Способ снижения артериального давления у индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии, и/или у индивидов с метаболическим синдромом - RU2427382C2

Чертежи

Описание

Для настоящей заявки испрашивается приоритет по предварительной заявке США с регистрационным номером №60/721720, поданной 28 сентября 2005 года, которая приведена здесь в полном объеме в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Это изобретение относится к способу профилактики и/или лечения метаболического синдрома и/или состояний, включающих метаболический синдром. Также это изобретение относится к способу лечения и/или профилактики состояния, предшествующего гипертензии. Эти способы включают введение млекопитающему, в том числе человеку, диетической добавки, которая содержит виноградный экстракт, эффективный для лечения индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии, или индивидов с метаболическим синдромом и/или состояниями, включающими метаболический синдром.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Артериальное давление представляет собой силу, с которой кровоток воздействует на стенки артерий. Нормальным артериальным давлением считается систолическое 120 и диастолическое 80. Гипертензия относится к заболеванию, характеризующемуся повышением систолического артериального давления до 140 и выше и/или повышением диастолического артериального давления до 90 и выше. При гипертензии наблюдается возрастание общего сопротивления периферических сосудов, например, обусловленное сужением сосудов, или возрастание сердечного выброса, или и то и другое. Эти состояния приводят к повышению артериального давления, поскольку величина артериального давления равна сопротивлению за время потока. Существует множество факторов, которые могут вносить вклад в высокое артериальное давление, в том числе стресс, диета и образ жизни, а также заболевания почек, гормональные расстройства и нарушения кровотока. Пациент с гипертензией, которому не проводят лечение, имеет высокий риск развития недостаточности левого желудочка, инфаркта миокарда, кровоизлияния в головной мозг или почечной недостаточности. Также гипертензия является фактором риска развития инсульта и коронарного атеросклероза. В настоящее время пациентов с гипертензией лечат с использованием терапии лекарственными средствами, включающей применение диуретиков, бета-блокаторов, ингибиторов ACE, антагонистов ангиотензина, блокаторов кальциевых каналов, альфа-блокаторов, альфа-бета-блокаторов, ингибиторов для нервной системы и сосудорасширяющих средств.

Индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии, определяют как индивидов, имеющих систолическое давление от 120 до 139 мм рт.ст. или имеющих диастолическое давление от 81 до 89 мм рт.ст. Эта классификация основана на седьмом докладе Объединенного национального комитета по профилактике, выявлению, оценке и лечению высокого артериального давления (JNC 7), страница 87, публикация NIH №04-5230. Как правило, индивидам с состоянием, предшествующим гипертензии, не проводят лечение терапией лекарственными средствами, а дают рекомендации относительно здорового образа жизни. Эти рекомендации включают поддержание здоровой массы; физическую активность; следование здоровой схеме приема пищи, в которой особое внимание уделяется фруктам, овощам и молочным продуктам с низким содержанием жиров; выбор и приготовление продуктов питания с меньшим содержанием натрия; а также умеренное потребление алкогольных напитков, если оно вообще присутствует. Как правило, принятие привычек здорового образа жизни является эффективным первым шагом для профилактики и контролирования патологического уровня артериального давления.

Многие пациенты с гипертензией обладают резистентностью к инсулину. Инсулин стимулирует поглощение глюкозы тканями, и его способность к такому действию значительно различается среди индивидов. При резистентности к инсулину ткани обладают сниженной способностью реагировать на воздействие инсулина. Для компенсации резистентности поджелудочная железа секретирует большее количество инсулина. Таким образом, индивиды с резистентностью к инсулину имеют высокие уровни инсулина в плазме. Существует свидетельство, что патологическое артериальное давление связано со степенью резистентности к инсулину. Точный механизм, по которому развивается резистентность к инсулину, не ясен, хотя предполагают, что играют роль генетические факторы, диета и степень физической активности.

"Метаболический синдром", также называемый "синдромом X", "синдромом резистентности к инсулину" или "смертельным квартетом", характеризуется суммированием факторов риска сердечно-сосудистого заболевания, инсульта и/или сахарного диабета типа II. Метаболический синдром может быть обусловлен сверхпродукцией кортизола, гормона стресса, вызывающего накопление жировой ткани в брюшной полости и резистентность к инсулину. В настоящее время индивидам с метаболическим синдромом не рекомендуют терапию лекарственными средствами. Факторы риска, которыми характеризуется метаболический синдром, включают повышенное количество жировой ткани внутри брюшной полости (брюшное ожирение), резистентность к инсулину вместе с повышенным риском развития диабета, гиперинсулинемию, высокие уровни жиров в крови, повышенное артериальное давление и повышенный уровень липидов в сыворотке. В Национальной образовательной программе по холестерину и лечению у взрослых (ATP III) метаболический синдром был определен как наличие у индивидов по меньшей мере трех из следующих факторов риска:

Однако Всемирная организация здравоохранения определяет метаболический синдром как наличие у индивидов диабета/резистентности к инсулину и по меньшей мере двух из следующих факторов риска: высокое отношение окружности талии к окружности бедер; высокий уровень триглицеридов или низкий уровень холестерина HDL; высокое артериальное давление; а также высокая скорость выведения альбумина с мочой.

Состояния, относящиеся к метаболическому синдрому, включают сахарный диабет типа II, дислипопротеинемию, инфаркт миокарда, инсульт и другие атеросклеротические заболевания, а также факторы риска этих заболеваний, в том числе резистентность к инсулину в целом, брюшное ожирение, которое обусловлено накоплением внутрибрюшинного жира, повышенные уровни липидов и глюкозы в сыворотке крови, повышенное диастолическое и/или систолическое артериальное давление и гипертензию.

Лечение индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии, и индивидов с метаболическим синдромом способствует принятию здорового образа жизни, что включает поддержание здоровой массы; физическую активность; а также следование здоровой схеме питания. Учитывая, что этим индивидам не рекомендована терапия лекарственными средствами, существует необходимость в диетической добавке, содержащей виноградный экстракт, которую эти индивиды могут использовать в качестве дополнительного лечения, эффективного для снижения артериального давления и не увеличивающего резистентность к инсулину.

Виноградные косточки содержат приблизительно 5-8% мас. флавоноидов. Флавоноиды составляют важную группу диетических полифенольных соединений, широко распространенных в растениях. Более чем 4000 химически уникальных флавоноидов было обнаружено в таких растительных источниках, как фрукты, овощи, бобы, орехи, семена, травы, специи, цветы, а также в таких напитках, как чай, какао, пиво, вино и виноградный сок.

По терминологии флавоноиды в отношении виноградных косточек относятся к мономерным флаван-3-олам, особенно (+)-катехину, (-)-эпикатехину и (-)-эпикатехин-3-галлату. Два или более химически связанных мономера флаван-3-ола называют проантоцианидинами или олигомерными проантоцианидинами ("OPC"), которые включают процианидины и продельфинидины. OPC, содержащие два мономера, называют димерами, три мономера называют тримерами, четыре мономера называют тетрамерами, пять мономеров называют пентамерами и т.д. Технически, олигомеры имеют длину цепи от 2 до 7 (от димеров до гептамеров); тогда как полимеры представляют собой компоненты с длиной цепи, превышающей 7. После значительного обсуждения Комитет по оценке способа с использованием виноградных косточек (при посредстве Национальной ассоциации производителей продуктов питания) пришел к согласованному выводу определять OPC как все проантоцианидины, содержащие два или более мономеров, включая полимеры или конденсированные таннины. Таким образом, олигомеры в виноградных экстрактах включают, например, димеры и тримеры, и существуют данные, что полимеры могут содержать до шестнадцати звеньев.

Ниже представлена обычная структура проантоцианидина, на которой показаны удлиняющие звенья и концевые звенья эпикатехин-галлата. Например, удлиняющие звенья представлены эпикатехиновыми (2) и эпигаллокатехиновыми (3) связывающими группами. Тогда как концевое звено представлено группой эпикатехингаллата (4).

Для коммерческого использования полифенольных соединений в виде виноградного экстракта эти соединения должны быть выделены из винограда в более концентрированном виде. Общий способ, которым полифенольные соединения экстрагируют, очищают и концентрируют из цельного винограда, виноградных выжимок и виноградных косточек, описан в патенте США №6544581, который приведен здесь полностью в качестве ссылки.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена взаимосвязь между исходным уровнем артериального давления и снижением систолического давления у индивида с метаболическим синдромом, которого лечат посредством виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению.

На фиг.2 представлена взаимосвязь между исходным уровнем артериального давления и снижением диастолического давления у индивида с метаболическим синдромом, которого лечат посредством виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению.

На фиг.3 представлено изменение концентрации окисленных LDL у индивидов с метаболическим синдромом, которых лечат посредством виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению.

На фиг.4 представлена взаимосвязь изменения концентрации окисленных LDL и исходной концентрации окисленных LDL у индивидов, получающих 300 мг виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения метаболического синдрома и/или состояний, включающих метаболический синдром. Этот способ включает введение млекопитающему, в том числе человеку, при необходимости такого лечения диетической добавки, содержащей эффективное количество виноградного экстракта. В частности, используемый согласно настоящему способу виноградный экстракт эффективен для снижения артериального давления и уменьшения концентрации холестерина окисленных LDL у индивида с метаболическим синдромом.

Также настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики метаболического синдрома у млекопитающего, где способ включает введение диетической добавки, содержащей виноградный экстракт, который включает приблизительно 5-15% мас. мономеров, приблизительно 5-20% мас. димеров, приблизительно 3-10% мас. тримеров, приблизительно 2-10% мас. тетрамеров и приблизительно 2-10% мас. пентамеров. Общее количество фенольных соединений с низкой молекулярной массой, в том числе мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров, составляет приблизительно 25-50% мас., предпочтительно - приблизительно 25-40% мас., более предпочтительно - приблизительно 30-40% мас., а более предпочтительно - приблизительно 25-35% мас. Общее количество фенольных соединений составляет приблизительно 80% мас. или более, а предпочтительно - приблизительно 90% мас. или более.

Также настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения состояния, предшествующего гипертензии. Этот способ включает введение млекопитающему, в том числе человеку, при необходимости такого лечения диетической добавки, содержащей эффективное количество виноградного экстракта. В частности, используемый согласно настоящему способу виноградный экстракт эффективен для снижения артериального давления у индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии.

Также настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики предшествующего гипертензии состояния у млекопитающего, где способ включает введение диетической добавки, содержащей виноградный экстракт, который включает приблизительно 5-15% мас. мономеров, приблизительно 5-20% мас. димеров, приблизительно 3-10% мас. тримеров, приблизительно 2-10% мас. тетрамеров и приблизительно 2-10% мас. пентамеров. Общее количество фенольных соединений с низкой молекулярной массой, в том числе мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров, составляет приблизительно 25-50% мас., предпочтительно - приблизительно 25-40% мас., более предпочтительно - приблизительно 30-40% мас., а более предпочтительно - приблизительно 25-35% мас. Общее количество фенольных соединений составляет приблизительно 80% мас. или более, а предпочтительно - приблизительно 90% мас. или более.

Термин "эффективное количество" обозначает количество виноградного экстракта, достаточное для снижения одного из двух или и того и другого из систолического и/или диастолического артериального давления у индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии, или индивидов с метаболическим синдромом по меньшей мере приблизительно на 2%, предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 5%, а более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно на 8% без оказывания неблагоприятных эффектов, таких как повышение у индивида резистентности к инсулину. При этом соответствующей клинической крайней точкой является величина систолического артериального давления ниже 120 мм рт.ст. у индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии, или индивидов с метаболическим синдромом. Также было предположено, что кроме снижения артериального давления используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт снижает у индивидов с метаболическим синдромом уровень окисленного холестерина LDL. Повышенный уровень холестерина LDL представляет собой общепризнанный фактор риска атеросклероза. Существует убедительное свидетельство, что модифицированный окислением LDL вызывает развитие этого патологического процесса. Таким образом, снижение концентрации окисленного LDL может ослаблять и/или предотвращать атеросклероз у индивидов с метаболическим синдромом.

Как определено нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией ("HPLC"), виноградный экстракт, подлежащий использованию согласно настоящему изобретению, имеет фенольный профиль, состоящий из приблизительно 5-15% мас. мономеров, приблизительно 5-20% мас. димеров, приблизительно 4-10% мас. тримеров, приблизительно 2-10% мас. тетрамеров и приблизительно 2-10% мас. пентамеров. Используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт также суммарно содержит приблизительно 80% мас. или более фенольных соединений, а предпочтительно - приблизительно 90% мас. или более, как определено способом Фолина-Чокальтеу. Используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт также содержит приблизительно 2% мас. или менее концевых звеньев эпикатехин-галлата, более предпочтительно - приблизительно 1% мас. или менее, как определено HPLC с обращенной фазой после реакции тиолиза. Используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт также содержит приблизительно 12% мас. или менее удлиняющих звеньев эпикатехин-галлата, предпочтительно - приблизительно 8% мас. или менее, а более предпочтительно - приблизительно 5% мас. или менее, как определено HPLC с обращенной фазой после реакции тиолиза.

Используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт можно получать модифицированием способа экстракции горячей водой, описанного в патенте США №6544581, как описано ниже. В общем, способ экстракции горячей водой, как описано в патенте '581, включает следующие стадии. На стадии (1) сухие или свежие виноградные косточки можно нагревать горячей водой в течение времени, достаточного для экстракции большинства полифенолов. Можно использовать температуру 140-212°F, предпочтительно - 160-212°F, более предпочтительно - 180-212°F, еще более предпочтительно - 190-212°F в течение периода приблизительно 1-6 часов. Время нагревания может различаться в зависимости от используемой температуры. Как правило, для более низких температур необходимо более продолжительное время экстракции. На стадии (2) неочищенный экстракт виноградные косточки-вода можно отделять от использованных косточек посредством просеивания через металлические сита. Затем экстракт можно охлаждать и обрабатывать любым приемлемым, коммерчески доступным пектолитическим ферментом, таким как Pectinex^® Ultra SP-L, производимым Novo Nordisk, в концентрации приблизительно 50-200 частиц на миллион для разрушения компонентов клеточной стенки. Предпочтительно экстракт косточки-вода можно обрабатывать ферментом в течение периода двух часов при температуре 80-120°F. Альтернативно, экстракт косточки-вода можно обрабатывать ферментом в течение 7-14 суток или более при приблизительно 40-50°F. На стадии (3) получаемый мутный экстракт косточек можно подкислять кислотой, предпочтительно - неорганической кислотой, более предпочтительно - серной кислотой, до величины pH приблизительно 1,5-2,5 и можно позволять реагировать в течение приблизительно от одного часа до приблизительно двух суток. Подкисленный экстракт можно охлаждать в течение нескольких недель, для того чтобы позволить осесть макромолекулам, в том числе белкам и другим полисахаридам. Затем охлажденный подкисленный экстракт можно фильтровать с использованием диатомовой земли для получения прозрачного экстракта косточек. Также можно использовать другие фильтровальные средства, такие как перлит.

Для получения виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению, стадию (2) из патента '581 можно модифицировать посредством ферментативной обработки экстракта косточки-вода в течение периода от четырех до пяти суток при температуре приблизительно 80-120°F. Хотя и не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что получаемый новый виноградный экстракт обусловлен более продолжительным в сравнении с используемым в патенте '581 выдерживанием при указанном температурном диапазоне для этой стадии. Время ферментативной обработки может различаться в зависимости от используемой температуры. Как правило, для более низких температур необходимо более продолжительное время обработки. Таким образом, экстракт косточки-вода можно обрабатывать ферментом в течение двух недель или более при температуре приблизительно 60-80°F.

Альтернативно, используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт можно получать посредством следующих стадий. После экстракции на стадии (1) или после обработки пектиназой на стадии (2) патента '581 экстракт можно наносить на бактериологический планшет с агаром. После инкубации могут присутствовать многочисленные виды дрожжей, бактерий и/или грибов в зависимости от исходного вещества. Живую культуру можно выделять в виде коктейля. После выделения коктейль можно использовать в последующих стадиях экстракции и/или обработки ферментом пектиназой. Например, экстракт косточки-вода можно обрабатывать ферментом с использованием любого приемлемого, коммерчески доступного пектолитического фермента и объединять с выделенным коктейлем дрожжей, бактерий и/или грибов. Объединенной смеси можно позволять выдерживаться в течение периода приблизительно от одних до десяти суток, предпочтительно - приблизительно от двух до пяти суток при температуре приблизительно 70-100°F. Время ферментативной обработки может различаться в зависимости от используемой температуры и количества инокулята. Получаемый мутный экстракт косточек можно подкислять приемлемой кислотой, как описано выше, до величины pH 1,5-2,5 и позволять реагировать в течение приблизительно от одного часа до приблизительно двух суток. Подкисленный экстракт можно охлаждать и хранить в течение нескольких суток для обеспечения выпадения белков и полисахаридов в осадок в виде хлопьев. Затем охлажденный подкисленный экстракт можно фильтровать с использованием диатомовой земли для получения прозрачного экстракта косточек, который можно дополнительно обрабатывать в соответствии с патентом '581 для получения очищенного виноградного экстракта, приемлемого для снижения артериального давления и уменьшения уровня окисленных LDL.

Количество галловой кислоты в получаемых способом '581 виноградных экстрактах в сравнении с виноградными экстрактами, которые получают способом, включающим коктейль из дрожжей, бактерий и/или грибов, анализировали посредством HPLC. В таком анализе было показано возрастание от величины приблизительно 50-150 частей на миллион галловой кислоты в виноградных экстрактах из способа '581 до величины приблизительно 400-1500 частей на миллион галловой кислоты в виноградных экстрактах, используемых согласно настоящему изобретению с применением коктейля. Увеличение количества галловой кислоты указывает на то, что концевые и удлиняющие звенья эпикатехин-галлата деэстерифицируются из процианидинов. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что коктейль из дрожжей, бактерий и/или грибов использует виноградный экстракт в качестве субстрата для роста и проявляет ферментативную активность танназы, что приводит к деэстерификации процианидинов и высвобождению галловой кислоты. Как таковое использование коктейля из живых дрожжей, бактерий и/или грибов приводит к образованию применяемого согласно настоящему изобретению виноградного экстракта, который содержит приблизительно 2% мас. или менее концевых звеньев эпикатехин-галлата, более предпочтительно - приблизительно 1% мас. или менее, а также приблизительно 12% мас. или менее удлиняющих звеньев эпикатехин-галлата, предпочтительно - приблизительно 8% мас. или менее, а более предпочтительно - приблизительно 5% мас. или менее.

В одном из вариантов осуществления виноградный экстракт согласно настоящему изобретению можно получать с использованием следующих стадий. После экстракции на стадии (1) или после обработки пектиназой на стадии (2) из патента '581 можно добавлять любой приемлемый коммерческий фермент в виде грибной танназы, например таннинацилгидролазу, E. C3.1.1.20, в концентрации приблизительно 5-1000 частей на миллион. В зависимости от используемой концентрации фермента танназы смеси можно позволять реагировать в течение приблизительно от одного часа до приблизительно двух суток, предпочтительно - от одних до двух суток, или до снижения количества концевых звеньев приблизительно до 2% или менее, предпочтительно - до 1% или менее, и снижения количества удлиняющих звеньев приблизительно до 8% или менее, предпочтительно - приблизительно до 5% или менее. После достаточного времени реакции экстракт можно подкислять до величины pH от 1,5 до 2,5, что обеспечивает выпадение белков и полисахаридов в осадок в виде хлопьев при хранении в холодильной камере при 40-60°F. Экстракт можно фильтровать для достижения прозрачности и дополнительно обрабатывать в соответствии с патентом '581 для получения виноградного экстракта с характеристиками для снижения артериального давления.

Используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт можно составлять в виде диетических добавок, включая капсулы, таблетки, порошки, растворы, гели, суспензии, кремы, пасты, гели, суппозитории, трансдермальные пластыри и т.п. Эти диетические добавки, например, в виде порошка или раствора можно добавлять к нутрицевтическим средствам, продуктам питания и/или напиткам для формирования функциональных продуктов в виде нутрицевтического средства, продукта питания и/или напитков. Диетические добавки можно составлять в виде порошков, например, для смешивания с предназначенными для потребления жидкостями, такими как молоко, сок, вода, или с предназначенными для потребления гелями или сиропами для смешивания в виде других диетических жидкостей или продуктов питания. Диетические добавки согласно этому изобретению можно составлять с другими продуктами питания или жидкостями для обеспечения предварительно рассчитанных дополнительных продуктов питания, таких как разовые порции закусок. Общепринятые продукты питания, которые могут содержать используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт, включают молочные продукты питания, такие как йогурт, крупяные каши, хлеб, закусочные продукты питания, фруктовые соки и другие безалкогольные напитки. По мере необходимости можно добавлять ароматизаторы, связывающие вещества, белок, сложные углеводы, витамины, минералы и т.п. Предпочтительно виноградный экстракт составляют для перорального введения.

Используемые согласно настоящему изобретению диетические добавки предназначены для ежесуточного введения или по мере необходимости. Величина профилактической или терапевтической дозы диетической добавки для индивидов с предшествующим гипертензии состоянием или индивидов с метаболическим синдромом различается в зависимости от тяжести состояния, подлежащего лечению, и способа введения. Величина дозы и, возможно, частота введения доз также различаются в зависимости от возраста, массы тела и реакции индивида. В целом, общий суточный диапазон доз для описанных в настоящей заявке состояний составляет приблизительно от 50 мг до приблизительно 1000 мг массы виноградного экстракта, вводимого в единых или разделенных дозах перорально, местно или трансдермально, предпочтительно - перорально. Предпочтительный диапазон суточной дозы для перорального введения составляет приблизительно от 50 мг до приблизительно 500 мг массы виноградного экстракта (т.е. исключая эксципиенты и носители), более предпочтительно - приблизительно от 150 мг до приблизительно 300 мг. Например, капсулы или таблетки можно составлять в виде доз 150 мг или 300 мг, тогда как напитки можно составлять вместе с 50 мг виноградного экстракта. Предпочтительно такую схему введения поддерживают в течение по меньшей мере одного месяца, более предпочтительно - шести месяцев или более.

Используемые согласно настоящему изобретению диетические добавки можно составлять общепринятым способом (например, влажной или сухой грануляцией) в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами, витаминами, минералами и/или другими питательными веществами. В случае твердых препаратов для перорального введения (таких как порошки, капсулы и таблетки) типичные носители и эксципиенты включают в себя, но ими не ограничиваются, крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связывающие вещества, дезинтегрирующие вещества и т.п.

Для введения индивиду диетических добавок согласно изобретению можно использовать любой приемлемый способ введения. Например, приемлемые способы введения включают пероральное, ректальное, парентеральное, внутривенное, местное, трансдермальное, подкожное и внутримышечное введение. Хотя для обеспечения индивида эффективным количеством виноградного экстракта согласно способам настоящего изобретения можно использовать любой приемлемый способ введения, предпочтительным является пероральное введение, включая твердые лекарственные формы, такие как таблетки, капсулы или порошки. Также предпочтительно виноградный экстракт составляют для использования в функциональных продуктах в виде нутрицевтического средства, продукта питания и/или напитков.

Используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт также можно сочетать с другими активными средствами, включающими в себя, но ими не ограничивающимися, диуретики, бета-блокаторы, ингибиторы ACE, антагонисты ангиотензина, блокаторы кальциевых каналов, альфа-блокаторы, альфа-бета-блокаторы, ингибиторы для нервной системы, сосудорасширяющие средства, антиоксиданты.

1. Характеризация виноградных экстрактов

В последнее время было указано, что использование полифенолов из виноградных косточек не снижает систолическое артериальное давление, а, в действительности, повышает систолическое артериальное давление при сочетанном применении с витамином C у индивидов с гипертензией. См. Ward et al. "The combination of vitamin C and grape-seed polyphenols increases blood pressure: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial," Journal of Hypertension 2005; 23:427-434. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что фенольный профиль виноградных экстрактов важен для их эффективности в снижении артериального давления. Виноградный экстракт, оцениваемый в исследовании Ward, представлял собой Vinlife^®, обладающий фенольным профилем из суммарно 50,6% фенольных соединений, как определено способом Фолина-Чокальтеу, 11,2% концевых звеньев эпикатехин-галлата и 11,8% удлиняющих звеньев эпикатехин-галлата, как определено посредством HPLC с обращенной фазой после реакции тиолиза, а также 7,3% мономеров, 4,4% димеров, 2,0% тримеров, 1,9% тетрамеров и 1,1% пентамеров, при общей сумме от мономеров до пентамеров 16,7%, как определено нормально-фазовой HPLC.

Коммерчески доступные экстракты виноградных косточек содержат множество мономеров и проантоцианидинов. Фенольный профиль некоторых коммерчески доступных экстрактов, как определено посредством HPLC с обращенной фазой, описан в Таблице 1, а также, как определено нормально-фазовой HPLC, описан в Таблице 2. В этих анализах используемый согласно настоящему изобретению виноградный экстракт (в настоящее время производимый Polyphenols, Inc. в виде MegaNatural^®-BP) обладает тремя дифференцирующими признаками, которые отличают его от других виноградных экстрактов:

1) высокая степень чистоты, что определено суммарным содержанием фенолового соединения, превышающим приблизительно 80% мас., а более предпочтительно - превышающим приблизительно 90% мас., как определено способом Фолина-Чокальтеу;

2) высокое количество, например приблизительно 25-50% мас., фенольных соединений с низкой молекулярной массой, где фенольные соединения с низкой молекулярной массой представляют собой мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры и пентамеры; а также

3) от небольшого количества до отсутствия, например, приблизительно менее чем 2%, предпочтительно - приблизительно менее чем 1%, эпикатехин-галлата в концевых звеньях, а также небольшое количество, например, приблизительно менее чем 12%, предпочтительно - приблизительно менее чем 5%, эпикатехин-галлата в удлиняющих звеньях.

И в этом случае, хотя и не желая ограничиваться какой-либо теорией, предполагают, что фенольный профиль виноградных экстрактов важен для их эффективности в лечении или профилактике состояния, предшествующего гипертензии, или метаболического синдрома у индивидов. В частности, предполагают, что отсутствие эпикатехин-галлата в концевых звеньях и небольшое количество эпикатехин-галлата в удлиняющих звеньях в виноградном экстракте, используемом согласно настоящему изобретению, вместе с присутствием более высокого количества соединений с низкой молекулярной массой ответственно за усиление расширения сосудов, которое, как предполагают, ответственно за снижение артериального давления в описанных ниже клинических исследованиях индивидов с метаболическим синдромом и состоянием, предшествующим гипертензии.

Способ HPLC с обращенной фазой для определения процента мономеров, олигомеров и полимеров

Анализ виноградного экстракта посредством HPLC с обращенной фазой можно использовать для определения соотношения мономеров, олигомеров и полимеров на основе площади пика при 280 нм.

Получение препарата: Точно отвешивают 0,1 г виноградного экстракта в мерную колбу емкостью 100 мл. Растворяют образец в небольшом количестве метанола (<5 мл), при необходимости подвергают воздействию ультразвука. Доводят до объема посредством 18 Мом воды. Перед инъекцией образец центрифугируют (14000 об/минута, 10 минут) или фильтруют через стеклянный фильтр 0,45 мкм. Определение массовых процентов мономеров, олигомеров и полимеров основано на площади пика и концентрации эталонных проб.

Способ определения концевых и удлиняющих звеньев проантоцианидинов на основе анализа HPLC после реакции тиолиза

Тиолиз представляет собой способ определения среднего молекулярного размера (степени полимеризации) и основной структуры проантоцианидинов в виноградных экстрактах. Обеспечиваемые данные могут указывать на биологическое качество виноградных экстрактов для питательного всасывания в организме.

Реагент для тиолиза: 5% фенилметантиол (бензилмеркаптан) в метаноле, содержащем 0,2 Н HCl.

Условия: 0,1% раствор виноградного экстракта в метаноле смешивали с равным объемом реагента для тиолиза, перемешивали и нагревали при 90°C в течение 2 минут. Для прекращения реакции добавляли воду. Затем реагирующее вещество центрифугировали в течение 2 минут при 14000 об/минута. Супернатант анализировали непосредственно с использованием HPLC.

Условия HPLC:

Подвижная фаза: A: 10% уксусной кислоты/0,1% TFA/5% ацетонитрил/84,9% воды (об./об./об./об.)

B: ацетонитрил

Градиент: 0-30 минут 0-50% B

30-35 минут 50-100% B

Колонка: 150 см × 2,0 мм внутренний диаметр, 4 мкм Synergi hydro-RP 80 A (Phenomenex, Torrance, CA)

Объемная скорость потока: 0,3 мл/минута

Длина волны при регистрации: HP 1100 FLD с возбуждением при @ 276 нм и эмиссией при @ 316 нм и HP DAD при 280 нм

Температура: 30°C

Объем для инъекции: 1-3 мкл

Подлежащие анализу виноградные экстракты растворяли в метаноле, смешивали с равным объемом реагента для тиолиза и нагревали в течение 2 минут при 90°C. Высвобождаемые звенья выявляли масс-спектрометрией и количественно определяли посредством HPLC в указанных выше условиях. Среднюю степень полимеризации измеряли вычислением молярного отношения всех звеньев флаван-3-ола (аддукты простого тиоэфира вместе с концевыми звеньями) к катехину, эпикатехину и эпикатехин-галлату, соответствующим концевым звеньям. Процентное содержание концевых звеньев эпикатехингаллата определяли на основе молярного отношения эпикатехингаллата к общей сумме моль концевых звеньев, включающей катехин, эпикатехин и эпикатехингаллат. Процентное содержание удлиняющих звеньев эпикатехингаллата определяли на основе молярного отношения аддуктов простого тиоэфира и эпикатехингаллата к общей сумме моль аддуктов простого тиоэфира в удлиняющих звеньях, включая аддукты простого тиоэфира и катехина, эпикатехина и эпикатехингаллата. Общее количество фенольных соединений количественно определяли в виде грамм эквивалентов галловой кислоты (GAE) способом Фолина-Чокальтеу. Для более подробного описания способа анализа Фолина-Чокальтеу см.: Waterhouse, A.L, Determination of Total Phenolics, in Current Protocols in Food Analytical Chemistry, I1.1.1-I1.1.8, Wrolstad, R.E., Wiley, 2001 или Singleton, V.L.; Orthofer, R.; Lamuela-Raventos, R.M. "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent", Methods in Enzymology 1999, 299, 152-178, где оба приведены здесь в качестве ссылки.

Анализ проантоцианидинов посредством HPLC: хроматографические анализы проводили с использованием HPLC серии HP 1100, оборудованном автоматическим устройством для нанесения образца/устройством для инъекции, двойной помпой, устройством для нагревания колонки, регистрирующим устройством на диодной матрице, устройством для регистрации флуоресценции и HP ChemStation для сбора и управления данными. Нормально-фазовые разделения олигомеров проантоцианидина проводили на колонке Phenomenex Luna Silica (2).

Подвижная фаза: A: дихлорметан, метанол, вода и уксусная кислота (83:13:2:2 (об./об.))

B: метанол, вода и уксусная кислота (96:2:2 (об./об.))

Градиент: 0-30 минут линейный 0-17,6% B

30-45 минут линейный 17,6-30,7% B

45-50 минут линейный 30,7-87,8% B

50-60 минут линейный 87,8% B

Колонка: Phenomenex LUNA Silica (3,0×150 мм; 3,0 мкм)

Объемная скорость потока: 0,5 мл/минута

Регистрация: HP 1100 FLD с возбуждением при @ 276 нм и эмиссией при @ 316 нм

Температура: 25°C

Объем для инъекции: 3 мкл

Во всех случаях колонку повторно уравновешивали между инъекциями с использованием эквивалента 5 мл исходной подвижной фазы. Для установления калибровочной кривой реагирования, из которой рассчитывают концентрацию проантоцианидинов, получали и анализировали эталонные образцы катехина. Относительные факторы реагирования димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров в отношении к мономерам при флуоресцентной регистрации описаны в R.L. Prior and L. Gu, "Occurrence and biological significance of proanthocyanidins in American diet", Phytochemistry 2005, 66(18) 2264-2280, где использовали эталонные образцы, выделенные и очищенные из бобов какао. Эти факторы реагирования использовали для расчета количества димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров по отношению к мономерам.

Представленные в Таблицах 1 и 2 результаты были получены с использованием различных способов, что, например, обуславливает различные диапазоны процентного содержания мономеров. Например, HPLC с обращенной фазой использовали для определения процентного содержания мономеров, олигомеров и полимеров на основе площадей пиков для этих трех групп соединений. Галловая кислота включена в качестве мономеров. В нормально-фазовой HPLC в качестве эталонных образцов для определения массового количества мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров в виноградном экстракте использовали катехин и эпикатехин. Для расчета количества димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров использовали описанные R.L.Prior и L.Gu относительные факторы реагирования димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров по отношению к мономерам.

2. Эффект виноградного экстракта на артериальное давление у индивидов с метаболическим синдромом

Эффекты виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению, на артериальное давление исследовали у двадцати четырех индивидов с диагнозом метаболический синдром. В исследование было включено равное число мужчин и женщин в возрасте от 20 до 50 лет. Метаболический синдром диагностировали на основе критериев, определенных Национальной образовательной программой по холестерину и лечению у взрослых III. У каждого индивида наблюдали по меньшей мере три из следующих признаков: 1) уровень сахара в крови натощак>110 мг/дл, 2) уровень HDL (<40 мг/дл у мужчин и <45 мг/дл у женщин), 3) артериальное давление>130/85 и 4) брюшное ожирение (>102 см для мужчин и >88 см для женщин). Индивидов исключали, если они были действующими или бывшими курильщиками (<3 лет); принимали противовоспалительные или антигипертензивные лекарственные средства; или потребляли продаваемые без рецепта антиоксидантные соединения.

Индивидов случайным образом объединяли в три группы по восемь человек, и в зависимости от назначения для их группы они получали одну из следующих капсул.

Группа 1 получала капсулу плацебо

Группа 2 получала капсулу, содержащую 150 мг виноградного экстракта

Группа 3 получала капсулу, содержащую 300 мг виноградного экстракта

Индивиды получали достаточное количество капсул, принимая одну и ту же дозу раз в сутки в течение следующих двадцати восьми суток. По окончании этого периода проводили измерения артериального давления. Амбулаторные величины артериального давления регистрировали в течение периода 12 часов в начале исследования и повторно через четыре недели. Способ был неинвазивным и включал помещение на плечо манжеты для измерения артериального давления. Манжеты была соединена с автоматическим, утвержденным FDA накачивающим устройством, которое носили на поясе.

В Таблице 3 представлены данные по артериальному давлению для трех групп индивидов с метаболическим синдромом. У индивидов, ежесуточно получавших 300 мг и 150 мг виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению, наблюдали значимое снижение систолического и диастолического давления. В группе, которая получала плацебо, значимые изменения отсутствовали.

Взаимосвязь исходного уровня артериального давления и снижения систолического и диастолического давления представлена на фиг.1 и 2. Величина артериального давления приведена в мм рт.ст. Поскольку диагноз метаболический синдром основан на наличии трех из указанных выше факторов риска (одним из которых является артериальное давление), индивидов в исследовании не разделяли случайным образом по величине артериального давления. Как таковая величина среднего артериального давления в трех группах не была сходной (а различалась в пределах узкого диапазона).

В этом исследовании показано, что виноградный экстракт согласно настоящему изобретению в суточных дозах 150 мг и 300 мг снижает и систолическое, и диастолическое артериальное давление у индивидов с метаболическим синдромом. Снижение артериального давления статистически значимо для обеих доз используемого экстракта. Действительно, изменения артериального давления, наблюдаемые при использовании виноградного экстракта, были сравнимы с изменениями, которые наблюдают в крупных клинических исследованиях с использованием фармацевтических средств

3. Эффект виноградного экстракта на уровень окисленных LDL у индивидов с метаболическим синдромом

Эффекты виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению, на уровень окисленных LDL исследовали у тех же двадцати четырех индивидов с диагнозом метаболический синдром, как описано выше. Концентрацию окисленных LDL измеряли в начале исследования и повторно через четыре недели после обработки. Для измерения концентрации окисленных LDL у каждого индивида забирали образец крови и анализировали.

Изменения концентрации окисленных LDL для трех групп обобщены на фиг.3. На фиг.3 представлено незначительное снижение уровня окисленных LDL в случае плацебо, тенденция к снижению уровня окисленных LDL у индивидов, которые получали 150 мг виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению, и статистически значимое снижение (p<0,05) уровня окисленных LDL у индивидов, которые получали 300 мг виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению. На фиг.4 представлена взаимосвязь изменения уровня окисленных LDL и исходной концентрации окисленных LDL у индивидов, получавших 300 мг используемого в исследовании виноградного экстракта. Коэффициент регрессии, R²=0,52. На фиг.4 представлено значительное снижение концентрации окисленных LDL у индивидов, в первую очередь для тех, у кого в начале были более высокие уровни окисленных LDL.

В этом исследовании показано, что виноградный экстракт согласно настоящему изобретению в суточной дозе 150 мг и 300 мг снижает концентрацию окисленных LDL в плазме у индивидов с метаболическим синдромом. Кроме того, наблюдали статистически значимое снижение концентрации окисленных LDL у тех индивидов, которые получали 300 мг виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению.

4. Эффект виноградного экстракта на индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии

Эффекты используемого согласно настоящему изобретению виноградного экстракта исследовали у двадцати четырех индивидов с диагнозом состояние, предшествующее гипертензии. В исследование было включено равное число мужчин и женщин в возрасте от 30 до 60 лет. Состояние, предшествующее гипертензии, диагностировали на основе седьмого доклада Объединенного национального комитета по профилактике, выявлению, оценке и лечению высокого артериального давления. Каждый индивид имел систолическое давление от 120 до 139 мм рт.ст. и/или диастолическое давление от 81 до 89 мм рт.ст. Индивидов исключали, если они были действующими или бывшими курильщиками (<3 лет); принимали противовоспалительные или антигипертензивные лекарственные средства; или потребляли продаваемые без рецепта антиоксидантные соединения.

Индивидов случайным в отношении пола образом объединяли в две группы по двенадцать человек, и в зависимости от назначения для их группы они получали одну из следующих капсул.

Группа 1 получала капсулу плацебо

Группа 2 получала капсулу, содержащую 300 мг MegaNatural^®-BP

Индивиды получали достаточное количество капсул, принимая одну и ту же дозу раз в сутки в течение следующих восьми недель. По окончании этого периода проводили измерения артериального давления. Амбулаторные величины артериального давления регистрировали в течение периода 12 часов в начале исследования и повторно через восемь недель. Способ был неинвазивным и включал помещение на плечо манжеты для измерения артериального давления. Манжеты была соединена с автоматическим, утвержденным FDA накачивающим устройством, которое носили на поясе.

В Таблице 4 представлены данные по артериальному давлению для двух групп индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии. Исходные величины артериального давления для двух групп значимо не отличались. У индивидов, которые ежесуточно получали 300 мг виноградного экстракта, используемого согласно настоящему изобретению, наблюдали значимое снижение и систолического, и диастолического давления; тогда как в группе, получавшей плацебо, значимые изменения отсутствовали. Например, среднее снижение систолического артериального давления в группе, обрабатываемой с использованием MegaNatural^®-BP, составляло 7,2±2,5 мм рт.ст., тогда как в группе плацебо систолическое артериальное давление возрастало на 0,03±1,5 мм рт.ст. Обобщенные данные приведены ниже. Величины представлены в мм рт.ст. (среднее значение±SEM).

В этом исследовании показано, что виноградный экстракт согласно настоящему изобретению в суточной дозе 300 мг снижает систолическое и диастолическое артериальное давление у индивидов с состоянием, предшествующим гипертензии. Снижение артериального давления является статистически значимым. Действительно, изменения артериального давления, наблюдаемые при использовании виноградного экстракта, были сравнимы с изменениями, которые наблюдали в крупных клинических исследованиях с использованием фармацевтических средств.

ПРИМЕРЫ

Изобретение дополнительно определено ссылкой на следующие ниже примеры, в которых описан способ получения виноградного экстракта и получения диетических добавок. Примеры являются типичными и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1: Способ получения виноградного экстракта

Высушенные виноградные косточки экстрагировали в течение двух часов с использованием воды при температуре 200°F и отделяли экстракт от косточек на металлических ситах. Экстракт охлаждали до 90-100°F и добавляли пектиназу в концентрации 200 частей на миллион. Разделяли экстракт на две порции. К одной порции добавляли коммерческий грибной фермент танназу (таннинацилгидролаза, E.C3.1.1.20) в концентрации 1000 частей на миллион. Ко второй порции добавляли танназу в концентрации 50 частей на миллион. Остаточная концентрация галловой кислоты в исходном экстракте составила 117 частей на миллион при 18,9% концевых звеньев и 11,1% удлиняющих звеньев. В течение приблизительно двух часов обработки посредством 1000 частей на миллион фермента танназы концентрация галловой кислоты повысилась до 904 частей на миллион при 0% концевых звеньев и приблизительно 5,5% удлиняющих звеньев. Чтобы концентрация галловой кислоты достигла 810 частей на миллион при менее чем 1% концевых звеньев и менее чем 6% удлиняющих звеньев, потребовалась обработка посредством 50 частей на миллион фермента танназы приблизительно в течение тридцати четырех часов. Приблизительно через двое суток оба экстракта подкисляли до величины pH 1,5-2,5, чтобы обеспечивало выпадение белков и полисахаридов в осадок в виде хлопьев при хранении в морозильной камере при 40-60°F. Экстракт фильтровали и дополнительно обрабатывали в соответствии с патентом '581 для получения виноградного экстракта с характеристиками для снижения артериального давления и снижения концентраций окисленных LDL.

Пример 2: Капсулы

Виноградный экстракт MegaNatural^®-BP (150 мг или 300 мг) смешивали в сухом виде со стеаратом магния (3 мг или 6 мг, соответственно) и помещали в капсулы с твердой желатиновой оболочкой (полученной из желатина и воды). В препарате 150 мг виноградный экстракт содержит как минимум 90% фенолов или 135 мг фенолов в 150 мг виноградного экстракта. В препарате 300 мг виноградный экстракт содержит как минимум 90% фенолов или 270 мг фенолов в 300 мг виноградного экстракта. Суточная доза составляет одну капсулу в сутки.

Пример 3: Порошок

Виноградный экстракт составляли в виде MegaNatural^®-BP сухой смеси с эксципиентами, как представлено в Таблице 5, для использования в напитке, где ингредиенты смешивали в сухом состоянии. Для получения конечного напитка сочетали 9,47 г сухой смеси с 500 мл холодной воды и перемешивали. Порция 500 мл содержит 16 калорий. Конечный напиток содержит 100 мг виноградного экстракта MegaNatural^®-BP и 120 мг витамина C в порции 1 л, обладающей величиной ORAC 2200 TE.

ORAC, измеряемый в ммоль эквивалентов Trolox (некоммерческого водорастворимого производного токоферола) (TE) на грамм, означает "способность поглощать радикалы кислорода". Это является стандартом, посредством которого ученые измеряют антиоксидантную активность в продуктах питания и добавках. Разовые порции свежих или свежеприготовленных фруктов и овощей в среднем обеспечивают от 600 до 800 единиц ORAC. Было предположено, что возрастающий прием продуктов питания или добавок, обеспечивающих от 2000 до 5000 единиц ORAC в сутки, может оказывать благоприятное воздействие на здоровье.

Пример 4: Напиток

Виноградный экстракт MegaNatural^®-BP составляли в виде напитка с эксципиентами, как представлено в Таблице 6. Следующий ниже напиток содержит 50 мг виноградного экстракта MegaNatural^®-BP и 60 мг витамина C (100% RDI) в порции 8 жидких унций. В порции 8 жидких унций напиток содержит 0 калорий и, суммарно, 0,15 г углеводов. Порция 16 жидких унций обладает величиной ORAC 2200 TE.

Пример 5: Напиток

Виноградный экстракт MegaNatural^®-BP составляли в виде напитка с эксципиентами, как представлено в Таблице 7. Следующий ниже напиток содержит 50 мг виноградного экстракта MegaNatural^®-BP и 60 мг витамина C (100% RDI) в порции 8 жидких унций. В порции 8 жидких унций напиток содержит 15 калорий и, суммарно, 4 г углеводов. Порция 16 жидких унций обладает величиной ORAC 2200 TE.

Пример 6: Витаминная/минеральная добавка

Виноградный экстракт MegaNatural^®-BP (150 мг) смешивали в сухом состоянии со следующими, указанными в Таблице 8 эксципиентами и прессовали в таблетку для формирования поливитаминной/минеральной добавки. Суточная доза составляет одну таблетку в сутки, предпочтительно принимая вместе с пищей.

Пример 7: Витаминная/минеральная добавка

Виноградный экстракт MegaNatural^®-BP (150 мг) смешивали со следующими, указанными в Таблице 9 эксципиентами и ингредиентами в V-образном смешивающем устройстве до гомогенного состояния. Смесь прессовали в таблетки, достигающие указанной массы 775 мг±2%, для формирования поливитаминной/минеральной добавки. На таблетки наносили распылением прозрачное покрытие из водорастворимой смолы, такой как гидроксипропилметилцеллюлоза, и сушили. Суточная доза составляет одну таблетку в сутки. Размер порции для состава в Таблице 9 составляет 500000 таблеток.

Реферат

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии и эндокринологии, и касается снижения артериального давления при метаболическом синдроме и состоянии, предшествующем гипертензии. Для этого вводят композицию, включающую эффективное количество полифенольного экстракта винограда, содержащего не более 2% мас. полифенолов, имеющих концевые звенья эпикатехин-галлата. Такой состав экстракта винограда, содержащий низкие концентрации полифенолов, имеющих концевые звенья эпикатехин-галлата, и высокую концентрацию моно- и олигомерных соединений, обеспечивает эффективное лечение указанной патологии за счет снижения артериального давления и нормализации липидного обмена. 5 н. и 33 з.п. ф-лы, 4 ил., 11 табл.

Формула