Конструкция - RU2565537C2

Чертежи

Показать все 17 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к конструкции, которая, при ее экспрессии в клетке-хозяине, является способной продуцировать пустые вирусные капсиды, в частности пустые капсиды вируса ящура (FMDV). Настоящее изобретение также относится к векторам и клеткам-хозяевам, включающим указанные конструкции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ящур (FMD)

FMD представляет собой высококонтазиозное и экономически разорительное заболевание парнокопытных животных (Artoidactyla), поражающее домашних жвачных животных, свиней и большое количество диких видов животных.

FMD широко распространен во всем мире. Развитые регионы, такие как континенты Северная и Центральная Америка и Антарктика и такие страны как Австралия и Новая Зеландия свободны от данного заболевания, в то время как FMD является эндемичным для многих развивающихся стран, таких как страны Африки южнее Сахары, ближнего Востока, южной Азии, Юго-Восточной Азии и Южной Америки. Существуют также несколько областей в мире, которые обычно свободны от данного заболевания, такие как Европа, где FMD был уничтожен в 1989 г. и где вакцинацию прекратили с 1991 г. Однако наблюдались редкие вспышки заболевания, такие как эпидемия 2001 г. в Великобритании/Ирландии/Франции/Нидерландах, вызванная паназиатским штаммом О (Knowles et al., (2001) Veterinary Record. 148, 258-259), и вспышка в Великобритании в 2007 г., вызванная серотипом О1 BFS/1967.

Агентом, вызывающим FMD, является вирус ящура (FMDV), позитивный смысловой одноцепочечный РНК-вирус семейства Picornaviridae. FMDV существует в форме семи антигенно различных серотипов, а именно А, О, С, Азия 1 и южноафриканских территорий (SAT) 1, 2 и 3, с многочисленными подтипами в каждом серотипе.

Трансляция одноцепочечной РНК дает полипротеин, который впоследствии подвергается процессингу кодируемыми вирусом протеиназами, с образованием структурных и неструктурных белков, требующихся для сборки и репликации вируса. Лидерная (L) протеиназа сама себя отщепляет в цис- или транс-положении на С-конце от предшественника капсида Р1-2А. Протеиназа 2А расщепляет сама себя на С-конце с высвобождением Р1-2А от Р2. На процессинг Р1-2А влияет 3С протеиназа, с образованием капсидных белков 1АВ (известного также как VP0) и 1D (VP1). В вирионе наблюдается расщепление 1АВ с образованием 1А (VP4) и 1B (VP2).

Вакцины FMDV

Обычные вакцины против FMD состоят их цельных вирусных вирионов, которые были химически инактивированы, обычно, с использованием азиридина, такого как бинарный этиленимин (BEI).

Вакцины из инактивированного цельного вируса играют ключевую роль в кампаниях по контролю и уничтожению FMD. Однако вакцины, выработанные из вирусной тканевой культуры, связаны с риском высвобождения вируса во время производства вакцины. Существует также риск неполноценной инактивации вируса, которая потенциально приводит с связанным с вакцинацией вспышкам FMD.

Для того чтобы уменьшить указанные риски, рассматривается возможность использовать пустые капсидоподобные частицы FMDV. Указанные частицы включают в себя структурные белки FMDV, но не способны реплицировать и инфицировать, поскольку не имеют РНК-генома. Поскольку внешняя структура пустых капсидов должна быть такой же, как у вируса дикого типа, пустые капсиды должны обладать аналогичной антигенностью и иммуногенностью.

Было предпринято несколько попыток получить пустые капсидные частицы FMD, но имели место периодически возникавшие проблемы, связанные с выходом и стабильностью продукта.

Экспрессионную систему вакцинного вируса использовали для экспрессии кассеты Р1-2А-3С (Abrahams et al. (1995) J. Gen. Virol. 76:3089-3098). Было установлено, что конститутивная экспрессия кассеты не была успешной, но рекомбинантые vv/FMDV можно было изолировать, когда кассету помещали под контроль промотора бактериофага Т7. Однако подобная система не может использоваться для длительной экспрессии пустых капсидов, поскольку со временем токсичность кассеты Р1-2А-3С будет превалировать. Проблема также в том, что будет необходима постоянная экспрессия T7 Pol для управления продукцией Р1-2А-3С. Может быть возможным достижение этого результата при малых масштабах в тканевой культуре, но будет невозможно экстраполировать это на производственные масштабы. Помимо этого, продукты, произведенные в вакцинных системах, не являются коммерчески жизнеспособными для медицинского или ветеринарного применения.

Li et al. (2008) (PloS ONE 28:3(5) e2273) сообщают об экспрессии капсидных белков FMDV в экспрессионной системе тутовый шелкопряд/бакуловирус. Рекомбинантный вирус, экспрессирующий интактные кодирующие области Р1-2А и 3С, использовали для инокуляции тутовым шелкопрядам, и впоследствии у умирающих шелкопрядов собирали гемолимфу. Было показано, что препарат из указанных «экспрессированных антигенов» вызывал анти-FMDV-антительный ответ у крупного рогатого скота. Однако природа «экспрессированных антигенов» полностью не ясна, и авторы взяли на себя допущение, что это является «субъединичной вакциной», в противоположность пустому капсиду.

Cao et al. ((2009) Veterinary Microbiology 137:10-17) описывают рекомбинантную бакуловирусную систему, которая одновременно экспрессирует гены для белков Р12А и 3С FMDV от индивидуальных промоторов. С использованием вестерн блоттинга было показано, что капсидные белки до некоторой степени подвергались процессингу протеиназой 3С, и что пустые капсидные частицы можно наблюдать с использованием иммуноэлектронного микроскопа. Иммунизация необработанным экстрактом пустых капсидов действительно давала иммунный ответ, но уровни FMDV-специфичных антител и нейтрализующих антител были ниже, чем при использовании обычной инактивированной вакцины. Предполагается, что это происходит из-за более низких уровней пустых капсидных частиц. Был сделан вывод о том, что требуются дальнейшие исследования для улучшения экспрессии белка и сборки пустых капсидов в клетках насекомых.

Таким образом, существует потребность в улучшенном способе изготовления пустых вирусных капсидов, который дает иммуногенный, стабильный продукт с разумным выходом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявитель неожиданно установил, что причиной низкого выхода, который исторически связан с изготовлением пустых капсидов FMDV, является то, что уровень протеиназы 3С является слишком высоким в клетке-хозяине, что вызывает токсичность. Для того чтобы производить пустые капсидные частицы с высоким выходом, необходимо балансировать между экспрессией и/или активностью протеиназы 3С, таким образом чтобы она экспрессировалась/была активна достаточно, чтобы расщеплять предшественник капсидного белка, но не экспрессировалась/не была активна на уровнях, которые индуцируют токсичность в клетке-хозяине.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, которая, при ее экспрессии в клетке-хозяине, является способной продуцировать пустые вирусные капсиды, включающей:

(i) нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок-предшественник;

(ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую протеиназу, способную расщеплять капсидный белок-предшественник; и

(iii) контрольный элемент, который контролирует экспрессию протеиназы таким образом, что когда конструкция присутствует в клетке-хозяине, контрольный элемент вызывает экспрессию протеиназы на уровне, достаточном для расщепления капсидного белка-предшественника, но не достаточном для индукции значительной токсичности в клетке-хозяине.

Контрольный элемент можно получать из ретровируса, в частности контрольный элемент может представлять собой сайт сдвига рамки считывания ретровируса, такой как сайт сдвига рамки считывания ВИЧ-1. Сайт сдвига рамки считывания ВИЧ-1 вызывает сдвиг рамки считывания приблизительно в 5% транслированных мРНК. Сайт сдвига рамки считывания может располагаться между нуклеотидной последовательностью, кодирующей капсидный белок-предшественник, и нуклеотидной последовательностью, кодирующей протеиназу, таким образом, что когда конструкция транслирована:

(1) если рибосома не претерпевает сдвига рамки считывания, она продуцирует процессированный продукт (который включает в себя капсидный белок-предшественник, но не протеиназу); но

(2) если рибосома претерпевает сдвиг рамки считывания, то транслируются и капсидный белок-предшественник, и протеиназа.

В конструкции согласно первому аспекту изобретения активность протеиназы также может быть уменьшена. Например, протеиназа может включать по меньшей мере одну мутацию, которая уменьшает ее активность по расщеплению капсидного белка-предшественника.

Протеиназа (например, мутантная протеиназа) может обладать активностью расщепления капсидного белка-предшественника, которая приблизительно в 3 раза ниже, чем у протеиназы дикого типа.

Пустые капсиды, продуцированные клеткой-хозяином, включающей в себя конструкцию по первому аспекту настоящего изобретения, могут представлять собой пикорнавирусные капсиды, такие как капсиды вируса ящура (FMDV).

Для того чтобы производить пустые капсиды FMDV, белок-предшественник может представлять собой Р1, а протеиназа может представлять собой 3С. Для того чтобы понизилась активность протеиназы 3С, она может включать в себя мутацию, например мутацию по Cys142.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему конструкцию по первому аспекту настоящего изобретения. Вектор может представлять собой, например, бакуловирусный трансферный вектор, ДНК-вектор, плазмиду или вирусный вектор.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, включающей конструкцию по первому аспекту настоящего изобретения. В первом варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин может быть способна продуцировать вектор в соответствии со вторым аспектом изобретения. Во втором варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин может быть способна продуцировать пустые вирусные капсиды.

Клетка-хозяин может представлять собой, например, клетку насекомого или клетку млекопитающего.

Другие аспекты изобретения относятся:

(i) к способу получения пустых вирусных капсидов экспрессией конструкции по первому аспекту настоящего изобретения в клетке-хозяине и сбора пустых вирусных капсидов, продуцированных клеткой-хозяином;

(ii) к способу получения вакцины получением пустых вирусных капсидов указанным способом и инкорпорацией пустых вирусных капсидов в вакцину;

(iii) к способу лечения и/или профилактики заболевания у пациента экспрессией конструкции по первому аспекту настоящего изобретения у пациента, таким образом, что пустые капсиды продуцируются in vivo;

(iv) к конструкции по первому аспекту настоящего изобретения или вектору по второму аспекту настоящего изобретения для применения для профилактики и/или лечения заболевания;

(v) к применению конструкции по первому аспекту настоящего изобретения или вектора по второму аспекту настоящего изобретения для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания;

(vi) к применению ретровирусного контрольного элемента для контроля экспрессии пикорнавирусного белка; и

(vii) к конструкции, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую пикорнавирусный белок под контролем ретровирусного контрольного элемента.

Вакцины на основе «пустых капсидов» имеют преимущества по сравнению с традиционными вакцинами на основе инактивированного цельного патогена (например, против FMD), поскольку для своего производства не требуют оборудования, обеспечивающего высокую степень безопасности, что уменьшает риск «побега» вируса. Они также не являются заразными, с ними легко манипулировать и (в связи с настоящим изобретением) их легко и недорого изготавливать.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 - Экспрессирующий вектор pOPINE5949-FS). Вектор является производным коммерческого вектора pTriEx1.1 (EMD Sciences), но в него были внесены изменения для непрерывного клонирования. Показаны отличительные признаки вектора и сайты диагностических сайтов рестрикции. Ключевым этапом успешной экспрессии пустых капсидов FMDV является интродукция последовательности, кодирующей сайт сдвига рамки считывания кодирующей области 3С между уникальными рестрикции NotI и Bsu36I. В результате все мРНК, происходящие из промотора р10 или CMV, транслируют белок-предшественник Р1, но только субпопуляция транслирует протеиназу 3С. В случае использования для формирования рекомбинантного бакуловируса последовательность между ORF603 по часовой стрелке к ORF629 рекомбинируется с вирусным геномом. Затем активируется промотор Р10 как часть бакуловирусного инфекционного цикла, с образованием рекомбинантного продукта в инфицированной клетке.

Фиг.2 - Сравнение уровней экспрессии между рекомбинантными бакуловирусами, которые кодируют P1-2А-3B3-3C (правая полоса) или P1-2А-3B3-3C_163S (левая полоса). Устранение активности 3С избавляет от избыточного синтеза Р1.

Фиг.3 - Последовательность, использовавшаяся для сдвига рамки считывания на стыке Р1-3С. Отличительными чертами являются дорожка урацилов (подчеркнуто), где наблюдается проскальзывание, за которым следует псевдоузел, который заставляет рибосому сделать паузу, способствуя, таким образом, проскальзыванию.

Фиг.4 - Интродукция последовательности сдвига рамки считывания ВИЧ-1. Рамка считывания Р1 является верхней из двух, и инсерция приводит к усечению транслированного продукта на стоп-кодоне, обозначенном красным цветом. Сдвиг рамки считывания А -1 в начале инсерцированной последовательности (оранжевый прямоугольник) приводит к коррекции рамки считывания с включением в нее 3С трансляции (нижняя рамка).

Фиг.5 - Измерения in vitro активности протеиназы 3С, мутировавшей по остатку 142. Отметьте, что и 142Т, и 142S обладают пониженной активностью по сравнению с исходной последовательностью.

Фиг.6 - Пикорнавирусная филогения. Близкородственное семейство имеет общую стратегию кодирования и репликационного цикла; то, что наблюдается в отношении хорошо изученных вирусов, таких как полиовирус (PV) и вирус ящура (FMDV), оказывается верным и для других членов семейства.

Полную филогению и обсуждение можно найти в Hughes AL (20040 Phylogeny of the Picornaviridae and differential evolutionary divergence of picornavirus proteins. Infect. Genet. Evol. 4:143-52).

Фиг.7 - Линейная карта экспрессионной кассеты с фиг.1 и возможные продукты ее трансляции. Предложенные относительные уровни трансляции для продукта P1 и P1-2A-3B-FS-3C взяты из литературы и не определялись опытным путем.

Фиг.8 - Токсичность протеиназы 3С. Клетки насекомых, инфицированные рекомбинантными бакуловирусами, экспрессируют FMDV P1, соединенный с 3С. В А дорожка 1 представляет собой мутант в активном сайте Cys по 163 остатку, и обильный синтез гибридного белка Р1-3С, который спонтанно разлагается до Р1, является очевидным. Дорожка 2 представляет собой протеиназу дикого типа; очевиден очень незначительный синтез Р1 зрелого капсидного белка VP1. В В сравниваются рекомбинантные вирусы, экспрессирующие Р1 (дорожка 1), и Р1, соединенный с ослабленной 3С (дорожка 2). Теперь поддерживается высокий уровень синтеза, а предшественник Р1 стехиометрически конвертируется в зрелый капсидный белок VP1. Клеточные лизаты разделяли посредством 10% SDS-PAGE, и вестерн блоты зондировали поливалентной антисывороткой FMDV, у которой наибольшая реактивность наблюдается против VP1. Молярные количества VP0 и VP3 также имеют место, но не обнаруживаются указанной сывороткой.

Фиг.9 - Сборка пустых капсидов FMDV. Показан анализ в градиенте сахарозы продуктов экспрессии из клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, в которых была достигнута модификация активности протеиназы 3С. Некоторое количество не подвергнувшегося процессингу предшественника Р1, возможно в агрегированном виде, присутствует в нижней части градиента, в то время как продукт расщепления VP1 формирует выраженный широкий пик во фракциях 35-45% сахарозы. Расположение в градиенте такое, которое ожидалось для собранной частицы, но не для растворимого антигена.

Фиг.10 - Визуализация пустых капсидов FMDV серотипа А, полученных с использованием бакуловирусной экспрессии. Пиковые фракции из градиента сахарозы объединяли и концентрировали перед абсорбцией на формварных сетках с угольной пленкой и негативным окрашиванием уранилацетатом. Видны скопления частиц диаметром 25 нм (два показаны стрелками). Отметьте окрашивание внутри частиц, показывающее, что они пустые.

Частица, показывающая особенно хорошую угловую резкость, согласующуюся с двадцатигранной структурой, указана красной стрелкой.

Фиг.11 - Визуализация пустых капсидов FMDV серотипа О, полученных с использованием бакуловирусной экспрессии.

Фиг.12 - График, демонстрирующий индукцию специфичных антител у морских свинок в ответ на иммунизацию синтетическими капсидами. Титры антител измеряли с использованием (А) анализа нейтрализации вируса и (В) жидкофазного блокирующего ELISA. Иммунизация морских свинок синтетическими капсидами серотипа А приводит к индукции титров антител, которые согласуются с уровнями, которые, как было показано в предыдущих исследованиях, являются защитными.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

КОНСТРУКЦИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, которая включает:

(i) нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок-предшественник;

(ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую протеиназу, способную расщеплять капсидный белок-предшественник; и

(iii) контрольный элемент, который контролирует экспрессию протеиназы.

Термин «нуклеотидная последовательность» включает последовательность РНК или ДНК. Она может быть одно- или двухцепочечной. Она может быть, например, геномной, рекомбинантной, представлять собой мРНК или кДНК.

Конструкция может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая включает нуклеотидные последовательности (i) и (ii), смежные друг с другом. Может иметь место отрезок последовательности между нуклеотидными последовательностями (i) и (ii). Контрольный элемент может присутствовать в указанном отрезке, таким образом, чтобы он контролировал экспрессию протеиназы, но не контролировал или не влиял на экспрессию капсидного белка-предшественника.

Конструкция может присутствовать в качестве части плазмиды, трансферного вектора или генома клетки-хозяина (см. ниже).

КОНТРОЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ

Конструкция по первому аспекту изобретения включает контрольный элемент, который контролирует экспрессию протеиназы. Контрольный элемент может, например, по меньшей мере частично, контролировать транскрипцию и/или трансляцию протеиназы.

Конкретно, контрольный элемент вызывает экспрессию протеиназы на уровне, достаточном для расщепления капсидного белка-предшественника, но не достаточном для индукции значительной токсичности в клетке-хозяине.

Расщепление капсидного белка-предшественника можно анализировать с использованием методик, известных специалистам. Например, экстракты рекомбинантных белков из клеток-хозяев можно разделять с использованием электрофореза в геле, а разделенные белки переносить на нитроцеллюлозную мембрану для вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг с противовирусным антителом должен выявлять степень и объем опосредованного протеиназой расщепления. Например, в случае FMDV, не претерпевший процессинга капсидный белок-предшественник (Р1-Р2А) будет проявляться как полоса 81 кДа, а расщепление может давать VP31 (47 кДа), VP3 (24 кДа) и/или VP1 (24 кДа).

Расщепление капсидного белка-предшественника предполагает продукцию пустых капсидов (см. ниже).

Степень цитотоксичности в клетке-хозяине, индуцированной протеиназой, также можно анализировать с использованием методик, известных специалистам. Например, исключение с трипановым синим можно использовать, например, путем смешивания равных объемов 0,4% трипанового синего с клетками и определения уровня жизнеспособности измерением с использованием автоматического счетчика клеток Countess (Invitrogen).

Уровень токсичности не считается «значимым», если он менее 10%, менее 5% или менее 2% клеток-хозяев, которые сделала нежизнеспособными протеиназа. Уровень токсичности не считается «значимым», если клетка-хозяин способна экспрессировать капсидный белок-предшественник на 80, 90 или 95% от уровня, который был бы достигнут в отсутствии коэкспрессии белка 3С (при игнорировании эффекта расщепления капсидного белка-предшественника протеиназой).

Контрольный элемент может уменьшать экспрессию протеиназы 3С по сравнению с уровнем экспрессии, который будет иметь место, если контрольный элемент отсутствует.

Контрольный элемент может представлять собой сайт сдвига рамки считывания, который заставляет транслирующую рибосому во время считывания мРНК пропускать (или повторять) по меньшей мере одно основание в некоторых процентах случаев. Во время сдвига рамки считывания транслирующие рибосомы можно индуцировать на сдвиг одного нуклеотида вперед или назад в определенной точке транскрипта, с последующим продолжением синтеза белка в рамке считывания +1 или -1, соответственно.

Запрограммированные -1 рибосомальные сигналы сдвига рамки считывания хорошо описаны, и также имеются сообщения о событиях -1 сдвига рамки считывания у некоторых бактерий. Ряд вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, используют запрограммированные -1 рибосомальные сдвиги рамки считывания, демонстрирующие, что цис-элементы, вовлеченные в процесс сдвига рамки считывания, являются действующими и у эукариотов. В вирусных системах эффективность сдвига рамки считывания является существенной детерминантой стехиометрии синтезированных вирусных белковых продуктов, которая должна жестко поддерживаться для эффективного размножения вируса.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) -1 использует рибосомальный сдвиг рамки считывания для продукции требующегося соотношения полипротеинов Gag и Gag-Pol. Петельно-стержневая структура сигнала сдвига рамки считывания, как полагают, мешает рибосоме и вызывает проскальзывание в направлении 5', что вызывает -1 сдвиг рамки считывания, и трансляция затем продолжается в новой рамке (см. фиг.3).

Контрольный элемент может вызывать сдвиг рамки считывания в 1-20%, 1-10%, 3-7% или приблизительно 5% транслированных мРНК.

Последовательность сдвига рамки считывания может включать протяженность приблизительно из 6 урацилов, где наблюдается проскальзывание, за которой следует последовательность, способная формировать псевдоузел, который вызывает паузу рибосомы, способствуя проскальзыванию.

Контрольный элемент может располагаться выше нуклеотидной последовательности, кодирующей протеиназу, и ниже последовательности, кодирующей капсидный белок-предшественник.

ПУСТЫЕ КАПСИДЫ

«Пустой капсид» представляет собой объект, который включает белковую оболочку вируса, но не имеет РНК- или ДНК-генома. Пустой капсид должен быть антигенным и иммуногенным в той же степени, что и вакцина дикого типа, поскольку в нем сохраняются те же структурные эпитопы, но он не должен вызывать инфекцию в силу отсутствия генома.

Продукцию пустых капсидов можно исследовать или подтвердить с использованием методик, известных специалистам, таких как центрифугирование в градиенте сахарозы или электронное микроскопирование (Abrahams et al. (1995), выше).

Можно использовать моноклональные антитела, специфичные для конформационных эпитопов вируса дикого типа, чтобы установить, сохранилась ли антигенность пустого капсида.

ПРОТЕИНАЗА

Протеиназа может представлять собой любую вирусную протеиназу, которая расщепляет капсидный белок-предшественник как этап продукции и сборки капсидов.

Как упоминалось выше, для пикорнавирусов, таких как FMDV, протеолитический процессинг предшественника Р1 в VP0 (VP2 плюс VP4), VP3 и VP1 осуществляется посредством вирусной протеиназы 3С или ее предшественник 3CD.

Последовательность протеиназы 3С FMDV дикого типа из штамма FMDV типа А приводится ниже:

Кристальная структура была объяснена и осуществлен мутагенный анализ для получения информации в активном сайте (Sweeney et al. (2007) J. Virol. 81:115-124).

Конструкция по первому аспекту изобретения может включать по меньшей мере одну мутацию, которая уменьшает ее активность по расщеплению капсидного белка-предшественника.

Мутация может, например, располагаться в активном сайте протеиназы. Полагают, что существует каталитическая триада в активном сайте, состоящая из остатков 163, 46 и 84. Мутация может включать делецию или замещение одного или более из указанных остатков. Мутация должна уменьшать, но не устранять активность по расщеплению капсидного белка-предшественника.

Кристалическая структура протеиназы 3С показала, что существует β-риббон, который оборачивается вокруг пептид-связывающей щели и вносит свой вклад в распознавание субстрата (Sweeney et al. (2007), выше). Мутация может иметь место в β-риббоне (остатки с 138 по 150). Мутация может представлять собой, например, замещение по остатку 142. Мутация может представлять собой мутацию C142V, C142A или С142Т. Мутация может представлять собой мутацию С142Т.

Мутация может уменьшать константу специфичности фермента в 3-2 раза или в 3-1,5 раза. Например, если константа специфичности для фермента дикого типа составляет 990 k_cat/Km, то константа специфичности для мутантного фермента может составлять от 495 до 330 или от 660 до 330 k_cat/Km.

Мутантная протеиназа может иметь 10-50%, 20-40% или приблизительно 30% активности по расщеплению капсидного белка-предшественника от активности протеиназы дикого типа.

КАПСИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК

Капсидный белок-предшественник может представлять собой (для пикорнавирусов) Р1, который расщепляется протеиназой 3С до VP0, VP3 и VP1.

Альтернативно, капсидный белок-предшественник может представлять собой Р1-2А. Протеиназа 2А отщепляет сама себя на С-конце с высвобождением Р1-2А из Р2.

Капсидный белок-предшественник может расщепляться протеиназой с образованием (части) пустого капсида. Белок-предшественник может включать все типы белка, необходимого для формирования пустого капсида, которые могут образовываться в результате расщепления протеиназой.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему конструкцию по первому аспекту изобретения.

Вектор может представлять собой, например, плазмиду или бакуловирусный трансферный вектор, ДНК-вектор или вирусный вектор.

Вектор может быть способен переносить конструкцию в клетку-хозяина.

Вектор может быть способен переносить конструкцию в клетку растения, насекомого или животного.

Бакуловирусную экспрессионную систему широко используют для продукции вирусов и вирусоподобных частиц.

Вектор по настоящему изобретению может представлять собой, например, одну или более трансферных плазмид, используемых для трансформации клеток (например, клеток E.coli), в которых размножается бакуловирусный челночный вектор.

Конструкция по первому аспекту изобретения может представлять собой или включать рекомбинантную бакуловирусную ДНК, генерированную сайт-специфичной транспозицией ДНК из трансферного вектора в бакуловирусный челночный вектор (бакмиду). Указанная ДНК может быть трансфектирована в клетки насекомых для продукции рекомбинантного бакуловируса.

Вектор по настоящему изобретению может представлять собой получившийся в результате рекомбинантный бакуловирус.

Другие вирусные векторы включают, без ограничения, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы, векторы вируса герпеса, ретровирусные векторы (включая лентивирусные векторы).

Ретровирусы широко используются в подходах генной терапии. Рекомбинантные ретровирусы, такие как вирус мышиного лейкоза Молонея, обладают способностью интегрироваться в геном хозяина на стабильной основе. Они содержат обратную транскриптазу, которая позволяет интегрироваться в геном хозяина. Ретровирусные векторы использовались в ряде разрешенных FDA клинических испытаний, таких как испытания SCID-X1.

Главный недостаток использования ретровирусов, таких как вирус мышиного лейкоза Молонея, заключается в необходимости активного деления клеток для трансдукции. В результате, клетки, такие как нейроны, являются очень устойчивыми к инфекции и трансдукции ретровирусами.

Лентивирусы представляют собой подкласс ретровирусов. Недавно их адаптировали в качестве носителей (векторов) для доставки генов, благодаря их способности интегрироваться в геном неделящихся клеток. Вирусный геном в форме РНК обратно транскрибируется, когда вирус проникает в клетку для продукции ДНК, которую затем инсерцируют в геном на случайную позицию посредством вирусного фермента интегразы. Вектор, теперь называемый провирусом, сохраняется в геноме и передается потомкам клетки после ее деления.

По соображениям безопасности лентивирусные векторы никогда не несут генов, требующихся для их репликации. Для получения лентивируса несколько плазмид трансфектируют в так называемую упаковочную клеточную линию, обычно НЕК 293. Одна или более плазмид, обычно называемых упаковочными плазмидами, кодируют белки вириона, такие как капсид и обратная транскриптаза. Другая плазмида содержит генетический материал, предназначенный для доставки вектором. Указанная плазмида транскрибируется с образованием вирусного генома, представляющего собой одноцепочечную РНК, и обозначается присутствием последовательности ψ (пси). Указанную последовательность используют для упаковки генома в вирион.

В противоположность лентивирусам, аденовирусная ДНК не интегрируется в геном и не реплицируется во время деления клетки. Главным образом их используют для генной терапии и вакцинации. Поскольку люди часто контактируют с аденовирусами, которые вызывают респираторные, желудочно-кишечные и глазные инфекции, они запускают быстрый иммунный ответ с потенциально опасными последствиями. Для преодоления указанной проблемы ученые в настоящее время изучают аденовирусы, к которым у людей нет иммунитета.

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой малый вирус, который инфицирует людей и некоторые другие виды приматов. В настоящее время не известно, вызывает ли AAV заболевание, и, как следствие, указанный вирус вызывает очень слабый иммунный ответ. AAV может инфицировать как делящиеся, так и не делящиеся клетки и может инкорпорировать свой геном в клетку-хозяин. Указанные свойства делают AAV весьма привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии.

КЛЕТКА-ХОЗЯИН

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, включающей конструкцию по первому аспекту изобретения.

Клетка-хозяин может быть способна продуцировать вектор (такой как вирусный вектор) по второму аспекту изобретения.

Клетка-хозяин может представлять собой упаковочную клетку или продуцирующую клетку, способную продуцировать вирусный вектор.

Клетка-хозяин может представлять собой клетку насекомого Sf9, способную продуцировать рекомбинантный бакуловирус по второму аспекту изобретения.

Клетка-хозяин может быть способна продуцировать пустые вирусные капсиды.

Клетка-хозяин может представлять собой клетку бактерии, насекомого, растения или животного.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ

Настоящее изобретение относится также к способу производства пустых вирусных капсидов, который включает в себя следующие этапы:

(i) экспрессию конструкции по первому аспекту изобретения в клетке-хозяине; и

(ii) сбор пустых вирусных капсидов, произведенных клеткой-хозяином.

Конструкцию по настоящему изобретению можно внедрять в клетку-хозяина, например, трансфекцией или трансдукцией вектором по второму аспекту изобретения.

Если пустые вирусные капсиды экспрессируются наружу по отношению к клетке-хозяину, их можно собирать из надосадочной жидкости.

Если пустые вирусные капсиды экспрессируются внутри клетки-хозяина, их можно собирать, например,

(i) лизисом клеток-хозяев (например, замораживанием-оттаиванием); и, необязательно,

(ii) концентрированием (например, преципитацией в PEG), и/или

(iii) очисткой.

Настоящее изобретение относится также к способу получения вакцины, который включает стадию получения пустых вирусных капсидов указанным способом и инкорпорирование пустых вирусных капсидов в вакцину.

Вакцина может включать также фармацевтически приемлемый разбавитель, адъювант или наполнитель.

ВИРУСЫ

Настоящее изобретение относится к получению пустых капсидов определенного вируса.

Вирус может представлять собой, например, пикорнавирус.

Примеры родов, видов и серотипов пикорнавирусов представлены в таблице 1:

Существуют также пикорнавирусы растений, которые были классифицированы в надсемейство Secoviridae, включающее семейства Comoviridae (роды Comovirus, Fabavirus и Nepovirus), Sequiviridae (роды Sequivirus и Waikavirus) и ряд unassigned родов (Cheravirus, Sadwavirus и Torradovirus) (типовые виды Tomato torrado virus)).

Вирус может представлять собой пчелиный вирус, такой как вирус острого паралича Israeli; пчелиный вирус Kashmir; вирус Kakugo; вирус Varroa Destructor; вирус Sacbrood; вирус деформации крыла. Все подобные вирусы были связаны с утратой пчелиных колоний; таким образом, существует потребность в диагностическом тесте для определения причины утраты колоний.

Вирус может представлять собой животный патоген, такой как FMDV или вирус везикулярной болезни свиней. Вирус может представлять собой человеческий патоген, такой как энтеровирус 71 (который вызывает вспышки диареи); вирусы Коксаки В (вызывающие диабет и миокардит) или полиовирус.

Получение пустых капсидов для вирусов, которые (в их естественном состоянии) действуют как человеческие или животные патогены, является важным для генерации вакцин и терапевтических композиций.

ВАКЦИНА

Термин «вакцина», использующийся в настоящем документе, относится к препарату, который после введения пациенту индуцирует или стимулирует защитный иммунный ответ. Вакцина может сделать организм иммунным к конкретному заболеванию.

Вакцину можно использовать в терапевтических целях, для лечения существующей инфекции или профилактически, для блокирования или уменьшения вероятности инфекции и/или предотвращения или уменьшения вероятности заболеть соответствующей болезнью.

Вакцина включает один или более вакцинирующих агентов и, необязательно, один или более адъювантов, наполнителей, носителей и разбавителей.

Вакцина также может включать, или быть способной экспрессировать, другой активный агент, например агент, который может стимулировать раннюю защиту еще до развития адаптивного иммунного ответа, индуцированного вакцинирующим агентом. Агент может представлять собой противовирусный агент, такой как интерферон типа I. Альтернативно, или помимо этого, агент может представлять собой гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).

Вакцинирующий агент может представлять собой, например, конструкцию по первому аспекту изобретения, вектор по второму аспекту изобретения или пустой капсид, произведенный клеткой-хозяином, по третьему аспекту изобретения.

ДНК-вакцинация имеет ряд преимуществ по сравнению с вакцинами на белковой основе. Например, ДНК-вакцина вызывает эндогенную экспрессию антигена in vivo, что позволяет антигенным пептидам презентироваться иммунной системе путями как МНС класса I, так и класса II, праймируя, таким образом, не только Т-клетки CD4+, но и Т-клетки CD8+. Таким образом, ДНК-вакцины способны индуцировать как гуморальный, так и сильный клеточный иммунный ответ. Использование плазмидной ДНК в качестве вакцины также может запускать врожденную иммунную систему хозяина через неметилированные мотивы Cp в каркасе бактериальной плазмиды и Toll-подобный рецептор 9 (TLR9).

Вакцина может не содержать гены 2В и 2С, кодирующие неструктурные белки, которые могут препятствовать клеточным иммунным ответам путем понижающей регуляции МНС и секреции цитокинов (Moffat et al., (2005) J. Virol. 79, 4382-95 и Moffat et al., (2005) J. Virol. 81, 1129-39).

Многие имеющиеся в продаже вакцины против FMD являются поливалентными для обеспечения защиты против различных серотипов FMD. Вакцина по настоящему изобретению может включать множество вакцинирующих агентов, каждый из которых направлен против отдельного серотипа и/или различных подтипов в пределах данного серотипа.

ЛЕЧЕНИЕ/ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЯ

Настоящее изобретение относится также к способу лечения и/или профилактики заболевания у пациента путем введения эффективного количества указанной вакцины.

Термин «профилактика» обозначает предотвращение, задержку, препятствование или уменьшение вероятности проникновения инфекционного вируса в клетку.

«Лечение» в рамках изобретения относится к лечению пациента с целью облегчения, излечения или уменьшения симптомов заболевания или уменьшения или остановки прогрессирования заболевания. Оно также относится к воздействию, которое делает инфицированного вирусом пациента не заразным для других пациентов.

Пациент может представлять собой любое животное или растение, которое является чувствительным к заболеванию. Пациент может представлять собой человека, насекомое (такое как пчела), растение, млекопитающее или другое животное.

В случае FMD пациент может представлять собой парнокопытное животное. Животные, чувствительные к FMD, включают крупный рогатый скот, овец, свиней и коз среди сельскохозяйственных животных, а также верблюдообразных (верблюдов, лам, альпак, гуанако и викуний). Некоторые дикие животные, такие как ежи, нутрии и любые дикие парнокопытные животные, такие как олень, и содержащиеся в зоопарке животные, включая слонов, также могут заболеть FMD.

ВВЕДЕНИЕ

Способы невирусной генной доставки включают использование физических (доставка генов без носителя) и химических (доставка генов с использованием синтетических векторов) подходов. Физические подходы, включая инъекцию с использованием иглы, электропорацию, генную пушку, ультразвук и гидродинамическую доставку, используют физическую силу, которая проникает через клеточную мембрану и облегчает внутриклеточный перенос генов. Химические подходы используют синтетические или натуральные соединения в качестве носителей для доставки нуклеотидной последовательности в клетки.

Наиболее подходящий способ доставки будет зависеть от системы доставки, используемой для доставки нуклеотидной последовательности в клетку-мишень. Например, для введения плазмид препарат плазмид можно вводить внутримышечно, внутрикожно или с использованием комбинации указанных способов.

Вирусные векторы можно вводить субъекту способами, известными специалистам, такими как непосредственная инъекция.

РЕТРОВИРУСНЫЙ КОНТРОЛЬ ПИКОРНАВИРУСНОГО БЕЛКА

Настоящее изобретение относится также к применению ретровирусного контрольного элемента для контроля экспрессии пикорнавирусного белка и к конструкции, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую пикорнавирусный белок под контролем ретровирусного контрольного элемента.

Ретровирусный контрольный элемент может представлять собой ретровирусный сайт сдвига рамки считывания, такой как сайт сдвига рамки считывания, который контролирует экспрессию Gag и Gag-pol в указанном вирусе.

Пикорнавирусный белок может представлять собой неструктурный белок, такой как протеиназа. Пикорнавирусный белок может быть способен расщеплять капсидный белок-предшественник. Пикорнавирусный белок может представлять собой протеиназу 3С из пикорнавируса или ее предшественник 3CD.

Далее изобретение будет описано с помощью примеров, которые помогут специалисту осуществлять изобретение и которые не предназначены для ограничения объема изобретения каким бы то ни было образом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Мутационный анализ протеиназы 3С в векторе, в котором ее экспрессия происходит под контролем промотора р10

Бакуловирусный трансферный вектор pOPINE5949 кодирует капсидный белок-предшественник FMDV Р1, за которым следует протеиназа FMDV 3С, связанная короткой спейсерной областью (2А-3D3), под контролем сильного бакуловирусного промотора р10 (фиг.1). Большая часть остального генома FMDV опускается. В случае использования для генерации рекомбинантного бакуловируса теоретическим результатом является экспрессия гибридного белка Р1-2А-3В3-3C, который должен саморасщепляться с образованием зрелых капсидных белков VP1-4 (кодируемых Р1) и собираться в вирусные капсиды. Действительным результатом инфекции указанным рекомбинантным бакуловирусом является очень малое образование продукта.

Указанное малое количество продукта является результатом токсичности 3С. Это иллюстрируется тем фактом, что включение в pOPINE5949 единственной точечной мутации активного сайта цистеина (Cys 163) 3С позволяет экспрессироваться большим количествам гибридного белка Р1-2А-3В3-3C (фиг.2). Это формально подтверждает тот факт, что активность 3С является контролирующим признаком синтеза рекомбинантного FMDV.

Методы

Мутацию Cys 163 вводили с использованием стандартного сайт-направленного мутагенеза, а затем реэкспрессировали мутантную кассету.

Вестерн блоттинг

Образцы белка разделяли на 10% Tris.HCl SDS-полиакриламидных гелях заводского изготовления (BioRad) и переносили на мембраны Immobilion-P (Millipore) с использованием полусухого блоттера. Фильтры блокировали в течение одного часа при комнатной температуре с использованием TBS, содержавшей 0,1 об.% Tween-20 (TBS-T), 5% масс./об. сухого молока. Первичные антитела морских свинок против вируса FMDV типа А использовали в разведении 1:1000 в PBS-T, 5% масс./об. сухого молока в течение 1 часа при комнатной температуре. После нескольких промываний с использованием TBS-T мембраны инкубировали в течение 1 часа с конъюгированным с HRP антителом против морских свинок и связавшиеся антитела выявляли с помощью хемилюминесценции BM (Roche).

Пример 2 - Продукция конструкции, в которой активность и экспрессия протеиназы 3С уменьшена

Для удерживания активности протеиназы 3С между двумя крайностями объединяли два следующих подхода:

1) внедрение элемента сдвига рамки считывания в 3D линкерную область между последовательностями, кодирующими Р1 и 3С, что вызывает уменьшение количества синтезированной 3С; и

2) мутация остатка 3С, Cys 142, которая уменьшает активность 3С.

Элемент сдвига рамки считывания представляет собой часть последовательности, которая вызывает пропуск основания транслирующей рибосомой в определенном проценте случаев при считывания мРНК. Хорошо описанным элементом сдвига рамки считывания является элемент, который описан для ретровируса ВИЧ-1, который вызывает -1 сдвиг рамки считывания приблизительно в 5% транслируемых мРНК. Заявители использовали последовательность, определенную Dinman et al. (PNAS, 16 апреля 2002 г., том 99, № 8, 5331-5336 (фиг.3)).

Таким образом, был сконструирован вектор pOPINE5949-FS с последовательностью сдвига рамки считывания, инсерцированной в 3D3 линкерную область таким образом, чтобы останавливать рамку считывания в указанном месте. Инсерция последовательности сдвига рамки считывания прерывает целостность мРНК Р1-2А-3В3-3C таким образом, что транслированный продукт получается усеченным в области 3В3, а 3С не продуцируется (несмотря на то что последовательность, расположенная ниже, которая ее кодирует, присутствует в записи информации). Однако -1 сдвиг рамки считывания рибосомой в указанной области приводит к экспрессии гибридного белка Р1-2А-3В3-3C подгруппой мРНК, занятых рибосомой (фиг.4). Если частота события сдвига рамки считывания является такой же в клетках насекомых, как и в клетках млекопитающих, то продукты трансляции будут на 95% представлять собой Р1-2А и на 5% - Р1-2А-3В3-3C. Таким образом, имеет место пропорционально низкий уровень синтеза протеиназы 3С.

Рекомбинантный бакуловирус, сконструированный с использованием последовательности pOPINE5949-FS, показал паттерн расщепления, соответствующий генерации низких уровней протеиназы 3С (данные не показаны). Однако общий уровень синтеза, все еще показывавший некоторую цитотоксичность и активность 3С, был еще уменьшен путем сайт-направленного мутагенеза последовательности 3С на позиции Cys 142, которая играет свою роль в активности фермента ((Sweeney et al. (2007), см. выше)) (фиг.5).

Пример 3 - Продукция расщепленного продукта VP1 и пустых капсидов FMDV

Комбинация сдвига рамки считывания и мутации 142Т в рекомбинантном бакуловирусе давала желательный уровень Р1 и 3С и значительные количества расщепленного продукта VP1, который подвергался сборке с другим продуктом расщепления с формированием пустого капсида FMDV.

Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в настоящий документ в качестве ссылок. Различные модификации и вариации описанных способов и системы по настоящему изобретению будут очевидны для специалистов и не означают отступления от объема и идеи изобретения. Несмотря на то что изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами его осуществления, следует понимать, что изобретение в той форме, в которой оно заявлено, не должно ненадлежащим образом ограничиваться указанными конкретными вариантами его осуществления. Действительно, различные модификации описанных способов осуществления настоящего изобретения, которые являются очевидными для специалистов в области вирусологии, молекулярной биологии или родственных областей, входят в объем следующей формулы изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Раскрыта конструкция, которая, при экспрессии в клетке-хозяине, является способной продуцировать пустые вирусные капсиды. Конструкция включает нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок-предшественник; нуклеотидную последовательность, кодирующую протеиназу, способную расщеплять капсидный белок-предшественник; и контрольный элемент, который контролирует экспрессию протеиназы. При этом контроль осуществляется таким образом, что когда конструкция присутствует в клетке-хозяине, контрольный элемент вызывает экспрессию протеиназы на уровне, достаточном для расщепления капсидного белка-предшественника, но не достаточном для индукции значительной токсичности в клетке-хозяине. Также описаны вектор и клетка-хозяин, включающие указанную конструкцию, и их применение для генерации пустых вирусных капсидов. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 1 табл., 3 пр.

Формула