Объединенная очистка и измерение метилирования днк с совместным измерением мутаций и/или уровней экспрессии мрнк в автоматическом реакционном картридже - RU2019119086A
Код документа: RU2019119086A
Формула
1. Комплект картриджей для определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты, где указанный комплект картриджей содержит:
первый картридж, содержащий:
камеру приема образца;
колонку, содержащую первый матричный материал;
канал или камеру с контролем температуры;
камеру изъятия образца; и
множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, при этом в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит бисульфитный реагент; и
второй картридж, содержащий:
камеру приема образца;
колонку, содержащую второй матричный материал;
канал или камеру с контролем температуры; и
множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, при этом в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит реагент для десульфирования и/или элюирования.
2. Комплект картриджей по п. 1, в котором указанный канал или камера с контролем температуры в указанном первом картридже представляет собой канал или камеру термоциклирования.
3. Комплект картриджей по любому из пп. 1, 2, в котором указанный канал или камера с контролем температуры в указанном втором картридже представляет собой канал или камеру термоциклирования.
4. Комплект картриджей по любому из пп. 1-3, в котором указанный бисульфитный реагент содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из бисульфита аммония, метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO).
5. Комплект картриджей по п. 4, в котором указанный бисульфитный реагент содержит бисульфит аммония.
6. Комплект картриджей по любому из пп. 1-5, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, которая содержит поглотители для предотвращения окисления сульфитов и/или катализаторы.
7. Комплект картриджей по п. 6, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители, выбранные из группы, состоящей из Тролокса и гидрохинона.
8. Комплект картриджей по любому из пп. 6-7, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей полиамины в качестве катализаторов.
9. Комплект картриджей по любому из пп. 1-8, в котором указанный первый картридж выполнен с возможностью добавления в этот картридж бисульфитного реагента во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
10. Комплект картриджей по любому из пп. 1-9, в котором указанный бисульфитный реагент представлен в качестве компонента в одной из указанного множества камер в указанном первом картридже.
11. Комплект картриджей по любому из пп. 1-10, в котором по меньшей мере одна камера, составляющая множество камер в указанном втором картридже, содержит праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР), и/или зонд для ПЦР, и/или мастер-микс для ПЦР.
12. Комплект картриджей по любому из пп. 1-11, в котором указанный второй картридж содержит одну или более камер, содержащих один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических для метилирования праймеров для ПЦР, специфических для метилирования зондов для ПЦР, фермента(ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
13. Комплект картриджей по п. 12, в котором указанный второй картридж содержит по меньшей мере две камеры, содержащие один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических для метилирования праймеров для ПЦР, специфических для метилирования зондов для ПЦР, фермента(ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
14. Комплект картриджей по любому из пп. 1-13, причем указанный второй картридж содержит по меньшей мере одну камеру, содержащую праймеры и зонды для определения метилирования прямой цепи конвертированной ДНК.
15. Комплект картриджей по любому из пп. 1-14, в котором указанный второй картридж содержит по меньшей мере одну камеру, содержащую праймеры и зонды для определения метилирования обратной цепи конвертированной ДНК.
16. Комплект картриджей по любому из пп. 12-15, в котором указанные праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты представлены на шариках.
17. Комплект картриджей по любому из пп 1-16, в котором указанный второй картридж содержит один или более праймеров, представленных в таблицах 5,11 или 12, и/или один или более зондов, представленных в таблицах 5, 11 или 12.
18. Комплект картриджей по п. 17, в котором указанный второй картридж содержит следующие зонды и праймеры для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР:
внешний прямой праймер (248b), содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
внешний обратный праймер (249b), содержащий последовательность нуклеотидов: ААААААС(Т*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
внутренний прямой праймер (250), содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
внутренний обратный праймер (251), содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
зонд (252а), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАААСАС(Т*)САССАААТС(N*)САААС-блокатор (SEQ ID NO: 268).
19. Комплект картриджей по любому из пп. 17, 18, в котором указанный второй картридж содержит следующие зонды и праймеры для определения метилирования АСТВ (например, в качестве контроля) с использованием вложенной реакции ПЦР: внешний прямой праймер (102), содержащий последовательность нуклеотидов GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
внешний обратный праймер (103), содержащий последовательность нуклеотидов ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
внутренний прямой праймер (148), содержащий последовательность нуклеотидов GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
внутренний обратный праймер (149), содержащий последовательность нуклеотидов CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO: 150); и
зонд (178), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC- блокатор (SEQ ID NO: 179).
20. Система для определения метилирования нуклеиновой кислоты в биологическом образце, включающая:
корпус, выполненный с возможностью размещения одного или более модулей обработки образца, где каждый модуль обработки образца выполнен с возможностью крепления съемного первого картриджа и/или второго картриджа из указанного комплекта картриджей по любому из пп. 1-19;
при этом указанная система выполнена с возможностью:
управления модулями обработки образца с обеспечением выполнения обработки образца для управления первым картриджем из указанного комплекта картриджей с обеспечением выполнения бисульфитной конверсии нуклеиновой кислоты в образце, введенном в указанный первый картридж и/или
выполнения десульфирования и определения метилирования одной или более нуклеиновых кислот-мишеней внутри соответствующего съемного картриджа для образца.
21. Способ определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты, включающий:
обеспечение биологического образца в камере для образца первого картриджа в комплекте картриджей по любому из пп. 1-19 и управление указанным первым картриджем с обеспечением:
связывания ДНК в указанном образце с указанным первым матричным материалом; промывания связанной ДНК;
элюирования связанной ДНК из матричного материла;
объединения элюированной ДНК с указанным бисульфитный реагентом;
нагревания смеси ДНК и бисульфитного реагента в указанном канале или камере с контролем температуры с обеспечением выполнения бисульфитной конверсии указанной ДНК; и
доставки конвертированной бисульфитом ДНК в камеру изъятия образца указанного первого картриджа.
22. Способ по п. 21, где указанный способ дополнительно включает:
обеспечение конвертированной бисульфитом ДНК в камере для образца второго картриджа в комплекте картриджей по любому из пп. 1-19; и управление указанным вторым картриджем с обеспечением:
связывания указанной конвертированной бисульфитом ДНК с указанным вторым матричным материалом;
промывания связанной конвертированной бисульфитом ДНК;
элюирования промытой конвертированной бисульфитом ДНК из указанного второй матричного материала; и
десульфирования конвертированной бисульфитом ДНК.
23. Способ по п. 22, в котором указанным вторым картриджем управляют с обеспечением элюирования конвертированной бисульфитом ДНК из указанного второго матричного материала перед десульфированием.
24. Способ по п. 22, в котором указанным вторым картриджем управляют с обеспечением элюирования конвертированной бисульфитом ДНК из указанного второго матричного материала после или в ходе десульфирования.
25. Способ по любому из пп. 22-24, где указанный способ включает управление указанным вторым картриджем с обеспечением выполнения специфической в отношении метилирования ПЦР и/или секвенирования нуклеиновой кислоты, и/или высокоточного анализа кривых плавления (HRM) для указанной конвертированной нуклеиновой кислоты с определением метилирования указанной нуклеиновой кислоты.
26. Способ выявления у субъекта рака или предрасположенности к раку, включающий:
обеспечение биологического образца от указанного субъекта, где указанный биологический образец содержит ДНК;
применение комплекта картриджей по любому из пп. 1-19, при этом указанный первый картридж указанного комплекта картриджей применяют с выполнением конверсии бисульфитом указанной ДНК; и указанный второй картридж указанного комплекта картриджей применяют для десульфирования конвертированной ДНК и определения метилирования одного или более промоторов гена в указанной ДНК, статус метилирования которой является маркером рака, при этом увеличение метилирования указанного одного или более промоторов гена является показателем наличия рака, или предрасположенности к раку, или стадии рака или предракового состояния.
27. Набор для определения метилирования ДНК, включающий:
контейнер, содержащий первый картридж и/или второй картридж из комплекта картриджей по любому из пп. 1-19.
28. Набор по п. 27, где указанный набор содержит реагент для конверсии в указанном картридже или в обособленном от картриджа контейнере.
29. Набор по п. 28, где указанный набор содержит указанный реагент для конверсии в обособленном от картриджа контейнере.
30. Набор по п. 28, где указанный набор содержит указанный реагент для конверсии, который размещен в камере картриджа.
31. Набор по любому из пп. 28-30, в котором указанный реагент для конверсии содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия, бисульфита аммония и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO).
