, 5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или диапазон между любыми двумя из этих значений, аминокислоты в длину. В некоторых воплощениях слитый домен представляет собой существенную часть или всю последовательность функционального белка (например, фермента, фактора транскрипции или фактора трансляции). В некоторых воплощениях слитый белок представляет собой белок, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы.

Также рассматриваются способы оптимизации клеточного роста и экспрессии белка в культуральной среде. Для роста в культуральной среде клетки, такие как дрожжи, могут быть чувствительными к низкому рН (Narendranath et al., Appl Environ Microbiol. 2005 May; 71(5): 2239-2243; включены ссылкой в полном объеме). Во время роста дрожжи должны поддерживать постоянный внутриклеточный рН. Есть много ферментов, функционирующих в клетках дрожжей во время роста и метаболизма. Каждый фермент работает лучше всего при своем оптимальном pH, который является кислым из-за ацидофильной природы самих дрожжей. Когда внеклеточный рН отклоняется от оптимального уровня, дрожжевой клетке необходимо инвестировать энергию, чтобы либо накачать, либо откачать ионы водорода, чтобы поддерживать оптимальный внутриклеточный рН. Как таковые среды, содержащие буферы для контроля pH, будут оптимальными. В качестве альтернативы, клетки также могут быть перенесены в новую среду, если отслеживаемый pH высокий.

Оптимизация роста бактериальных и дрожжевых клеток также может быть достигнуто путем добавления питательных веществ и добавок в культуральную среду. Альтернативно, культуры могут быть выращены в ферментере, спроектированном для контроля температуры, pH и контролируемых скоростей аэрации. Растворенный кислород и азот могут поступать в среду по мере необходимости.

Термин «функционально связанный», при использовании в данном документе, относится к функциональным связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной нуклеотидной последовательностью, в результате экспрессии последнего.

«Могрозиды» и «соединения могрозидов» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к семейству тритерпеновых гликозидов. Неограничивающие примерные примеры могрозидов включают такие, как Могрозид V, Сиаменозид I, Могрозид IV_E, Изомогрозид V, Могрозид III_E, 11-Деокси-Могрозид V, 11-Оксо-могрозид V, Могрозид VI, Могрозид IV_A, Могрозид II_А, Могрозид II_А1, Могрозид II_А2, Могрозид I_А, 11-оксо-Могрозид VI, 11-оксо-Могрозид III_E, 11-оксо-Могрозид IV_E, Могрозид I_E, Могрол, 11-оксо-могрол, Могрозид II_E, Могрозид III_A2 и Могрозид III, которые были идентифицированы из плодов Siraitia grosvenorii (Swingle), которые отвечают за сладость плодов. В приведенных в данном документе воплощениях промежуточные соединения могут быть использованы при получении Соединения 1 in vivo, ex vivo или in vitro, имеющего структуру:

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка для продуцирования соединения 1 дополнительно продуцирует могрозиды и содержит гены, кодирующие ферменты для продуцирования могрозидов. Рекомбинантные клетки, способные продуцировать могрозиды, дополнительно описаны в WO2014086842, полностью включенной в данный документ ссылкой. В некоторых воплощениях рекомбинантную клетку выращивают в среде, чтобы обеспечить экспрессию ферментов и продуцирование соединения 1 и промежуточных соединений могрозидов. В некоторых воплощениях Соединение 1 получают путем лизиса клетки с помощью силы сдвига (то есть клеточных дезинтеграторов высокого давления или обработки ультразвуком) или способами лизиса детергентами. В некоторых воплощениях клетки обогащаются в питательной среде молекулами-предшественниками, такими как могрол, для ускорения продуцирования соединения 1.

Используемый в данном документе термин «промотор» относится к нуклеотидной последовательности, которая направляет транскрипцию структурного гена. В некоторых альтернативах промотор расположен в 5'-некодирующей области гена, проксимально к стартовому сайту транскрипции структурного гена. Элементы последовательности в промоторах, которые функционируют при инициации транскрипции, часто характеризуются консенсусными нуклеотидными последовательностями. Без ограничения указанным, эти промоторные элементы могут включать сайты связывания РНК-полимеразы, последовательности TATA, последовательности CAAT, элементы, специфичные для дифференцировки (DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993); настоящим включено ссылкой полностью) респонсивные элементы циклического AMP (CRE), респонсивные элементы на сыворотку (SRE; Treisman et al., Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990); включены ссылкой полностью), респонсивные элементы на глюкокортикоиды (GRE) и сайты связывания с другими факторами транскрипции, такими как CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992); включено ссылкой в полном объеме), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994); включено ссылкой в полном объеме), SP1, белок, связывающий респонсивный элемент cAMP (CREB; Loeken et al., Gene Expr. 3: 253 (1993); настоящим явно включен ссылкой в полном объеме) и октамерные факторы (см. в целом, Watson et al., Eds., Molecular Biology of the Gene, 4-е изд. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987; включена ссылкой в полном объеме)) и Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994); включены ссылкой в полном объеме). Используемый в данном документе промотор может быть конститутивно активным, репрессируемым или индуцибельным. Если промотор является индуцибельным промотором, то скорость транскрипции увеличивается в ответ на индуцирующий агент. Напротив, скорость транскрипции не регулируется индуцирующим агентом, если промотор является конститутивным промотором.

«Последовательность пропуска рибосомы», в соответствии с описанием в данном документе, относится к последовательности, которая во время трансляции заставляет рибосому «пропустить» последовательность пропуска рибосомы и транслировать область после последовательности пропуска рибосомы без образования пептидной связи. Некоторые вирусы, например, имеют последовательности пропуска рибосом, которые позволяют последовательную трансляцию нескольких белков в одной нуклеиновой кислоте без связывания белков через пептидную связь. Как описано в данном документе, это представляет собой последовательность «линкер». В некоторых альтернативах нуклеиновых кислот, представленных в настоящем документе, нуклеиновые кислоты содержат последовательность пропуска рибосом между последовательностями генов для ферментов, описанных в настоящем документе, так что белки коэкспрессируются и не связаны пептидной связью. В некоторых альтернативах последовательность пропуска рибосомы представляет собой последовательность P2A, T2A, E2A или F2A. В некоторых альтернативах последовательность пропуска рибосомы представляет собой последовательность T2A.

Соединение 1

Как раскрыто в данном описании, соединение 1 представляет собой соединение, имеющее структуру:

или его соль.

Соединение 1 представляет собой высокоинтенсивный подсластитель, который может быть использован в самых разнообразных продуктах, в которых желателен сладкий вкус. Соединение 1 по низкокалорийности имеет преимущество перед другими подсластителями, такими как сахароза или фруктоза.

В некоторых воплощениях соединение 1 находится в выделенной и очищенной форме. В некоторых воплощениях Соединение 1 присутствует в композиции, в которой Соединение 1 по существу очищено.

В некоторых воплощениях соединение 1 или его соль, выделяется и находится в твердой форме. В некоторых воплощениях твердая форма является аморфной. В некоторых воплощениях твердая форма является кристаллической. В некоторых воплощениях соединение находится в форме лиофилизата. В некоторых воплощениях Соединение 1 выделяют и помещают в буфер.

Специалисту в данной области будет понятно, что некоторые структуры, описанные в данном документе, могут быть резонансными формами или таутомерами соединений, которые могут быть точно представлены другими химическими структурами, даже кинетически; специалисту будет понятно, что такие структуры могут представлять только очень небольшую часть образца такого соединения (соединений). Такие соединения рассматриваются в объеме изображенных структур, хотя такие резонансные формы или таутомеры в данном документе не представлены.

В соединении 1 могут присутствовать изотопы. Каждый химический элемент, представленный в составной структуре, может включать любой изотоп указанного элемента. Например, в структуре соединения атом водорода может быть явно раскрыт или понимается как присутствующий в соединении. В любом положении соединения, в котором может присутствовать атом водорода, атом водорода может представлять собой любой изотоп водорода, включая, без ограничения указанным, водород-1 (протий) и водород-2 (дейтерий). Таким образом, ссылка в настоящем документе на соединение охватывает все потенциальные изотопные формы, если контекст явно не указывает иное. В некоторых воплощениях соединения, описанные в настоящем документе, обогащены одним или несколькими изотопами относительно естественной распространенности таких изотопов. В некоторых воплощениях соединения, описанные в данном документе, обогащены дейтерием. В некоторых воплощениях более 0,0312% атомов водорода в соединениях, описанных в данном документе, представляют собой дейтерий. В некоторых воплощениях более 0,05%, 0,08% или 0,1% атомов водорода в соединениях, описанных в данном документе, представляют собой дейтерий.

В некоторых воплощениях соединение 1 способно образовывать кислые и/или основные соли в силу наличия амино и/или карбоксильных групп или групп, подобных им.

В некоторых воплощениях Соединение 1 является по существу выделенным. В некоторых воплощениях соединение 1 по существу очищено. В некоторых воплощениях соединение находится в форме лиофилизата. В некоторых воплощениях соединение является кристаллическим. В некоторых воплощениях соединение является аморфным.

Композиции для производства

В некоторых воплощениях производственная композиция не содержит ни одного, или меньше определенного количества нежелательных соединений. В некоторых воплощениях композиция содержит или не содержит один или несколько изомеров Могрозида I, Могрозида II и Могрозида III. В некоторых воплощениях композиция содержит массовый процент менее чем 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн или 100 ч/млн всех изомеров Могрозида I, Могрозида II и Могрозида III. В некоторых воплощениях композиция содержит или не содержит один или несколько из числа Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида III_E, Могрозида III_A2, Могрозида IE, Могрозида II_E и 11-оксо-могрола. В некоторых воплощениях композиция содержит массовый процент менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн или 100 ч/млн одного или нескольких из числа Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида III_E, Могрозида III_A2, Могрозида IE, Могрозида II_E и 11-оксо-могрола. В некоторых воплощениях композиция содержит массовый процент менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн или 100 ч/млн Могрозида IIIE. В некоторых воплощениях композиция содержит массовый процент менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн или 100 ч/млн 11-оксо-Могрозида IIIE. В некоторых воплощениях композиция содержит массовый процент менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн или 100 ч/млн 11-оксо-могрола.

В некоторых воплощениях, композиция для производства находится в твердой форме, которая может кристаллической или аморфной. В некоторых воплощениях композиция находится в форме частиц. Твердая форма композиции может быть получена с использованием любого подходящего способа, включая, без ограничения указанным, перекристаллизацию, фильтрацию, выпаривание растворителя, измельчение, перемалывание, распылительную сушку, агломерацию распылением, агломерацию в кипящем слое, влажную или сухую грануляцию и их комбинации. В некоторых воплощениях предоставляется текучая композиция в форме частиц, чтобы облегчить использование в других процессах производства пищевых продуктов. В некоторых таких воплощениях размер образуемых частиц от 50 до 300 мкм, от 80 до 200 мкм или от 80 до 150 мкм.

Некоторые воплощения обеспечивают композицию для производства, содержащую соединение 1, которое находится в форме раствора. Например, в некоторых воплощениях раствор, полученный одним из процессов получения, описанных в настоящем документе, используется без дополнительной очистки. В некоторых воплощениях концентрация соединения 1 в растворе превышает 300 ч/млн, 500 ч/млн, 800 ч/млн, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. 8%, 9%, 10%, 15% или 20% по массе. В некоторых воплощениях концентрация всех изомеров Могрозида I, Могрозида II и Могрозида III составляет менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн или 100 ч/млн. В некоторых воплощениях концентрация одного или нескольких из числа Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида III_E, Могрозида III_A2, Могрозида IE, Могрозида II_E и 11-оксомогрола в производственной композиции составляет менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн, 100 ч/млн, 50 ч/млн, 30 ч/млн, 20 ч/млн, 10 ч/млн, 5 ч/млн, 1 ч/млн или 0,1 ч/млн одного или больше из числа Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида III_E, Могрозида III_A2, Могрозида IE, Могрозида II_E и 11-оксо-могрола. В некоторых воплощениях концентрация Могрозида III_E составляет менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн, 100 ч/млн, 50 ч/млн, 30 ч/млн. 20 ч/млн, 10 ч/млн, 5 ч/млн, 1 ч/млн или 0,1 ч/млн. В некоторых воплощениях концентрация 11-оксо-Могрозида III_E составляет менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн, 100 ч/млн, 50 ч/млн, 30 ч/млн, 20 ч/млн, 10 ч/млн, 5 ч/млн, 1 ч/млн или 0,1 ч/млн. В некоторых воплощениях концентрация 11-оксомогрола составляет менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,3%, 0,1%, 800 ч/млн, 500 ч/млн, 200 ч/млн, 100 ч/млн, 50 ч/млн. 30 ч/млн, 20 ч/млн, 10 ч/млн, 5 ч/млн, 1 ч/млн или 0,1 ч/млн.

Способы получения соединения 1 и промежуточных соединений могрозидов

В некоторых воплощениях соединение 1 получают путем контакта различных начальных и/или промежуточных соединений с одним или несколькими ферментами. Контакт может быть in vivo (например, в рекомбинантной клетке) или in vitro. Начальное и промежуточные соединения для получения соединения 1 могут включать, без ограничения указанным, Могрозид V, Могрозид II_E, Могрозид III_E, Сиаменозид I, изомер Могрозида VI, Могрозид II_A, Могрозид IV_Е, или Могрозид IV_A.

В некоторых воплощениях соединение 1, как раскрыто в настоящем описании, получено в рекомбинантных клетках - хозяевах in vivo, как описано в данном описании, или путем модификации этих способов. Пути модификации методологии включают, среди прочего, температуру, растворитель, реагенты и т.д., известные специалистам в данной области. Способы, показанные и описанные в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем формулы изобретения. Специалисты в данной области смогут распознать модификации раскрытых способов и разработать альтернативные пути на основе раскрытых в данном документе сведений; все такие модификации и альтернативные пути входят в объем формулы изобретения.

В некоторых воплощениях соединение 1, раскрытое в данном документе, получают путем очистки и/или выделения из рекомбинантной бактериальной клетки, дрожжевой клетки, клетки растений или клетки насекомых. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка происходит из Siraitia grosvenorii. В некоторых таких воплощениях экстракт, полученный из Siraitia grosvenorii, может быть фракционирован с использованием подходящего метода очистки. В некоторых воплощениях экстракт фракционируют, используя ВЭЖХ, и соответствующую фракцию собирают для получения желаемого соединения в выделенной и очищенной форме.

В некоторых воплощениях соединение 1 получают путем ферментативной модификации соединения, выделенного из Siraitia grosvenorii. Например, в некоторых воплощениях соединение 1, выделенное из Siraitia grosvenorii, приводят в контакт с одним или несколькими ферментами для получения желаемых соединений. Контакт может быть in vivo (например, в рекомбинантной клетке) или in vitro. Начальные и промежуточные соединения для получения соединения 1 могут включать, без ограничения указанным, Могрозид V, Могрозид II_E, Могрозид III_E, сиаменозид I, Могрозид VI изомера, Могрозид II_A, Могрозид IV_Е, или Могрозид IV_A. Одно или несколько из этих соединений могут быть получены in vivo. Ферменты, подходящие для применения при получении соединений, описанных в настоящем документе, могут включать, без ограничения указанным, пектиназу, β-галактозидазу (например, ароматазу), целлюлазу (например, Целлюкласт), гликоматлодекстрин-глюканотрансферазу (например, торузим), инвертазу глюкострансферазу (например, UGT76G1), декстрансукразу, лактазу, арабанзу, ксиланазу, гемицеллюлозу, амилазу или их комбинацию. В некоторых воплощениях фермент-торузим включает аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 89-94.

Некоторые воплощения обеспечивают способ получения Соединения 1,

где способ включает фракционирование экстракта Siraitia grosvenorii на колонке для ВЭЖХ и сбор элюированной фракции, содержащей соединение 1.

Некоторые воплощения обеспечивают способ получения Соединения 1

где способ включает обработку Могрозида III_E ферментом глюкозотрансферазой UGT76G1. В некоторых воплощениях UGT76G1 кодируется последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 440. В некоторых воплощениях UGT76G1 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 439.

Различные соединения могрозида могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения соединения 1. Неограничивающим примером таких соединений могрозидов является соединение 3, имеющее структуру:

В некоторых воплощениях способ получения соединения 3 включает контакт могрозида III_E с клеткой (например, рекомбинантной клеткой-хозяином), которая экспрессирует одну или несколько цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз. В некоторых воплощениях цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 95.

Различные соединения могрозида могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения соединения 1. Одним неограничивающим примером таких соединений могрозидов является соединение 12, имеющее структуру:

В некоторых воплощениях способ получения соединения 12 включает контакт могрозида VI с клеткой (например, рекомбинантной клеткой-хозяином), которая экспрессирует одну или несколько инвертаз.

Различные соединения могрозида могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения соединения 1. Одним неограничивающим примером таких соединений могрозидов является соединение 5, имеющее структуру:

В некоторых воплощениях способ получения соединения 5 включает контакт могрозида III_E с клеткой (например, рекомбинантной клеткой-хозяином), которая экспрессирует одну или несколько цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз. В некоторых воплощениях способ осуществляют в присутствии крахмала.

Различные соединения могрозида могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения соединения 1. Одним неограничивающим примером таких соединений могрозидов является соединение 4, имеющее структуру:

В некоторых воплощениях способ получения соединения 4 включает контакт могрозида III_E с клеткой (например, рекомбинантной клеткой-хозяином), которая экспрессирует одну или несколько цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз. В некоторых воплощениях способ осуществляют в присутствии крахмала.

Гидролиз гипергликозилированных могрозидов

В некоторых воплощениях, один или несколько гипер-гликозилированных могрозидов гидролизуют до Могрозида IIIЕ при контакте с одним или несколькими ферментами гидролазы. В некоторых воплощениях гипергликозилированные могрозиды выбраны из могрозида IV, могрозида V, могрозида VI и их комбинаций. В некоторых воплощениях гипергликозилированные могрозиды выбраны из Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, 11-Дезокси-могрозида V, 11-Оксомогрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, 11- оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида IV_E и их комбинации.

Неожиданно было обнаружено, что соединение 1 демонстрирует толерантность к гидролизу некоторыми гидролизующими ферментами, даже если такие ферменты демонстрируют возможность гидролиза гипер-гликозилированных могрозидов в Могрозид IIIE. Альфа-связанный гликозид, присутствующий в соединении 1, обеспечивает уникальное преимущество перед другими могрозидами (например, бета-связанными гликозидами) благодаря его устойчивости к гидролизу. В некоторых воплощениях во время микробного продуцирования соединения 1 микробный хозяин будет гидролизовать нежелательные бета-связанные могрозиды обратно в Могрозид IIIE. Это улучшит чистоту Соединения 1 из-за следующего: 1) Снижения нежелательных уровней Могрозида VI, Могрозида V и Могрозида IV, 2) Гидролиз увеличит количество Могрозида III_E, доступное для применения в качестве предшественника для получения Соединения 1.

Фигура 38 иллюстрирует получение гипергликозилированных могрозидов посредством ферментов гликозилирования, которые затем могут быть гидролизованы обратно в Могрозид IIIE. В результате получается смесь из могрозидов с более низким, чем желательно, выходом гипергликозилированных могрозидов. Ферменты гидролазы могут быть удалены, но все еще получается смесь могрозидов и продолжительность жизни продуцирующего организма может быть уменьшена. Однако, поскольку Соединение 1 устойчиво к гидролизу, гидролиз можно использовать для превращения гипергликозилированных могрозидов в Могрозид III_E, который затем можно преобразовать в Соединение 1 (как показано на фигуре 39).

В некоторых воплощениях гидролаза является β-глюкан-гидролазой. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой EXG1. Белок EXG1 может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, на 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или более идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1013 или 1014. В некоторых воплощениях белок EXG1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1013 или 1014. В некоторых воплощениях гидролаза представляет собой EXG2. Белок EXG2 может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1023. В некоторых воплощениях белок EXG2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1023. Гидролазой может быть, например, любая из гидролаз, раскрытых в данном документе.

Получение соединения 1 из Могрозида III_E

Соединение 1 может быть получено из Могрозида III_E путем контакта с одним или несколькими ферментами, способными превращать Могрозид III_E в соединение 1. В некоторых воплощениях фермент, способный катализировать выработку Соединения 1, представляет собой одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В некоторых воплощениях, фермент, способный катализировать получение соединения 1 представляет собой ЦГТазу. В некоторых воплощениях ЦГТаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях ЦГТаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях фермент, способный катализировать выработку соединения 1, представляет собой декстрансукразу. В некоторых воплощениях декстрансукраза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях декстрансукраза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях декстрансукразу кодируют нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 104, 105, 157, 158 и 895. В некоторых воплощениях декстрансукраза кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей или состоящей из любой из SEQ ID NO: 104, 105, 157, 158 и 895. В некоторых воплощениях фермент, способный катализировать выработку соединения 1, представляет собой трансглюкозидазу. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 163-292 и 723. Параметры для определения процентной идентичности последовательности могут быть выполнены с помощью программного обеспечения ClustalW от Blast search (ncbi.nih.gov). Использование этих программ может определить консервативность между белковыми гомологами.

В некоторых воплощениях, фермент, способный катализировать получение соединения 1, представляет собой уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). UGT может содержать, например, аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 4-9, 15-19, 125, 126, 128, 129, 293-307, 407, 409, 411, 413, 439, 441 и 444. В некоторых воплощениях UGT содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 4-9, 10-14, 125, 126, 128, 129, 293-304, 306, 407, 409, 411. 413, 439, 441 и 444. В некоторых воплощениях UGT кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13), UGT10391 (SEQ ID NO: 14) и SEQ ID NO: 116-124, 127, 130, 408, 410, 412, 414, 440, 442, 443 и 445. В некоторых воплощениях UGT кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей, состоящую из любой одной из последовательности нуклеиновой кислоты UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13), UGT10391 (SEQ ID NO: 14), SEQ ID NO: 116-124, 127, 130, 408, 410, 412, 414, 440, 442, 443 и 445. В некоторых воплощениях фермент может представлять собой UGT98 или UGT SK98. Например, в соответствии с описанием в данном документе, рекомбинантная клетка-хозяин, способная продуцировать соединение 1, может содержать третий ген, кодирующий UGT98 и/или UGT SK98. В некоторых воплощениях UGT98 или UGT SK98 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 9 или 16. В некоторых воплощениях UGT включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с UGT73C3 (SEQ ID NO: 4), UGT73C6 (SEQ ID NO: 5), UGT85C2 (SEQ ID NO: 6), UGT73C5 (SEQ ID NO: 7), UGT73E1 (SEQ ID NO: 8), UGT98 (SEQ ID NO: 9), UGT1576 (SEQ ID NO: 15), UGT SK98 (SEQ ID NO: 16), UGT430 (SEQ ID NO: 17), UGT1697 (SEQ ID NO: 18) и UGT11789 (SEQ ID NO: 19). В некоторых воплощениях UGT содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из UGT73C3 (SEQ ID NO: 4), UGT73C6 (SEQ ID NO: 5), 85C2 (SEQ ID NO: 6), UGT73C5 (SEQ ID NO: 7), UGT73E1 (SEQ ID NO: 8), UGT98 (SEQ ID NO: 9), UGT1576 (SEQ ID NO: 15), UGT SK98 (SEQ ID NO: 16), UGT430 (SEQ ID NO: 17), UGT1697 (SEQ ID NO: 18) и UGT11789 (SEQ ID NO: 19). В некоторых воплощениях UGT кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, на 70, 80, 90, 95, 98, 99% или более идентичности последовательности с UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13) или UGT10391 (SEQ ID NO: 14). В некоторых воплощениях UGT кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей или состоящей из любой из последовательностей UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13) и UGT10391 (SEQ ID NO: 14). Как в данном документе раскрыто, фермент, способный катализировать образование соединения 1, может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или более идентичности последовательностей с любым из ферментов UGT, раскрытых в данном документе. Кроме того, рекомбинантная клетка-хозяин, способная продуцировать соединение 1, может включать фермент, содержащий или состоящий из последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или более идентичности последовательностей с любым из ферментов UGT, раскрытых в данном документе. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин включает фермент, содержащий или состоящий из последовательности любого из ферментов UGT, раскрытых в данном документе.

В некоторых воплощениях изобретения способ получения соединения 1 включает обработку Могрозида III_E ферментом глюкозотрансферазы UGT76G1, например, UGT76G1 из SEQ ID NO: 439 и UGT76G1 кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 440.

Ферменты для получения соединений могрозидов и Соединения 1

Как описано в данном документе, ферменты UDP гликозилтрансферазы, цикломальтодекстрин глюканотрансферазы (ЦГТазы), гликотрансферазы, декстрансукразы, целлюлазы, β-глюкозидазы, амилазы, трансглюкозидазы, пектиназы и декстраназы могут включать аминокислотные последовательности, представленные в таблице последовательностей в данном описании и также могут кодироваться последовательностями нуклеиновых кислот, представленными в Таблице последовательностей. Кроме того, ферменты могут также включать функциональные гомологи с идентичностью последовательностей, по меньшей мере, 70% по отношению к аминокислотным последовательностям, описанным в таблице последовательностей. Параметры для определения процентной идентичности последовательности могут быть выполнены с помощью программного обеспечения ClustalW от Blast search (ncbi.nih.gov). Использование этих программ может определить консервативность между белковыми гомологами.

В некоторых воплощениях трансглюкозидазы включают аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя значениями, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях ЦГТаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101 и 154. В некоторых воплощениях трансглюкозидазы включают аминокислотную последовательность или кодируются нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723.

Способы в настоящем документе также включают встраивание генов в рекомбинантные клетки для получения промежуточных соединений, таких как пируват, ацетил-Коа, цитрат и другие промежуточные соединения цикла трикарбоновых кислот (цикла лимонной кислоты). Промежуточные соединения могут быть дополнительно использованы для получения соединений могрозидов для получения Соединения 1. Способы увеличения содержания сквалена описаны в Gruchattka et al. и Rodriguez et al. (PLoS One. 2015 Dec 23; 10(12; Microb Cell Fact. 2016 Mar 3; 15:48; включены в данный документ ссылкой в полном объеме).

Также предполагается экспрессия ферментов с образованием оксидосквалена и диэпоксисквалена. Применение ферментов для получения оксидосквалена и диэпоксисквалена можно использовать для ускорения синтеза сквалена с помощью скваленсинтазы и/или скваленэпоксидазы. Например, Su et al. описали ген, кодирующий SgSQS, состоящий из 417 аминокислот белок из Siraitia grosvenorii для скваленсинтазы (Biotechnol Lett. 2017 Mar 28; включен в данный документ ссылкой в полном объеме). Генетическая инженерия рекомбинантных клеток для экспрессии HMG CoA редуктазы также полезна для синтеза сквалена (Appl Environ Microbiol. 1997 Sep; 63(9):3341-4; Front Plant Sci. 2011 июнь 30; 2:25; FEBS J. 2008 Apr; 275 (8): 1852-9.; все включены в настоящий документ ссылкой в полном объеме. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, включающим последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 898 или 900. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%. или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 897 или 899.

Также предполагается экспрессия ферментов для получения кукурбитадиенола/эпоксикукурбитадиенола. Примеры курубитадиенолсинтаз из C pepo, S grosvenorii, C sativus, C melo, C moschata и C maxim предполагаются для встраивания в рекомбинантные клетки с помощью векторов для экспрессии. Оксидоскваленциклазы для биосинтеза тритерпенов также рассматриваются для экспрессии в рекомбинантной клетке, что может привести к циклизации ациклического субстрата в различные полициклические тритерпены, которые также могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения соединения 1 (Org Biomol Chem. 2015 Jul 14 ; 13 (26): 7331-6; включено в настоящее описание ссылкой в полном объеме).

Также предполагается экспрессия ферментов, которые проявляют активность эпоксидгидролазы для образования гидрокси-кукурбитадиенолов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения рекомбинантные клетки для продуцирования соединения 1 дополнительно содержат гены, которые кодируют ферменты, проявляющие активность эпоксидгидролазы для получения гидрокси-кукурбитадиенолов. Такие ферменты представлены в Itkin et al. который включен в данный документ ссылкой в полном объеме. Ферменты, описанные в Itkin et al., приведены в таблице 1, таблице последовательностей, приведенной в данном документе. Ikin et al. также описывают ферменты для получения ключевых могрозидов, семейств UGS, гликозилтрансфераз и гидролаз, которые могут быть генетически модифицированы для обратных реакций, таких как гликозилирование.

Также предполагается экспрессия ферментов в рекомбинантных клетках с гидроксилатными соединениями могрозидов для получения могрола. Эти ферменты могут включать белки семейства CAZY, UDP-гликозилтрансферазы, ЦГТазы, гликозилтрансферазы, декстрансукразы, целлюлазы, B-глюкозидазы, трансглюкозидазы, пектиназы, декстраназы, дрожжевые и грибные гидролизующие ферменты. Такие ферменты можно использовать, например, для гидролиза Могрозида V до Могрозида IIIE_, где Могрозид III_E может быть дополнительно обработан для получения Соединения 1, например, in vivo. В некоторых воплощениях грибные лактазы включают аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 678-722.

В некоторых воплощениях получают предшественник могрола, такой как сквален или оксидосквален, могрол или могрозид. Предшественник могрола можно использовать в качестве предшественника при получении Соединения 1. Сквален может быть получен из фарнезилпирофосфата с использованием скваленсинтазы, а оксидосквален может быть получен из сквалена с использованием скваленэпоксидазы. Скваленсинтазой может быть, например, скваленсинтаза из Gynostemma pentaphyllum (учетный номер белка C4P9M2), растения семейства тыквенных. Скваленсинтазы также могут включать скваленсинтазы из Arabidopsis thaliana (белок номер C4P9M3), Brassica napus, Citrus Macrophylla, Euphorbia tirucalli (учетный номер белка B9WZW7), Glycine max, Glycyrrhiza glabra (учетный номер белка Q42760, Q42761), Glycrrhiza uralensis (учетный номер белка D6QX40, D6QX41, D6QX42, D6QX43, D6QX44, D6QX45, D6QX47, D6QX39, D6QX55, D6QX38, D6QX53, D6QX37, D6QX35, B5AID5, B5AID4, B5AID3, C7EDD0, C6KE07, C6KE08, C7EDC9), Lotus japonicus (учетный номер белка Q84LE3), Medicago truncatula (учетный номер белка Q8GSL6), Pisum sativum, Ricinus communis (учетный номер белка B9RHC3). Различные скваленсинтазы описаны в WO 2016/050890, содержание которого включено в настоящее описание ссылкой в полном объеме.

Рекомбинантные клетки-хозяева

Любой из ферментов, раскрытых в настоящем описании, может быть получен in vitro, ex vivo или in vivo. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент (включая, без ограничения указанным, любую из числа UGT, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, бета-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ, декстраназ, цитохрома P450, эпоксидгидролаз, кукурбитадиенолсинтаз, скваленэпоксидаз, скваленсинтаз, гидролаз и оксидоскваленциклаз) могут вводиться в рекомбинантную клетку-хозяина, например, в форме экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты in vivo. Векторы экспрессии могут быть введены в клетку-хозяина, например, стандартными методами трансформации (например, тепловой трансформацией) или трансфекцией. Системы экспрессии могут продуцировать ферменты для продукции могрозида и соединения 1, чтобы получать соединение 1 в клетке in vivo. Полезные системы экспрессии включают, без ограничения указанным, системы на клетках бактерий, дрожжей и насекомых. Например, системы на клетках насекомых могут быть заражены системой экспрессии на основе рекомбинантного вируса для экспрессии представляющих интерес ферментов. В некоторых воплощениях гены кодон-оптимизированы для экспрессии в конкретной клетке. В некоторых воплощениях гены функционально связаны с промотором для управления транскрипцией и трансляцией белка фермента. Как описано в данном документе, может быть проведена оптимизация кодонов, и затем оптимизированная последовательность может быть встроена в вектор для трансформации рекомбинантной клетки-хозяина.

Экспрессирующие векторы могут дополнительно включать регуляторные последовательности транскрипции или трансляции, кодирующие последовательности для факторов транскрипции или трансляции, или различные промоторы (например, промоторы GPD1) и/или энхансеры, чтобы способствовать транскрипции интересующего гена в клетках дрожжей.

Рекомбинантные клетки, как описано в настоящем описании, в некоторых воплощениях, генетически модифицированы с получением соединения 1 in vivo. Кроме того, клетки можно подпитывать предшественником могрола или предшественником могрозида во время роста клетки или после роста клетки, чтобы повысить скорость выработки конкретного промежуточного соединения для пути получения соединения 1 in vivo. Клетка может быть в суспензии или иммобилизована. Клетка может находиться в ферментационном бульоне или в реакционном буфере. В некоторых воплощениях для переноса предшественника могрола или предшественника могрозида в клетку используется пермеабилизующий агент. В некоторых воплощениях предшественник могрола или предшественник могрозида может быть предоставлен в очищенной форме или в виде части композиции или экстракта.

Рекомбинантная клетка-хозяин может представлять собой клетку, например, растения, двустворчатого, рыбы, гриба, бактерии или млекопитающего. Например, растение может быть выбрано из Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicago, Betula, Astrahausus Astragalus Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia и Morus. Гриб может быть выбран из Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix, Metarhizium, Aspergillus, Yarrowia и Lipomyces. В некоторых воплощениях гриб представляет собой Aspergillus nidulans, Yarrowia lipolytica или Rhodosporin toruloides. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях дрожжи выбирают из Candida, Sacccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Coniochaeta, Rhodosporidium, Yarrowia и Microboryomycetes. В некоторых воплощениях бактерии выбирают из Frankia, Actinobacteria, Streptomyces и Enterococcus. В некоторых воплощениях бактерией является Enterococcus faecalis.

В некоторых воплощениях рекомбинантные гены кодон-оптимизированы для экспрессии в клетках бактерий, млекопитающих, растений, грибов или насекомых. В некоторых воплощениях один или несколько генов содержат функциональную мутацию, повышающую активность кодируемого фермента. В некоторых воплощениях культивирование рекомбинантной клетки-хозяина включает мониторинг культивирования на pH, уровень растворенного кислорода, уровню азота или комбинации таких условий культивирования.

Получение Могрола из Сквалена

Некоторые воплощения способа получения Соединения 1 включают получение промежуточного соединения для применения при получении Соединения 1. Соединение, имеющее структуру:

продуцируется in vivo в рекомбинантном хозяине. В некоторых воплощениях соединение находится в рекомбинантной клетке-хозяине, секретируется в среду, в которой растет рекомбинантная клетка, или находится и там, и там. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка дополнительно продуцирует промежуточные соединения, такие как соединения могрозидов, in vivo. Рекомбинантная клетка может быть выращена в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируются гены, описанные в данном документе. Некоторые воплощения способов выращивания клеток описаны в данном документе.

В некоторых воплощениях изобретения промежуточный продукт представляет собой или содержит, по меньшей мере, один из числа сквалена, оксидосквалена, курубитадиенола, могрола и могрозидов. В некоторых воплощениях изобретения могрозид представляет собой Могрозид IIE. Как описано в данном документе, могрозиды представляют собой семейство гликозидов, которые могут быть выделены естественным путем, например, из растения или плода. Как предполагается в настоящем документе, могрозиды могут продуцироваться рекомбинантной клеткой-хозяином.

В некоторых альтернативных способах, описанных в настоящем описании, рекомбинантная клетка-хозяин включает полинуклеотид или последовательность, содержащую одну или более из следующего:

ген, кодирующий скваленэпоксидазу;

ген, кодирующий кукурбитадиенолсинтазу;

ген, кодирующий цитохром P450;

ген, кодирующий цитохром P450 редуктазу; и

ген, кодирующий эпоксидгидролазу.

В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 54. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза содержит последовательность из Arabidopsis thaliana (учетный номер белка: Q9SM02, 065403, 065402, 065404, 081000 или Q9T064), Brassica napus (учетный номер белка 10 065727, 065726), белок Euphorbia tionuci учетный номер белка A7VJN1), Medicago truncatula (учетный номер белка Q8GSM8, Q8GSM9), Pisum sativum и Ricinus communis (учетный номер белка B9R6VO, B9S7W5, B9S6Y2, B9TOY3, B9S7TO, B9SX91) и функциональные гомологи любого из вышеупомянутого имеющие, по меньшей мере, 70%, например, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 90%, например, по меньшей мере, 95%, например, по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей с ними. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 или 335.

В некоторых воплощениях клетка включает гены, кодирующие ERG7 (ланостеринсинтазу). В некоторых воплощениях ланостеринсинтаза содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 111. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется генами, содержащими последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любым из пунктов: 31-48. В некоторых воплощениях последовательности могут быть разделены последовательностями пропуска рибосом для получения разделенных белков.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий полипептид, имеющий активность кукурбитадиенолсинтазы. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, включает аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей последовательности с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, содержит С-концевую часть, содержащую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 73. В некоторых воплощениях ген, кодирующий полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, кодон-оптимизирован. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированный ген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 74.

В некоторых воплощениях полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, представляет собой слитый полипептид, содержащий слитый домен, слитый с кукурбитадиенолсинтазой. Слитый домен может быть слит, например, с N- или С-концом кукурбитадиенолсинтазы. Слитый домен может быть расположен, например, в N-концевой области или С-концевой области слитого полипептида. Длина области слияния может варьироваться. Например, слитый домен может составлять или составлять около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 или диапазон между любыми двумя из этими значениями аминокислот в длину. В некоторых воплощениях слитый домен имеет длину от 3 до 1000 аминокислот. В некоторых воплощениях слитый домен имеет длину от 5 до 50 аминокислот. В некоторых воплощениях слитый домен содержит существенную часть или всю последовательность функционального белка. В некоторых воплощениях слитый домен содержит часть или всю последовательность дрожжевого белка. Например, слитый полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, может включать аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 851, 854, 856, 1024, 859, 862, 865, 867, 915, 920, 924, 928, 932, 936, 940, 944, 948, 952, 956, 959, 964, 967, 971, 975, 979, 983, 987, 991, 995, 999, 1003, 1007 и 1011. В некоторых воплощениях слитый полипептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 851, 854, 856, 1024, 859, 862, 865, 867, 915, 920, 924, 928. 932, 936, 940, 944, 948, 952, 956, 959, 964, 967, 971, 975, 979, 983, 987, 991, 995, 999, 1003, 1007 и 1011. В некоторых воплощениях слитый домен слитого полипептида включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 866, 870, 917, 921, 925, 929, 933, 937, 941, 945, 949, 953, 957, 961, 968, 972, 976, 980, 984, 988, 992, 996 1000, 1004, 1008 и 1012. В некоторых воплощениях слитый домен слитого полипептида содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 866, 870, 917, 921, 925, 929, 933, 937, 941, 945, 949, 953, 957, 961, 968, 972, 976, 980, 984, 988, 992, 99 6, 1000, 1004, 1008 и 1012. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза, слитая с слитым доменом, включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327, 329-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях воплощения кукурбитадиенолсинтаза, слитая с слитым доменом, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327, 329-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях воплощения кукурбитадиенолсинтаза, слитая с слитым доменом, кодируется геном, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, или 100% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905. В некоторых воплощениях воплощения кукурбитадиенолсинтаза, слитая с слитым доменом, кодируется геном, включающим последовательность нуклеиновой кислоты или состоящую из нее, представленную в любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418. 421, 423, 425, 4 27, 897, 899, 901, 903 и 905. Раскрытие в настоящем документе включает рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы. Также раскрытие включает рекомбинантную клетку, содержащую слитый полипептид, обладающий активностью кукурбитадиенолсинтазы, или молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид.

Описанные в данном документе слитые полипептиды, обладающие активностью кукурбитадиенолсинтазы, можно использовать для катализа ферментативных реакций в виде кукурбитадиенолсинтаз. Например, субстрат для кукурбитадиенолсинтазы может связываться с одним или несколькими из этих слитых полипептидов для получения продуктов реакции. Неограничивающие примеры продукта реакции включают куркурбитадиенол, 24,25-эпоксикуркурбитадиенол и любую их комбинацию. Неограничивающие примеры субстрата для кукурбитадиенолсинтазы включают 2,3-оксидосквален, диоксидоксидвален, диэпоксисквален и любую их комбинацию. В некоторых воплощениях субстрат может контактировать с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или несколько слитых полипептидов, обладающих активностью кукурбитадиенолсинтазы. Субстрат может быть предоставлен рекомбинантным клеткам-хозяевам, присутствовать в рекомбинантной клетке-хозяине, получен с помощью рекомбинантной клетки-хозяина, или любой их комбинации.

В некоторых воплощениях цитохром P450 представляет собой CYP5491. В некоторых воплощениях цитохром P540 включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 44, и/или SEQ ID NO: 74. В некоторых воплощениях полипептид P450 редуктазы включает аминокислотную последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 46. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется геном, содержащим последовательность, имеющую или имеющую, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887 и 891.

В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза содержит последовательность, имеющую, или имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%, или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 38 или 40. В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 38 или 40.

Некоторые способы получения сквалена для получения могрола

Сквален - это органическая молекула, состоящая из 30 атомов углерода, которая может вырабатываться растениями и животными и являющаяся биохимическим предшественником семейства стероидов. Кроме того, сквален может быть использован в качестве предшественника в синтезе могрола in vivo в рекомбинантной клетке-хозяине. Окисление (через сквален монооксигеназу) одной из концевых двойных связей сквалена дает 2,3-сквален оксид, который подвергается катализируемой ферментами циклизации с образованием ланостерола, который затем превращается в холестерин и другие стероиды. Как описано в Gruchattka et al. (“In Vivo Validation of In Silico Predicted Metabolic Engineering Strategies in Yeast: Disruption of α-Ketoglutarate Dehydrogenase and Expression of ATP-Citrate Lyase for Terpenoid Production.” PLOS ONE December 23, 2015; включенного в данное описание ссылкой в полном объеме), синтез сквалена может происходить первоначально из предшественников цикла гликолиза с получением сквалена. Сквален, в свою очередь, может быть положительно регулирован за счет избыточной экспрессии АТФ-цитрат-лиазы для увеличения выработки сквалена. Некоторые воплощения, раскрытые в данном документе, включают ферменты для продуцирования сквалена и/или ускорения продуцирования сквалена в рекомбинантных клетках-хозяевах, например рекомбинантных дрожжевых клетках. АТФ-цитрат-лиаза также может опосредовать синтез ацетил-КоА, который может быть использован для выработки сквалена и мевалоната, что наблюдалось у дрожжей S. cerevisiae (Rodrigues et al. “ATP citrate lyase mediated cytosolic acetyl-CoA biosynthesis increases mevalonate production in Saccharomyces cerevisiae” Microb Cell Fact. 2016; 15: 48.; включен ссылкой в полном объеме). Пример гена, кодирующего фермент для опосредования синтеза ацетил- КоА, приведен в SEQ ID NO: 130. В некоторых воплощениях настоящего изобретения рекомбинантная клетка включает последовательности, обеспечивающие синтез ацетил-КоА.

Некоторые воплощения, раскрытые в данном документе, предоставляют способы получения Соединения 1, имеющего структуру:

В некоторых воплощениях способы дополнительно включают получение промежуточных соединений на пути получения соединения 1 in vivo. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин, которая продуцирует соединение 1, содержит, по меньшей мере, один фермент, способный превращать оксидосквален с образованием 24,25 эпокси-кукурбитадиенола, превращать оксидосквален в кукурбитадиенол, катализируя гидроксилирование 24,25, эпокси-кукурбитадиенола в 11-гидрокси- 24,25 эпокси кукурбитадиенол, фермент для катализа гидроксилирования кукурбитадиенола до 11-гидрокси-кукурбитадиенола, фермент эпоксидирования кукурбитадиенола до 24,25 эпокси кукурбитадиенола, ферменты, способные катализировать эпоксидирование 11-гидроксикукурбитадиенола для получения 11-гидрокси- 24,25 эпокси-кукурбитадиенола, ферменты для превращения 11-гидрокси-кукурбитадиенола в 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол, ферменты для катализа превращения 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенола с образованием магрола и/или ферменты для катализа гликозилирования предшественника могрозида для получения соединения могрозидов. В некоторых воплощениях фермент для гликозилирования кодируется последовательностью, изложенной в любой из SEQ ID NO: 121, 122, 123 и 124.

В некоторых воплощениях, фермент для катализа гидроксилирования 24,25 эпокси кукурбитадиенола с образованием 11-гидрокси-24,25 эпокси кукурбитадиенола представляет собой CYP5491. В некоторых воплощениях CYP5491 содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 49. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей к последовательности SEQ ID NO: 54.

В некоторых воплощениях фермент, способный эпоксидировать 11-гидроксикукурбитадиенол включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74.

В некоторых альтернативах рекомбинантная клетка включает гены для экспрессии ферментов, способных превращать диоксидосквален в 24,25 эпокси-кукурбитадиенол, превращать оксидосквален в кукурбитадиенол, гидроксилировать 24,25 эпокси-кукурбитадиенол в 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол, гидроксилировать кукурбитадиенол с получением 11-гидрокси-кукурбитадиенола, эпоксидировать кукурбитадиенол с получением 24,25 эпокси-кукурбитадиенола и/или эпоксидировать 11-гидроксикукурбитадиенол с получением 11-гидрокси-24, 25 эпокси-кукурбитадиенола. В этих воплощениях в данном документе промежуточные соединения и могрозиды продуцируются in vivo.

В некоторых воплощениях способ получения соединения 1 дополнительно включает получение одного или нескольких соединений, представляющих собой могрозид, и промежуточных соединений, таких как оксидосквален, диксидосквален, кукурбитдиенол, 24,25 эпокси-кукурбитадиенол, 11-гидрокси-кукурбитадиенол, 11-гидрокси 24, 25 эпокси кукурбитадиенол, могрол и соединения могрозидов.

Способы получения соединений могрозидов

Раскрытое в данном документе включает способы получения соединения могрозидов, например, одного из соединений могрозидов, описанного в WO2014086842 (включено в настоящее описание ссылкой в полном объеме). Соединение могрозида может использоваться клеткой в качестве промежуточного соединения для дальнейшего получения соединения 1, раскрытого в данном документе.

Рекомбинантные хозяева, такие как микроорганизмы, клетки растений или растения, могут быть использованы для экспрессии полипептидов, полезных для биосинтеза могрола (тритерпенового ядра) и различных гликозидов могрола (могрозидов).

В некоторых воплощениях способ производства может содержать один или несколько из следующих стадий в любом порядке:

(1) повышение уровня оксо-сквалена

(2) повышение уровня диоксидосквалена

(3) Оксидосквален -> кукурбитадиенол

(4) Диоксидосквален -> 24,25 эпокси-кукурбитадиенол

(5) Кукурбитадиенол -> 11-гидрокси-кукурбитадиенол

(6) 24,25 эпокси-кукурбитадиенол -> 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол

(7) 11-гидрокси-кукурбитадиенол -> могрол

(8) 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол -> могрол

(9) могрол -> различные соединения могрозида.

В воплощениях настоящего изобретения рекомбинантная клетка также может продуцировать оксидосквален, диоксидосквален, кукурбитадиенол, 24,25 эпокси-кукурбитадиенол или могрол. Способ может включать выращивание рекомбинантного микроорганизма в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируется один или несколько ферментов, катализирующих стадию (стадии) способов по изобретению, например синтазы, гидролазы, CYP450 и/или UGT. Рекомбинантный микроорганизм может быть выращен в периодическом или непрерывном процессе с подпиткой. Как правило, рекомбинантный микроорганизм выращивают в ферментере при определенной температуре(ах) в течение желаемого периода времени, чтобы увеличить выход Соединения 1.

В некоторых воплощениях изобретения соединения могрозидов могут быть получены с использованием целых клеток, которые питаются сырьем, которое содержит молекулы-предшественники, для увеличения выхода Соединения 1. Сырье может подаваться во время роста клеток или после роста клеток. Целые клетки могут быть в суспензии или иммобилизованы. Целые клетки могут находиться в ферментационном бульоне или в реакционном буфере.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую фермент или смесь ферментов, способных катализировать оксидосквален в кукурбитадиенол, кукурбитадиенол в 11-гидроксикукурбитадиенол, 11-гидроксикукурбитадиенол в могрол, и/или могрол к могрозид. В некоторых воплощениях клетка может дополнительно содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую фермент или смесь ферментов, способных катализировать диоксидосквален в 24,25 эпокси-кукурбитадиенол, 24,25 эпокси-кукурбитадиенол в гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол, 11 -гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол в могрол и/или могрол в могрозид.

Клетка-хозяин может содержит рекомбинантный ген, кодирующий кукурбитадиенолсинтазу и/или рекомбинантный ген, кодирующий полипептид цитохрома Р450.

В некоторых воплощениях клетка включает белок, имеющий, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906 (куркурбитадиенолсинтаза).

В некоторых воплощениях воплощения превращение оксидосквалена в кукурбитадиенол катализируется кукурбитадиенолсинтазой любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906, или их функциональным гомологом, разделяющий, по меньшей мере, 70%, например, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 90%, например, по меньшей мере, 95%, например, при, по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей с ними. В некоторых воплощениях полипептид кукурбитадиенолсинтазы содержит С-концевую часть, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 73. В некоторых воплощениях ген, кодирующий полипептид кукурбитадиенолсинтазы, кодон-оптимизирован. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированный ген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 74.

В некоторых воплощениях преобразование кукурбитадиенола в 11-гидрокси-кукурбитадиенол катализируется CYP5491 из SEQ ID NO: 49 или его функциональным гомологом, разделяющим, по меньшей мере, 70%, например, по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 90%, например, по меньшей мере, 95%, например по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей с ними.

В некоторых воплощениях преобразование 11-гидрокси-кукурбитадиенола в могрол включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из эпоксидгидролазы 1 из SEQ ID NO: 29, эпоксидгидролазы 2 из SEQ ID NO: 30 и функциональных гомологов вышеупомянутого, разделяющего, по меньшей мере, 70%, таких как по меньшей мере, 80%, например, по меньшей мере, 90%, например, по меньшей мере, 95%, например, по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей с ними. В некоторых воплощениях гены, кодирующие эпоксидгидролазу 1 и эпоксидгидролазу 2, кодон-оптимизированы для экспрессии. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированные гены эпоксидгидролазы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 114 или 115.

В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза включает аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 21-28 (Itkin et al., включено в настоящее описание ссылкой в полном объеме).

В некоторых воплощениях превращение могрола в могрозид катализируется в рекомбинантной клетке-хозяине одним или несколькими UGT, выбранными из группы, состоящей из UGT1576 SEQ ID NO: 15, UGT98 SEQ ID NO: 9, UGT SK98 из SEQ ID NO: 68 и функциональные гомологи указанного выше разделяют, по меньшей мере, на 70%, например, по меньшей мере, на 80%, например, по меньшей мере, на 90%, например, по меньшей мере, на 95%, например, по меньшей мере, на 98% идентичности последовательностей с ними.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит рекомбинантный ген, кодирующий полипептид цитохрома Р450, кодируемый любой из последовательностей в SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879 881, 883, 885, 887 и 891.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит рекомбинантный ген, кодирующий полипептид скваленэпоксидазы, включающий последовательность в SEQ ID No: 50.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин содержит рекомбинантный ген, кодирующий полипептид кукурбитадиенолсинтазы любого из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422. 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях полипептид кукурбитадиенолсинтазы содержит С-концевую часть, содержащую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 73. В некоторых воплощениях ген, кодирующий полипептид кукурбитадиенолсинтазы, кодон-оптимизирован. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированный ген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 74.

Получение соединений могрозидов из могрола

В некоторых воплощениях изобретения способ получения соединения 1 включает контакт могрозида III_E с первым ферментом, способным катализировать получение соединения 1, из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях способ выполняется in vivo, где рекомбинантная клетка включает ген, кодирующий первый фермент, способный катализировать выработку соединения 1 из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает ген, кодирующий фермент, способный катализировать выработку могрозида IE1 из могрола. В некоторых воплощениях фермент содержит последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 4-8.

В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает ферменты для превращения могрозида II_E в могрозид IV, могрозид V, 11-оксомогрозид V и сиаменозид I. В некоторых воплощениях воплощения ферменты для превращения могрозида II_E в могрозид IV, могрозид V 11-оксомогрозид V и сиаменозид I кодируются генами, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, представленные в SEQ ID NO: 9-14 и 116-120. В некоторых воплощениях способ получения соединения 1 включает обработку Могрозида III_E ферментом глюкозотрансферазой UGT76G1.

В некоторых воплощениях способ включает фракционирование лизата из рекомбинантной клетки на колонке ВЭЖХ и сбора элюированной фракции, содержащей соединение 1.

В некоторых воплощениях способ включает контакт могрозида III_E с первым ферментом, способным катализировать образование соединения 1 из могрозида III_E. В некоторых воплощениях контакт могрозида III_E с первым ферментом включает контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая включает первый ген, кодирующий первый фермент. В некоторых воплощениях первый ген является гетерологичным по отношению к рекомбинантной клетке-хозяину. В некоторых воплощениях изобретения могрозид III_E контактирует с первым ферментом в рекомбинантной клетке-хозяине, которая содержит первый полинуклеотид, кодирующий первый фермент. В некоторых воплощениях изобретения могрозид III_E присутствует в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях изобретения могрозид III_E продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях способ включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируется первый фермент. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой одну или несколько из UDP-гликозилтрансфераз, цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз (ЦГТаз), гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой ЦГТазу. В некоторых воплощениях ЦГТаза включает аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательностью любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях трансглюкозидазы кодируются любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях ЦГТаза содержат или состоят из последовательности, изложенной в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой декстрансукразу. В некоторых воплощениях декстрансукраза включает аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях DexT включает аминокислотную последовательность, любую из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях DexT содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 104 или 105. В некоторых воплощениях декстрансукраза включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или 106-110. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой трансглюкозидазу. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательности любого из SEQ ID NO: 3163-291 и 723. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163-291 и 723. В некоторых воплощениях трансглюкозидазы кодируются любой из SEQ ID NO: 163-291 и 723. В некоторых воплощениях трансглюкозидазы включают аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях гены кодируют ЦГТазу, содержащую одну из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 1, 3, 78-101 и 154.

В некоторых воплощениях способ включает контакт Могрозида II_A с рекомбинантной клеткой-хозяином для получения могрозида IIIE, в котором рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает второй ген, кодирующий второй фермент, способный катализировать продуцирование могрозида III_E из могрозида IIA. В некоторых воплощениях изобретения могрозид II_A продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой одну или несколько из UDP гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). В некоторых воплощениях трансглюкозидазы включают аминокислотную последовательность, представленную любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях гены кодируют ЦГТазу, содержащую аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях UGT представляет собой UGT73C3 (SEQ ID NO: 4), UGT73C6 (SEQ ID NO: 5, 444 или 445), 85C2 (SEQ ID NO: 6), UGT73C5 (SEQ ID NO: 7), UGT73E1 (SEQ ID NO: 8), UGT98 (SEQ ID NO: 9 или 407), UGT1576 (SEQ ID NO: 15), UGT SK98 (SEQ ID NO: 16), UGT430 (SEQ ID NO: 17), UGT1697 (SEQ ID NO: 18), или UGT11789 (SEQ ID NO: 19), или любой из SEQ ID NO: 4, 5, 7-9, 15-19, 125, 126, 128, 129, 293-304, 306, 307, 407 439, 441 и 444. В некоторых воплощениях UGT кодируется геном, представленным в UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13) или UGT10391 (SEQ ID NO: 14).

В некоторых воплощениях способ включает контакт могрола с рекомбинантной клеткой-хозяином для получения могрозида III_E, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать продуцирование могрозида III_E из могрола. В некоторых воплощениях изобретения могрол продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов включают одну или несколько из UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). В некоторых воплощениях UGT представляет собой UGT73C3, UGT73C6, 85C2, UGT73C5, UGT73E1, UGT98, UGT1495, UGT1817, UGT5914, UGT8468, UGT10391, UGT1576, UGT SK98, UGT169, UGT169, UGT169.

В некоторых воплощениях способ включает контакт соединения могрозида с рекомбинантной клеткой-хозяином для получения могрозида III_E, при этом рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать продуцирование могрозида III_E из соединения могрозидов, где соединение могрозидов представляет собой один или несколько из числа могрозида IA1, могрозида IE1, могрозида II_A1, могрозида II_E, могрозида III_A1, могрозида III_A2, могрозида III, могрозида IV, могрозида IV_A, могрозида V или сиаменозида. В некоторых воплощениях соединение могрозидов продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов включают одну или несколько из UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях трансглюкозидазы включают аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях гены кодируют ЦГТазу, содержащую аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях способ включает контакт Могрозида IA1 с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий UGT98 или UGT SK98. В некоторых воплощениях фермент UGT98 или UGT SK98 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 9, 407 или 16. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию Могрозида II_A в клетке. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов содержат аминокислоту, представленную любой из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 106-109, 147, 154, 163-303, 405, 411, 354-405. 447-723, 770, 776 и 782.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт 11-гидрокси-24,25 эпоксикукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает третий ген, кодирующий эпоксидгидролазу. В некоторых воплощениях 11-гидрокси-24,25 эпоксикукурбитадиенол продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт 11-гидрокси-кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит четвертый ген, кодирующий цитохром P450 или эпоксидгидролазу. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется генами, содержащими последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, и 891. В некоторых воплощениях 11-гидрокси-кукурбитадиенол продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт 3, 24, 25 тригидрокси-кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает пятый ген, кодирующий цитохром P450. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется генами, содержащими последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 31-48, 316 и 318. В некоторых воплощениях 3, 24, 25 тригидрокси-кукурбитадиенол продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию могрола в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях цитохром P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 20, 308 или 315. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется генами, содержащими последовательность, изложенную в любой одной SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887 и 891. В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 21-30 и 309-314.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий цитохром P450. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию 11-кукурбитадиенола. В некоторых воплощениях 11-гидроксикукурбитадиенол экспрессируется в клетках, содержащих ген, кодирующий белок CYP87D18 или SgCPR. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 315, 872 или 874. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR кодируется SEQ ID NO: 316, 871 или 873. В некоторых воплощениях кукурбитадиенол продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях ген, кодирующий цитохром P450, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887 и 891. В некоторых воплощениях цитохром P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887 и 891. В некоторых воплощениях полипептид P450 кодируется генами, содержащими последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, и 891.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт 2,3-оксидосквалена с рекомбинантной клеткой-хозяином, в которой рекомбинантная клетка-хозяин содержит седьмой ген, кодирующий кукурбитадиенолсинтазу. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902., 904 или 906. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется одной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903. и 905. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению кукурбитадиенола. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, включающим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 898 или 900. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 897 или 899.

В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется геном, содержащим последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 74. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется геном, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905. В некоторых воплощениях 11-гидроксикукурбитадиенол продуцируется клеткой. В некоторых воплощениях 11-OH кукурбитадиенол экспрессируется в клетках, содержащих ген, кодирующий белок CYP87D18 или SgCPR. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 315, 872 или 874. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR кодируется SEQ ID NO: 316, 871 или 873. В некоторых воплощениях полипептид кукурбитадиенолсинтазы содержит С-концевую часть, содержащую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 73. В некоторых воплощениях ген, кодирующий полипептид кукурбитадиенолсинтазы, кодон-оптимизирован. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированный ген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 74. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422. 424, 426, 446, 902, 904 и 906 (которые включают, например, кукурбитадиенолсинтазу из C pepo, S grosvenorii, C sativus, C melo, C moschata и C maxim). В некоторых воплощениях полипептид кукурбитадиенолсинтазы содержит С-концевую часть, содержащую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 73. В некоторых воплощениях ген, кодирующий полипептид кукурбитадиенолсинтазы, кодон-оптимизирован. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированный ген содержит соотношение нуклеиновых кислот, указанное в SEQ ID NO: 74. В некоторых воплощениях осуществление кукурбитадиенолсинтазы содержит аминокислоту, содержащую полипептид из Lotus japonicas (BAE53431), Populus trichocarpa (XP_002310905), Actaea racemosa (ADC84219), Betula platyphylla (BAB83085), Glycyrrhiza glabra (BAA76902), Vitis vinifera (XP_002264289), Centella asiatica (AAS01524), Centella asiatica (BAA33460), и Betula platyphylla (BAB83086), как описано в WO 2016/050890, включенных в данное описание ссылкой в полном объеме.

В некоторых воплощениях способ включает контакт сквалена с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит восьмой ген, кодирующий скваленэпоксидазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению 2,3-оксидосквалена. В некоторых воплощениях сквален продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 или 335.

В некоторых воплощениях способ включает контакт фарнезилпирофосфата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит девятый ген, кодирующий скваленсинтазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к образованию сквалена. В некоторых воплощениях фарнезилпирофосфат продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях скваленсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 69 или 336.

В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт геранил-ПФ с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит десятый ген, кодирующий фарнезил-ПФ-синтазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению фарнезил-ПФ. В некоторых воплощениях геранил-ПФ продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 338. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого гена функционально связаны с гетерологичным промотором. В некоторых воплощениях гетерологичный промотор представляет собой промотор CMV, EF1a, SV40, PGK1, бета-актин человека, CAG, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, Lac, Ptac, pL или их комбинацию. В некоторых воплощениях промотор является индуцибельным, репрессируемым или конститутивным промотором. В некоторых воплощениях в рекомбинантной клетке-хозяине усиленно продуцируется одно или несколько из числа пирувата, ацетил-КоА, цитрата и промежуточных соединений цикла трикарбоновых кислот. В некоторых воплощениях цитозольная локализация была активирована в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого гена содержат, по меньшей мере, одну последовательность, кодирующую саморасщепляющий пептид 2А. Используемые в данном документе термины «первый», «второй», «третий», «четвертый», «пятый», «шестой», «седьмой», «восьмой», «девятый», «десятый» и т.д. не определяют конкретный порядок и/или требование для присутствия предыдущего числа. Например, описанная в данном документе рекомбинантная клетка-хозяин может содержать первый ген и третий ген, но не второй ген. В качестве другого примера, рекомбинантная клетка-хозяин может содержать первый ген, пятый ген и десятый ген, но не второй ген, третий ген, четвертый ген, шестой ген, седьмой ген, восьмой ген и девятый ген.

Рекомбинантная клетка-хозяин может быть, например, клеткой растения, двустворчатого моллюска, рыбы, гриба, бактерии или млекопитающего. Например, растение выбирают из Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicago, Betula, Astragalus, Jatropha, Camellia, Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia и Morus. В некоторых воплощениях гриб выбирают из Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix, Metarhizium, Aspergillus, Yarrowia и Lipomyces. В некоторых воплощениях гриб представляет собой Aspergillus nidulans, Yarrowia lipolytica или Rhodosporin toruloides. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях дрожжи выбирают из Candida, Sacccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Coniochaeta, Rhodosporidium и Microboryomycetes. В некоторых воплощениях бактерию выбирают из Frankia, Actinobacteria, Streptomyces, Enterococcus. В некоторых воплощениях бактерия представляет собой Enterococcus faecalis. В некоторых воплощениях один или более из первой, второй третий, четвертый, пятый, шестой, седьмой, восьмой, девятый и десятый гены были кодон-оптимизированы для экспрессии в клетке бактерий, млекопитающих, растений, грибов или насекомых. В некоторых воплощениях один или несколько из первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого генов содержат функциональную мутацию, повышающую активность кодируемого фермента. В некоторых воплощениях культивирование рекомбинантной клетки-хозяина включает мониторинг культивирования на pH, уровень растворенного кислорода, уровень азота или их комбинацию условий культивирования. В некоторых воплощениях способ включает выделение соединения 1. В некоторых воплощениях изобретения выделение соединения 1 включает лизис рекомбинантной клетки-хозяина. В некоторых воплощениях выделение Соединения 1 включает выделение Соединения 1 из культуральной среды. В некоторых воплощениях способ включает очистку соединения 1. В некоторых воплощениях очищающее соединение 1 включает ВЭЖХ, твердофазную экстракцию или их комбинацию. В некоторых воплощениях очистка включает сбор рекомбинантных клеток, сохранение надосадочной жидкости и лизис клеток. В некоторых воплощениях лизис включает воздействие на клетки силы сдвига или детергентов, в результате чего получается лизат. В некоторых воплощениях усилие сдвига является результатом обработки ультразвуком, клеточными дезинтеграторами высокого давления или гранулами. В некоторых воплощениях лизат подвергают стадиям фильтрации и очистки. В некоторых воплощениях лизат фильтруют и очищают твердофазной экстракцией.

В некоторых воплощениях предлагается соединение, имеющее структуру соединения 1,

где соединение получают способом любого из альтернативных способов, представленных в настоящем документе.

В некоторых воплощениях предлагается клеточный лизат, содержит соединение 1, имеющее структуру:

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка содержит: соединение 1, имеющее структуру:

и ген, кодирующий фермент, способный катализировать выработку соединения 1 из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях ген является гетерологичным геном для рекомбинантной клетки.

В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка, содержащая первый ген, кодирующий первый фермент, способный катализировать продуцирование соединения 1, имеющего структуру:

из могрозида IIIE. В некоторых воплощениях первый фермент включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 или 154 (ЦГТаза). В некоторых воплощениях первый фермент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 или 154 (ЦГТаза). В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой декстрансукразу. В некоторых воплощениях декстрансукраза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях декстрансукраза содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 103, 104 или 105. В некоторых воплощениях декстрансукраза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 103-110 и 156-162 и 896. В некоторых воплощениях DexT содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 104 или 105. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой трансглюкозидазу. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательности SEQ ID NO: 201 или SEQ ID NO: 291. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка дополнительно включает второй ген, кодирующий уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). В некоторых воплощениях UGT включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18 и 19. В некоторых воплощениях UGT содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 16, 17 и 18. В некоторых воплощениях UGT кодируется последовательностью, изложенной в UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13), или UGT10391 (SEQ ID NO: 14). В некоторых воплощениях клетка включает третий ген, кодирующий UGT98 или UGT SK98. В некоторых воплощениях UGT98 или UGT SK98 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 9, 407 или 16. В некоторых воплощениях клетка включает четвертый ген, кодирующий эпоксидгидролазу. В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 21-30 и 309-314. В некоторых воплощениях клетка включает пятую последовательность, кодирующую P450. В некоторых воплощениях P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 20, 49, 308, 315 или 317. В некоторых воплощениях P450 кодируется геном, содержащим последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887 и 891. В некоторых воплощениях дополнительно включает шестую последовательность, кодирующую кукурбитадиенолсинтазу. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях полипептид кукурбитадиенолсинтазы содержит С-концевую часть, содержащую последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 73. В некоторых воплощениях ген, кодирующий полипептид кукурбитадиенолсинтазы, кодон-оптимизирован. В некоторых воплощениях кодон-оптимизированный ген содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 74. В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает седьмой ген, кодирующий скваленэпоксидазу. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 и 335. В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает восьмой ген, кодирующий скваленсинтазу. В некоторых воплощениях восьмой ген включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 69 или SEQ ID NO: 336. В некоторых воплощениях клетка дополнительно включает девятый ген, кодирующий фарнезил-ПФ-синтазу. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 338. В некоторых воплощениях клетка представляет собой клетку млекопитающего, бактерии, гриба или насекомого. В некоторых воплощениях клетка представляет собой дрожжевую клетку. Неограничивающие примеры дрожжей включают Candida, Sacccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Conioboorycetace. В некоторых воплощениях растение выбирают из группы, состоящей из Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicago, Betula, Astragalus, Jatropha, Camellia, Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia и Morus. В некоторых воплощениях гриб представляет собой Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix или Metarhizium.

В некоторых воплощениях клетка включает последовательность фермента, изложенную в любой из SEQ ID NO: 897, 899, 909, 911, 913, 418, 421, 423, 425, 427, 871, 873, 901, 903 или 905. В некоторых воплощениях фермент содержит последовательность, представленную или кодируемую последовательностью в SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 446, 872, 874-896, 898, 900, 902, 904, 906, 908. 910, 912 и 951-1012.

В некоторых воплощениях ДНК может быть получена путем синтеза генов. Это может быть осуществлено, например, с помощью Genescript или IDT. ДНК можно клонировать с помощью стандартных методов молекулярной биологии в вектор для сверхэкспрессии, такой как, например, pQE1, pGEX-4t3, pDest-17, серии pET, pFASTBAC. Штаммы-хозяева E.coli могут быть использованы для продуцирования фермента (то есть Top10 или серии BL21 +/- кодон плюс) с использованием 1 мМ IPTG для индукции при OD 600 равного 1. Штаммы E. coli могут быть размножены при 37°С, 250 об/мин и переключены при комнатной температуре или 30°С (150 об/мин) на индукцию. Если указано, некоторые ферменты также могут экспрессироваться с помощью линии клеток насекомых SF9 с использованием pFASTBAC и оптимизированного MOI. Неочищенный экстракт, содержащий ферменты, может быть получен путем обработки ультразвуком и использован для реакций, описанных в настоящем документе. Все реакции UDP-гликозилтрансферазы включают сахарозосинтазу и могут быть получены в A. thaliana путем синтеза генов и могут быть экспрессированы в E.coli.

Гидролиз гипергликозилированных могрозидов с образованием Соединения 1

В некоторых воплощениях, гипер-гликозилированные могрозиды могут быть гидролизованы с получением соединения 1. Неограничивающие примеры гипергликозилированных могрозидов включают Могрозид V, Сиаменозид I, Могрозид IV_E, Изомогрозид V, Могрозид III_E, 11-Дезокси-Могрозид V, 11-Оксо-Могрозид V, Могрозид VI, Могрозид IV_A, Могрозид II_А, Могрозид II_А1, Могрозид II_А2, Могрозид I_А, 11-оксо-Могрозид VI, 11-оксо-Могрозид III_E, 11-оксо-Могрозид IV_E, Могрозид I_E, Могрол, 11-оксо-могрол, Могрозид II_E, Могрозид III_A2 и Могрозид III. Ферментами, способными катализировать процесс гидролиза с образованием соединения 1, могут быть, например, ЦГТаза (например, демонстрирует гидролиз без крахмала), целлюлазы, β-глюкозидазы, трансглюкозидазы, амилазы, пектиназы, декстраназы и грибные лактазы. Аминокислотные последовательности некоторых из этих ферментов и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие некоторые из этих ферментов, можно найти в таблице 1.

В некоторых воплощениях Соединение 1 проявляет толерантность к гидролитическим ферментам в рекомбинантной клетке, где гидролитические ферменты проявляют способности гидролизовать Могрозид VI, Могрозид V, Могрозид IV до Могрозида IIIE. Альфа-связанный гликозид, присутствующий в соединении 1, обеспечивает уникальное преимущество перед другими могрозидами (бета-связанными гликозидами) благодаря своей устойчивости к гидролизу. Во время микробного продуцирования Соединения 1 рекомбинантные клетки-хозяева (например, микробные клетки-хозяева) могут гидролизовать нежелательные бета-связанные Могрозиды обратно в Могрозид IIIE. Не будучи связанными какой-либо конкретной теорией, полагаем, что гидролиз клетками-хозяевами может улучшить чистоту соединения 1 вследствие: 1) снижения уровней нежелательного Могрозида VI, Могрозида V и Могрозида IV и/или 2) гидролиз увеличит количество Могрозида III_E, доступного для применения в качестве предшественника для получения Соединения 1.

Очистка соединений могрозидов

Некоторые воплощения включают выделение соединений могрозидов, например, соединения 1. В некоторых воплощениях изобретения выделение соединения 1 включает лизис рекомбинантной клетки-хозяина. В некоторых воплощениях выделение Соединения 1 включает выделение Соединения 1 из культуральной среды. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает очистку соединения 1. В некоторых воплощениях очистка соединения 1 включает ВЭЖХ, твердофазную экстракцию или их комбинацию. В некоторых воплощениях очистка включает сбор рекомбинантных клеток, сохранение надосадочной жидкости и лизис клеток. В некоторых воплощениях лизис включает воздействие на клетки силы сдвига или детергентов, в результате чего получается лизат. В некоторых воплощениях усилие сдвига является результатом обработки ультразвуком, клеточными дезинтеграторами высокого давления или гранулами. В некоторых воплощениях лизат подвергают стадиям фильтрации и очистки. В некоторых воплощениях лизат фильтруют и очищают твердофазной экстракцией. Затем лизат можно отфильтровать и обработать сульфатом аммония для удаления белков и фракционировать на ВЭЖХ C18 (колонка Atlantis Prep T3 OBD 5 × 10 см, 5 мкм, Waters) и путем инъекций с использованием градиента A/B (A = вода B = ацетонитрил) от 10 → 30% B в течение 30 минут, с промывкой 95% B, с последующим повторным уравновешиванием при 1% (общее время прогона = 42 минуты). Прогоны могут быть собраны в тарированные пробирки (12 фракций/планшет, 3 планшета на серию) в количестве 30 мл/фракция. Лизат также может быть центрифугирован для удаления твердого вещества и взвешенных частиц. Затем планшеты могут быть высушены в Genevac HT12/HT24. Ожидается, что желаемое соединение будет элюировано во фракции 21 вместе с другими изомерами. Объединенные фракции могут быть дополнительно фракционированы в 47 прогонах на фторфенильной ВЭЖХ-колонке (3 × 10 см, колонка Xselect фторфенил OBD, 5 мкм, Waters) с использованием градиента A/B (A = вода, B = ацетонитрил) 15± 30% в течение 35 минут, с промывкой 95% B, с последующим повторным уравновешиванием при 15% (общее время пробега = 45 минут). Каждый прогон собирали в 12 тарированных пробирок (12 фракций/планшет, 1 планшет на серию) по 30 мл/фракция. Фракции, содержащие желаемый пик с желаемой чистотой, могут быть объединены на основе анализа UPLC и высушены при пониженном давлении, с получением беловатого порошкообразного твердого вещества. Чистое соединение может быть повторно суспендировано/растворено в 10 мл воды и лиофилизировано для получения чистоты, по меньшей мере, 95%.

Для очистки Соединения 1 в некоторых воплощениях соединение может быть очищено твердофазной экстракцией, что может устранить необходимость в ВЭЖХ. Соединение 1 может быть очищено, например, до или около 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% чистоты или любого уровня чистоты в пределах диапазона, описанного любыми двумя вышеупомянутыми значениями. В некоторых воплощениях соединение 1, которое очищают твердофазной экстракцией, является или по существу идентично очищенному ВЭЖХ материалу. В некоторых воплощениях способ включает фракционирование лизата из рекомбинантной клетки на колонке ВЭЖХ и сбора элюированной фракции, содержащей соединение 1.

Ферментация

Для получения Соединения 1 клетки-хозяева могут быть ферментированы в соответствии с описанием в данном документе. Этот процесс может также включать способы, которые происходят в воздухе или без него и могут быть выполнены, например, в анаэробной среде. Целые клетки (например, рекомбинантные клетки-хозяева) могут находиться в ферментационном бульоне или в реакционном буфере.

Экстракт плодов архата (Siraitia grosvenorii) также можно использовать для контакта с клетками с целью получения соединения 1. В некоторых воплощениях предлагается способ получения Соединения 1. Способ может включать контакт экстракта плодов архата с первым ферментом, способным катализировать выработку Соединения 1 из могрозида, такого как Могрозид V, Сиаменозид I, Могрозид IV_E, Изомогрозид V, Могрозид III_E, 11-Дезокси-Могрозид V, 11-оксо-Могрозид V, Могрозид VI, Могрозид IV_A, Могрозид II_A, Могрозид IIA1, Могрозид IIA2, Могрозид I_A, 11-оксо-Могрозид VI, 11-оксо-Могрозид III_E, 11-оксо-Могрозид IV_E, Могрозид I_E, Могрол, 11-оксо-могрол, Могрозид II_E, Могрозид III_A2 и Могрозид III. В некоторых воплощениях контакт включает контакт экстракта плодов могрола с рекомбинантной клеткой-хозяином, которая включает первый ген, кодирующий первый фермент. В некоторых воплощениях первый ген является гетерологичным по отношению к рекомбинантной клетке-хозяину. В некоторых воплощениях экстракт плодов могрола контактирует с первым ферментом в рекомбинантной клетке-хозяине, которая содержит первый полинуклеотид, кодирующий первый фермент. В некоторых воплощениях изобретения могрозид III_E находится в экстракте плодов могрола. В некоторых воплощениях изобретения могрозид III_E также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает культивирование рекомбинантной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, в которых экспрессируется первый фермент. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой одну или несколько из UDP-гликозилтрансфераз, цикломальтодекстрин-глюканотрансфераз (ЦГТаз), гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой ЦГТазу. Например, ЦГТаза может включать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или более идентичности последовательностей с последовательностью любой из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях ЦГТаза включает аминокислотную последовательность одной из SEQ ID NO: 1, 3, 78-101, 148 и 154. В некоторых воплощениях ЦГТаза включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 78-101. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой декстрансукразу. В некоторых воплощениях декстрансукраза включает аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях декстрансукраза включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой трансглюкозидазу. В некоторых воплощениях трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую последовательность, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с последовательности любого из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях воплощения трансглюкозидаза включает аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 163-290 и 723. В некоторых воплощениях первый фермент представляет собой бета-глюкозидазу. В некоторых воплощениях бета-глюкозидаза включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 292, или аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 292. В некоторых воплощениях экстракт плодов могрола содержит Могрозид II_A, а рекомбинантная клетка-хозяин содержит второй ген, кодирующий второй фермент, способный катализировать выработку могрозида III_E из Могрозида II_A. В некоторых воплощениях изобретения могрозид II_A также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). В некоторых воплощениях UGT представляет собой UGT73C3 (SEQ ID NO: 4), UGT73C6 (SEQ ID NO: 5, 444 или 445), 85C2 (SEQ ID NO: 6), UGT73C5 (SEQ ID NO: 7), UGT73E1 (SEQ ID NO: 8), UGT98 (SEQ ID NO: 9 или 407), UGT1576 (SEQ ID NO: 15), UGT SK98 (SEQ ID NO: 16), UGT430 (SEQ ID NO: 17), UGT1697 (SEQ ID NO: 18), UGT11789 (SEQ ID NO: 19) или включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с UGT73C3 (SEQ ID NO: 4), UGT73C6 (SEQ ID NO: 5, 444 или 445), 85C2 (SEQ ID NO: 6), UGT73C5 (SEQ ID NO: 7), UGT73E1 (SEQ ID NO: 8), UGT98 (SEQ ID NO: 9 или 407), UGT1576 (SEQ ID NO: 15), UGT SK98 (SEQ ID NO: 16), UGT430 (SEQ ID NO: 17), UGT1697 (SEQ ID NO: 18), UGT11789 (SEQ ID NO: 19). В некоторых воплощениях UGT кодируется геном, представленным в UGT1495 (SEQ ID NO: 10), UGT1817 (SEQ ID NO: 11), UGT5914 (SEQ ID NO: 12), UGT8468 (SEQ ID NO: 13) или UGT10391 (SEQ ID NO: 14). В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит могрол. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт могрола с экстрактом плода монаха, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать выработку Могрозида III_E из могрола. В некоторых воплощениях, могрол также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов включают одну или несколько из UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях второй фермент представляет собой уридиндифосфат-глюкозилтрансферазу (UGT). В некоторых воплощениях UGT представляет собой UGT73C3, UGT73C6, 85C2, UGT73C5, UGT73E1, UGT98, UGT1495, UGT1817, UGT5914, UGT8468, UGT10391, UGT1576, UGT SK98, UGT97 или, по меньшей мере, UGT119, UGT119, UGT119 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с этими UGT. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой-хозяином для получения могрозида III_E, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает один или несколько генов, кодирующих один или несколько ферментов, способных катализировать выработку Могрозида III_E из соединения могрозида где соединение могрозидов представляет собой один или несколько из могрозида I_A1, могрозида I_E1, могрозида II_A1, могрозида II_E, могрозида II_A, могрозида III_A1, могрозида III_A2, могрозида III, могрозида IV, могрозида IV_A, могрозида V или сиаменозида. В некоторых воплощениях соединение могрозида также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов включают одну или несколько из UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В некоторых воплощениях соединение могрозида представляет собой Могрозид II_E. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов содержат аминокислоту, представленную любой из SEQ ID NO: 293-303. В некоторых воплощениях изобретения соединение могрозида представляет собой Могрозид II_A или Могрозид II_E, и в котором контакт экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой, экспрессирующей один или несколько ферментов, продуцирует Могрозид III_A, Могрозид IV_E и Могрозид V. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов содержат аминокислоту, указанную в SEQ ID NO: 304. В некоторых воплощениях один или несколько ферментов кодируются последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 305. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит Могрозид IA1. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий UGT98 или UGT SK98. В некоторых воплощениях фермент UGT98 или UGT SK98 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 9, 407, 16 или 306. В некоторых воплощениях UGT98 кодируется последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 307. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию Могрозида II_A в клетке. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает третий ген, кодирующий эпоксидгидролазу. В некоторых воплощениях 11-гидрокси-24,25 эпокси-кукурбитадиенол также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит четвертый ген, кодирующий цитохром P450 или эпоксидгидролазу. В некоторых воплощениях 11-гидрокси-кукурбитадиенол также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит 3, 24, 25 тригидрокси-кукурбитадиенол. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин дополнительно включает пятый ген, кодирующий цитохром P450. В некоторых воплощениях 3, 24, 25 тригидрокси-кукурбитадиенол также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях контакт с экстрактом плодов могрола приводит к продуцированию могрола в рекомбинантной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях цитохром P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 20 или 308. В некоторых воплощениях эпоксидгидролаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 21-30 и 309-314. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит кукурбитадиенол. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт кукурбитадиенола с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит ген, кодирующий цитохром P450. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению 11-гидроксикукурбитадиенола. В некоторых воплощениях 11-гидроксикукурбитадиенол экспрессируется в клетках, содержащих ген, кодирующий белок CYP87D18 или SgCPR. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 315, 872 или 874. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR кодируется SEQ ID NO: 316, 871 или 873. В некоторых воплощениях кукурбитадиенол также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях ген, эндоцитирующий цитохром P450, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 31-48, 316, 431, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887 и 891. В некоторых воплощениях цитохром P450 включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 20 или 49. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит 2,3-оксидосквален. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт 2,3-оксидосквалена экстракта плодов архата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит седьмой ген, кодирующий кукурбитадиенолсинтазу. В некоторых воплощениях изобретения кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 или 906. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 или 905. В некоторых воплощениях экстракт из плодов монаха содержит промежуточные соединения могрозидов, такие как Могрозид V, Сиаменозид I, Могрозид IV_E, Изомогрозид V, Могрозид III_E, 11-Дезокси-Могрозид V, 11-Оксо-могрозид V, Могрозид VI, Могрозид IV_A, Могрозид II_A, Могрозид IIA1, Могрозид IIA2, Могрозид IA, 11-оксо-Могрозид VI, 11-оксо-Могрозид III_E, 11-оксо-Могрозид IV_E, Могрозид I_E, Могрол, 11-оксо-могрол, Могрозид II_E, Могрозид III_A2 и Могрозид III. В некоторых воплощениях этот способ дополнительно включает контакт промежуточного соединения с могрозидом с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит седьмой ген, кодирующий кукурбитадиенолсинтазу. В некоторых воплощениях изобретения кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 или 906. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 или 905. В некоторых воплощениях контакт приводит к продуцированию кукурбитадиенола. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален и диэпоксисквален также продуцируются рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, включающим последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 898 или 900 или содержащая последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 898 или 900. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 897 или 899; или кодируется нуклеиновой кислотой, представленной в SEQ ID NO: 897 или 899.

В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 70-73, 75-77, 319, 321, 323, 325, 327-333, 420, 422, 424, 426, 446, 902, 904 и 906. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза представляет собой кукурбитадиенолсинтазу из C pepo, S grosvenorii, C sativus, C melo, C moschata или C maxim. В некоторых воплощениях кукурбитадиенолсинтаза кодируется геном, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любым два из этих чисел, идентичность последовательности любому из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905 или содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, представленной в любой из SEQ ID NO: 74, 320, 322, 324, 326, 328, 418, 421, 423, 425, 427, 897, 899, 901, 903 и 905. В некоторых воплощениях 11-ОН кукурбитадиенол продуцируется клеткой. В некоторых воплощениях 11-OH кукурбитадиенол экспрессируется в клетках, содержащих ген, кодирующий CYP87D18 или SgCPR. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR содержит последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 315, 872 или 874, или последовательность, указанную в SEQ ID NO: 315, 872 или 874. В некоторых воплощениях CYP87D18 или SgCPR кодируется последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO: 316, 871 или 873 или последовательность, указанную в SEQ ID NO: 316, 871 или 873. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит сквален. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают ферментом, включающим последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более идентичности последовательностей с SEQ. ID NO: 898 или 900, или последовательность, представленную в SEQ ID NO: 898 или 900. В некоторых воплощениях 2,3-оксидосквален или диэпоксисквален получают с помощью фермента, кодируемого нуклеотидной последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100 % или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с SEQ ID NO; 897 или 899, или последовательность, представленную в SEQ ID NO: 897 или 899. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт сквалена с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит восьмой ген, кодирующий скваленэпоксидазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению 2,3-оксидосквалена. В некоторых воплощениях сквален также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях скваленэпоксидаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% или диапазон между любыми двумя из этих значений, идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 или 335. В некоторых воплощениях эпоксид сквалена кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 335. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит фарнезилпирофосфат. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт фарнезилпирофосфата с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит девятый ген, кодирующий скваленсинтазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к образованию сквалена. В некоторых воплощениях фарнезилпирофосфат также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях скваленсинтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или более идентичности последовательностей с любой из SEQ ID NO: 69 и 336. В некоторых воплощениях скваленсинтаза кодируется последовательностью, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO: 337. В некоторых воплощениях экстракт плодов архата содержит геранил-ПФ. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает контакт геранил-ПФ с рекомбинантной клеткой-хозяином, где рекомбинантная клетка-хозяин содержит десятый ген, кодирующий фарнезил-ПФ-синтазу. В некоторых воплощениях контакт приводит к получению фарнезил-ПФ. В некоторых воплощениях геранил-ПФ также продуцируется рекомбинантной клеткой-хозяином. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза включает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 98%, по меньшей мере, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 338. В некоторых воплощениях фарнезил-ПФ-синтаза кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 339. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого гена функционально связаны с гетерологичным промотором. В некоторых воплощениях гетерологичный промотор представляет собой CMV, EF1a, SV40, PGK1, бета-актин человека, CAG, GAL1, GAL10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, Ptac. pL промотор или их комбинацию. В некоторых воплощениях промотор является индуцибельным, репрессируемым или конститутивным промотором. В некоторых воплощениях в рекомбинантной клетке-хозяине положительно регулируется выработка одного или нескольких из числа пирувата, ацетил-КоА, цитрата и промежуточных соединений цикла трикарбоновых кислот. В некоторых воплощениях в рекомбинантной клетке-хозяине положительно регулируется цитозольная локализация. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого гена содержат, по меньшей мере, одну последовательность, кодирующую саморасщепляющий пептид 2А. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой клетку растения, двустворчатого моллюска, рыбы, гриба, бактерии или млекопитающего. В некоторых воплощениях растение выбирают из Siraitia, Momordica, Gynostemma, Cucurbita, Cucumis, Arabidopsis, Artemisia, Stevia, Panax, Withania, Euphorbia, Medicago, Chlorophytum, Eleutherococcus, Aralia, Morus, Medicago, Betula, Astrahausus Astragalus Hypholoma, Aspergillus, Solanum, Huperzia, Pseudostellaria, Corchorus, Hedera, Marchantia и Morus. В некоторых воплощениях гриб выбирают из Trichophyton, Sanghuangporus, Taiwanofungus, Moniliophthora, Marssonina, Diplodia, Lentinula, Xanthophyllomyces, Pochonia, Colletotrichum, Diaporthe, Histoplasma, Coccidioides, Histoplasma, Sanghuangporus, Aureobasidium, Pochonia, Penicillium, Sporothrix, Metarhizium, Aspergillus, Yarrowia и Lipomyces. В некоторых воплощениях гриб представляет собой Aspergillus nidulans, Yarrowia lipolytica или Rhodosporin toruloides. В некоторых воплощениях рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых воплощениях дрожжи выбирают из Candida, Sacccharaomyces, Saccharomycotina, Taphrinomycotina, Schizosaccharomycetes, Komagataella, Basidiomycota, Agaricomycotina, Tremellomycetes, Pucciniomycotina, Aureobasidium, Coniochaeta, Rhodosporidium и Microboryomycetes. В некоторых воплощениях бактерии выбраны из группы, состоящей из Frankia, Actinobacteria, Streptomyces и Enterococcus. В некоторых воплощениях бактерией является Enterococcus faecalis. В некоторых воплощениях один или несколько генов первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого кодонов оптимизированы для экспрессии в клетках бактерий, млекопитающих, растений, грибов или насекомых. В некоторых воплощениях один или несколько из числа первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого и десятого генов содержат функциональную мутацию, повышающую активность кодируемого фермента. В некоторых воплощениях культивирование рекомбинантной клетки-хозяина включает мониторинг культивирования на pH, уровень растворенного кислорода, уровень азота или их комбинацию условий культивирования. В некоторых воплощениях способ включает выделение соединения 1. В некоторых воплощениях изобретения изолирующее соединение 1 включает лизис рекомбинантной клетки-хозяина. В некоторых воплощениях выделение Соединения 1 включает выделение Соединения 1 из культуральной среды. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает очистку соединения 1. В некоторых воплощениях очистка соединения 1 включает ВЭЖХ, твердофазную экстракцию или их комбинацию. В некоторых воплощениях очистка дополнительно включает сбор рекомбинантных клеток, сохранение надосадочной жидкости и лизис клеток. В некоторых воплощениях лизис включает воздействие на клетки сдвигового усилия или детергентов, в результате чего получается лизат. В некоторых воплощениях сдвиговая сила является результатом обработки ультразвуком, клеточных дезинтеграторов высокого давления или гранул. В некоторых воплощениях лизат подвергают стадиям фильтрации и очистки. В некоторых воплощениях лизат фильтруют и очищают твердофазной экстракцией. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает второе или третье добавление экстракта плодов архата в питательную среду рекомбинантных клеток-хозяев. Кроме того, способ может быть осуществлен путем контакта экстракта плодов архата с лизатом рекомбинантных клеток, где лизат рекомбинантных клеток содержит экспрессированные ферменты, перечисленные в данном документе.

Как правило, соединения, раскрытые и описанные в данном документе, по отдельности или в комбинации, могут быть предоставлены в композиции, такой как, например, проглатываемая композиция. В одном воплощении соединения, которые раскрыты и описаны в настоящем документе, по отдельности или в комбинации, могут придавать сладкий вкус проглатываемой композиции. В других воплощениях соединения, раскрытые и описанные в настоящем документе, по отдельности или в комбинации, могут действовать как усилитель сладкого вкуса для усиления сладости другого подсластителя. В других воплощениях соединения, раскрытые в данном документе, придают более сахароподобный временной профиль и/или вкусовой профиль композиции подсластителя путем объединения одного или нескольких соединений, которые раскрыты и описаны в данном документе, с одним или несколькими другими подсластителями в композиции подсластителя. В другом воплощении соединения, которые раскрыты и описаны в данном документе, по отдельности или в комбинации, могут увеличивать или усиливать сладкий вкус композиции путем контакта ее композиции с соединениями, которые раскрыты и описаны в настоящем документе, с образованием модифицированной композиции. В другом воплощении соединения, которые раскрыты и описаны в данном документе, по отдельности или в комбинации, могут находиться в композиции, которая модулирует сладкие рецепторы и/или их лиганды, экспрессируемые в организме, отличном от вкусовых рецепторов.

Используемый в данном документе термин «композиция для приема внутрь» включает любую композицию, которая, отдельно или вместе с другим веществом, подходит для приема внутрь, предназначена ли она для потребления или нет. Пищевая композиция включает как «продукты питания или напитки», так и «непищевые продукты». Под «продуктами питания или напитками» подразумевается любой съедобный продукт, предназначенный для потребления людьми или животными, включая твердые вещества, полутвердые вещества или жидкости (например, напитки), и включает функциональные пищевые продукты (например, любую свежую или обработанную пищу, заявленную иметь свойства, способствующие укреплению здоровья и/или профилактике заболеваний, выходящие за рамки основной питательной функции поставки питательных веществ). Термин «непищевые продукты или напитки» или «непригодная для употребления композиция» включает любой продукт или композицию, которые могут быть приняты человеком или животными для целей, отличных от потребления, или в качестве пищи или напитка. Например, непищевой продукт или напиток или нерастворимая композиция включает добавки, нутрицевтики, фармацевтические и безрецептурные лекарства, средства по уходу за полостью рта, такие как средства для чистки зубов и полоскания для рта, и жевательная резинка.

Композиции, содержащие соединения могрозидов

Также в данном документе раскрыты композиции, например, композиции для приема внутрь, содержащие одно или несколько из соединений могрозидов, раскрытых в данном документе, включая, без ограничения указанным, соединение 1 и соединения, показанные на фигуре 43. В некоторых воплощениях принимаемая внутрь композиция может представлять собой напиток. Например, напиток может быть выбран из группы, состоящей из улучшенных газированных напитков, колы, газированных напитков со вкусом лимона и лайма, газированных напитков со вкусом апельсина, газированных напитков со вкусом винограда, газированных напитков со вкусом клубники, газированных напитков со вкусом ананаса, имбирного эля, корневого пива, фруктовых соков, фруктовых соков, фруктовых напитков, нектаров, овощных соков, овощных напитков, спортивных напитков, энергетических напитков, улучшенных водных напитков, улучшенной вода с витаминами, ароматизированных напитков, кокосовой воды, напитков типа чая, кофе, какао-напитков, напитков, содержащих молочные компоненты, напитков, содержащих экстракты злаков, и смузи. В некоторых воплощениях напиток может быть безалкогольным напитком.

«Приемлемый для употребления ингредиент» представляет собой вещество, которое подходит для перорального приема и может быть объединено с соединением, описанным в настоящем документе, для образования композиции для приема внутрь. Приемлемый для употребления ингредиент может быть в любой форме в зависимости от предполагаемого применения продукта, например, твердым, полутвердым, жидким, пастой, гелем, лосьоном, кремом, пенистым материалом, суспензией, раствором или любыми их комбинациями (такими как жидкость, содержащая твердое содержимое). Приемлемый для употребления ингредиент может быть искусственным или натуральным. Ингредиенты, приемлемые для приема внутрь, включают много общих пищевых ингредиентов, таких как вода с нейтральным, кислым или щелочным pH, фруктовые или овощные соки, уксус, маринады, пиво, вино, природные водно-жировые эмульсии, такие как молоко или сгущенное молоко, пищевые масла и шортенинги, жирные кислоты и их алкильные эфиры, низкомолекулярные олигомеры пропиленгликоля, глицериловые эфиры жирных кислот и дисперсии или эмульсии таких гидрофобных веществ в водных средах, соли, как хлорид натрия, пшеничная мука, растворители, такие как этанол, твердые пищевые продукты разбавители, такие как растительные порошки или мука, или другие жидкие носители; дисперсионные или суспензионные средства; поверхностно-активные вещества; изотонические агенты; загустители или эмульгаторы, консерванты; твердые связующие вещества; смазки и тому подобное.

Дополнительные приемлемые для употребления ингредиенты включают кислоты, включая, без ограничения указанным, лимонную кислоту, фосфорную кислоту, аскорбиновую кислоту, сульфат натрия, молочную кислоту или винную кислоту; горькие ингредиенты, включая, например, кофеин, хинин, зеленый чай, катехины, полифенолы, экстракт зеленого кофе робусты, экстракт зеленого кофе, изолят сывороточного белка или хлорид калия; красящие агенты, включая, например, карамельный цвет, красный № 40, желтый № 5, желтый № 6, синий № 1, красный № 3, фиолетовую морковь, черный морковный сок, фиолетовый батат, овощной сок, фруктовый сок, бета-каротин, куркумин куркумы или диоксид титана; консерванты, включая, например, бензоат натрия, бензоат калия, сорбат калия, метабисульфат натрия, сорбиновую кислоту или бензойную кислоту; антиоксиданты, включая, например, аскорбиновую кислоту, динатрий-кальций-ЭДТА, альфа-токоферолы, смешанные токоферолы, экстракт розмарина, экстракт виноградных косточек, ресвератрол или гексаметафосфат натрия; витамины или функциональные ингредиенты, включая, например, ресвератрол, Co-Q10, омега-3 жирные кислоты, теанин, холинхлорид (цитоколин), фиброзол, инулин (корень цикория), таурин, экстракт женьшеня, экстракт гуананы, экстракт имбиря, L-фенилаланин, L-карнитин, L-тартрат, D-глюкононолактон, инозит, биофлавоноиды, эхинацею, гинко билоба, мате, масло льняного семени, экстракт кожуры гарцинии камбоджийской, экстракт белого чая, рибозу, экстракт расторопши, экстракт виноградных косточек, пиродиксин HCl (витамин B6), цианообаламин (витамин B12), ниацинамид (витамин B3), биотин, лактат кальция, пантотенат кальция (пантотеновая кислота), фосфат кальция, карбонат кальция, хлорид хрома, полиникотинат хрома, сульфат меди, фолиевая кислота, пирофосфат железа, железо, лактат магния, карбонат магния, сульфат магния, монокалий фосфат, мононатрий фосфат, фосфор, йодид калия, фосфат калия, рибофлавин, сульфат натрия, глюконат натрия, полифосфат натрия, натрий бикарбонат, тиаминмононитрат, витамин D3, пальмитат витамина A, глюконат цинка, лактат цинка или сульфат цинка; вещества, вызывающие помутнение, включая, например, эфир канифоли, бромированное растительное масло (BVO) или изобутират ацетата сахарозы (SAIB); буферы, включая, например, цитрат натрия, цитрат калия или соль; ароматизаторы, включая, например, пропиленгликоль, этиловый спирт, глицерин, гуммиарабик (камедь акации), мальтодекстрин, модифицированный кукурузный крахмал, декстрозу, натуральный ароматизатор, натуральный ароматизатор с другими натуральными ароматизаторами (натуральный ароматизатор WONF), натуральные и искусственные ароматизаторы, искусственные ароматизатор, диоксид кремния, карбонат магния или трикальций фосфат; и стабилизаторы, включая, например, пектин, ксантановую камедь, карбоксиметилцеллюлозу (CMC), полисорбат 60, полисорбат 80, триглицериды со средней длиной цепи, целлюлозный гель, целлюлозную камедь, казеинат натрия, модифицированный пищевой крахмал, гуммиарабик (камедь акации) или каррагинан.

Примеры

Некоторые аспекты воплощений, обсужденных выше, раскрыты более подробно в следующих примерах, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего раскрытия.

Пример 1. Получение сиаменозида I

Как раскрыто в данном описании, сиаменозид I может быть промежуточным соединением могрозидов для получения соединения 1, описанного в данном документе. Например, сиаменозид I может быть гидролизован с образованием могрозида III_E, который затем может быть использован для получения соединения 1. Например, способ получения сиаменозида I может включать: контакт могрола с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать рекомбинантную клетку, экспрессирующую пектиназу из Aspergillus aculeatus.

В качестве другого примера, способ получения сиаменозида I может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-Дезокси-могрозида V, 11-оксо-Могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида I_E, Могрола, 11-оксомогрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать пектиназу из Aspergillus aculeatus.

Пример 2. Получение Могрозида IV_E

Как раскрыто в данном документе, Могрозид IV_E может быть промежуточным соединением могрозидов для получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, Могрозид IV_E из могрозида V затем может быть использован для получения Соединения 1. Например, способ получения могрозида IV_E может включать: контакт могрозида V с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. В качестве другого примера рекомбинантная клетка может содержать ген, кодирующий пектиназу. Пектиназа может кодироваться геном Aspergillus aculeatus.

В качестве другого примера, способ получения Могрозид IV_E может включать: контакт одного или более из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изо-могрозида V, Могрозида IIIЕ, 11-дезокси-Могрозида V, 11- Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида I_E, Могрол, 11-оксомогрол, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать пектиназу из Aspergillus aculeatus.

Пример 3. Получение Могрозида III_E

Как раскрыто в данном документе, Могрозид III_E может быть промежуточным соединением могрозидов для получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, Могрозид II_A может быть гликозилирован для получения могрозида III_E, который затем может быть использован для получения соединения 1.

В качестве другого примера, способ получения могрозида III_E может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Могрозида II_A, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-Дезокси-могрозида V, 11-оксо-Могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида I_E, Могрола, 11-оксомогрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, пектиназа из Aspergillus aculeatus может кодироваться геном в рекомбинантной клетке-хозяине.

Пример 4. Получение Могрозида IV_A

Как раскрыто в данном описании, Могрозид IV_A может быть промежуточным соединением могрозидов для получения соединения 1, описанного в данном документе. Например, Могрозид IV_A из могрозида V можно затем использовать для получения Соединения 1.

Например, способ получения Могрозид IV_A может включать: контакт Могрозида V с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент также может представлять собой, например, β-галактозидазу из Aspergillus oryzae.

В качестве другого примера, способ получения могрозида IV_A может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-Дезокси-могрозида V, 11-оксо-Могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида I_E, Могрола, 11-оксомогрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, в способе может использоваться β-галактозидаза из Aspergillus oryzae.

Пример 5. Получение Могрозида II_A

Как раскрыто в данном документе, Могрозид II_A может быть промежуточным соединением могрозидов для получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения могрозида II_A может включать: контакт Могрозида IA₁ с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения могрозида II_A может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида IA 1, Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, изо-Могрозида V, Могрозида III_E, 11-Дезокси-могрозида V, 11-оксо-Могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо -Могрозида IV_E, Могрозида I_E, Могрола, 11-оксомогрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, также может использоваться Целлюкласт.

Пример 6. Получение Могрозида III_А1 из Аромазы

Как раскрыто в данном документе, Могрозид III_A1 может представлять собой промежуточное соединение могрозида для получения раскрытого в данном документе соединения 1. Например, Могрозид III_A1 может быть промежуточным соединением для получения могрозида IV_A, который затем может быть использован в качестве промежуточного соединения для получения соединения 1. Например, способ получения могрозида III_A1 I может включать контакт Сиаменозида I с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент также может быть, например, аромазой. В качестве другого примера, способ получения могрозида III_A1 I может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-Дезокси-могрозида V, 11-оксо- Могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида I_E, Могрола, 11-оксомогрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Пример 7. Получение соединения 3

Как раскрыто в данном документе, соединение 3 может быть промежуточным соединением могрозидов, которое получают с раскрытым в данном документе соединением 1. Например, способ получения соединения 3 может включать: контакт могрола с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может представлять собой цикломальтодекстрин глюканотрансферазу из Bacillus lichenformis и/или Торузим.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 3 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-Дезокси-могрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида III_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксомогрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать фермент ЦГТазу.

Пример 8. Получение соединения 4.

Как раскрыто в данном документе, Соединение 4, получено во время получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 4 может также привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 4 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может представлять собой, например, цикломальтодекстрин-глюканотрансферазу из Bacillus lichenformis и/или Торузим.

Пример 9: Получение Соединения 5

Соединение 5 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в процессе получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 5 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 5 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТазу из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 10. Получение Соединения 6

Как раскрыто в данном описании, Соединение 6 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 6 может также привести к получению Соединения 1, способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 6 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТаза из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 11. Получение соединения 7.

Как раскрыто в данном документе, соединение 7 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 7 может также привести к получению Соединения 1, способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения соединения 7 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТазу из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 12. Получение соединения 8

Как раскрыто в данном документе, соединение 8 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 8 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения соединения 8 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТазу из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 13: Получение соединения 9

Как раскрыто в данном документе, соединение 9 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 9 может также привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 9 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТаза из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 14. Получение соединения 10

Как раскрыто в данном документе, соединение 10 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 10 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения соединения 10 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТазу из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 15. Получение соединения 11

Как раскрыто в данном документе, соединение 11 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 11 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E или 11-оксо-MIIIE с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 11 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать ЦГТаза из Bacillus lichenformis или Торузим.

Пример 16. Получение соединения 12

Как раскрыто в данном документе, соединение 12 может быть промежуточным соединением могрозидов, которое может быть использовано при получении соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ получения Соединения 12 может также привести к получению Соединения 1, способ может включать контакт изомера Могрозид VI с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может представлять собой, например, фермент инвертазу из пекарских дрожжей.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 12 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Пример 17. Получение соединения 13

Как раскрыто в данном документе, соединение 13 может представлять собой промежуточный могрозид, полученный во время получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Экспрессированный фермент также может представлять собой, например, Целлюкласт.

В качестве другого примера, способ получения соединения 13 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать Целлюкласт.

Пример 18. Получение соединения 14

Как раскрыто в данном документе, соединение 14 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Экспрессированный фермент также может представлять собой, например, Целлюкласт.

В качестве другого примера, способ получения соединения 14 может включать: контакт одного или более из Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать Целлюкласт. Способ может также потребовать наличие сахара, такого как, например, α -лактоза.

Пример 19. Получение соединения 15

Как раскрыто в данном описании, соединение 15 может быть промежуточным соединением могрозидов, которое может быть использовано для получения соединения 1, описанного в данном документе. Например, способ может включать контакт могрозида II_A с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 15 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать Торузим.

Пример 20. Получение соединения 16

Как раскрыто в данном документе, соединение 16 может представлять собой промежуточное соединение могрозида, которое можно использовать для получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, способ может включать контакт могрозида II_A с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 16 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать Торузим.

Этот фермент может представлять собой, например, Торузим. Рекомбинантная клетка может дополнительно содержать ген, кодирующий, например, гликотрансферазу кликломатодекстрина (например, Торузим), инвертазу, глюкострансферазу (например, UGT76G1).

Пример 21. Получение соединения 17

Как раскрыто в данном описании, соединение 17 может представлять собой промежуточное соединение могрозида для получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, соединение 17 может быть гидролизовано с образованием могрозида III_E, который затем может быть использован для получения соединения 1. Например, способ получения соединения 17 может включать: контакт Сиаменозида I с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, трансглюкозидаз, сахарозосинтаз, пектиназ и дектаз. Например, может быть использована рекомбинантная клетка, экспрессирующая UDP-гликозилтрансферазу.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 17 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Например, можно использовать UDP-гликозилтрансферазы.

Пример 22. Получение соединения 18

Как раскрыто в данном документе, соединение 18 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Например, соединение 18 может быть гидролизовано с образованием могрозида III_E, которое затем может быть использовано для получения соединения 1. Например, способ получения Соединения 18 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментами могут быть, например, Sus1 и UGT76G1.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 18 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, UGT76G1.

Пример 23. Получение соединения 19

Как раскрыто в данном документе, соединение 19 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 19 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Например, способ получения Соединения 18 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментами могут быть, например, Sus1 и UGT76G1.

В качестве другого примера, способ получения соединения 19 может включать: контакт одного или более из Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, UGT76G1. Фермент также может быть, например, сахарозосинтазой Sus1.

Пример 24. Получение соединения 20

Как раскрыто в данном описании, соединение 20 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученном в процессе получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 20 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Например, способ получения соединения 20 может также привести к получению соединения 1, способ может включать контакт Могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментами могут быть, например, Sus1 и UGT76G1.

В качестве другого примера, способ получения соединения 20 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, UGT76G1. Фермент также может быть, например, сахарозосинтазой Sus1. Фермент может представлять собой, например, сахарозосинтазу Sus1 и UGT76G1.

Пример 25. Получение соединения 21

Как раскрыто в данном документе, соединение 21 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 21 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Например, способ получения Соединения 21 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида IV_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментами могут быть, например, Sus1 и UGT76G1.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 21 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, UGT76G1. Фермент также может быть, например, сахарозосинтазой Sus1. Ферменты могут представлять собой, например, сахарозосинтазу Sus1 и GT76G1.

Пример 26. Получение соединения 22

Как раскрыто в данном описании, соединение 22 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученное в процессе получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 22 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Например, способ получения Соединения 22 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида IV_A с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментами могут быть, например, Sus1 и UGT76G1.

В качестве другого примера, способ получения соединения 22 может включать: контакт одного или более из Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, UGT76G1. Фермент также может представлять собой, например, сахарозосинтазу Sus1. Ферментами могут быть, например, сахароза-синтаза Sus1 и GT76G1.

Пример 27. Получение соединения 23

Как раскрыто в данном документе, соединение 23 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 23 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Например, способ получения Соединения 22 может также привести к получению Соединения 1, способ может включать контакт Могрозида IV_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 23 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, детрансукразой, которая будет гидролизовать гипергликозилированные изомеры могрозида IV_E до желаемого изомера могрозида V.

Примеры 28 и 29: Получение Могрозида IIА1 и Могрозида IIА2 с помощью грибной лактазы

Как раскрыто в данном документе, Могрозид II_A1 и Могрозид II_A2 могут быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Могрозид IIА1 и Могрозид IIА2 может быть дополнительно гидролизован для получения, например, Соединения 1. Например, способ получения Могрозида II_A1 и Могрозида II_A2 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозида IV_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, лактазой из гриба.

В качестве другого примера, способ получения могрозида II_A1 и Могрозида II_A2 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Пример 30. Получение Могрозида_IA с помощью Вискозима

Как раскрыто в данном документе, Могрозид_IA может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Могрозид_IAможет быть дополнительно гидролизован для получения, например, Соединения 1. Способ получения могрозида IA также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт Могрозид II_A с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментом может быть, например, Viscozyme.

В качестве другого примера, способ получения могрозида IA может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Ферментом может быть, например, Вискозим (Viscozyme).

Пример 31. Получение соединения 24

Как раскрыто в данном описании, Соединение 24 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 24 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Способ получения соединения 24 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой DexT.

В качестве другого примера, способ получения соединения 24 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой DexT.

Пример 32. Получение соединения 25

Как раскрыто в данном описании, соединение 25 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 25 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Способ получения соединения 25 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой DexT.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 25 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой DexT.

Пример 33. Получение соединения 26

Как раскрыто в данном документе, соединение 26 может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединение 26 может быть дополнительно гидролизовано, например, для получения Соединения 1. Способ получения Соединения 2 6 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой DexT.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 26 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, декстрансукразой DexT.

Примеры 34 и 35. Получение Могрола и Могрозида IE с помощью пектиназы

Как раскрыто в данном документе, Могрол и Могрозид I_E могут быть промежуточными соединениями могрозидов, полученными в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Могрол может быть использован в качестве субстрата для получения Могрозид IA1, который дополнительно гидролизуется с образованием соединения 1, а Могрозид I_E может быть дополнительно гидролизован, например, для получения соединения 1. Способ получения Могрола и Могрозида также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт могрозида V с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может представлять собой, например, фермент пектиназу из Aspergillus aculeatus.

В качестве другого примера, способ получения Могрола и Могрозида IE может содержать: контакт одного или более из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Пример 36. Получение Могрозида IIE

Как раскрыто в данном документе, Могрозид II_E может быть промежуточным соединением могрозидов, полученным в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Могрозид II_E может быть дополнительно гидролизован, например, для получения Соединения 1. Способ получения могрозида II_E также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт могрозида V с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может представлять собой, например, фермент пектиназу из Aspergillus aculeatus.

В качестве другого примера, способ получения Могрозид II_E может включать: контакт одного или более из Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Примеры 37 и 38. Получение соединений 32 и 33

Соединение 32

Соединение 33

Как раскрыто в данном описании, соединения 32 и 33 могут быть промежуточными соединениями могрозидов, полученными в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Соединения 32 и 33 могут быть дополнительно гидролизованы, например, для получения соединения 1. Способ получения Соединений 32 и 33 также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может представлять собой, например, фермент пектиназу из Aspergillus aculeatus.

В качестве другого примера, способ получения Соединения 32 и 33 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Примеры 39 и 40. Получение соединений 34 и 35

Соединение 34

Соединение 35

Как раскрыто в данном описании, соединение 34 и 35 могут быть промежуточным соединением могрозидов, полученными в ходе получения соединения 1, раскрытого в данном описании. Соединения 32 и 33 могут быть дополнительно гидролизованы, например, для получения соединения 1. Способ получения соединений 34 и 35 также может приводить к получению соединения 1, где способ может включать контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, целлюкластом.

В качестве другого примера, способ получения Соединений 34 и 35 может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Примеры 41 и 42. Получение Могрозида III_A2 и Могрозида III

Могрозид III_А2

Могрозид III

Как раскрыто в данном документе, Могрозид III_A2 и Могрозид III могут быть промежуточными соединениями могрозидов, полученными в ходе получения Соединения 1, раскрытого в данном документе. Могрозид III_А2 и Могрозид III могут быть дополнительно гидролизованы, например, для получения Соединения 1.

Например, Могрозид A2 и Могрозид III также могут связываться с UGT с образованием Могрозида IV_A, другого соединения, которое может быть использовано, чтобы сделать Могрозид IIIe, который дополнительно гидролизуют с образованием соединения 1.

Способ получения могрозида III_A2 и Могрозида III также может привести к получению Соединения 1, где способ может включать контакт могрозида III_E с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ. Фермент может быть, например, Целлюкласт.

В качестве другого примера, способ получения могрозида III_A2 и Могрозида III может включать: контакт одного или нескольких из числа Могрозида V, Сиаменозида I, Могрозида IV_E, Изомогрозида V, Могрозида III_E, 11-дезоксигрозида V, 11-Оксо-могрозида V, Могрозида VI, Могрозида IV_A, Могрозида II_A, Могрозида IIA1, Могрозида IIA2, Могрозида IA, 11-оксо-Могрозида VI, 11-оксо-Могрозида III_E, 11-оксо-Могрозида IV_E, Могрозида IE, Могрола, 11-оксо-Могрола, Могрозида II_E, Могрозида III_A2 и Могрозида III с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей одну или несколько из числа UDP-гликозилтрансфераз, ЦГТаз, гликотрансфераз, декстрансукраз, целлюлаз, β-глюкозидаз, амилаз, трансглюкозидаз, пектиназ и декстраназ.

Пример 43. Использование фермента CGT-SL для получения Соединения 1

В 1 мл реакционного объема, 5 мг Могрозида III_E, 50 мг растворимого крахмала, 0,1 М NaOAc рН 5,0, 125ul из ВКТ-SL фермента (от Geobaccilus thermophillus), смешивали с водой и с мешалкой и инкубировали при 50°С. Для ВЭЖХ были взяты образцы в ряде временных точек.

ВЭЖХ данные: Масс - спектр получения соединения 1, как показано на фигуре 1. В некоторых воплощениях CTG- SL может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, 148 или 154.

Пример 44. Клонирование: ген, кодирующий фермент декстрансукразу, был амплифицирован с помощью ПЦР из Leuconostoc citreum ATCC11449 и клонирован в pET23a

Условия роста: штамм BL21 Codon Plus RIL выращивали в 2xYT при 37°С, 250 об/мин до OD600, равного 1. 10 мМ лактозы добавляли для индукции, инкубировали при комнатной температуре, 150 об/мин в течение ночи. Неочищенный экстракт, использованный для реакции, был получен либо ультразвуком, либо осмотическим шоком.

В некоторых воплощениях декстрансукраза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях DexT может включать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103. В некоторых воплощениях DexT содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 104 или 105.

Пример 45. Реакция Могрозида III_E с декстрансукразой S mutans Clarke ATCC25175 с получением соединения 1

Условия роста: штамм, указанный выше, выращивали анаэробно с добавками глюкозы, как указано в Wenham, Henessey и Cole (1979), чтобы стимулировать выработку декстрансукразы. 5 мг/мл Могрозида III_E добавляли в питательную среду. Для ВЭЖХ были взяты образцы в ряде временных точек. Данные ВЭЖХ представлены на фигуре 2 как масс-спектрометрические данные получения Соединения 1.

Пример 46. Реакция Могрозида III_E с ЦГТазой

В 1 мл реакционного объема, 5 мг Могрозида III_E, 50 мг растворимого крахмала, 0,1 М NaOAc рН 5,0, 125 мкл фермента и воды, смешивали с помощью мешалки и инкубировали при 50°С. Для ВЭЖХ были взяты образцы в ряде временных точек. Используемым ферментом была ЦГТаза. Продукт соединения 1 виден в данных ВЭЖХ и данных масс-спектроскопии, как показано на фигуре 1. Массовые пики соответствуют размеру Соединения 1.

Пример 47. Реакция Могрозида III_E с Целлюкластом

Ксилозилирование Целлюкластом проводили с помощью могрозида III_E с Celluclast из природного носителя: Trichoderma reesei.

Условия реакции: 5 мг Могрозида III_E, 100 мг ксилана, 50 мкл целлюлозы смешивали в общем объеме 1 мл с 0,1 М ацетатом натрия, pH 5,0, инкубировали при 50°C с перемешиванием. Для ВЭЖХ были взяты образцы в ряде временных точек.

Ксилозилированный продукт выделен на фигуре 3. Продукты ксилозилирования могут быть использованы в качестве промежуточных соединений при получении Соединения 1. Последовательности для Целлюкласта включены в таблицу 1 и используются в данном документе для получения ксилозилированных продуктов.

Пример 48. Гликозилтрансферазы (мальтотриозилтрансфераза) (нативный хозяин: Geobacillus sp. APC9669)

В этом примере, была использована гликозилтрансфераза AGY15763.1 (Amano Enzyme США Лтд, Elgin, IL; SEQ ID NO: 434, таблица 1). 20 мл деионизированной воды, 0,6 мл 0,5M MES pH 6,5, 6 г растворимого крахмала, 150 мг Могрозида III_E и 3 мл фермента добавляли в 40 мл флакон с завинчивающейся крышкой с плоским дном. Сосуд герметизировали с помощью черной крышки, инкубировали при 30°С и перемешивают при 500 об./мин. с помощью магнитной мешалки. Было проведено еще 3 идентичных реакции для общего количества 600 мг Могрозида III_E, используемого в качестве исходного материала. Реакция была остановлена через 24 часа. Нерастворимый крахмал удаляли центрифугированием (4000 об/мин в течение 5 минут, Eppendorf). Надосадочную жидкость нагревали до 80°C в течение 30 минут при перемешивании (500 об/мин) с последующим центрифугированием (4000 об/мин в течение 10 минут, Eppendorf). Надосадочную жидкость фильтровали через PES 250 мл, 0,22 микрона и проверяли с помощью LC-MS (Sweet Naturals 2016-Enzymatic_2016Q4_A.SPL, строка 1254) для получения данных ВЭЖХ.

Белок AGY15763.1 (SEQ ID NO: 434) может быть кодирован нативной последовательностью ДНК (SEQ ID NO: 437) или кодон-оптимизированной (для E.coli) (SEQ ID NO: 438)

Примером дополнительной гликозитрансферазы, которая, как ожидается, будет действовать аналогичным образом, является белок UGT76G1 из Stevia rebaudiana (SEQ ID NO: 439), который может экспрессироваться в E.coli. Нативная кодирующая последовательность для UGT76G1 (SEQ ID NO: 439) представлена в SEQ ID NO: 440).

Пример 49. UDP-гликозилтрансферазы UGT73C5 в присутствии Могрола

Могрол подвергали взаимодействию с UDP-гликозилтрансферазой, что приводило к выработке Могрозида I и Могрозида II. 1 мг/мл Могрола подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего UGT73C5 (A. thaliana) (334), 2 мкл неочищенного экстракта, содержащего сахарозосинтазу, 5 мМ UDP, 1x ингибитора протеазы М221, 200 мМ сахарозы, 0,5 мг/мл спектиномицина, в 0,1 М Трис -HCl pH 7,0, инкубировали при 30°C. через 2 дня отбирали образцы для ВЭЖХ. Продукты реакции были от Могрола до Могрозида I и Могрозида II, как показано на фигурах 4 и 5.

Белковая последовательность UGT73C5 показана в SEQ ID NO: 441, нативная кодирующая последовательность ДНК для UGT73C5 (SEQ ID NO: 441) показана в SEQ ID NO: 442, и кодирующая последовательность UGT73C5 (кодон- оптимизированный для E.coli) показана в SEQ ID NO: 443.

Пример 50. UDP-гликозилтрансферазы (UGT73C6) в присутствии Могрола для получения могрозида I

Условия реакции: 1 мг/мл могрола подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего UGT73C6, 2 мкл неочищенного экстракта, содержащий синтазы сахарозы, 5 мМ UDP, ингибитор протеазы 1x M221, 200 мМ сахарозы, 0,5 мг/мл спектиномицина, в 0,1 М Трис-HCl рН 7,5, инкубировали при 30°С. Через 2 дня отбирали образцы для ВЭЖХ. Продуктом реакции был Могрозид I из Могрола. Как показано в данных ВЭЖХ и данных масс-спектроскопии на фигуре 6.

Последовательность белка и кДНК, кодирующая A. thaliana UGT73C6, показана на SEQ ID NO: 444 и SEQ ID NO: 445, соответственно.

Пример 51. UDP-гликозилтрансферазы (338) в присутствии Могрола для получения могрозида I, Могрозида II_A и двух разных продуктов Могрозида III

Условия реакции: 1 мг/мл Могрола или Могрозида II_A подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего 338, 2 мкл неочищенного экстракта, содержащего сахарозосинтазу, 5 мМ UDP, ингибитор протеазы 1x M221, 200 мМ сахарозы, 0,5 мг/мл спектиномицина, в 0,1М Трис-HCl pH 8,5, инкубировали при 30°C. Образцы для ВЭЖХ были взяты через 2 дня.

Реакция могрола с UDP-гликотрансферазой Bacillus sp. (338) (описанной в Pandey et al., 2014; включено в настоящее описание ссылкой в полном объеме) привела к продуктам реакции: Могрозиду I, Могрозиду II_A и 2 различным продуктам Могрозида III. На фигурах 7-9 показаны данные ВЭЖХ и масс-спектроскопии для продуктов, полученных после реакции. На фигуре 8 показаны пики, которые соответствуют размеру Могрола IIA.

Последовательность белка и гДНК, кодирующая UGT 338, представлена в SEQ ID NO: 405 и SEQ ID NO: 406, соответственно.

Пример 52. UDP-гликозилтрансферазы (301 (UGT98)) в присутствии Могрозида III_E для получения Сиаменозида I и Могрозида V

Условия реакции: 1 мг/мл Могрозид III_E подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего 301 мкл, 2 мкл неочищенного экстракта, содержащего сахарозосинтазу, 5 мМ UDP, 1x ингибитор протеазы М221, 200 мМ сахарозы, 0,5 мг/мл спектиномицина, в 0,1 М трис- HCl pH 7,0, инкубировали при 30°C. Через 2 дня отбирали образцы для ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа. Продуктами реакции из Могрозида III_E были Сиаменозид I и Могрозид V, как показано на фигурах 10-11.

Последовательность белка и гДНК, кодирующая S. grosvenorii 301 UGT98, представлена в SEQ ID NO: 407 и SEQ ID NO: 408, соответственно.

Пример 53. UDP-гликозилтрансферазы (339) в присутствии Могрола, Сиаменозида I или Соединения 1 для получения могрозида I из Могрола, Изомогрозида V из Сиаменозида I и Производного Соединения 1 из Соединения 1

Условия реакции: 1 мг/мл Могрола, сиаменозида I или соединения 1, подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего 339 (описанный в Itkin et al., включено ссылкой в полном объеме), 2 мкл неочищенного экстракта, содержащего сахарозосинтазу, 5мм UDP, 1x ингибитор протеазы M221, 200 мМ сахарозы, 0,5 мг/мл спектиномицина, в 0,1 М трис-HCl pH 7,0, инкубировали при 30°C. Образцы для ВЭЖХ собирали через 2 дня.

Продукты реакции из могрола приводят к Могрозиду I, сиаменозида I - к Изомогрозиду V, а соединения 1 - к производным соединения 1 (фигуры 12-14).

Белок и последовательность ДНК, кодирующая S. grosvenorii UGT339, представлены в SEQ ID NO: 409 и SEQ ID NO: 410 соответственно.

Пример 54. UDP-гликозилтрансферазы (330) в присутствии Могрозида II_A, Могрозида II_E, Могрозида III_E, Могрозида IV_A или Могрозида IV_E для получения могрозида IIIA, Могрозида IV_E и Могрозида V

Как описано в настоящем документе, использование UDP-гликотрансферазы (330), как описано в Noguchi et al. 2008 (включено в данный документ ссылкой в полном объеме) привело к продуктам реакции Могрозиду IIIA, Могрозиду IV_E, Могрозиду V. Природным носителем был Sesamum indicum, а продуцентом-хозяином был SF9. Для реакции 1 мг/мл Могрозида II_A, Могрозида II_E, Могрозида III_E, Могрозида IV_A или Могрозида IV_E подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего 330 мкл, 2 мкл неочищенного экстракта, содержащего сахарозосинтазу, 5 мМ UDP, 1x ингибитор протеазы M221, 200 мМ сахарозы, спектиномицина 0,5 мг/мл, в 0,1 М трис-HCl, рН 7,0, инкубировали при 30°С. Через 2 дня отбирали образцы для ВЭЖХ.

Реакция привела к неожиданным продуктам, таким как Могрозид IIIA, Могрозид IV_E, Могрозид V. Как показана на фигурах 15-20, размеры полученных соединений соответствуют Могрозиду IIIA, Могрозиду IV_E и Могрозиду V.

Последовательность белка и гДНК, кодирующая белок S. grosvenorii UGT330, представлены в SEQ ID NO: 411 и SEQ ID NO: 412, соответственно.

Пример 55. UDP-гликозилтрансферазы (328) (описанные в Itkin et al) в присутствии Могрозида II_A, Могрозида II_E, Могрозида III_E, Могрозида IV_A или Могрозида IV_E для получения могрозида IIIA, Могрозида IV_E и Могрозида V

Условия реакции: 1 мг/мл Могрозида III_E подвергали взаимодействию с 200 мкл неочищенного экстракта, содержащего 330 мкл, 2 мкл неочищенного экстракта, содержащего сахарозосинтазу, 5 мМ UDP, 1x ингибитор протеазы M221, 200 мМ сахарозы, 0,5 мг/мл спектиномицина, в 0,1 М трис- HCl pH 7,0, инкубировали при 30°C. Образцы для ВЭЖХ были взяты через 2 дня.

Продуктами реакции были Могрозид IV_E и Могрозид В. Как показано на фигурах 21-22, размер продуктов в данных масс - спектроскопии соответствует Могрозиду IV_E и Могрозиду V. Белок UGT328 S. grosvenorii (гликозилтрансфераза) и последовательность, кодирующую его, представлены в SEQ ID NO: 413 и 414, соответственно.

Последовательность белка сахарозосинтазы AtSus1 и гДНК, кодирующая белок AtSus1, представлены в SEQ ID NO: 415 и 416, соответственно.

Пример 56. Получение Могрола в дрожжах

ДНК получали посредством синтеза генов либо с помощью Genescript, либо с помощью IDT. Для некоторых из кукурбитадиенолсинтаз кДНК или геномную ДНК получали из10 - 60-дневной рассады с последующей ПЦР-амплификацией с использованием специфических и вырожденных праймеров. ДНК клонировали с помощью стандартных методов молекулярной биологии в один из следующих векторов сверхэкспрессии: pESC-Ura, pESC-His или pESC-LEU. Штамм Saccharomyces cerevisiae YHR072 (гетерозиготный по erg7) был приобретен у GE Dharmacon. Плазмиды (векторы pESC), содержащие гены синтеза могрола, трансформировали/совместно трансформировали с использованием набора Zymo Yeast Transformation Kit II. Штаммы выращивали в стандартных средах (YPD или SC), содержащих соответствующую селекцию с 2% глюкозы или 2% галактозы для индукции гетерологичных генов при 30°С, 220 об/мин. Когда указано, добавляли ингибитор ланостеринсинтазы, Ro 48-8071 (Cayman Chemicals) (50 мкг/мл). Выработку могрола и предшественников в дрожжах готовили после 2-дневной индукции с последующим лизисом (Yeast Buster), экстракцией этилацетатом, сушкой и ресуспендированием в метаноле. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ.

Получение кукурбитадиенола катализируется кукурбитадиенолсинтазой S. grosvernorii SgCbQ в условиях роста без какого - либо ингибитора.

Получение кукурбитадиенола показано в данных ВЭЖХ и масс-спектроскопии, которые показывают массовые пики для указанного продукта (фигура 23). Последовательность белка и последовательность ДНК, кодирующая S. grosvernorii SgCbQ, представлены в SEQ ID NO: 446 и 418, соответственно.

Cpep2 также использовали для получения кукурбитадиенола в дрожжах. Как показано на фигуре 24, это профиль масс-спектроскопии, который демонстрирует пики и характерные фрагменты, которые соответствуют кукурбитадиенолу. Белковая последовательность Cpep2 и последовательность ДНК, кодирующая белок Cpep2, представлены в SEQ ID NO: 420 и 421, соответственно.

Cpep4 из Cucurbita pepo (Jack O 'Lantern) также использовали для получения кукурбитадиенола в условиях роста без ингибитора. Получение кукурбитадиенола показано в масс-спектрометрических данных, представленных на фигурах 24 и 25. Показано, что пики и фрагменты соответствуют кукурбитадиенолу. Последовательность белка и последовательность ДНК, кодирующая Cpep4, представлены в SEQ ID NO: 422 и 423, соответственно.

Предполагаемая последовательность белка кукурбитадиенолсинтазы, Cmax, была получена из природного носителя Cucurbita maxima. Выведенная кодирующая последовательность ДНК будет использоваться для синтеза и экспрессии генов. Последовательности кукурбитадиенолсинтазы для белка и ДНК, кодирующих кукурбитадиенолсинтазу, показаны ниже:

Белки и кодирующие последовательности ДНК ниже, были получены путем выравнивания последовательности продукта ПЦР геномной ДНК с известными последовательностями кукурбитадиенолсинтаз, доступных через общедоступные базы данных (PubMed). Ожидается, что любой из этих белков Cmax может быть использован в раскрытых в данном документе способах, системах, композициях (например, клетках-хозяевах) для получения Соединения 1. Неограничивающим примером Cmax белка является Cmax1 (белок) (SEQ ID NO: 424), кодируемый Cmax1 (ДНК) (SEQ ID NO: 425).

Предполагаемая последовательность белка кукурбитадиенолсинтазы, представляющая собой Cmos1, была получена из природного носителя Cucurbita moschata. Выведенная кодирующая последовательность ДНК используется для синтеза и экспрессии генов. Белок(белки) и кодирующая последовательность(и) ДНК, показанные ниже, были получены путем выравнивания последовательности продукта ПЦР геномной ДНК с известными последовательностями кукурбитадиенолсинтазы, доступными через публичные базы данных (Pubmed). Любой из этих белков Cmos может быть использован в раскрытых в данном документе способах, системах, композициях (например, клетках-хозяевах) для получения Соединения 1. Неограничивающим примерным белком Cmos1 является Cmos1 (белок) (SEQ ID NO: 426), кодируемый Cmos1 (ДНК) (SEQ ID NO: 427).

Пример 57. Получение дигидроксикукурбитадиенола в дрожжах (кукурбитадиенолсинтаза и эпоксидгидролаза)

Получение дигидроксикукурбитадиенола в дрожжах рассматривали с использованием кукурбитадиенолсинтазы и эпоксидгидролазы. Природным носителем для этих ферментов является S. Grosvenorii.

Условия роста: SgCbQ совместно экспрессировали с эпоксидгидролазой (EPH) в присутствии ингибитора ланостеринсинтазы.

Возможный дигидроксикукурбитадиеноловый продукт показан на фигуре 26.

Последовательность белка EPH и ДНК, кодирующая белок EPH (кодон -оптимизированная для S.cerevisiae,) представлены в SEQ ID NO: 428 и 429, соответственно.

Пример 58. Получение Могрола с помощью кукурбитадиенолсинтазы, эпоксидгидролазы, цитохрома Р450 и цитохром Р450 редуктазы

Четыре фермента, в том числе кукурбитадиенолсинтазу, эпоксидгидролазу, цитохром Р450, а также цитохром Р450 - редуктазу совместно экспрессировали в S.cerevisiae. Для условий роста SgCbQ, EPH, CYP87D18 и AtCPR (цитохром P450 редуктаза из A. thaliana) коэкспрессировали в присутствии ингибитора ланостеринсинтазы. Ожидалось продуцирование могрола в S. cerevisiae. Последовательности белка и последовательности ДНК, кодирующие SgCbQ, EPH, CYP87D18 и AtCPR (цитохром P450 редуктазу из A. thaliana), представляют собой: CYP87D18 (белок) (SEQ ID NO: 430) и CYP87D18 (ДНК) (SEQ ID NO: 431); и AtCPR (белок) (SEQ ID NO: 432) и AtCPR (ДНК) (SEQ ID NO: 433).

Пример 59. Соединение 1 устойчиво к микробному гидролизу

Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica и Candida bombicola, инкубировали в YPD с добавлением 1 мг/мл Могрозида V или соединения 1. Через 3 дня надосадочные жидкости анализировали с помощью ВЭЖХ.

Как показано в данных ВЭЖХ, эпоксидгидролаза гидролизовала Могрозид V до Могрозида IIIE. У соединения 1 продуктов гидролиза не наблюдалось (фигура 37).

Пример 60. Декстрансукраза Streptococcus mutans Clarke ATCC 25175

Streptococcus mutans Clarke можно выращивать анаэробно с добавлением глюкозы. Пример условий роста можно найти в Wenham, Henessey and Cole (1979), в которых способ используется, например, для стимуляции выработки декстрансукразы. 5 мг/мл Могрозида III_E добавляли в питательную среду. Например, образцы временных точек для мониторинга выработки могут быть взяты для ВЭЖХ. Последовательности для различных декстрансукраз можно найти в таблице 1, которая включает белковые последовательности для декстрансукраз и последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют декстрансукразы (например, SEQ ID NO: 157-162). В некоторых воплощениях декстрансукраза содержит или состоит из аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 103, 106-110, 156 и 896. В некоторых воплощениях DexT может включать аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 103. В некоторых воплощениях DexT содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 104 или 105. В некоторых воплощениях в настоящем документе рекомбинантная клетка кодирует белок, содержащий последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 156-162, и/или содержит кодирующую нуклеиновую кислоту декстрансукразу, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в любой из SEQ ID NO с: 157-162. Этот пример используется для получения Соединения 1.

Пример 61. Процедура получения соединения 1 с чистотой 90% и органолептическая оценка

Фракция, содержащая смесь из 3 изомеров α-Могрозида получали обработкой могрозида III_E (MIII_E) с помощью реакции ферментов Декстрансукразы/ декстраназы с последующим фракционированием SPE. На основании анализа UPLC эта смесь имеет 3 изомера, изомеры 11-оксо-соединения 1, соединения 1 и могрозида V в соотношениях 5: 90: 5%, соответственно. Эти 3 изомера характеризовали после очистки различных фракций/источников с помощью LC-MS, 1D и 2D ЯМР спектров и сравнением близкородственных изомеров в рядах могрозидов, описанных в литературе. Этот образец дополнительно оценивали органолептически, сравнивая с чистым образцом Соединения 1 с использованием треугольного критерия.

Ферментативная реакция и процедура очистки

100 мл рНа 5,5 1М буфер ацетата натрия, 200 г сахарозы, 100 мл декстрансукразы DEXT (1 мг/мл неочищенного экстракта, pET23a, BL21-Codon Plus-RIL, выращенные в 2X YT), 12,5 г Могрозида IIIЕ и 600 мл воды добавляли к 2,8 л колбу для перемешивания, и колбу встряхивали при 30°С, 200 об/мин. Ход реакции периодически контролировали с помощью LC-MS. Через 72 часа, реакционную смесь обрабатывали 2,5 мл декстраназы (Amano) и продолжали встряхивать колбу при 30°C. Через 24 ч реакционную смесь гасили путем нагревания при 80°С и центрифугировали при 5000 оборотах в минуту в течение 5 минут, и надосадочную жидкость фильтровали и загружали непосредственно в колонку с 400 г С18 SPE и фракционировали, используя ступенчатый градиент MeOH:H₂O 5/25/50/75/100. Каждую стадию в градиенте собирали в 6 сосудов с 225 мл в каждом сосуде. Искомые продукты элюировали во второй сосуд фракции 75% МеОН (SPE 75-2) и сушили при пониженном давлении. Затем его повторно суспендировали/растворяли в 7 мл H₂O, замораживали и лиофилизировали в сосуде в течение 3 дней, получая 1,45 г белого твердого вещества.

В соответствии с анализом UPLC (фигуры 28 и 29), смесь имеет 3 охарактеризованных изомера α-Могрозида; изомеры 11-оксо-соединения 1, соединения 1 и могрозида V в соотношениях 5: 90: 5%, соответственно. На основании анализа¹H и¹³C-ЯМР (пиридин-d₅ + D₂O) не было обнаружено никаких остаточных растворителей и/или структурно не связанных примесей.

Органолептическая оценка

Треугольный критерий для чистого соединения 1 против 90% чистого соединения 1 проводили 10 ноября 2016 года. Были испытаны две разные композиции: (1) LSB + + 175 ч/млн чистого соединения 1 (стандарт) и (2) LSB + LSB + 175 ч/млн соединения 1 с чистотой 90%. Все образцы композиций были изготовлены с использованием буфера с низким содержанием натрия (LSB) pH ~ 7,1 и содержали 0% этанола.

Выводы. Эксперты обнаружили, что состав (1) LSB + 175 ч/млн чистого Соединения 1 (стандарт) существенно не отличался от состава (2) LSB + 175 ч/млн 90% чистого Соединения 1 (тест) (p> 0,05). Некоторые аналитические результаты испытаний приведены в таблицах 2-4.

Таблица 2. Частота участников панели, которые правильно выбрали другой образец. n = 38 (19 участников панели x 2 повтора).

Таблица 3. Аналитические результаты: день тестирования

Таблица 4. Аналитические результаты: за день до дня тестирования

Пример 62. Экспрессия гена в рекомбинантных дрожжевых клетках

ДНК получали посредством синтеза генов посредством Genescript, IDT или Genewiz. Для некоторых кукурбитадиенолсинтаз, кДНК или геномная ДНК были получены из 10-60-дневнойрассады с последующей ПЦР-амплификацией с использованием специфических и вырожденных праймеров. ДНК клонировали с помощью стандартных методов молекулярной биологии или путем клонирования с восстановлением разрывов дрожжей (Joska et al., 2014) в один из следующих векторов для сверхэкспрессии: pESC-Ura, pESC-His или pESC-LEU. Экспрессия гена регулировалась одним из следующих промоторов; Gal1, Gal10, Tef1 или GDS. Трансформацию дрожжей осуществляли с использованием набора Zymo Yeast Transformation Kit II. Штаммы дрожжей выращивали в стандартных средах (YPD или SC), содержащих соответствующую селекцию с 2% глюкозы или 2% галактозы для индукции гетерологичных генов. Штаммы дрожжей выращивали во встряхиваемой колбе или 96 - луночных планшетов при 30°С, 140-250 об/мин. Когда указано, добавляли ингибитор ланостеринсинтазы, Ro 48-8071 (Cayman Chemicals) (50 мкг/мл). Дрожжевое производство могрола и его предшественников проводили путем лизиса (Yeast Buster), экстракции этилацетатом, сушки и ресуспендирования в метаноле. Образцы анализировали методами LCMS, описанными ниже, используя градиент A/B (A = H₂O, B = ацетонитрил):

Для анализа диэпоксисквалена, способ LCMS включал использование C18 2,1 х 50 мм колонки, 5% B в течение 1,5 мин, градиент от 5% до 95% В или 5,5 мин, 95% B в течение 6 мин, 100% B в течение 3 мин, 5% B в течение 1,5, и все при скорости потока 0,3 мл/мин.

Для анализа кукурбитадиенола первый способ LCMS включал использование колонки С4 2,1 × 100 мм, градиента от 1 до 95% В в течение 6 минут и при скорости потока 0,55 мл/мин; а второй способ LCMS включал использование Waters Acquity UPLC Protein BEH C4 2.1×100mM, 1,7 мкм, с защитой, 62-67% B в течение 2 минут, 100% B в течение 1 минуты и при скорости потока 0,9 мл/мин.

Для анализа 11-ОН кукурбитадиенола способ LCMS включал использование колонки C8 2,1 × 100 мм, градиент от 60 до 90% B в течение 6 минут при скорости потока 0,55 мл/мин.

Для анализа могрола, способ LCMS включал использование колонки C8 2.1 × 100 mm, градиент от 50 до 90% B в течение 6 минут при скорости потока 0,55 мл/мин

Для анализа Могрозида III_E и Соединения 1 способ LCMS включал использование колонки с фторфенилом 2,1 × 100 мм, градиент от 15 до 30% B в течение 6 минут, при скорости потока 0,55 мл/мин.

Пример 63

Стадия 1. Повышение доступности оксидосквалена

Штамм Saccharomyces cerevisiae YHR072 (гетерозиготный по ланостеринсинтазе erg7) был приобретен у GE Dharmacon. Экспрессия активного гена erg7 была снижена путем замены промотора на промотор cup1 (Peng et al., 2015). Усеченная дрожжевая HMG-CoA-редуктаза (tHMG-CoA) под контролем промотора GDS и дрожжевая скваленэпоксидаза (erg1) под контролем промотора Tef1 были интегрированы в геном. Повышение оксидосквалена контролировали по образованию диэпоксисквалена, как показано в ВЭЖХ и УФ-абсорбции (фигура 31).

tHMG-CoA (белок) SEQ ID NO: 898 (путь 1)

tHMG-CoA (ДНК) SEQ ID NO: 897 (путь 1)

Erg1 (белок) SEQ ID NO: 900; Erg1 (DNA) SEQ ID NO: 899

В некоторых воплощениях фермент tHMG-CoA используют для получения диэпоксисквалена.

Гены, кодирующие предполагаемые скваленэпоксидазы в S. grosvenorii (Itkins et al., 2016), были отобраны для тестирования на повышение продукции оксидосквалена/диэпоксисквалена. Последовательности 3 скваленэпоксидаз можно найти в таблице 1 для их аминокислотных и кодирующих последовательностей (SEQ ID NO: 50-56, 60, 61, 334 или 335). Дополнительные последовательности для скваленэпоксидаз, подходящие для применения в раскрытых в данном документе способах, системах и композициях для получения оксидосквалена и/или диэпоксисквалена и для повышения выработки оксидосквалена и/или диэпоксисквалена, включают: SQE1 (белок) SEQ ID NO: 908, SQE1 (ДНК) SEQ ID NO: 909; SQE2 (белок) SEQ ID NO: 910, SQE2 (ДНК) SEQ ID NO: 911; SQE3 (белок) SEQ ID NO: 912 и SQE3 (ДНК) SEQ ID NO: 913.

Стадия 2. Получение кукурбитадиенола

Ферменты кукурбитадиенолсинтазы

Плазмиды, содержащие ген кукурбитадиенолсинтазы (SgCbQ) S. grosvernorii, трансформировали в штамм дрожжей с повышенной выработкой оксидосквалена. Штаммы выращивали 1-3 дня при 30°С, 150-250 об/мин. Получение кукурбитадиенола показано в данных ВЭЖХ и масс-спектроскопии, которые демонстрируют пики массы для указанного продукта (фигура 23). Белок SgCbQ и гДНК, кодирующая SgCbQ, представлены в SEQ ID NO: 446 и SEQ ID NO: 418, соответственно. Белок Cpep2 из Cucurbita pepo (Jack O 'Lantern) также использовали для получения кукурбитадиенола в дрожжах. На фигуре 24 показан профиль масс-спектроскопии, который содержит пики и характерные фрагменты, которые соответствуют кукурбитадиенолу. Белок Cpep2 и ДНК, кодирующая Cpep2, представлены в SEQ ID NO: 420 и SEQ ID NO: 421, соответственно. Белок Cpep4 Cucurbita pepo (Jack O 'Lantern) также использовали при получении кукурбитадиенола. Клетки-хозяева культивировали в условиях роста без ингибитора. Выработку кукурбитадиенола продемонстрировали в масс-спектрометрических данных, показанных на фигуре 25. Показано, что пики и фрагменты соответствуют кукурбитадиенолу. Белок Cpep4 и ДНК, кодирующая Cpep4, представлены в SEQ ID NO: 422 и SEQ ID NO: 423, соответственно. Белок Cmax из Cucurbita maxima также использовали для получения кукурбитадиенола в дрожжах. На фигуре 32 показан профиль масс-спектроскопии, который содержит пики и характерные фрагменты, которые соответствуют кукурбитадиенолу. Последовательность белка Cmax1 представлена в SEQ ID NO: 424, а кодирующая последовательность для Cmax1 (ДНК) представлена в SEQ ID NO: 425. Белок Cmelo Cucumis melo также использовали для получения кукурбитадиенола в дрожжах. На фигуре 32 показан профиль масс-спектроскопии, который содержит пики и характерные фрагменты, которые соответствуют кукурбитадиенолу. Последовательность белка Cmelo представлена в SEQ ID NO: 902, а кодирующая последовательность для Cmelo (ДНК) представлена в SEQ ID NO: 901. Ожидается, что белок Cmos1 из Cucurbita moschata также может быть использован для получения кукурбитадиенола в рекомбинантных клетках-хозяевах, например клетках дрожжей. Последовательности Cmos1 (белок) (SEQ ID NO: 426) и Cmos1 (ДНК) (SEQ ID NO: 427) были получены путем выравнивания последовательности продукта ПЦР геномной ДНК с известными последовательностями кукурбитадиенолсинтазы, доступными через общедоступные базы данных (Pubmed). Ожидается, что белок Cmost 1 (SEQ ID NO: 426) можно использовать для получения кукурбитадиенола в рекомбинантных клетках-хозяевах, например дрожжевых клетках.

Превращение других оксидоскваленциклаз в кукурбитадиенолсинтазу

Плазмиды, содержащие модифицированные гены для оксидосквалена, трансформировали в штамм дрожжей с усиленной выработкой оксидосквалена. Штаммы выращивали 1-3 дня при 30°С, 150-250 об/мин.

Белок PSX Y118L из природного носителя Pisum sativum также использовали для получения кукурбитадиенола в дрожжах. На фигуре 33 показан профиль масс-спектроскопии, который содержит пики и характерные фрагменты, которые соответствуют кукурбитадиенолу, когда тирозин в положении 118 превращается в лейцин. Последовательности для белка и ДНК, кодирующие модифицированную оксидоскваленциклазу, представляют собой: PSXY118L (белок) (SEQ ID NO: 904) и PSXY118L (ДНК, оптимизированная по кодонам) (SEQ ID NO: 903).

Оксидоскваленциклаза из Dictyostelium sp. также была использована для получения кукурбитадиенола в дрожжах. Как показано на фигуре 34, пик ВЭЖХ кукурбитадиенола показан, когда тирозин в положении 80 превращается в лейцин. Последовательности для белка и ДНК, кодирующих модифицированную оксидоскваленциклазу, представляют собой: DdCASY80L (белок) (SEQ ID NO: 906) и DdCASY80L (ДНК) (SEQ ID NO: 905).

Улучшение активностей кукурбитадиенолсинтазы

Ген, кодирующий кукурбитадиенолсинтазу из Cucumis melo, был кодон-оптимизирован (SEQ ID: 907) и использован в качестве отправной точки для создания библиотеки модификаций. Модификации были введены с помощью стандартных методов молекулярной биологии, состоящих из слитых пептидов на N-конце (т.е. 5') или С-конце (т.е. 3') фермента. Библиотеки плазмид модифицированных генов кукурбитадиенолсинтазы были трансформированы в дрожжевой штамм с усиленной выработкой оксидосквалена. Активность фермента измеряли по соотношениям высот пиков или площадей 409 и 427 положительных массовых фрагментов при ожидаемом времени удерживания кукурбитадиенола по сравнению с внутренним стандартом с использованием 2 способа LCMS, описанного выше. Эффективность фермента оценивали как средний % активности по сравнению со средней активностью исходного фермента (n = 8). Стадии 1 последовательности ферментов и последовательности, которые кодируют фермент, можно найти в SEQ ID NO: 951-1012. Последовательность стадии 1 также включает гибриды SS2c-G10, SS2e-A7b, SS2d-G11, SS2e-A7a, SS4d-G5, SS4d-C7, SS3b-D8 и SS2c-A10a, описанные в таблице 1.

Стадия 3. Получение 11-OH кукурбитадиенола

CYP87D18 (CYP450, S. grosvenorii) и SgCPR (CYP450 редуктаза, S. grosvenorii) были экспрессированы в штамме S. cerevisiae, продуцирующем кукурбитадиенол. 11-ОН кукурбитадиенол (то есть 11-гидрокси-кукурбитадиенол) наблюдали с использованием данных ВЭЖХ и масс-спектроскопии (фигура 36). Последовательность белка S. grosvenorii CYP87D18 показана в SEQ ID NO: 872, а кодирующая последовательность CYP87D18 (кодон-оптимизированная ДНК) показана в SEQ ID NO: 871. Последовательность белка S.grosvenorii SgCPR показана в SEQ ID NO: 874, а кодирующая последовательность SgCPR1 (кодон-оптимизированная ДНК) показана в SEQ ID NO: 873.

Дополнительные CYP450 из S. grosvenorii и Glycyrrhiza (CYP88D6) были экспрессированы в штамме S. cerevisiae, продуцирующем кукурбитадиенол. Белковые последовательности и кодирующие последовательности ДНК для ферментов представлены в SEQ ID NO: 875-890.

Стадия 4. Получение могрола

CYP1798 (фермент CYP450, S. grosvenorii) и EPH2A (эпоксидгидролаза, S. grosvenorii) были экспрессированы в штамме S. cerevisiae, продуцирующем 11-OH кукурбитадиенол. Могрол наблюдали с использованием данных ВЭЖХ и масс-спектроскопии (фигура 36). Кодирующие последовательности ДНК и белковые последовательности для ферментов представлены в SEQ ID NO: 891-894.

Эпоксидирование кукурбитадиенола и/или 11-ОН кукурбитадиенола

Также дополнительные CYP45 и SQE из S. grosvenorii и Glycyrrhiza (CYP88D6) были экспрессированы в штамме S. cerevisiae, продуцирующем кукурбитадиенол или 11-ОН кукурбитадиенол для проверки эпоксидирования.

Для SQE, последовательности, кодирующие белок и ДНК для ферментов, представлены в SEQ ID NO: 882-888. Для CYP450 кодирующие последовательности белка и ДНК для ферментов представлены в SEQ ID NO: 875-890.

Стадия 7. Получение соединения 1 из могрозида III_E в S. cerevisiae.

Штамм S. cerevisiae, экспрессирующий усеченную декстрансукразу (tDexT), инкубировали в YPD (30°С, 250 об/мин), содержащей 7 мг/мл Могрозида V, в течение 1-2 дней, что привело к гидролизу до Могрозида IIIE. Клетки S.cerevisiae, собирали, лизировали, а затем смешиваются с надосадочной жидкостью, содержащей YPD могрозида IIIe. Для инициирования реакции декстрансукразы добавляли сахарозу до конечной концентрации 200 г/л с последующей инкубацией при 30°С, 250 об/мин в течение 2 дней. Получение соединения 1 наблюдали с использованием ВЭЖХ (фигура 37). Последовательность белка для tDexT представлена в SEQ ID NO: 896, а кодирующая последовательность ДНК для tDexT показана в SEQ ID NO. 895.

Пример 64

S.cerevisiae, или Y. lipolytica выращивали в присутствии Могрозида V, чтобы позволить гидролитические ферменты в дрожжах, для получения могрозида IIIe. Через 1 или 2 дня клетки лизировали, анализировали с помощью ВЭЖХ для определения содержания могрозида. После 1 дня инкубации S. cerevisiae продуцировала смесь Могрозида V, Могрозида IV и Могрозида IIIE. После 2 дней инкубации, по существу, все могрозиды были преобразованы в Могрозид III_E, как показано на фигуре 40А.

Кроме того, после 2 дней инкубации Y. lipolytica продуцирует в основном Могрозид III_E (показано на фигуре 40B).

Пример 65

S.cerevisiae, или Y. lipolytica был выращен в присутствии соединения 1. В отличие от других могрозидов (см. Пример 64), продуктов гидролиза из-за гидролиза Соединения 1 не наблюдалось, что показано на фигуре 41.

Пример 66

S.cerevisiae, был изменен, чтобы избыточно экспрессировать декстрансукразу (Dext). Этот модифицированный штамм выращивали в присутствии смеси могрозидов, чтобы гидролитические ферменты в S. cerevisiae могли продуцировать Могрозид IIIE. После 2 дней инкубации клетки лизировали для высвобождения фермента DexT и добавляли сахарозу. Через 24 часа было получено значительное количество Соединения 1 (показано на фигуре 42).

Пример 67. Получение слитых белков, обладающих активностью кукурбитадиенолсинтазы

Готовили коллекцию или библиотеку слитых полинуклеотидов в рамке считывания для гена кукурбитадиенолсинтазы в S. cerevisiae (кодирующая последовательность ДНК, представлена в SEQ ID NO: 907, а последовательность белка, представлена в SEQ ID NO: 902). Слитые полинуклеотиды в рамке считывания клонировали в молекулу дрожжевого вектора для получения слитых белков.

Различные слитые белки были получены и испытаны на активность кукурбитадиенолсинтазы. Результаты тестирования для некоторых слитых белков, сгенерированных в этом примере, показаны в таблице 5.

Таблица 5. Активность кукурбитадиенолсинтазы слитых белков

Пример 68. UDP-гликозилтрансферазы (фермент 311, SEQID: 436-438) в присутствии Могрозида III_E, Могрозида IV_E или Могрозида IV_A для получения изомеров Могрозида IV и Могрозида V

Условия реакции: В 50 мл пробирку Falcon с 17 мл воды, добавляли 3 мл рН 7,0 1М Трис-HCl, 0,12 г UDP (Carbosynth), 3 г сахарозы, 300 мкл ингибитора протеазы 100x M221, 150 мкл канамицина (50 мг/мл), 1,185 мл сахарозоинтазы Sus1 (1 мг/мл неочищенного экстракта), 150 мг исходных могрозидов, и 6 мл фермента 311 (1 мг/мл неочищенного экстракта) и инкубировали при 30°С, 150 об/мин. Ход реакции периодически контролировали с помощью LC-MS. Через 3 дня реакцию останавливали нагреванием до 80°С в течение 30 минут при перемешивании (500 об/мин). Затем реакционную смесь центрифугировали (4000 об/мин в течение 10 минут, Eppendorf) и надосадочную жидкость фильтровали через 0,22 мкм PVDF и 50 мл. Идентифицированные продукты реакции показаны на фигуре 43.

Таблица 1. Некоторые последовательности белков и ДНК, раскрытые в данном документе

Хотя изобретение было описано со ссылкой на его конкретные воплощения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть сделаны различные изменения и могут быть заменены эквиваленты без отклонения от истинного смысла и объема изобретения. Это включает воплощения, которые не обеспечивают все преимущества и особенности, изложенные в данном документе. Кроме того, может быть сделано много модификаций для адаптации конкретной ситуации, материала, состава вещества, процесса, стадии или стадий процесса к цели, сущности и объему настоящего изобретения. Предполагается, что все такие модификации находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения. Соответственно, объем изобретения определяется только ссылкой на прилагаемую формулу изобретения.

--->

Список последовательностей

<110> Senomyx, Inc.

<120> METHODS FOR MAKING HIGH INTENSITY

SWEETENERS

<130> SNMX.044WO

<150> 62/501018

<151> 2017-05-03

<150> 62/551750

<151> 2017-08-29

<160> 1023

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 694

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase;

Bacillus)

<400> 1

Met Lys Glu Lys Asp Lys Leu Lys Val Asn Arg Asn Asn Val Asn Phe

1 5 10 15

Ser Lys Asp Ile Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe His Asn Gly

20 25 30

Cys Pro Ser Tyr Asn Pro Lys Gly Gly Leu Tyr Asp Glu Ser Arg Lys

35 40 45

Asn Lys Lys Lys Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Ile Gly Ile Ile Glu Lys

50 55 60

Leu Asn Thr Asn Tyr Phe Thr Glu Leu Gly Val Thr Ser Leu Trp Ile

65 70 75 80

Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Phe Thr Pro Ile Asn Asp Leu Val Gly

85 90 95

Ser Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Arg Thr Asn

100 105 110

Pro Phe Phe Gly Thr Phe Gly Asp Phe Gln Thr Leu Ile Thr Thr Ala

115 120 125

His Ala Lys Asp Ile Lys Ile Ile Met Asp Phe Ala Pro Asn His Thr

130 135 140

Ser Pro Ala Leu His Asp Asp Ala Thr Tyr Ala Glu Asn Gly Arg Leu

145 150 155 160

Tyr Asp Asn Gly Leu Leu Leu Gly Gly Tyr Asp Asn Asp Tyr Asn His

165 170 175

Tyr Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Glu Glu Tyr Glu Asp Gly

180 185 190

Val Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Ile

195 200 205

Ala Ile Asp Leu Tyr Phe Lys Glu Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Gln

210 215 220

Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met Ser Tyr Gly

225 230 235 240

Trp Gln Lys Ser Trp Leu Asn Ser Ile Tyr Asn Tyr Arg Pro Val Phe

245 250 255

Ile Phe Gly Glu Trp Tyr Ile Asn Pro Asn Glu Tyr Asp His Arg Asn

260 265 270

Val His Phe Ala Asn Asn Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Ser Phe

275 280 285

Ala His Lys Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Gly Met Asp Ser Met His

290 295 300

Gly Leu His Lys Met Ile Glu Glu Thr Tyr Gln Ile Tyr Asn Asp Val

305 310 315 320

Asn Asn Leu Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe His

325 330 335

Ile Asn Gly Gln Ser Lys Arg Arg Ile Glu Gln Ser Leu Val Phe Leu

340 345 350

Leu Thr Ser Arg Gly Ile Pro Ser Val Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr

355 360 365

Met Val Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Arg Gly Gln Met Glu Ser Phe

370 375 380

Asp Val Asn Thr Asp Asn Phe Lys Ile Ile Gln Ser Leu Ser Ser Leu

385 390 395 400

Arg Ser Leu Asn Tyr Ala Leu Pro Tyr Gly Asn Thr Lys Glu Arg Tyr

405 410 415

Ile Thr Asn Asp Ile Tyr Val Tyr Glu Arg Tyr Phe Gly Ser Asp Val

420 425 430

Val Leu Ile Ala Leu Asn Arg Asn Leu Thr Glu Gly Tyr Glu Ile Lys

435 440 445

Asp Val Lys Thr Ile Leu Pro Ser Arg Lys Tyr Lys Asp Ile Leu Asp

450 455 460

Gly Leu Leu Asp Gly Glu Ala Ile Arg Val Glu Asn Asn Asn Ile Asp

465 470 475 480

Ser Leu Trp Leu Gly Pro Gly Ser Gly Gln Val Trp His His Lys Gly

485 490 495

Val Asn Ser Ile Pro Leu Ile Gly Thr Val Gly His Lys Met Thr Thr

500 505 510

Val Gly Gln Ile Ile Cys Ile Glu Gly Cys Gly Phe Thr Ser Lys Lys

515 520 525

Gly Ser Val Leu Phe Glu Glu Lys Glu Ala Glu Val Val Ser Trp Ser

530 535 540

His Thr Ser Ile Lys Val Lys Val Pro Ala Val Asn Asp Gly Lys Tyr

545 550 555 560

Glu Ile Thr Val Val Thr Asp Thr Gly Thr Arg Ser Asn Ile Tyr Lys

565 570 575

His Ile Glu Val Leu Asn Thr Lys Gln Val Cys Ile Arg Phe Val Ile

580 585 590

Glu Asn Gly Tyr Glu Ile Pro Glu Ser Glu Val Phe Ile Met Gly Asn

595 600 605

Thr Tyr Ser Leu Gly Asn Met Asn Pro Cys Lys Ala Val Gly Pro Phe

610 615 620

Phe Asn Gln Ile Met Tyr Gln Phe Pro Thr Gly Tyr Phe Asp Ile Ser

625 630 635 640

Val Pro Ala Asp Thr Leu Leu Glu Phe Lys Phe Ile Arg Lys Ile Asn

645 650 655

Asn Thr Leu Leu Ile Glu Gly Gly Glu Asn His Lys Tyr Arg Thr Pro

660 665 670

Ser Phe Gly Thr Gly Glu Val Val Val Lys Trp Gln Thr Ala Glu Lys

675 680 685

Thr Ile Leu Val Glu Ser

690

<210> 2

<211> 1381

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DexT Protein

<400> 2

Met Pro Ala Asn Ala Pro Asp Lys Gln Ser Val Thr Asn Ala Pro Val

1 5 10 15

Val Pro Pro Lys His Asp Thr Asp Gln Gln Asp Asp Ser Leu Glu Lys

20 25 30

Gln Gln Val Leu Glu Pro Ser Val Asn Ser Asn Ile Pro Lys Lys Gln

35 40 45

Thr Asn Gln Gln Leu Ala Val Val Thr Ala Pro Ala Asn Ser Ala Pro

50 55 60

Gln Thr Lys Thr Thr Ala Glu Ile Ser Ala Gly Thr Glu Leu Asp Thr

65 70 75 80

Met Pro Asn Val Lys His Val Asp Gly Lys Val Tyr Phe Tyr Gly Asp

85 90 95

Asp Gly Gln Pro Lys Lys Asn Phe Thr Thr Ile Ile Asp Gly Lys Pro

100 105 110

Tyr Tyr Phe Asp Lys Asp Thr Gly Ala Leu Ser Asn Asn Asp Lys Gln

115 120 125

Tyr Val Ser Glu Leu Phe Ser Ile Gly Asn Lys His Asn Ala Val Tyr

130 135 140

Asn Thr Ser Ser Asp Asn Phe Thr Gln Leu Glu Gly His Leu Thr Ala

145 150 155 160

Ser Ser Trp Tyr Arg Pro Lys Asp Ile Leu Lys Asn Gly Lys Arg Trp

165 170 175

Ala Pro Ser Thr Val Thr Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ala Trp Trp

180 185 190

Pro Asp Lys Ser Thr Gln Val Thr Tyr Leu Asn Tyr Met Lys Asp Gln

195 200 205

Gly Leu Leu Ser Gly Thr His His Phe Ser Asp Asn Glu Asn Met Arg

210 215 220

Thr Leu Thr Ala Ala Ala Met Gln Ala Gln Val Asn Ile Glu Lys Lys

225 230 235 240

Ile Gly Gln Leu Gly Asn Thr Asp Trp Leu Lys Thr Ala Met Thr Gln

245 250 255

Tyr Ile Asp Ala Gln Pro Asn Trp Asn Ile Asp Ser Glu Ala Lys Gly

260 265 270

Asp Asp His Leu Gln Gly Gly Ala Leu Leu Tyr Thr Asn Ser Asp Met

275 280 285

Ser Pro Lys Ala Asn Ser Asp Tyr Arg Lys Leu Ser Arg Thr Pro Lys

290 295 300

Asn Gln Lys Gly Gln Ile Ala Asp Lys Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Glu

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala

325 330 335

Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Met Met Asn Ile Gly Ser Ile Leu

340 345 350

Gln Asn Asp Asp Gln Ala Asn Phe Asp Gly Tyr Arg Val Asp Ala Val

355 360 365

Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Gly Glu Tyr Ala Lys

370 375 380

Ala Ala Tyr Gly Val Asp Lys Asn Asp Ala Arg Ala Asn Gln His Leu

385 390 395 400

Ser Ile Leu Glu Asp Trp Gly Asp Glu Asp Pro Asp Tyr Val Lys Ala

405 410 415

His Gly Asn Gln Gln Ile Thr Met Asp Phe Pro Leu His Leu Ala Ile

420 425 430

Lys Tyr Ala Leu Asn Met Pro Asn Asp Lys Arg Ser Gly Leu Glu Pro

435 440 445

Thr Arg Glu His Ser Leu Val Lys Arg Ile Thr Asp Asp Lys Glu Asn

450 455 460

Val Ala Gln Pro Asn Tyr Ser Phe Ile Arg Ala His Asp Ser Glu Val

465 470 475 480

Gln Thr Ile Ile Ala Asp Ile Ile Lys Asp Lys Ile Asn Pro Ala Ser

485 490 495

Thr Gly Leu Asp Ser Thr Val Thr Leu Asp Gln Ile Lys Gln Ala Phe

500 505 510

Asp Ile Tyr Asn Ala Asp Glu Leu Lys Ala Asp Lys Val Tyr Thr Pro

515 520 525

Tyr Asn Ile Pro Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr

530 535 540

Ile Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr Asp Asp Gly Gln Tyr

545 550 555 560

Met Ala Lys Gln Ser Pro Tyr Tyr Gln Ala Ile Asp Ala Leu Leu Lys

565 570 575

Ala Arg Ile Lys Tyr Ala Ala Gly Gly Gln Thr Met Lys Met Asn Tyr

580 585 590

Phe Pro Asp Glu Gln Ser Val Met Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly

595 600 605

Ala Met Thr Ala Ser Asp Ser Gly Asn Gln Glu Thr Arg Tyr Gln Gly

610 615 620

Ile Gly Leu Val Val Asn Asn Arg Pro Asp Leu Lys Leu Ser Asp Lys

625 630 635 640

Asp Glu Val Lys Met Asp Met Gly Ala Ala His Lys Asn Gln Asp Tyr

645 650 655

Arg Pro Val Leu Leu Thr Thr Lys Ser Gly Leu Lys Val Tyr Ser Thr

660 665 670

Asp Ala Asn Ala Pro Val Val Arg Thr Asp Ala Asn Gly Gln Leu Thr

675 680 685

Phe Lys Ala Asp Met Val Tyr Gly Val Asn Asp Pro Gln Val Ser Gly

690 695 700

Tyr Ile Ala Ala Trp Val Pro Val Gly Ala Ser Glu Asn Gln Asp Ala

705 710 715 720

Arg Thr Lys Ser Glu Thr Thr Gln Ser Thr Asp Gly Ser Val Tyr His

725 730 735

Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser Gln Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn

740 745 750

Phe Gln Asp Phe Pro Thr Thr Pro Asp Glu Phe Thr Asn Ile Lys Ile

755 760 765

Ala Gln Asn Val Asn Leu Phe Lys Asp Trp Gly Ile Thr Ser Phe Glu

770 775 780

Met Ala Pro Gln Tyr Arg Ala Ser Ser Asp Lys Ser Phe Leu Asp Ala

785 790 795 800

Ile Val Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Ile Gly Tyr

805 810 815

Asn Thr Pro Thr Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Asn Leu Leu Asp Ala Leu

820 825 830

Arg Ala Leu His Gly Gln Gly Ile Gln Ala Ile Asn Asp Trp Val Pro

835 840 845

Asp Gln Ile Tyr Asn Leu Pro Asp Glu Gln Leu Val Thr Ala Ile Arg

850 855 860

Thr Asp Gly Ser Gly Asp His Thr Tyr Gly Ser Val Ile Asp His Thr

865 870 875 880

Leu Tyr Ala Ser Lys Thr Val Gly Gly Gly Ile Tyr Gln Gln Gln Tyr

885 890 895

Gly Gly Ala Phe Leu Glu Gln Leu Lys Thr Gln Tyr Pro Gln Leu Phe

900 905 910

Gln Gln Lys Gln Ile Ser Thr Asp Gln Pro Met Asn Pro Asp Ile Gln

915 920 925

Ile Lys Ser Trp Glu Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly

930 935 940

Arg Gly Ala Trp Tyr Val Leu Lys Asp Trp Gly Thr Gln Gln Tyr Phe

945 950 955 960

Asn Val Ser Asp Ala Gln Thr Phe Leu Pro Lys Gln Leu Leu Gly Glu

965 970 975

Lys Ala Lys Thr Gly Phe Val Thr Arg Gly Lys Glu Thr Ser Phe Tyr

980 985 990

Ser Thr Ser Gly Tyr Gln Ala Lys Ser Ala Phe Ile Cys Asp Asn Gly

995 1000 1005

Asn Trp Tyr Tyr Phe Asp Asp Lys Gly Lys Met Val Val Gly Asn Gln

1010 1015 1020

Val Ile Asn Gly Ile Asn Tyr Tyr Phe Leu Pro Asn Gly Ile Glu Leu

1025 1030 1035 1040

Gln Asp Ala Tyr Leu Val His Asp Gly Met Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Asn

1045 1050 1055

Ile Gly Lys Gln Leu His Asn Thr Tyr Tyr Gln Asp Lys Gln Lys Asn

1060 1065 1070

Phe His Tyr Phe Phe Glu Asp Gly His Met Ala Gln Gly Ile Val Thr

1075 1080 1085

Ile Ile Gln Ser Asp Gly Thr Pro Val Thr Gln Tyr Phe Asp Glu Asn

1090 1095 1100

Gly Lys Gln Gln Lys Gly Val Ala Val Lys Gly Ser Asp Gly His Leu

1105 1110 1115 1120

His Tyr Phe Asp Gly Ala Ser Gly Asn Met Leu Phe Lys Ser Trp Gly

1125 1130 1135

Arg Leu Ala Asp Gly Ser Trp Leu Tyr Val Asp Glu Lys Gly Asn Ala

1140 1145 1150

Val Thr Gly Lys Gln Thr Ile Asn Asn Gln Thr Val Tyr Phe Asn Asp

1155 1160 1165

Asp Gly Arg Gln Ile Lys Asn Asn Phe Lys Glu Leu Ala Asp Gly Ser

1170 1175 1180

Trp Leu Tyr Leu Asn Asn Lys Gly Val Ala Val Thr Gly Glu Gln Ile

1185 1190 1195 1200

Ile Asn Gly Gln Thr Leu Tyr Phe Gly Asn Asp Gly Arg Gln Phe Lys

1205 1210 1215

Gly Thr Thr His Ile Asn Ala Thr Gly Glu Ser Arg Tyr Tyr Asp Pro

1220 1225 1230

Asp Ser Gly Asn Met Ile Thr Asp Arg Phe Glu Arg Val Gly Asp Asn

1235 1240 1245

Gln Trp Ala Tyr Phe Gly Tyr Asp Gly Val Ala Val Thr Gly Asp Arg

1250 1255 1260

Ile Ile Lys Gly Gln Lys Leu Tyr Phe Asn Gln Asn Gly Ile Gln Met

1265 1270 1275 1280

Lys Gly His Leu Arg Leu Glu Asn Gly Ile Met Arg Tyr Tyr Asp Ala

1285 1290 1295

Asp Thr Gly Glu Leu Val Arg Asn Arg Phe Val Leu Leu Ser Asp Gly

1300 1305 1310

Ser Trp Val Tyr Phe Gly Gln Asp Gly Val Pro Val Thr Gly Val Gln

1315 1320 1325

Val Ile Asn Gly Gln Thr Leu Tyr Phe Asp Ala Asp Gly Arg Gln Val

1330 1335 1340

Lys Gly Gln Gln Arg Val Ile Gly Asn Gln Arg Tyr Trp Met Asp Lys

1345 1350 1355 1360

Asp Asn Gly Glu Met Lys Lys Ile Thr Tyr Ala Ala Ala Leu Glu His

1365 1370 1375

His His His His His

1380

<210> 3

<211> 711

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CGTase CGT-SL

<400> 3

Met Lys Arg Trp Leu Ser Val Val Leu Ser Met Ser Leu Val Phe Ser

1 5 10 15

Ala Phe Phe Leu Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala Ala

20 25 30

Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Ile Val Tyr Gln Ile

35 40 45

Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly

50 55 60

Ser Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly

65 70 75 80

Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Glu

85 90 95

Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe

100 105 110

Ala Val Met Asn Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp

115 120 125

Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser Asp

130 135 140

Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile

145 150 155 160

Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn Pro

165 170 175

Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Ile Gly

180 185 190

Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Ser Tyr Phe His His Asn Gly Gly Thr

195 200 205

Thr Phe Ser Asn Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu

210 215 220

Ala Asp Phe Asn His Gln Asn Gln Phe Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Asp

225 230 235 240

Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met Asp

245 250 255

Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Phe Met Asp Glu

260 265 270

Val Tyr Asp Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Ser

275 280 285

Glu Asn Glu Val Asp Ser Asn Asn His Phe Phe Ala Asn Glu Ser Gly

290 295 300

Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu

305 310 315 320

Arg Asn Asn Ser Asp Asp Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp

325 330 335

Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp

340 345 350

Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ala Asp Glu Gly Asp Pro Arg Lys

355 360 365

Val Asp Ile Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Asn

370 375 380

Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn

385 390 395 400

Asn Arg Lys Met Met Thr Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln

405 410 415

Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Ser Asn Pro Ala Leu Ser

420 425 430

Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val Tyr Ile Tyr

435 440 445

Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg Ser

450 455 460

Leu Ser Lys Ser Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ser

465 470 475 480

Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Ala Leu Leu Asp Gly Asn Thr Ile

485 490 495

Gln Val Gly Ser Asn Gly Ala Val Asn Ala Phe Asn Leu Gly Pro Gly

500 505 510

Glu Val Gly Val Trp Thr Tyr Ser Ala Ala Glu Ser Val Pro Ile Ile

515 520 525

Gly His Ile Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Lys Leu Thr Ile

530 535 540

Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Val Gly Thr Val Lys Phe Gly Asn

545 550 555 560

Thr Val Ala Ser Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Thr Val Thr

565 570 575

Val Pro Asn Ile Pro Ala Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Thr Ser

580 585 590

Gly Gly Gln Val Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn

595 600 605

Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Asn Thr Asn Trp

610 615 620

Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Asn Val His Glu Leu Gly Asn Trp

625 630 635 640

Asn Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Leu Phe Asn Gln Val Ile Tyr Ser

645 650 655

Tyr Pro Thr Trp Tyr Val Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile

660 665 670

Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Gly Ser Gly Asn Val Ile Trp Glu

675 680 685

Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Ser Thr Thr Gly Thr

690 695 700

Val Asn Val Asn Trp Gln Tyr

705 710

<210> 4

<211> 496

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT73C3

<400> 4

Met Ala Thr Glu Lys Thr His Gln Phe His Pro Ser Leu His Phe Val

1 5 10 15

Leu Phe Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Ile Asp Ile

20 25 30

Ala Arg Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Thr Ile Thr Ile Val Thr Thr

35 40 45

Pro His Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu

50 55 60

Ser Gly Leu Ala Ile Asn Ile Leu His Val Lys Phe Pro Tyr Gln Glu

65 70 75 80

Phe Gly Leu Pro Glu Gly Lys Glu Asn Ile Asp Ser Leu Asp Ser Thr

85 90 95

Glu Leu Met Val Pro Phe Phe Lys Ala Val Asn Leu Leu Glu Asp Pro

100 105 110

Val Met Lys Leu Met Glu Glu Met Lys Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile

115 120 125

Ser Asp Trp Cys Leu Pro Tyr Thr Ser Ile Ile Ala Lys Asn Phe Asn

130 135 140

Ile Pro Lys Ile Val Phe His Gly Met Gly Cys Phe Asn Leu Leu Cys

145 150 155 160

Met His Val Leu Arg Arg Asn Leu Glu Ile Leu Glu Asn Val Lys Ser

165 170 175

Asp Glu Glu Tyr Phe Leu Val Pro Ser Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe

180 185 190

Thr Lys Leu Gln Leu Pro Val Lys Ala Asn Ala Ser Gly Asp Trp Lys

195 200 205

Glu Ile Met Asp Glu Met Val Lys Ala Glu Tyr Thr Ser Tyr Gly Val

210 215 220

Ile Val Asn Thr Phe Gln Glu Leu Glu Pro Pro Tyr Val Lys Asp Tyr

225 230 235 240

Lys Glu Ala Met Asp Gly Lys Val Trp Ser Ile Gly Pro Val Ser Leu

245 250 255

Cys Asn Lys Ala Gly Ala Asp Lys Ala Glu Arg Gly Ser Lys Ala Ala

260 265 270

Ile Asp Gln Asp Glu Cys Leu Gln Trp Leu Asp Ser Lys Glu Glu Gly

275 280 285

Ser Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser

290 295 300

Gln Leu Lys Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Arg Arg Ser Phe

305 310 315 320

Ile Trp Val Ile Arg Gly Ser Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Phe Glu Trp

325 330 335

Met Leu Glu Ser Gly Phe Glu Glu Arg Ile Lys Glu Arg Gly Leu Leu

340 345 350

Ile Lys Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val

355 360 365

Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile

370 375 380

Thr Ser Gly Ile Pro Leu Ile Thr Trp Pro Leu Phe Gly Asp Gln Phe

385 390 395 400

Cys Asn Gln Lys Leu Val Val Gln Val Leu Lys Ala Gly Val Ser Ala

405 410 415

Gly Val Glu Glu Val Met Lys Trp Gly Glu Glu Asp Lys Ile Gly Val

420 425 430

Leu Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly

435 440 445

Asp Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Val Lys Glu Leu Gly

450 455 460

Glu Leu Ala His Lys Ala Val Glu Lys Gly Gly Ser Ser His Ser Asn

465 470 475 480

Ile Thr Leu Leu Leu Gln Asp Ile Met Gln Leu Ala Gln Phe Lys Asn

485 490 495

<210> 5

<211> 495

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT73C6

<400> 5

Met Ala Phe Glu Lys Asn Asn Glu Pro Phe Pro Leu His Phe Val Leu

1 5 10 15

Phe Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala

20 25 30

Arg Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Leu Ile Thr Ile Val Thr Thr Pro

35 40 45

His Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu Ser

50 55 60

Gly Leu Pro Ile Asn Leu Val Gln Val Lys Phe Pro Tyr Gln Glu Ala

65 70 75 80

Gly Leu Gln Glu Gly Gln Glu Asn Met Asp Leu Leu Thr Thr Met Glu

85 90 95

Gln Ile Thr Ser Phe Phe Lys Ala Val Asn Leu Leu Lys Glu Pro Val

100 105 110

Gln Asn Leu Ile Glu Glu Met Ser Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile Ser

115 120 125

Asp Met Cys Leu Ser Tyr Thr Ser Glu Ile Ala Lys Lys Phe Lys Ile

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Phe His Gly Met Gly Cys Phe Cys Leu Leu Cys Val

145 150 155 160

Asn Val Leu Arg Lys Asn Arg Glu Ile Leu Asp Asn Leu Lys Ser Asp

165 170 175

Lys Glu Tyr Phe Ile Val Pro Tyr Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe Thr

180 185 190

Arg Pro Gln Val Pro Val Glu Thr Tyr Val Pro Ala Gly Trp Lys Glu

195 200 205

Ile Leu Glu Asp Met Val Glu Ala Asp Lys Thr Ser Tyr Gly Val Ile

210 215 220

Val Asn Ser Phe Gln Glu Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Phe Lys

225 230 235 240

Glu Ala Arg Ser Gly Lys Ala Trp Thr Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys

245 250 255

Asn Lys Val Gly Val Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ser Asp Ile

260 265 270

Asp Gln Asp Glu Cys Leu Glu Trp Leu Asp Ser Lys Glu Pro Gly Ser

275 280 285

Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Gln Arg Pro Phe Ile

305 310 315 320

Trp Val Ile Arg Gly Trp Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Val Glu Trp Phe

325 330 335

Ser Glu Ser Gly Phe Glu Asp Arg Ile Gln Asp Arg Gly Leu Leu Ile

340 345 350

Lys Gly Trp Ser Pro Gln Met Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val Gly

355 360 365

Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Thr

370 375 380

Ala Gly Leu Pro Met Leu Thr Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Phe Cys

385 390 395 400

Asn Glu Lys Leu Val Val Gln Ile Leu Lys Val Gly Val Ser Ala Glu

405 410 415

Val Lys Glu Val Met Lys Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu

420 425 430

Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly Glu

435 440 445

Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Glu

450 455 460

Ser Ala His Lys Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Ile

465 470 475 480

Thr Phe Leu Leu Gln Asp Ile Met Gln Leu Ala Gln Ser Asn Asn

485 490 495

<210> 6

<211> 481

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rf85C2

<400> 6

Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile

1 5 10 15

Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln

20 25 30

Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe

35 40 45

Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly

50 55 60

Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser

65 70 75 80

Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu

85 90 95

Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp

100 105 110

Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile

115 120 125

Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu

130 135 140

Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu

145 150 155 160

Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr

165 170 175

Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu

180 185 190

Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu

195 200 205

Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His

210 215 220

Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu

225 230 235 240

Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu

260 265 270

His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu

275 280 285

Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr

290 295 300

Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala

305 310 315 320

Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile

325 330 335

Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys

340 345 350

Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His

355 360 365

Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile

370 375 380

Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp

385 390 395 400

Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly

405 410 415

Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val

420 425 430

Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys

435 440 445

Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser

450 455 460

Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg

465 470 475 480

Asn

<210> 7

<211> 495

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT73C5

<400> 7

Met Val Ser Glu Thr Thr Lys Ser Ser Pro Leu His Phe Val Leu Phe

1 5 10 15

Pro Phe Met Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Val Asp Ile Ala Arg

20 25 30

Leu Leu Ala Gln Arg Gly Val Ile Ile Thr Ile Val Thr Thr Pro His

35 40 45

Asn Ala Ala Arg Phe Lys Asn Val Leu Asn Arg Ala Ile Glu Ser Gly

50 55 60

Leu Pro Ile Asn Leu Val Gln Val Lys Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Gly

65 70 75 80

Leu Gln Glu Gly Gln Glu Asn Ile Asp Ser Leu Asp Thr Met Glu Arg

85 90 95

Met Ile Pro Phe Phe Lys Ala Val Asn Phe Leu Glu Glu Pro Val Gln

100 105 110

Lys Leu Ile Glu Glu Met Asn Pro Arg Pro Ser Cys Leu Ile Ser Asp

115 120 125

Phe Cys Leu Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Lys Lys Phe Asn Ile Pro

130 135 140

Lys Ile Leu Phe His Gly Met Gly Cys Phe Cys Leu Leu Cys Met His

145 150 155 160

Val Leu Arg Lys Asn Arg Glu Ile Leu Asp Asn Leu Lys Ser Asp Lys

165 170 175

Glu Leu Phe Thr Val Pro Asp Phe Pro Asp Arg Val Glu Phe Thr Arg

180 185 190

Thr Gln Val Pro Val Glu Thr Tyr Val Pro Ala Gly Asp Trp Lys Asp

195 200 205

Ile Phe Asp Gly Met Val Glu Ala Asn Glu Thr Ser Tyr Gly Val Ile

210 215 220

Val Asn Ser Phe Gln Glu Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Lys Asp Tyr Lys

225 230 235 240

Glu Val Arg Ser Gly Lys Ala Trp Thr Ile Gly Pro Val Ser Leu Cys

245 250 255

Asn Lys Val Gly Ala Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ser Asp Ile

260 265 270

Asp Gln Asp Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Ser Lys Lys His Gly Ser

275 280 285

Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Ile Cys Asn Leu Pro Leu Ser Gln

290 295 300

Leu Lys Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Glu Ser Gln Arg Pro Phe Ile

305 310 315 320

Trp Val Ile Arg Gly Trp Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Val Glu Trp Phe

325 330 335

Ser Glu Ser Gly Phe Glu Asp Arg Ile Gln Asp Arg Gly Leu Leu Ile

340 345 350

Lys Gly Trp Ser Pro Gln Met Leu Ile Leu Ser His Pro Ser Val Gly

355 360 365

Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Thr

370 375 380

Ala Gly Leu Pro Leu Leu Thr Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Phe Cys

385 390 395 400

Asn Glu Lys Leu Val Val Glu Val Leu Lys Ala Gly Val Arg Ser Gly

405 410 415

Val Glu Gln Pro Met Lys Trp Gly Glu Glu Glu Lys Ile Gly Val Leu

420 425 430

Val Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Ala Val Glu Glu Leu Met Gly Glu

435 440 445

Ser Asp Asp Ala Lys Glu Arg Arg Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Asp

450 455 460

Ser Ala His Lys Ala Val Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Ser Asn Ile

465 470 475 480

Ser Phe Leu Leu Gln Asp Ile Met Glu Leu Ala Glu Pro Asn Asn

485 490 495

<210> 8

<211> 495

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT73E1

<400> 8

Met Ser Pro Lys Met Val Ala Pro Pro Thr Asn Leu His Phe Val Leu

1 5 10 15

Phe Pro Leu Met Ala Gln Gly His Leu Val Pro Met Val Asp Ile Ala

20 25 30

Arg Ile Leu Ala Gln Arg Gly Ala Thr Val Thr Ile Ile Thr Thr Pro

35 40 45

Tyr His Ala Asn Arg Val Arg Pro Val Ile Ser Arg Ala Ile Ala Thr

50 55 60

Asn Leu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Leu Gln Leu Arg Ser Thr Glu Ala

65 70 75 80

Gly Leu Pro Glu Gly Cys Glu Ser Phe Asp Gln Leu Pro Ser Phe Glu

85 90 95

Tyr Trp Lys Asn Ile Ser Thr Ala Ile Asp Leu Leu Gln Gln Pro Ala

100 105 110

Glu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ser Pro Pro Pro Asp Cys Ile Ile Ser

115 120 125

Asp Phe Leu Phe Pro Trp Thr Thr Asp Val Ala Arg Arg Leu Asn Ile

130 135 140

Pro Arg Leu Val Phe Asn Gly Pro Gly Cys Phe Tyr Leu Leu Cys Ile

145 150 155 160

His Val Ala Ile Thr Ser Asn Ile Leu Gly Glu Asn Glu Pro Val Ser

165 170 175

Ser Asn Thr Glu Arg Val Val Leu Pro Gly Leu Pro Asp Arg Ile Glu

180 185 190

Val Thr Lys Leu Gln Ile Val Gly Ser Ser Arg Pro Ala Asn Val Asp

195 200 205

Glu Met Gly Ser Trp Leu Arg Ala Val Glu Ala Glu Lys Ala Ser Phe

210 215 220

Gly Ile Val Val Asn Thr Phe Glu Glu Leu Glu Pro Glu Tyr Val Glu

225 230 235 240

Glu Tyr Lys Thr Val Lys Asp Lys Lys Met Trp Cys Ile Gly Pro Val

245 250 255

Ser Leu Cys Asn Lys Thr Gly Pro Asp Leu Ala Glu Arg Gly Asn Lys

260 265 270

Ala Ala Ile Thr Glu His Asn Cys Leu Lys Trp Leu Asp Glu Arg Lys

275 280 285

Leu Gly Ser Val Leu Tyr Val Cys Leu Gly Ser Leu Ala Arg Ile Ser

290 295 300

Ala Ala Gln Ala Ile Glu Leu Gly Leu Gly Leu Glu Ser Ile Asn Arg

305 310 315 320

Pro Phe Ile Trp Cys Val Arg Asn Glu Thr Asp Glu Leu Lys Thr Trp

325 330 335

Phe Leu Asp Gly Phe Glu Glu Arg Val Arg Asp Arg Gly Leu Ile Val

340 345 350

His Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Thr Ile Gly

355 360 365

Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Ser Ile Thr

370 375 380

Ala Gly Val Pro Met Ile Thr Trp Pro Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu

385 390 395 400

Asn Glu Ala Phe Ile Val Glu Val Leu Lys Ile Gly Val Arg Ile Gly

405 410 415

Val Glu Arg Ala Cys Leu Phe Gly Glu Glu Asp Lys Val Gly Val Leu

420 425 430

Val Lys Lys Glu Asp Val Lys Lys Ala Val Glu Cys Leu Met Asp Glu

435 440 445

Asp Glu Asp Gly Asp Gln Arg Arg Lys Arg Val Ile Glu Leu Ala Lys

450 455 460

Met Ala Lys Ile Ala Met Ala Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Asn Val

465 470 475 480

Ser Ser Leu Ile Arg Asp Val Thr Glu Thr Val Arg Ala Pro His

485 490 495

<210> 9

<211> 458

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT98

<400> 9

Met Asp Ala Gln Arg Gly His Thr Thr Thr Ile Leu Met Phe Pro Trp

1 5 10 15

Leu Gly Tyr Gly His Leu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Ala Lys Ser Leu

20 25 30

Ser Arg Arg Asn Phe His Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Ser Val Asn Leu

35 40 45

Asp Ala Ile Lys Pro Lys Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ile

50 55 60

Gln Leu Val Glu Leu Cys Leu Pro Ser Ser Pro Asp Gln Leu Pro Pro

65 70 75 80

His Leu His Thr Thr Asn Ala Leu Pro Pro His Leu Met Pro Thr Leu

85 90 95

His Gln Ala Phe Ser Met Ala Ala Gln His Phe Ala Ala Ile Leu His

100 105 110

Thr Leu Ala Pro His Leu Leu Ile Tyr Asp Ser Phe Gln Pro Trp Ala

115 120 125

Pro Gln Leu Ala Ser Ser Leu Asn Ile Pro Ala Ile Asn Phe Asn Thr

130 135 140

Thr Gly Ala Ser Val Leu Thr Arg Met Leu His Ala Thr His Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Ser Lys Phe Pro Ile Ser Glu Phe Val Leu His Asp Tyr Trp Lys

165 170 175

Ala Met Tyr Ser Ala Ala Gly Gly Ala Val Thr Lys Lys Asp His Lys

180 185 190

Ile Gly Glu Thr Leu Ala Asn Cys Leu His Ala Ser Cys Ser Val Ile

195 200 205

Leu Ile Asn Ser Phe Arg Glu Leu Glu Glu Lys Tyr Met Asp Tyr Leu

210 215 220

Ser Val Leu Leu Asn Lys Lys Val Val Pro Val Gly Pro Leu Val Tyr

225 230 235 240

Glu Pro Asn Gln Asp Gly Glu Asp Glu Gly Tyr Ser Ser Ile Lys Asn

245 250 255

Trp Leu Asp Lys Lys Glu Pro Ser Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly

260 265 270

Ser Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Glu Glu Met Glu Glu Ile Ala His Gly

275 280 285

Leu Glu Ala Ser Glu Val His Phe Ile Trp Val Val Arg Phe Pro Gln

290 295 300

Gly Asp Asn Thr Ser Ala Ile Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu

305 310 315 320

Glu Arg Val Gly Glu Arg Gly Met Val Val Lys Gly Trp Ala Pro Gln

325 330 335

Ala Lys Ile Leu Lys His Trp Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys

340 345 350

Gly Trp Asn Ser Val Met Glu Ser Met Met Phe Gly Val Pro Ile Ile

355 360 365

Gly Val Pro Met His Leu Asp Gln Pro Phe Asn Ala Gly Leu Ala Glu

370 375 380

Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ala Lys Arg Asp Ser Asp Gly Lys Ile

385 390 395 400

Gln Arg Glu Glu Val Ala Lys Ser Ile Lys Glu Val Val Ile Glu Lys

405 410 415

Thr Arg Glu Asp Val Arg Lys Lys Ala Arg Glu Met Gly Glu Ile Leu

420 425 430

Arg Ser Lys Gly Asp Glu Lys Ile Asp Glu Leu Val Ala Glu Ile Ser

435 440 445

Leu Leu Arg Lys Lys Ala Pro Cys Ser Ile

450 455

<210> 10

<211> 1434

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT1495 gene sequence

<400> 10

atgcttccat ggctggctca cggccatgtc tcccctttct tcgagctcgc caagttgctc 60

gccgctagaa acttccacat attcttctgc tccaccgccg taaacctccg ctccgtcgaa 120

ccaaaactct ctcagaagct ctcctcccac gtggagctgg tggagctcaa cctaccgccc 180

tcgccggagc tccctccgca ccgccacacc accgccggcc ttccaccgca cctcatgttc 240

tcgctcaagc gagctttcga catggccgct cccgccttcg ccgccatcct ccgcgacctg 300

aacccggact tgctcatcta cgacttcctg cagccgtggg cggcggcgga ggctctgtcg 360

gcggatattc cggccgtgat gttcaaaagc acgggtgcgc tcatggcggc catggtcgcg 420

tacgagctga cgtttccgaa ctctgatttt ttctcgcttt tccctgagat tcgtctctcc 480

gagtgcgaga ttaaacagct gaagaacttg tttcaatgtt ctgtgaatga tgcgaaagac 540

aagcaaagga ttaagggatg ttatgagaga tcttgcggca tgattttggt gaaatctttc 600

agagaaatcg aaggcaaata tattgatttt ctctctactc tgctgggcaa gaaggttgtt 660

ccagttggtc cacttgttca acaaacagaa gacgacgtcg tatcaggaag ttttgacgaa 720

tggctaaatg gaaaagatag atcgtcttcc atactcgtgt ctttcggaag cgagttctac 780

ctgtccagag aagacatgga agagatcgcg catggcttag agctgagcca ggtgaacttc 840

atatgggtcg tcaggtttcc ggcgggagga gagagaaaca cgacaaaggt ggaagaagaa 900

ctgccaaaag ggtttctaga gagagttaga gagagaggga tggtggtgga gggctgggcg 960

ccgcaggctc agatcttgaa acatccaagc gtcggcggat tcctcagcca ctgcgggtgg 1020

agctccgtcg tggagagcat gaaattcggc gttccgatca tcgccatgcc gatgcacctc 1080

gaccagccgc tgaattcccg gctggtcgag cggctcggcg tcggcgtagt ggtggagaga 1140

gacggccgcc tccggggaga ggtggagaga gttgtcagag aggtggtggt ggagaaaagt 1200

ggagagagag tgaggaagaa ggtggaggag tttgcagaga tcatgaagaa gaaaaaagac 1260

aatgaagaga tggacgtagt cgtggaagag ttggtgacgc tctgcaggaa gaagaagaag 1320

gaggaggatt tacagagtaa ttattggtgc agaaccgcca ttgatgacca ttgttctgaa 1380

gtcgtgaaga ttgaagatgc tgcagcagcc gacgaggagc ctctttgcaa ataa 1434

<210> 11

<211> 1383

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT1817 gene sequence

<400> 11

atggctgtca cttacagcct gcacatagca atgtaccctt ggtttgcttt cggccacttg 60

actccatttc tccaagtctc caacaagctt gccaaggaag gccacaaaat ctccttcttc 120

atcccaacga aaacgctaac caaattgcag cctttcaatc tctttccaga tctcattacc 180

tttgtcccca tcactgttcc tcatgttgat ggtctccctc ttggagctga gactactgct 240

gatgtttctc acccttcaca gctcagtctc atcatgactg ctatggattg cacccaaccc 300

gaaatcgagt gtcttcttcg agacataaaa cctgatgcca tcttcttcga tttcgcgcac 360

tgggtgccaa aattggcatg tggattgggc attaagtcga ttgattacag tgtctgttct 420

gcagtatcaa ttggttatgt tttgccccta ttaaggaaag tttgtggaca agatttatta 480

actgaagatg attttatgca gccatctcct ggctacccga gttccaccat caatcttcaa 540

gctcatgagg ctcgatattt tgcatctctg agccgctgga ggtttggcag tgatgtccct 600

ttctttagtc gccatcttac tgcacttaat gaatgcaatg ctttagcatt caggtcatgt 660

agggagattg aagggccttt tatagactat ccagaaagtg aattaaaaaa gcctgtgttg 720

ctttccggag cagtggatct acaaccgcca accacaactg tagaagaaag atgggcaaaa 780

tggctatcag ggttcaacac cgactcggtc gtatattgtg catttggaag tgagtgtacc 840

ttagcaaaag accaattcca agaactgctg ttgggttttg agctttcaaa tatgccattc 900

tttgctgcac ttaaaccacc ttttggtgtt gactcggttg aagcagcctt gcctgaaggt 960

tttgaacaga gagttcaggg aagaggggtg gtctatgggg gatgggtcca acagcagctc 1020

attttggagc acccatcaat tggatgcttt gttacacatt gtggatcagg ctccttatca 1080

gaggcgttag tgaagaagtg tcaattagtg ttgttacctc gtatcggtga ccactttttc 1140

cgagcaagaa tgttgagcaa ttatttgaaa gttggtgtgg aggtagagaa aggagaagga 1200

gatggatctt ttacaaagga aagtgtgtgg aaggcagtga agacagtgat ggatgaagag 1260

aatgaaactg ggaaagagtt cagagcgaac cgtgccaaga taagagagct attgctcgac 1320

gaagatctcg aggagtctta tatcaacaat ttcatccaca gcctgcatac tttgaatgca 1380

tga 1383

<210> 12

<211> 1347

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT5914

<400> 12

atggaagcta agaactgcaa aaaggttctg atgttcccat ggctggcgca tggtcacata 60

tcaccatttg tagagctggc caagaagctc acagacaaca acttcgccgt ttttctatgt 120

tcttcccctg caaatcttca aaacgtcaag ccaaaactcc cccatcacta ctctgattcc 180

attgaactcg tggagctcaa ccttccatcg tcgccggagc ttccccctca tatgcacacc 240

accaatggcc tccctttgca tttagttccc accctcgttg acgccttgga catggccgct 300

ccgcacttct ccgccatttt acaggaactg aatccagatt ttctcatatt cgacatcttc 360

caaccctggg cggctgaaat cgcttcctcc ttcggcgttc ctgctatttt gttgcttatc 420

gttggatctg ctataaccgc tttaggggtt cattttgtcc ggagctccgg tacggaattc 480

ccctttcccg agcttactaa atcattcaag aaggaggacg accgaaaacc tccaggagat 540

tccggcaacg atagaggaaa acggctattc aaatgtctgc tggacctgga acattcttca 600

gagactattt tggtgaacag ttttacagag atagagggca aatatatgga ctatctctcg 660

gtcttactga agaagaagat ccttccgatt ggtcctttgg ttcagaaaat tggctccgat 720

gacgatgaat cgggaatcct ccggtggctt gacaagaaga aaccgaattc aactgtgtac 780

gtttcgttcg ggagtgagta ctatttgagc aaagaagaca tagcagagct tgcgcatggt 840

ctggaaatca gcggcgtcaa tttcatctgg attgttcggt ttccaaaggg agagaaaatc 900

gccattgaag aggcattacc agatgaattt cttgaaagag tcggagagag aggcgtcgtc 960

gttgatggat gggcgccgca gatgaaaata ttagggcatt cgagcgtcgg cgggtttctg 1020

tctcactgcg gatggaactc tgtgctggag agtctggtgc tcggcgtgcc gatcatatcc 1080

ctgccgatac acctcgaaca gccgtggaac gccttggtag cggagcacgt cggcgtttgt 1140

gtgagggcga agagagacga cggaggaaat cttcaaagag agttggtggc ggaggccatt 1200

aaagaagtgg tggttgagga aacaggagcg gaactgagaa gcaaagcaag agtaattagt 1260

gaaatcttga aaaataaaga agctgaaaca atacaagatt tggtggctga gcttcaccgg 1320

ctttctgacg caagaagagc ttgttga 1347

<210> 13

<211> 1389

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT8468 gene sequence

<400> 13

atggaaaaaa atcttcacat agtgatgctt ccatggtcgg cgttcggcca tctcatacca 60

ttttttcacc tctccatagc cttagccaaa gccaaagttt atatctcctt cgtctccact 120

ccaagaaata ttcagagact yccccaaatc ccgccggact tagcttcttt catagatttg 180

gtggccattc ccttgccgag actcgacgac gatctgttgc tagaatctgc agaggccact 240

tctgatattc cgatcgacaa gattcagtat ttgaagcgag ccgtcgacct cctccgccac 300

cccttcaaga agtttgtcgc cgaacaatcg ccggactggg tcgtcgttga ttttcatgct 360

tattgggccg gcgagatcta ccaggagttt caagttcccg tcgcctactt ctgtattttc 420

tcggccatct gtttgcttta tcttggacct ccagacgtgt attcgaagga tcctcagatc 480

atggcacgaa tatctcccgt taccatgacg gtgccgccgg agtgggtcgg ttttccgtcc 540

gccgtagcct acaacttgca tgaggcgacg gtcatgtact ctgctctcta tgaaacaaat 600

gggtctggaa taagcgactg cgagaggatt cgccggctcg tcctttcctg tcaagccgtg 660

gccattcgaa gctgcgagga gattgaaggc gaatacctta ggttatgtaa gaaactgatt 720

ccaccgcagg ggattgccgt cggcttgctt ccgccggaaa agccaccaaa atcagatcac 780

gagctcatca aatggcttga cgagcaaaag ctccgattcg tcgtgtacgt gacattcggc 840

agcgaatgca acctgacgaa ggaccaagtt cacgagatag cccacgggct ggaactgtcg 900

gagctgccat ttttatgggc actgaggaaa cccagctggg cagctgagga agacgatggg 960

ctgccgtctg ggtttcgtga gagaacgtcc gggagagggg tggtgagcat ggagtgggtg 1020

ccgcagttgg agattctggc gcaccaggcc atcggcgtct ctttagttca cgggggctgg 1080

ggctctatta tcgagtcgct acaagctggg cactgtctgg ttgtgctgcc gtttatcatc 1140

gaccagccgc tgaactcaaa gcttttggtg gagaaaggga tggcgcttga gatcagaagg 1200

aacggttctg atggatggtt tagtagagaa gacatcgccg gaactttgag agaagctatg 1260

cggtcgtctg aggaaggcgg gcagctgagg agccgtgcaa aagaggcggc ggccatcgtt 1320

ggagatgaga agctgcagtg ggaacaatac ttcggcgcgt tcgtacagtt tctgagggac 1380

aagtcttga 1389

<210> 14

<211> 1395

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT10391 gene sequence

<400> 14

atgtccgagg agaaaggcag agggcacagc tcgtcgacgg agagacacac tgctgccgcc 60

atgaacgccg agaaacgaag caccaaaatc ttgatgctcc catggctggc tcacggccac 120

atatctccat acttcgagct cgccaagagg ctcaccaaga aaaactgcca cgtttacttg 180

tgttcttcgc ctgtaaatct ccaaggcatc aagccgaaac tctctgaaaa ttactcttcc 240

tccattgaac ttgtggagct tcatcttcca tctctccccg accttcctcc ccatatgcac 300

acgaccaaag gcatccctct acatctacaa tccaccctca tcaaagcctt cgacatggcc 360

gcccctgatt tttccgacct gttgcagaaa ctcgagccgg atctcgtcat ttccgatctc 420

ttccagccat gggcagttca attagcgtcg tctcggaaca ttcccgtcgt caatttcgtt 480

gtcaccggag tcgctgttct tagtcgtttg gctcacgtgt tttgcaactc cgttaaggaa 540

ttccctttcc cggaactcga tctaaccgac cattggatct ccaagagccg ccgcaaaacg 600

tccgacgaat taggtcgcga gtgcgcgatg cgatttttca actgcatgaa acaatcttca 660

aacatcactc tagccaacac tttccccgag ttcgaagaaa aatacatcga ttatctctct 720

tcctcgttta agaaaaagat tcttccggtt gctcctctag ttcctgaaat cgacgcagac 780

gacgagaaat cggaaattat cgagtggctt gacaagaaga aaccgaaatc gactgtttac 840

gtttcgtttg ggagtgagta ttatctgacg aaagaagaca gggaagagct cgcccatggc 900

ttagaaaaga gcggcgtgaa tttcatctgg gttattaggt ttccaaaggg cgagaagatc 960

accattgaag aggctttacc agaaggattt ctcgagagag taggggacag gggagtgatt 1020

atcgacgggt gggcgccgca gttgaaaata ttgaggcatt caagcgtggg cgggttcgtg 1080

tgccactgcg ggtggaactc tgtggtggag agcgtggtgt ttggggtgcc gatcatagcc 1140

ttgccgatgc agctcgatca gccatggcat gcgaaggtgg cggaggacgg cggcgtctgt 1200

gcggaggcga agagagacgt tgaagggagc gttcagagag aagaggtggc gaaggccatt 1260

aaagaggtgg tgtttgagaa gaaggggggg gttctgagtg gaaaagcaag agagatcagc 1320

gaggccttga gaaagaggga aggggaaatc atagaggaat tggttgctga gtttcaccag 1380

ctctgtgaag cttga 1395

<210> 15

<211> 496

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT1576 amino acid sequence

<400> 15

Met Ala Ser Pro Arg His Thr Pro His Phe Leu Leu Phe Pro Phe Met

1 5 10 15

Ala Gln Gly His Met Ile Pro Met Ile Asp Leu Ala Arg Leu Leu Ala

20 25 30

Gln Arg Gly Val Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Pro His Asn Ala Ala

35 40 45

Arg Tyr His Ser Val Leu Ala Arg Ala Ile Asp Ser Gly Leu His Ile

50 55 60

His Val Leu Gln Leu Gln Phe Pro Cys Lys Glu Gly Gly Leu Pro Glu

65 70 75 80

Gly Cys Glu Asn Val Asp Leu Leu Pro Ser Leu Ala Ser Ile Pro Arg

85 90 95

Phe Tyr Arg Ala Ala Ser Asp Leu Leu Tyr Glu Pro Ser Glu Lys Leu

100 105 110

Phe Glu Glu Leu Ile Pro Arg Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Met Cys

115 120 125

Leu Pro Trp Thr Met Arg Ile Ala Leu Lys Tyr His Val Pro Arg Leu

130 135 140

Val Phe Tyr Ser Leu Ser Cys Phe Phe Leu Leu Cys Met Arg Ser Leu

145 150 155 160

Lys Asn Asn Leu Ala Leu Ile Ser Ser Lys Ser Asp Ser Glu Phe Val

165 170 175

Thr Phe Ser Asp Leu Pro Asp Pro Val Glu Phe Leu Lys Ser Glu Leu

180 185 190

Pro Lys Ser Thr Asp Glu Asp Leu Val Lys Phe Ser Tyr Glu Met Gly

195 200 205

Glu Ala Asp Arg Gln Ser Tyr Gly Val Ile Leu Asn Leu Phe Glu Glu

210 215 220

Met Glu Pro Lys Tyr Leu Ala Glu Tyr Glu Lys Glu Arg Glu Ser Pro

225 230 235 240

Glu Arg Val Trp Cys Val Gly Pro Val Ser Leu Cys Asn Asp Asn Lys

245 250 255

Leu Asp Lys Ala Glu Arg Gly Asn Lys Ala Ser Ile Asp Glu Tyr Lys

260 265 270

Cys Ile Arg Trp Leu Asp Gly Gln Gln Pro Ser Ser Val Val Tyr Val

275 280 285

Ser Leu Gly Ser Leu Cys Asn Leu Val Thr Ala Gln Ile Ile Glu Leu

290 295 300

Gly Leu Gly Leu Glu Ala Ser Lys Lys Pro Phe Ile Trp Val Ile Arg

305 310 315 320

Arg Gly Asn Ile Thr Glu Glu Leu Gln Lys Trp Leu Val Glu Tyr Asp

325 330 335

Phe Glu Glu Lys Ile Lys Gly Arg Gly Leu Val Ile Leu Gly Trp Ala

340 345 350

Pro Gln Val Leu Ile Leu Ser His Pro Ala Ile Gly Cys Phe Leu Thr

355 360 365

His Cys Gly Trp Asn Ser Ser Ile Glu Gly Ile Ser Ala Gly Val Pro

370 375 380

Met Val Thr Trp Pro Leu Phe Ala Asp Gln Val Phe Asn Glu Lys Leu

385 390 395 400

Ile Val Gln Ile Leu Arg Ile Gly Val Ser Val Gly Thr Glu Thr Thr

405 410 415

Met Asn Trp Gly Glu Glu Glu Glu Lys Gly Val Val Val Lys Arg Glu

420 425 430

Lys Val Arg Glu Ala Ile Glu Ile Val Met Asp Gly Asp Glu Arg Glu

435 440 445

Glu Arg Arg Glu Arg Cys Lys Glu Leu Ala Glu Thr Ala Lys Arg Ala

450 455 460

Ile Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Arg Asn Leu Thr Met Leu Ile Glu

465 470 475 480

Asp Ile Ile His Gly Gly Gly Leu Ser Tyr Glu Lys Gly Ser Cys Arg

485 490 495

<210> 16

<211> 459

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT SK98

<400> 16

Met Asp Ala Gln Arg Gly His Thr Thr Thr Ile Leu Met Leu Pro Trp

1 5 10 15

Val Gly Tyr Gly His Leu Leu Pro Phe Leu Glu Leu Ala Lys Ser Leu

20 25 30

Ser Arg Arg Lys Leu Phe His Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Ser Val Ser

35 40 45

Leu Asp Ala Ile Lys Pro Lys Leu Pro Pro Ser Ile Ser Ser Asp Asp

50 55 60

Ser Ile Gln Leu Val Glu Leu Arg Leu Pro Ser Ser Pro Glu Leu Pro

65 70 75 80

Pro His Leu His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Ser His Leu Met Pro Ala

85 90 95

Leu His Gln Ala Phe Val Met Ala Ala Gln His Phe Gln Val Ile Leu

100 105 110

Gln Thr Leu Ala Pro His Leu Leu Ile Tyr Asp Ile Leu Gln Pro Trp

115 120 125

Ala Pro Gln Val Ala Ser Ser Leu Asn Ile Pro Ala Ile Asn Phe Ser

130 135 140

Thr Thr Gly Ala Ser Met Leu Ser Arg Thr Leu His Pro Thr His Tyr

145 150 155 160

Pro Ser Ser Lys Phe Pro Ile Ser Glu Phe Val Leu His Asn His Trp

165 170 175

Arg Ala Met Tyr Thr Thr Ala Asp Gly Ala Leu Thr Glu Glu Gly His

180 185 190

Lys Ile Glu Glu Thr Leu Ala Asn Cys Leu His Thr Ser Cys Gly Val

195 200 205

Val Leu Val Asn Ser Phe Arg Glu Leu Glu Thr Lys Tyr Ile Asp Tyr

210 215 220

Leu Ser Val Leu Leu Asn Lys Lys Val Val Pro Val Gly Pro Leu Val

225 230 235 240

Tyr Glu Pro Asn Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Tyr Ser Ser Ile Lys

245 250 255

Asn Trp Leu Asp Lys Lys Glu Pro Ser Ser Thr Val Phe Val Ser Phe

260 265 270

Gly Thr Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Glu Glu Met Glu Glu Ile Ala Tyr

275 280 285

Gly Leu Glu Leu Ser Glu Val Asn Phe Ile Trp Val Leu Arg Phe Pro

290 295 300

Gln Gly Asp Ser Thr Ser Thr Ile Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe

305 310 315 320

Leu Glu Arg Ala Gly Glu Arg Ala Met Val Val Lys Gly Trp Ala Pro

325 330 335

Gln Ala Lys Ile Leu Lys His Trp Ser Thr Gly Gly Leu Val Ser His

340 345 350

Cys Gly Trp Asn Ser Met Met Glu Gly Met Met Phe Gly Val Pro Ile

355 360 365

Ile Ala Val Pro Met His Leu Asp Gln Pro Phe Asn Ala Gly Leu Leu

370 375 380

Glu Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ala Lys Arg Gly Ser Asp Gly Lys

385 390 395 400

Ile Gln Arg Glu Glu Val Ala Lys Ser Ile Lys Glu Val Val Ile Glu

405 410 415

Lys Thr Arg Glu Asp Val Arg Lys Lys Ala Arg Glu Met Gly Glu Ile

420 425 430

Leu Arg Ser Lys Gly Asp Glu Lys Ile Asp Glu Leu Val Ala Glu Ile

435 440 445

Ser Leu Leu Arg Lys Lys Ala Pro Cys Ser Ile

450 455

<210> 17

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT430 amino acid sequence

<400> 17

Met Glu Gln Ala His Asp Leu Leu His Val Leu Leu Phe Pro Tyr Pro

1 5 10 15

Ala Lys Gly His Ile Lys Pro Phe Leu Cys Leu Ala Glu Leu Leu Cys

20 25 30

Asn Ala Gly Leu Asn Val Thr Phe Leu Asn Thr Asp Tyr Asn His Arg

35 40 45

Arg Leu His Asn Leu His Leu Leu Ala Ala Cys Phe Pro Ser Leu His

50 55 60

Phe Glu Ser Ile Ser Asp Gly Leu Gln Pro Asp Gln Pro Arg Asp Ile

65 70 75 80

Leu Asp Pro Lys Phe Tyr Ile Ser Ile Cys Gln Val Thr Lys Pro Leu

85 90 95

Phe Arg Glu Leu Leu Leu Ser Tyr Lys Arg Thr Ser Ser Val Gln Thr

100 105 110

Gly Arg Pro Pro Ile Thr Cys Val Ile Thr Asp Val Ile Phe Arg Phe

115 120 125

Pro Ile Asp Val Ala Glu Glu Leu Asp Ile Pro Val Phe Ser Phe Cys

130 135 140

Thr Phe Ser Ala Arg Phe Met Phe Leu Tyr Phe Trp Ile Pro Lys Leu

145 150 155 160

Ile Glu Asp Gly Gln Leu Pro Tyr Pro Asn Gly Asn Ile Asn Gln Lys

165 170 175

Leu Tyr Gly Val Ala Pro Glu Ala Glu Gly Leu Leu Arg Cys Lys Asp

180 185 190

Leu Pro Gly His Trp Ala Phe Ala Asp Glu Leu Lys Asp Asp Gln Leu

195 200 205

Asn Phe Val Asp Gln Thr Thr Ala Ser Leu Arg Ser Ser Gly Leu Ile

210 215 220

Leu Asn Thr Phe Asp Asp Leu Glu Ala Pro Phe Leu Gly Arg Leu Ser

225 230 235 240

Thr Ile Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Val Gly Pro Ile His Ala Leu Leu

245 250 255

Asn Ser His His Cys Gly Leu Trp Lys Glu Asp His Ser Cys Leu Ala

260 265 270

Trp Leu Asp Ser Arg Ala Ala Arg Ser Val Val Phe Val Ser Phe Gly

275 280 285

Ser Leu Val Lys Ile Thr Ser Arg Gln Leu Met Glu Phe Trp His Gly

290 295 300

Leu Leu Asn Ser Gly Thr Ser Phe Leu Phe Val Leu Arg Ser Asp Val

305 310 315 320

Val Glu Gly Asp Gly Glu Lys Gln Val Val Lys Glu Ile Tyr Glu Thr

325 330 335

Lys Ala Glu Gly Lys Trp Leu Val Val Gly Trp Ala Pro Gln Glu Lys

340 345 350

Val Leu Ala His Glu Ala Val Gly Gly Phe Leu Thr His Ser Gly Trp

355 360 365

Asn Ser Ile Leu Glu Ser Ile Ala Ala Gly Val Pro Met Ile Ser Cys

370 375 380

Pro Lys Ile Gly Asp Gln Ser Ser Asn Cys Thr Trp Ile Ser Lys Val

385 390 395 400

Trp Lys Ile Gly Leu Glu Met Glu Asp Gln Tyr Asp Arg Ala Thr Val

405 410 415

Glu Ala Met Val Arg Ser Ile Met Lys His Glu Gly Glu Lys Ile Gln

420 425 430

Lys Thr Ile Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ala Lys Tyr Lys Val Ser Lys

435 440 445

Asp Gly Thr Ser Tyr Arg Asn Leu Glu Ile Leu Ile Glu Asp Ile Lys

450 455 460

Lys Ile Lys Pro Asn

465

<210> 18

<211> 474

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT1697

<400> 18

Met Val Gln Pro Arg Val Leu Leu Phe Pro Phe Pro Ala Leu Gly His

1 5 10 15

Val Lys Pro Phe Leu Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ser Asp Ala Gly Ile

20 25 30

Asp Val Val Phe Leu Ser Thr Glu Tyr Asn His Arg Arg Ile Ser Asn

35 40 45

Thr Glu Ala Leu Ala Ser Arg Phe Pro Thr Leu His Phe Glu Thr Ile

50 55 60

Pro Asp Gly Leu Pro Pro Asn Glu Ser Arg Ala Leu Ala Asp Gly Pro

65 70 75 80

Leu Tyr Phe Ser Met Arg Glu Gly Thr Lys Pro Arg Phe Arg Gln Leu

85 90 95

Ile Gln Ser Leu Asn Asp Gly Arg Trp Pro Ile Thr Cys Ile Ile Thr

100 105 110

Asp Ile Met Leu Ser Ser Pro Ile Glu Val Ala Glu Glu Phe Gly Ile

115 120 125

Pro Val Ile Ala Phe Cys Pro Cys Ser Ala Arg Tyr Leu Ser Ile His

130 135 140

Phe Phe Ile Pro Lys Leu Val Glu Glu Gly Gln Ile Pro Tyr Ala Asp

145 150 155 160

Asp Asp Pro Ile Gly Glu Ile Gln Gly Val Pro Leu Phe Glu Gly Leu

165 170 175

Leu Arg Arg Asn His Leu Pro Gly Ser Trp Ser Asp Lys Ser Ala Asp

180 185 190

Ile Ser Phe Ser His Gly Leu Ile Asn Gln Thr Leu Ala Ala Gly Arg

195 200 205

Ala Ser Ala Leu Ile Leu Asn Thr Phe Asp Glu Leu Glu Ala Pro Phe

210 215 220

Leu Thr His Leu Ser Ser Ile Phe Asn Lys Ile Tyr Thr Ile Gly Pro

225 230 235 240

Leu His Ala Leu Ser Lys Ser Arg Leu Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ala

245 250 255

Ser Ala Leu Ser Gly Phe Trp Lys Glu Asp Arg Ala Cys Met Ser Trp

260 265 270

Leu Asp Cys Gln Pro Pro Arg Ser Val Val Phe Val Ser Phe Gly Ser

275 280 285

Thr Met Lys Met Lys Ala Asp Glu Leu Arg Glu Phe Trp Tyr Gly Leu

290 295 300

Val Ser Ser Gly Lys Pro Phe Leu Cys Val Leu Arg Ser Asp Val Val

305 310 315 320

Ser Gly Gly Glu Ala Ala Glu Leu Ile Glu Gln Met Ala Glu Glu Glu

325 330 335

Gly Ala Gly Gly Lys Leu Gly Met Val Val Glu Trp Ala Ala Gln Glu

340 345 350

Lys Val Leu Ser His Pro Ala Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly

355 360 365

Trp Asn Ser Thr Val Glu Ser Ile Ala Ala Gly Val Pro Met Met Cys

370 375 380

Trp Pro Ile Leu Gly Asp Gln Pro Ser Asn Ala Thr Trp Ile Asp Arg

385 390 395 400

Val Trp Lys Ile Gly Val Glu Arg Asn Asn Arg Glu Trp Asp Arg Leu

405 410 415

Thr Val Glu Lys Met Val Arg Ala Leu Met Glu Gly Gln Lys Arg Val

420 425 430

Glu Ile Gln Arg Ser Met Glu Lys Leu Ser Lys Leu Ala Asn Glu Lys

435 440 445

Val Val Arg Gly Gly Leu Ser Phe Asp Asn Leu Glu Val Leu Val Glu

450 455 460

Asp Ile Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Lys Phe

465 470

<210> 19

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UGT11789

<400> 19

Met Asp Ala Lys Glu Glu Ser Leu Lys Val Phe Met Leu Pro Trp Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Tyr Leu Glu Leu Ala Lys Arg Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Lys Phe Leu Val Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Val Asn Leu Glu

35 40 45

Ala Ile Lys Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ser Asp Ser Ile Gln Leu

50 55 60

Met Glu Val Pro Leu Glu Ser Thr Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His

65 70 75 80

Thr Ala Lys Gly Leu Pro Pro His Leu Met Pro Lys Leu Met Asn Ala

85 90 95

Phe Lys Met Val Ala Pro Asn Leu Glu Ser Ile Leu Lys Thr Leu Asn

100 105 110

Pro Asp Leu Leu Ile Val Asp Ile Leu Leu Pro Trp Met Leu Pro Leu

115 120 125

Ala Ser Ser Leu Lys Ile Pro Met Val Phe Phe Thr Ile Phe Gly Ala

130 135 140

Met Ala Ile Ser Phe Met Ile Tyr Asn Arg Thr Val Ser Asn Glu Leu

145 150 155 160

Pro Phe Pro Glu Phe Glu Leu His Glu Cys Trp Lys Ser Lys Cys Pro

165 170 175

Tyr Leu Phe Lys Asp Gln Ala Glu Ser Gln Ser Phe Leu Glu Tyr Leu

180 185 190

Asp Gln Ser Ser Gly Val Ile Leu Ile Lys Thr Ser Arg Glu Ile Glu

195 200 205

Ala Lys Tyr Val Asp Phe Leu Thr Ser Ser Phe Thr Lys Lys Val Val

210 215 220

Thr Thr Gly Pro Leu Val Gln Gln Pro Ser Ser Gly Glu Asp Glu Lys

225 230 235 240

Gln Tyr Ser Asp Ile Ile Glu Trp Leu Asp Lys Lys Glu Pro Leu Ser

245 250 255

Thr Val Leu Val Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Tyr Leu Ser Lys Glu Glu

260 265 270

Met Glu Glu Ile Ala Tyr Gly Leu Glu Ser Ala Ser Glu Val Asn Phe

275 280 285

Ile Trp Ile Val Arg Phe Pro Met Gly Gln Glu Thr Glu Val Glu Ala

290 295 300

Ala Leu Pro Glu Gly Phe Ile Gln Arg Ala Gly Glu Arg Gly Lys Val

305 310 315 320

Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln Ala Lys Ile Leu Ala His Pro Ser Thr

325 330 335

Gly Gly His Val Ser His Asn Gly Trp Ser Ser Ile Val Glu Cys Leu

340 345 350

Met Ser Gly Val Pro Val Ile Gly Ala Pro Met Gln Leu Asp Gly Pro

355 360 365

Ile Val Ala Arg Leu Val Glu Glu Ile Gly Val Gly Leu Glu Ile Lys

370 375 380

Arg Asp Glu Glu Gly Arg Ile Thr Arg Gly Glu Val Ala Asp Ala Ile

385 390 395 400

Lys Thr Val Ala Val Gly Lys Thr Gly Glu Asp Phe Arg Arg Lys Ala

405 410 415

Lys Lys Ile Ser Ser Ile Leu Lys Met Lys Asp Glu Glu Glu Val Asp

420 425 430

Thr Leu Ala Met Glu Leu Val Arg Leu Cys Gln Met Lys Arg Gly Gln

435 440 445

Glu Ser Gln Asp

450

<210> 20

<211> 520

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CYP1798 amino acid sequence

<400> 20

Met Glu Met Ser Ser Ser Val Ala Ala Thr Ile Ser Ile Trp Met Val

1 5 10 15

Val Val Cys Ile Val Gly Val Gly Trp Arg Val Val Asn Trp Val Trp

20 25 30

Leu Arg Pro Lys Lys Leu Glu Lys Arg Leu Arg Glu Gln Gly Leu Ala

35 40 45

Gly Asn Ser Tyr Arg Leu Leu Phe Gly Asp Leu Lys Glu Arg Ala Ala

50 55 60

Met Glu Glu Gln Ala Asn Ser Lys Pro Ile Asn Phe Ser His Asp Ile

65 70 75 80

Gly Pro Arg Val Phe Pro Ser Met Tyr Lys Thr Ile Gln Asn Tyr Gly

85 90 95

Lys Asn Ser Tyr Met Trp Leu Gly Pro Tyr Pro Arg Val His Ile Met

100 105 110

Asp Pro Gln Gln Leu Lys Thr Val Phe Thr Leu Val Tyr Asp Ile Gln

115 120 125

Lys Pro Asn Leu Asn Pro Leu Ile Lys Phe Leu Leu Asp Gly Ile Val

130 135 140

Thr His Glu Gly Glu Lys Trp Ala Lys His Arg Lys Ile Ile Asn Pro

145 150 155 160

Ala Phe His Leu Glu Lys Leu Lys Asp Met Ile Pro Ala Phe Phe His

165 170 175

Ser Cys Asn Glu Ile Val Asn Glu Trp Glu Arg Leu Ile Ser Lys Glu

180 185 190

Gly Ser Cys Glu Leu Asp Val Met Pro Tyr Leu Gln Asn Leu Ala Ala

195 200 205

Asp Ala Ile Ser Arg Thr Ala Phe Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Gly Lys

210 215 220

Met Ile Phe Gln Leu Leu Lys Glu Leu Thr Asp Leu Val Val Lys Val

225 230 235 240

Ala Phe Gly Val Tyr Ile Pro Gly Trp Arg Phe Leu Pro Thr Lys Ser

245 250 255

Asn Asn Lys Met Lys Glu Ile Asn Arg Lys Ile Lys Ser Leu Leu Leu

260 265 270

Gly Ile Ile Asn Lys Arg Gln Lys Ala Met Glu Glu Gly Glu Ala Gly

275 280 285

Gln Ser Asp Leu Leu Gly Ile Leu Met Glu Ser Asn Ser Asn Glu Ile

290 295 300

Gln Gly Glu Gly Asn Asn Lys Glu Asp Gly Met Ser Ile Glu Asp Val

305 310 315 320

Ile Glu Glu Cys Lys Val Phe Tyr Ile Gly Gly Gln Glu Thr Thr Ala

325 330 335

Arg Leu Leu Ile Trp Thr Met Ile Leu Leu Ser Ser His Thr Glu Trp

340 345 350

Gln Glu Arg Ala Arg Thr Glu Val Leu Lys Val Phe Gly Asn Lys Lys

355 360 365

Pro Asp Phe Asp Gly Leu Ser Arg Leu Lys Val Val Thr Met Ile Leu

370 375 380

Asn Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Ser Met Leu Thr Arg Ile

385 390 395 400

Ile Gln Lys Glu Thr Arg Val Gly Lys Leu Thr Leu Pro Ala Gly Val

405 410 415

Ile Leu Ile Met Pro Ile Ile Leu Ile His Arg Asp His Asp Leu Trp

420 425 430

Gly Glu Asp Ala Asn Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Ser Lys Gly Val

435 440 445

Ser Lys Ala Ala Lys Val Gln Pro Ala Phe Phe Pro Phe Gly Trp Gly

450 455 460

Pro Arg Ile Cys Met Gly Gln Asn Phe Ala Met Ile Glu Ala Lys Met

465 470 475 480

Ala Leu Ser Leu Ile Leu Gln Arg Phe Ser Phe Glu Leu Ser Ser Ser

485 490 495

Tyr Val His Ala Pro Thr Val Val Phe Thr Thr Gln Pro Gln His Gly

500 505 510

Ala His Ile Val Leu Arg Lys Leu

515 520

<210> 21

<211> 313

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EPH1 epoxide hydrolase

<400> 21

Met Glu Lys Ile Glu His Ser Thr Ile Ala Thr Asn Gly Ile Asn Met

1 5 10 15

His Val Ala Ser Ala Gly Ser Gly Pro Ala Val Leu Phe Leu His Gly