Аналоги 8-(анилино)-1-нафталинсульфоната и их применение в тестах обнаружения аналита - RU2244706C2

Описание

Данное изобретение относится к области композиций красителей, в особенности композиций, подходящих для использования в тестах обнаружения аналита, например, в тестах по определению глюкозы.

Предпосылки изобретения

Все более возрастающей потребностью в современном обществе является обнаружение аналита в физиологических жидкостях, например в крови или продуктах, полученных из крови. Тесты обнаружения аналита находят использование в разнообразных случаях, включающих пробы в клинических лабораториях, проверку в домашних условиях и т.д., при этом результаты указанных испытаний играют существенную роль в установлении диагноза и при лечении множества болезненных состояний. Представляющие интерес аналиты включают глюкозу при лечении диабета, холестерин и т.д. В ответ на все возрастающую важность обнаружения аналита было создано множество способов и устройств, предназначенных для использования как в клинических, так и домашних условиях.

Во многих способах и устройствах, имеющихся в настоящее время, используется сигнал производящая система, предназначенная для идентификации присутствия в физиологической пробе, такой как кровь, представляющего интерес аналита. Так, например, в одной из систем обнаружения глюкозы, применяемой в настоящее время, используется воспроизводящая сигнал система, которая включает глюкозооксидазу, пероксидазу хрена мета[3-метил-2-бензотиазолинонгидразон]N-сульфонилбензолсульфонат мононатрий (MBTHSB) и 8-(аналино)-1-нафталинсульфонат (ANS). Смотри патент США №5563031. Когда глюкоза соединяется с вышеуказанной сигнал производящей системой в присутствии кислорода, происходит следующая реакция:

Глюкоза + H₂O+1/2O₂ - глюконолактон + H₂O₂

Пероксидаза хрена H₂O₂ + MBTHSB + Н⁺ [MBTHSB ]⁺ + 2Н₂O

1/2O₂

[MBTHSB]⁺ +ANS - голубой краситель + Н₂О

Несмотря на то, что при описанном выше сочетании MBTHSB-ANS краситель были достигнуты хорошие результаты, имеется возможность ее усовершенствования. Так, например, продукт - голубой краситель, полученный описанным выше сочетанием MBTHSB/ANS краситель в сигнал производящей системе в ходе теста, во время стадии обнаружения подвергается смещению (сдвигу), что, в конечном счете, может привести к неточности результатов.

Соответственно существует интерес в разработке новых соединений, предназначенных для использования в сигнал производящих системах для обнаружения аналита. Особое значение будет придаваться получению заместителей ANS, которые дают в качестве продукта реакции голубой краситель, который во время обнаружения не подвергается смещению.

Предшествующий уровень техники

Представляющие интерес патенты включают: 4935346; 4962040; 5453360; 5563031; 5776719 и 5922530. Интерес представляет также: Kosower & Kanety, "Interamolecular Donor-Acceptor Systems, 10. Multiple Fluorescences from 8-(phenylamino)-1-naphthalensulfonates" J.Am. Chem. Soc. (1983) 105: 6236-6243.

Сущность изобретения

Предложены аналоги AHC(ANS) и способы их применения. Аналоги ANS взаимодействуют с гидрохлоридом 3-метил-2-бензотиазолинонгидразоном (МБТГ, МВТН) или его аналогами, например MBTHSB с получением продукта реакции, который обладает меньшим смещением по сравнению с продуктом реакции ANS и МВТН или аналогом МВТН. Заявленные аналоги ANS дополнительно характеризуются тем, что они имеют, по меньшей мере, один неводородный заместитель, присутствующий в фенильной группе. Заявленные аналоги найдут использование во многих областях и являются в особенности подходящими для использования в тестах обнаружения аналита, таких как пробы по обнаружению глюкозы.

Описание конкретных вариантов воплощения

Данное изобретение предусматривает новые аналоги ANS. Заявленные аналоги ANS характеризуются наличием, по меньшей мере, одного неводородного заместителя, присутствующего в их фенильных группах. Присутствие, по меньшей мере, одного неводородного заместителя обеспечивает уменьшенное смещение (которое определено ниже) продукта реакции заявленных аналогов с МВТН (или его аналогами). Предусмотрены также способы использования заявленных аналогов ANS в тестах обнаружения аналита, например пробах обнаружения глюкозы. В дальнейшем описании данного изобретения сначала будут описаны заявленные аналоги, а затем способы применения заявленных аналогов в тестах обнаружения аналита.

Перед дальнейшим описанием изобретения следует отметить, что необходимо иметь в виду, что изобретение не ограничивается конкретными описанными ниже вариантами, так как в конкретных вариантах могут быть сделаны изменения, которые также входят в объем представленной формулы изобретения. Кроме того, следует учитывать, что используемая терминология представлена только с целью описания частных вариантов и не предназначена для какого-либо ограничения объема настоящего изобретения, который определяется представленной формулой изобретения.

В данном описании и прилагаемой формуле изобретения ссылки, приведенные в единственном числе, включают и ссылки во множественном числе, если в контексте четко не указано иначе. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такие же значения, которые являются общепринятыми для специалистов в области, к которой принадлежит данное изобретение.

Аналоги ANS

Изобретением предлагаются новые аналоги ANS. Заявленные аналоги ANS характеризуются тем, что они взаимодействуют с МВТН или его аналогами в присутствии окислителя, пероксидазы и кислорода с получением хромогенного специфического голубого продукта реакции, который показывает уменьшенное смещение. Термин “уменьшенное смещение” означает, что продукт реакции, полученный при сочетании заявленного аналога ANS с МВТН (или его аналогом) дает более устойчивые показатели по сравнению со смещением показаний, наблюдаемым при реакции ANS с МВТН или его аналогом, где смещение измеряется в течение времени 2 минут от начала реакции. Смотри ниже раздел “Экспериментальная часть”, где подробно описана методика измерения смещения показания. Смещение показаний продуктов реакции, полученных с использованием заявленных аналогов, обычно уменьшается, по меньшей мере, примерно на 35%, обычно, по меньшей мере, примерно на 60% и во многих вариантах, по меньшей мере, примерно на 80%. Кроме того, во многих вариантах заявленного изобретения, цветовая характеристика, обеспеченная продуктом реакции, полученным с использованием заявленных аналогов, часто является более интенсивной, чем цветовая характеристика, наблюдаемая при использовании ANS, при этом цветовая характеристика может быть интенсивнее, по меньшей мере, на 5%, обычно, по меньшей мере, примерно на 20% и во многих вариантах, по меньшей мере, примерно на 35%. Цветовая характеристика определяется в соответствии с методикой, представленной ниже в разделе “Экспериментальная часть”.

Заявленные аналоги ANS характеризуются наличием, по меньшей мере, одного неводородного заместителя, присутствующего в фенильных группах. Число присутствующих в фенильной группе неводородных заместителей может составлять от около 1 до 5, обычно от около 1 до 3 и более предпочтительно от около 1 до 2. В качестве заместителя в фенильной группе может быть использована любая подходящая неводородная группа, если она обеспечивает аналог ANS, который показывает вышеуказанное уменьшенное смещение. Обычно неводородный(ые) заместитель(и) уменьшает(ют) склонность к агрегации окрашенного продукта, полученного взаимодействием аналога ANS с МВТН (или его аналогами). Типичные неводородные заместители включают: алкилы (замещенные и/или разветвленные), арилы (замещенные или незамещенные), галогены, OR, SeR, SR и SiR₃, где R представляет собой алкильную или арильную группу, которая может быть замещенной и/или разветвленной.

Особый интерес представляют алкильные заместители, в особенности низшие алкилы с 1-6 атомами углерода, обычно с 1-4 атомами углерода, где алкильные заместители могут иметь прямую или разветвленную цепь. Представляющие особый интерес алкильные заместители включают метил, изопропил и третбутил.

В некоторых вариантах заявленные аналоги, кроме того, ограничиваются тем, что когда заместителем в фенильной группе является метальная группа, она не связана с 3', 4' или 5'-положением фенильной группы.

Во многих вариантах заявленные аналоги описываются структурной формулой:

где n является целым числом от 1 до 5, обычно от 1 до 3 и более предпочтительно от 1 до 2; и каждый Х независимо является неводородным заместителем, где подходящие заместители включают такие, которые указаны выше, при этом во многих вариантах каждый Х является алкилом, обычно низшим алкилом с 1-6 атомами углерода, обычно с 1-4 атомами углерода, имеющим прямую или разветвленную цепь. Как указывалось выше, в некоторых предпочтительных вариантах каждый Х является или метилом, изопропилом или третбутилом. В некоторых вариантах, если Х является метилом, он не расположен в 3', 4' или 5' -положении фенильной группы.

Особый интерес представляют следующие аналоги ANS: 8-(4'-третбутилфенил)амино-1-нафталинсульфонат; 8-(4'-изопропилфенил)амино-1-нафталинсульфонат; 8-(2'-третбутилфенил)амино-1-нафталинсульфонат; 8-(3',5'-ди-третбутилфенил)амино-1-нафталинсульфонат; 8-(4'-метилфенил)амино-1-нафталинсульфонат; и 8-(2'-метилфенил)амино-1-нафталинсульфонат.

Особый интерес представляют заявленные аналоги, находящиеся в их кислотной или солевой форме, при этом присутствующие в солевой форме катионы включают аммоний, натрий, калий, кальций, магний и подобные катионы.

Вышеуказанные аналоги ANS данного изобретения могут быть получены с использованием любого подходящего способа, при этом типичные подходящие способы предусмотрены ниже в разделе “Экспериментальная часть”.

Использование

Заявленные соединения ANS (в кислотной или солевой форме) находят применение во множестве различных областей в качестве индикаторов присутствия окислителей. Иными словами, заявленные аналоги находят использование в качестве реагентов сигнал производящих систем, которые обнаруживают присутствие окислителей. Окислители, которые могут быть обнаружены при использовании сигнал производящих систем, включающих заявленные аналоги, включают пероксиды, например пероксид водорода, гидропероксид кумола, гидропероксид мочевины, пероксид бензоила; пербораты, например натрия, калия и т.д.

Заявленные аналоги являются в особенности подходящими для использования в качестве реагентов в сигнал производящих системах, предназначенных для обнаружения присутствия аналита в пробе, обычно в физиологической пробе, например в крови или в продукте, полученном из цельной крови. Представляющие интерес аналиты, которые могут быть обнаружены с использованием сигнал производящих систем, включающих заявленные аналоги, включают глюкозу, холестерин, мочевую кислоту, спирты (например, метанол, этанол), формальдегид, глицерин-3-фосфат и подобные. Особый интерес представляет использование заявленных аналогов в сигнал производящих системах, предназначенных для обнаружения присутствия глюкозы в физиологической пробе, в особенности в цельной крови.

Сигнал производящие системы, членами которых являются заявленные аналоги, обычно дополнительно включают оксидазу, пероксидазу и второй член, окрашивающей пары (в которой один из заявленных аналогов ANS является первым членом). Оксидазу, присутствующую в сигнал производящей системе, обычно выбирают в зависимости от природы подлежащего обнаружению аналита, при этом подходящие оксидазы включают глюкозооксидазу, холестериноксидазу, уриказу, алкогольоксидазу, альдегидоксидазу, глицерофосфатоксидазу и подобные. Пероксидазы, которые могут быть членами сигнал производящей системы, включают пероксидазу хрена, другие ферменты и синтетические аналоги, имеющие перокислительную активность, или химические окислители соединения и т.д. Смотри, например, Y.Ci, F. Wang; Analytica Chemica Acta, 233 (1990), 299-302.

Вторым членом окрашивающей пары сигнал производящей системы, первым членом которой являются заявленные аналоги ANS, обычно является МВТН или его аналог. Подходящие аналоги МВТН, которые могут быть использованы в качестве членов в заявленных сигнал производящих системах, включают такие, которые описаны в патентах США №№5922530; 5776719; 5563031; 5453360 и 4962040, описания которых включены в данное описание в качестве ссылки. Особый интерес представляют следующие аналоги МВТН: мета[3-метил-2-бензотиазолинонгидразон]N-сульфонилбензолсульфонат мононатрий (MBTHSB), гидрохдорид 3-метил-2-бензотиазолинонгидразона(МВТН), 3-метил-6-(натрийсульфонат)бензотиазолинон-2-гидразон, 6-гидрокси-3-метил-2-бензотиазолинонгидразон, 4-гидрокси-3-метил-2-бензотиазолинонгидразон и 6-карбокси-3-метил-2-бензотиазолинонгидразон.

Для обнаружения аналита с использованием сигнал производящей системы, членами которой являются заявленные аналоги, в особенности члены окрашивающей пары, которая была рассмотрена выше, пробу, которая, как предполагается, содержит представляющий интерес аналит (т.е. целевой аналит), обычно физиологическую пробу, например цельную кровь или продукт, полученный из крови, приводят в контакт с членами сигнал производящей системы последовательно или одновременно. Присутствие аналита приводит к получению окисляющих частиц, таких как пероксид водорода, и ковалентному связыванию двух членов окрашивающей пары вышеописанной сигнал производящей системы приводят к хромогенному продукту реакции. Хромогенный продукт реакции обычно представляет голубой продукт реакции, который характеризуется низким смещением в некоторых разновидностях тестов (например, в модификации Sure Step®), как указывалось выше. Присутствие хромогенного продукта связано с присутствием аналита в исходной пробе, причем можно качественно или количественно определить количество аналита в исходной пробе.

Сигнал производящие системы, включающие заявленные аналоги, являются в особенности подходящими для применения в устройствах для тестов обнаружения аналита, в которых члены сигнал производящий системы находится на пористой подложке, например индикаторной полоске, на которую наносят пробу и с которой считывают сигнал. Характерные примеры устройств, в которых найдут использование заявленные аналоги, включают такие, которые описаны в: 4734360; 4900666; 4935346; 5059394; 5304468; 5306623; 5418142; 5426032; 5515170; 5526120; 5563042; 5620863; 5753429; 5573452; 5780304; 5789255; 5843691; 5846486 и других патентах; описания данных патентов включены в данное описание в качестве ссылок.

Для иллюстрации, но не для ограничения предлагаются следующие примеры.

Экспериментальная часть

Синтез аналогов ANS.

1. А. Аммониевая соль 4'-третбутил ANS.

8-Амино-1-нафталинсульфоновую кислоту (1,53 г), 4'-трет-бутиланилин (3,60 г) и соль 2,6-диэтиланилин-НСl (0,95 г) смешивали в тефлоновом сосуде и после продувки N₂ сосуд герметизировали. Затем сосуд помещали в автоклав Парра, который помещали в печь и нагревали в течение 18 часов при 165°С. Смесь повторно перемешивали и нагревали в течение еще 15 часов. После завершения реакции автоклав охлаждали в бане со льдом. Смесь переносили в химический стакан и растворяли в этилацетате. Осуществляли очистку хроматографией (Колонка, заполненная силикагелем 60 GF₂₅₄) с использованием в качестве элюента этилацета. Получение аммониевой соли 4'-третбутил ANS: 4'-третбутил ANS растворяли в смешанном растворителе, состоящем из этанола и этилацетата. К соединению добавляли водный раствор NH₄OH и выпаривали растворитель, при этом получали светло-желтое кристаллическое твердое вещество. Небольшое количество темно-красной примеси удаляли промывкой твердого продукта этанолом.

2. В. Аммониевая соль 4'-изоропил ANS.

8-Амино-1-нафталинсульфоновую кислоту (1,53 г), 4'-изопропиланилин (3,60 г) и соль 2,6-диэтиланилин-НСl (0,95 г) смешивали в тефлоновом сосуде и после продувки N₂ сосуд герметизировали. Затем сосуд заключали в автоклав Парра, который помещали в печь и нагревали в течение 18 часов при 165°С. Смесь повторно перемешивали и нагревали в течение еще 15 часов. После завершения реакции автоклав охлаждали в бане со льдом. Смесь переносили в химический стакан и промывали 2-пропанолом (обычно наблюдалось выделение значительного количества кристаллического продукта, который мог быть перекристаллизован в соответствующую аммониевую соль). Осуществляли очистку хроматографией (колонка, заполненная силикагелем 60 GF₂₅₄) с использованием в качестве элюента этилацетата. Получение аммониевой соли 4'-изопропил ANS: 4'-изопропил ANS растворяли в смешанном растворителе, состоящем из этанола и этилацетата. К соединению добавляли водный раствор NH₄OH и выпаривали растворитель, при этом получали светло-желтое кристаллическое твердое вещество. Небольшое количество темно-красной примеси удаляли промывкой твердого продукта этанолом.

3. С. Аммониевая соль 2'-третбутил ANS.

8-Амино-1-нафталинсульфоновую кислоту (1,53 г), 2'-третбутиланилин (3,60 г) и соль 2,6-диэтиланилин-НСl (0,95 г) смешивали в тефлоновом сосуде и после продувки азотом сосуд герметизировали. Затем сосуд заключали в автоклав Пappa, который помещали в печь и нагревали в течение 48 часов при 195°С. Смесь повторно перемешивали и нагревали в течение еще 48 часов. После завершения реакции реакционную смесь охлаждали в бане со льдом. Смесь переносили в химический стакан и растворяли в этилацетате. Осуществляли очистку хроматографией (колонка, заполненная силикагелем 60 GF₂₅₄) с использованием в качестве растворителя этилацетата. Получение аммониевой соли 2'-третбутил ANS: 2'-третбутил ANS растворяли в смешанном растворителе, состоящем из этанола и этилацетата. К соединению добавляли водный раствор NH₄ OH и выпаривали растворитель, при этом получали светло-желтое кристаллическое твердое вещество. Имеющуюся темно-красную примесь удаляли промывкой твердого продукта этанолом.

4. D. Аммониевая соль 3',5'-ди-третбутил ANS.

8-Амино-1-нафталинсульфоновую кислоту (1,53 г), 3',5'-ди-третбутиланилин (3,80 г) и соль 2,6-диэтиланилин-НСl (0,95 г) смешивали в тефлоновом сосуде и после продувки N₂ сосуд герметизировали. Затем сосуд заключали в автоклав Парра, который помещали в печь и нагревали в течение 24 часов при 190°С. Смесь повторно перемешивалась и нагревалась в течение еще 24 часов. После завершения реакции автоклав охлаждали в бане со льдом. Смесь переносили в химический стакан и растворяли в этилацетате. Осуществляли очистку хроматографией (колонка, заполненная силикагелем 60 GF₂₅₄) с использованием в качестве растворителя этилацетата. Получение аммониевой соли (3',5'-ди-третбутил)АNS: (3',5'-ди-третбутил)ANS растворяли в смешанном растворителе, состоящем из этанола и этилацетата. К соединению добавляли водный раствор NH₄OH и выпаривали растворитель, при этом получали светло-желтое кристаллическое твердое вещество.

II. Испытание аналогов ANS.

5. Полученные вышеуказанные аналоги ANS испытывали следующим образом.

А: Приготовление испытуемых индикаторных полосок. Пористую сторону полисульфоновой мембраны толщиной 0,35 мкм (реакционная матрица, полученная от U.S. Filter, San Diego, CA) погружали до насыщения в водный пропиточный состав, показанный в таблице 1. Затем ее удаляли из пропиточного состава и выжимали избыток реагента с помощью стеклянного бруса. Затем внутри печи с циркуляцией воздуха и температурой 56°С на 10 минут подвешивали индикаторную полоску, после чего ее удаляли и погружали до насыщения в органический пропиточный состав, показанный в таблице 2. Затем ее опять сушили, как на предыдущей стадии. Полученной полоске придавали форму, необходимую для испытания.

В. Испытание

Для испытания реакции глюкозы использовали полоску вида Sure Step®. Испытание осуществляли в камере, имеющей температуру 35°С и относительную влажность 50%. На модифицированных измерительных приборах Sure Step® получали данные коэффициента отражения. Пробы крови обычно регулировали таким образом, чтобы содержание глюкозы в цельной крови было равным 120 мг/дл.

K/S=K/S является мерой коэффициента отражения, указанного и определенного в патенте США №4935346, кол. 14, описание которого включено в данное описание в качестве ссылки.

Макс. K/S=максимальное значение K/S во время измерения в течение 2-х минут.

% K/S=[(Макс. K/S аналога)/(Макс. K/S ANS)]×100

60s K/S=K/S при 660 нм, определенный через 60 с после нанесения крови на полоску

% смещения - [(K/S Макс. - 60s K/S)/(K/S макс)]×100

III. Результаты

Было найдено, что когда аналоги ANS заявленного изобретения использовали в тесте глюкозы, описанном выше в разделе II, то по сравнению с системами, в которых использовался ANS, наблюдали уменьшенное смещение окрашенного продукта. Кроме того, по сравнению с системами, в которых использовался ANS, цветовая характеристика была более интенсивной. В конечном счете, было найдено, что при использовании 4'-третбутил ANS завершение реакции достигалось быстрее, чем при использовании ANS или его других аналогов.

Из вышеприведенных результатов и данных очевидно, что заявленное изображение дает ряд преимуществ по сравнению с ANS, когда его используют в сигнал производящей системе, которая дополнительно включает МВТН или его аналоги. Указанные преимущества включают уменьшенное смещение и более интенсивную цветовую характеристику. Кроме того, заявленные аналоги являются подходящими для использования с более широким диапазоном аналогов МВТН, чем ANS. Заявленное изобретение по существу представляет значительный вклад в данную область.

Все публикации и патенты, цитированные в данном описании, включены в качестве ссылки, как если бы указывалось, что каждая отдельная публикация или патент включены по отдельности. Цитирование каждой публикации предназначено для ее раскрытия до даты подачи и не следует полагать, что настоящее изобретение не обладает приоритетным правом по сравнению с предыдущими публикациями.

Хотя представленное выше изобретение описано подробно с целью иллюстрации и примеры приведены с целью его лучшего понимания, для специалистов в данной области в свете идей изобретения очевидно, что в нем могут быть сделаны некоторые изменения и модификации без отклонения от объема или сущности, охарактеризованных в приложенной формуле изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области композиций красителей, подходящих для использования в тестах обнаружения аналита, например в тестах по определению глюкозы. Описывается аналог 8-(анилино)-1-нафталинсульфоната(АНС), способный взаимодействовать с гидррхлоридом 3-метил-2-бензотиазолинонгидразона (МБТГ) или с его аналогом с получением окрашенного продукта, имеющего пониженное смещение по сравнению с окрашенным продуктом, полученным при взаимодействии АНС и МБТГ, или его аналога, где аналог АНС включает, по меньшей мере, один алкильный заместитель, связанный с фенильной группой, при условии, что когда указанный заместитель является метилом, указанный заместитель не присутствует в положениях 3', 4' или 5'. Описывается также продукт реакции АНС с МБТГ, способ его получения, композиция на основе этого продукта и способ обнаружения присутствия аналита в пробе с использованием указанного выше соединения. Изобретение позволяет повысить точность результатов обнаружения аналита. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл.

Формула

3. Аналог АНС по п.1 или 2, описываемый формулой

где n равно от 1 до 5; и

Х независимо представляет алкильную группу с 1-6 атомами углерода, при условии, что когда Х находится в положении 3', 4' или 5', Х не является метилом.

5. Аналог 8-(анилино)-1-нафталинсульфоната (АНС) по п.1, описываемый формулой

где n равно от 1 до 5; и

Х независимо представляет изопропил или трет-бутил, и где указанный аналог АНС способен взаимодействовать с гидрохлоридом 3-метил-2-бензотиазолинонгидразона (МБТГ) или с его аналогом с получением окрашенного продукта, имеющего пониженное по крайней мере примерно на 35% смещение по сравнению с окрашенным продуктом, полученным при взаимодействии АНС и МБТГ или его аналога.