Микрофлюидные способы и картриджи для разделения клеток - RU2732235C2

Чертежи

Показать все 14 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу отбора клеток на основании уровня экспрессии, предпочтительно - экспонирования, более предпочтительно - секреции ими представляющего интерес белка из популяции, отличающейся гетерогенной экспрессией клеток, с применением магнитных гранул. Кроме того, настоящее изобретение также относится к микрофлюидному, предпочтительно одноразовому, стерильному картриджу для отбора клеток на основании уровня экспрессии, предпочтительно - экспонирования, более предпочтительно -секреции ими представляющего интерес белка, и к способу манипулирования магнитными гранулами внутри микрофлюидной реакционной камеры.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Конструирование линий клеток млекопитающих для эффективного получения терапевтических белков было значительно усовершенствовано в результате конструирования более эффективных ДНК-векторов и сконструированных линий клеток (Girod et al., 2007, Galbete et al., 2009, Ley et al., 2013; LeFourn et al., 2014). Тем не менее, до сих пор часто проводится мануальный скрининг линий клеток, времязатратный и трудоемкий, для идентификации клеток с наилучшими характеристиками, например, клеток, отличающихся максимальной продуктивностью. Соответственно, в данной области техники существует потребность в разработке автоматизированной процедуры для скрининга на максимально продуктивные линии клеток, то есть линии клеток, продуцирующих максимальный уровень трансгена, в большой поликлональной популяции стабильно трансфицированных клеток. Существует, в частности, потребность в разработке способа быстрой идентификации, отбора и/или сортировки СНО и других рекомбинантных клеток, которые экспрессируют и предпочтительно - экспонируют, и еще более предпочтительно - секретируют высокие уровни, например, терапевтических белков.

Существует ряд публикаций, демонстрирующих осуществимость применения магнитных гранул/частиц для сортировки клеток (например, с использованием управляемых вручную трубок и магнитов) в исследовательских лабораториях. Большинство описанных способов являются медленными и трудоемкими, и отличаются ограниченной пропускной способностью и эффективностью. Кроме того, осуществляемые вручную процедуры трудно адаптировать к условиям объектов, соответствующих требованиям GMP (надлежащей производственной практики) или GLP (надлежащей лабораторной практики), и, соответственно, они не используются на биотехнологических или фармацевтических предприятиях.

В настоящем изобретении предложено применение магнитных гранул в микрофлюидной среде для обеспечения предпочтительно полностью автоматизированного разделения клеток млекопитающих, на основании различных уровней экспрессии определенного трансгенного продукта.

Хотя устройство MACS, продаваемое Miltenyi Biotec®, позволяет удалять мертвые клетки из культур линий клеток млекопитающих с применением магнитных гранул в комбинации с колонкой с магнитным материалом, функционирующей под действием сильного постоянного магнита, оно не позволяет проводить избирательную сортировку магнитных гранул и не позволяет проводить сортировку с отбором высокопродуктивных и низкопродуктивных клеток для предпочтительной идентификации и отбора высокопродуктивных клеток. Были описаны альтернативные способы и аппараты на основе мечения высокопродуктивных клеток антителами. Быстрое выделение высокопродуктивных клеток может включать применение флуоресцентных камер, обеспечивающих визуализацию колоний клеток, растущих в мягком агаре, в сочетании с роботизированным отбором высокофлуоресцентных колоний. Примером является CellCelector™ от ТАР для сбора стволовых клеток (Caron et al., 2009). Как вариант, ClonePix™ от Genetix основаны на формировании иммунопреципитатов секретируемых белков в полутвердой культуральной среде, аналогичным образом соединяемых с камерами и манипулятором для сбора клеток. В указанных способах клетки растут не свободным образом в суспензионной среде, а в виде колоний, и сбор клеток производится на ранних стадиях клонирования, в частности, до вероятного достижения стабильной экспрессии. Используемое оборудование отличается сравнительно низкой пропускной способностью, не позволяя проанализировать 100000 трансфицированных клеток и более, что, тем не менее, необходимо для поиска наиболее продуктивных клонов. Кроме того, указанные процессы являются относительно медленными и требуют для реализации нескольких дней. Предложенный в настоящем изобретении способ на основе микрофлюидики разработан с целью смягчения и/или устранения недостатков существующего уровня техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу сортировки с отбором клеток, экспонирующих представляющий интерес белок и, согласно определенным вариантам реализации, продуцирующих представляющий интерес трансген, например, терапевтический белок, предпочтительно на высоком уровне, необязательно, из сложной поликлональной популяции.

Согласно определенным вариантам реализации настоящее изобретение позволяет идентифицировать высокопродуктивные линии клеток с применением магнитных гранул с помощью простой в использовании микрофлюидной системы за относительно короткий период времени (например, менее чем за 36 или 24 часа). Согласно другим вариантам реализации жизнеспособные клетки (например, высокопродуктивные клетки) сортируют с применением одноразовых (сменных) картриджей в стабильно стерильной среде, для проведения соответствующей требованиям GMP сортировки клеток.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ отбора клеток на основании уровня экспрессии ими представляющего интерес белка из популяции отличающихся гетерогенной экспрессией клеток с применением магнитных гранул.

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации и предпочтительного выбора клеток, на поверхности которых экспонирован представляющий интерес белок, включающему:

(a) получение образца, содержащего указанные клетки;

(b) получение функционализированных магнитных гранул, содержащих один или большее количество аффинных групп, и необязательно гранулы-носители, причем указанная(ые) аффинная(ые) группа(ы) адаптирована(ы) для связывания клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок;

(c) смешивание указанных клеток с указанными функционализированными магнитными гранулами и необязательно с указанными гранулами-носителями,

при этом указанная аффинная группа гранул связывает клетки, экспонирующие указанный белок на поверхности, с получением магнитно-меченых клеток (ММК), содержащих магнитную метку,

(d) разделение, например, в ходе по меньшей мере одного этапа промывания, не меченых магнитными частицами клеток и указанных ММК, и

(e) идентификацию и предпочтительный выбор клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок.

Указанный представляющий интерес белок может представлять собой маркерный белок или продукт трансгенной экспрессии (ТЕР).

Указанные клетки могут представлять собой рекомбинантные клетки, и указанный образец может содержать указанные рекомбинантные клетки, которые были трансфицированы трансгеном, при этом указанный представляющий интерес белок может представлять собой продукт трансгенной экспрессии (ТЕР); при этом указанные ММК могут утрачивать магнитную метку через некоторый интервал времени после связывания с аффинной группой, и при этом указанные ММК могут быть идентифицированы и предпочтительно отобраны на основании указанного интервала времени.

Рекомбинантные клетки, секретирующие ТЕР, могут быть отделены от рекомбинантных клеток, экспонирующих, однако не секретирующих указанный ТЕР, на основании указанного интервала времени.

Могут быть отобраны ММК, утрачивающие магнитную метку менее чем через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 часа после связывания, менее чем через 24, менее чем через 36, менее чем через 48, менее чем через 36, менее чем через 60, менее чем через 72, менее чем через 84 или менее чем через 96 часов после связывания.

Указанный представляющий интерес белок может представлять собой маркерный белок для идентификации стволовой клетки, в частности, раковой стволовой клетки (РСК) или циркулирующей опухолевой клетки.

Аффинная группа указанных магнитных гранул может непосредственно связывать указанный белок.

По меньшей мере одна соединяющая молекула может связывать аффинную группу и указанный белок, присоединяя магнитные гранулы к указанному белку. Указанная соединяющая молекула может представлять собой антитело или его фрагмент, которое(ый) может быть биотинилирован(о).

Клетки могут быть смешаны при температуре, превышающей 20, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 градусов.

Указанная смесь может представлять собой смесь функционализированных гранул (гранул для захвата) и гранул-носителей, и может находиться в реакционной камере.

Указанный способ может дополнительно включать воздействие внешним магнитным полем с некоторой амплитудой и полярностью на указанную реакционную камеру, при этом смешиванию гранул для захвата и клеток, экспонирующих указанный белок, в указанном внешнем магнитном поле могут способствовать указанные гранулы-носители.

Манипулирование магнитными гранулами может осуществляться с применением магнитного поля с изменяющимися во времени полярностью и амплитудой. Изменения указанного магнитного поля могут включать изменение частоты в диапазоне от 0,1 до 1000 циклов в секунду. Отбор клеток может достигаться за счет контроля частоты и амплитуды приложенного магнитного поля. Отбор клеток может также достигаться за счет контроля магнитных гранул и продолжительности смешивания клеток. При отборе клеток может осуществляться дополнительный контроль на основании одного или нескольких показателей, которые включают число этапов промывания, природу указанных магнитных гранул и продолжительность смешивания клеток на этапах промывания.

Уровень экспрессии, экспонирования или секреции указанного белка выбранными клетками может по меньшей мере на 10% превышать уровни для клеток, присутствующих в исходной популяции; уровень экспрессии, экспонирования или секреции белка выбранными клетками может предпочтительно быть на 20%, 40%, 60%, 80% или, более предпочтительно, более чем на 90% выше, чем в клетках, присутствующих в исходной популяции. Клетки могут также быть выбраны на основании более низкого уровня экспрессии белка, и уровень экспрессии белка выбранными клетками может быть по меньшей мере на 10% ниже, чем в клетках, присутствующих в исходной популяции. Уровень экспрессии белка выбранными клетками предпочтительно может быть на 20%, 40%, 60%, 80% или, более предпочтительно, более чем на 90% ниже, чем в клетках, присутствующих в исходной популяции.

Указанные гранулы для захвата могут представлять собой суперпарамагнитные гранулы, а указанные гранулы-носители могут представлять собой ферромагнитные гранулы.

Соотношение гранул для захвата к гранулам-носителям может составлять от 2:1 до 50:1, от 5:1 до 25:1, предпочтительно от 8:1 до 12:1, или приблизительно 10:1.

Амплитуда и/или полярность могут быть изменены для задания последовательных режимов функционирования, при этом указанное смешивание на этапе (с) может осуществляться в режиме смешивания, а указанное разделение на этапе (d) может осуществляться в режиме разделения гранул.

Указанные клетки могут представлять собой рекомбинантные клетки, и указанный белок, экспрессируемый на поверхности, может представлять собой ТЕР, а идентификацию согласно (е) осуществляют путем извлечения из реакционной камеры клеток, утративших магнитную метку (т.е. отделившихся от магнитных гранул) менее чем через 48 ч, предпочтительно менее чем через 36 или 24 ч после связывания.

В режиме смешивания и в режиме разделения гранул указанное(ые) магнитное(ые) устройство(а) может функционировать в режиме кругового или переменного поля с частотой 1- 1000 Гц и амплитудой 0,1-10000 мА, предпочтительно, 40-500 Гц и 200-500 мА.

Продолжительность применения и режима смешивания, и/или режима разделения гранул может составлять менее чем 60 секунд.

Настоящее изобретение также относится к картриджу для отбора клеток на основании уровня экспонирования и, предпочтительно, секреции ими (высвобождения с поверхности клетки; шеддинга) белка, например, ТЕР, из популяции клеток, содержащей экспонирующие, предпочтительно секретирующие указанный белок клетки, содержащему:

a. микрофлюидные каналы,

b. реакционную камеру для смешивания магнитных гранул в суспензии, отличающуюся тем, что указанная реакционная камера содержит по меньшей мере один входной и по меньшей мере один выходной канал для введения текучей среды в реакционную камеру и ее выведения из реакционной камеры, соответственно

с. контейнер для образцов клеток, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,

d. по меньшей мере один контейнер для промывочного реагента, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,

e. контейнер для отходов, сообщающийся через текучую среду по выходному каналу с реакционной камерой,

при этом каждый контейнер, соответствующий пунктам c.-d., также сообщается посредством одного из микрофлюидных каналов с вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха.

Настоящее изобретение также относится к интегральной системе для отбора клеток, например, рекомбинантных клеток, на основании уровня экспонирования и, предпочтительно, секреции ими (высвобождения с поверхности клетки; шеддинга) белка, например, ТЕР, экспрессируемого на поверхности указанных клеток, из популяции клеток, содержащей клетки, экспонирующие, предпочтительно секретирующие указанный белок, отличающейся тем, что указанная система содержит картридж, содержащий:

a. микрофлюидные каналы,

b. реакционную камеру для смешивания магнитных гранул в суспензии; при этом указанная реакционная камера содержит по меньшей мере первый входной и по меньшей мере второй выходной канал для введения текучей среды в указанную реакционную камеру и ее выведения из указанной реакционной камеры,

c. контейнер для образцов клеток, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,

d. по меньшей мере один контейнер для промывочного реагента, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,

e. контейнер для отходов, сообщающийся через текучую среду по выходному каналу с реакционной камерой, причем каждый контейнер, соответствующий пунктам c.-d., также сообщается посредством одного из микрофлюидных каналов с вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха; f. одно или большее количество устройств, создающих контролируемое магнитное поле (устройства для создания магнитного поля = УМП), в частности, один или большее количество электромагнитов, расположенных вокруг реакционной камеры или у реакционной камеры;

g. оборудование для обработки данных (например, компьютер), выполненный с возможностью корректировки магнитного поля, создаваемого УМП, в реакционной камере, путем коррекции частоты и/или амплитуды, причем каждая корректировка частоты и/или амплитуды задает режим функционирования в реакционной камере.

Указанное оборудование для обработки данных может быть выполнено с возможностью задания последовательности указанных режимов функционирования, включающей режим смешивания, режим захвата, режим иммобилизации, режим разделения гранул и/или режим выделения.

Указанное оборудование для обработки данных может быть адаптировано для установки следующих режимов функционирования УМП:

- в режиме кругового или переменного поля с частотой 1-1000 Гц, предпочтительно 40-500 Гц, и с амплитудой 0,1-10000 мА, предпочтительно 200-500 мА, во время использования режима смешивания и в режиме разделения гранул, при этом, например, указанный круговой режим может осуществляться в направлении по часовой и против часовой стрелки;

- в режиме кругового или переменного поля со значениями частоты и амплитуды ниже значений для режима смешивания, например, с частотой 0,5-40 Гц и с амплитудой 300-600 мА, во время использования режима захвата;

- с частотой 0 Гц и амплитудой, например, 300-600 мА, во время использования режима иммобилизации; и

- с повышенной относительно режима иммобилизации частотой, например, 40-500 Гц, и пониженной амплитудой, например, 30-300 мА, во время использования режима выделения.

Реакционная камера указанной системы или картриджа может содержать смесь гранул-носителей и гранул для захвата.

Указанный картридж может дополнительно содержать контейнер для выделения, куда поступают магнитно-меченые клетки, предпочтительно, магнитно-меченые рекомбинантные клетки из реакционной камеры.

Указанный(ая) картридж или система может дополнительно содержать по меньшей мере один второй входной и по меньшей мере один второй выходной канал, сообщающийся через текучую среду с указанной реакционной камерой, при этом указанный второй входной канал отходит от указанного по меньшей мере одного первого выходного канала, а указанный второй выходной канал отходит от указанного по меньшей мере одного первого входного канала, при этом указанный контейнер для выделения сообщается через текучую среду с реакционной камерой через второй входной канал; и указанный второй выходной канал соединен с дополнительным вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха.

Воздуховодное вентиляционное отверстие контейнера для выделения может быть соединено с насосом для выделения магнитно-меченых клеток в реакционной камере путем прокачивания воздуха через указанное вентиляционное отверстие контейнера для выделения, таким образом, что содержимое реакционной камеры перекачивают в контейнер для выделения через входной канал.

Объем реакционной камеры может составлять от 10 мкл до 500 мкл.

Картридж может быть автономным и/или одноразовым.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащий в одном контейнере картридж согласно описанию в настоящем документе, при этом указанная реакционная камера 5 может содержать гранулы для захвата и гранулы-носители (которые могут, как вариант, содержаться в дополнительном контейнере), и в отдельном контейнере - инструкции по применению гранул для захвата и гранул-носителей в картридже.

Указанные гранулы для захвата могут представлять собой суперпарамагнитные гранулы, а указанные гранулы-носители могут представлять собой ферромагнитные гранулы, при этом 10 соотношение суперпарамагнитных гранул и ферромагнитных гранул составляет от 2:1 до 50:1.

Настоящее изобретение также относится к клеткам, идентифицируемым и предпочтительно отбираемым с применением способов, систем и/или картриджей, описанных в настоящем документе.

Настоящее изобретение также относится к выделенной популяции клеток, содержащей 15 предпочтительно рекомбинантные клетки, секретирующие продукт трансгенной экспрессии на уровне, составляющем более чем 20, 40, 60, 80 pcd, при этом заявленная выделенная популяция содержит не более чем 40% исходной популяции клеток, из которой указанные клетки были выделены.

Настоящее изобретение также предусматривает применение клеток млекопитающих согласно описанию в настоящем документе в качестве терапевтических клеток, в том числе применение в генной терапии или регенеративной медицине, однако варианты применения не ограничиваются перечисленными.

Указанный секретируемый трансген может представлять собой терапевтический белок.

Интервал времени между смешиванием клеток с указанными функционализированными 25 магнитными гранулами и, необязательно, с указанными гранулами-носителями, и идентификацией и предпочтительным выбором клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок, может составлять менее 1 часа, менее чем 30 минут, менее чем 20 минут, менее чем 15 минут или менее чем 10 минут.

Заявленный предмет и все заявленные комбинации включены в настоящее описание 30 посредством ссылок и остаются частью раскрываемого объема изобретения даже в случае отказа от формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Цели и признаки настоящего изобретению подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Настоящее изобретение, в отношении как организации, так и способа эксплуатации, а также его дополнительные цели и преимущества могут быть наилучшим образом поняты из нижеследующего описания в сочетании с прилагаемыми чертежами, при этом:

На фиг. 1 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее получение клеток, отличающихся различными уровнями продуцирования иммуноглобулина. Клетки СНО-М котрансфицировали экспрессионными векторами с иммуноглобулином гамма (IgG) и селективным маркером устойчивости к антибиотику, а также плазмидой, кодирующей eBFP2. Поликлональные популяции, стабильно экспрессирующие различные уровни IgG, сортировали с применением FACS на основании экспонирования BFP и поверхностного IgG. Секрецию IgG выбранными клеточными клонами валидировали с применением ИФА ELISA.

На фиг. 2 приведены диаграммы для меченых GFP или BFP референсных клеток, опосредующих различные уровни экспонирования и секреции IgG: происходящие из клеток СНО-М клоны, экспонирующие различные уровни IgG на поверхности клеток при варьирующих уровнях секреции IgG, отбирали с применением FACS в качестве референсных популяций клеток. Меченые BFP экспонирующие средние уровни клетки BS2, экспонирующие высокие уровни клетки BLC и экспонирующие очень высокие уровни клетки ВНВ сравнивают с меченым GFP очень высокопродуктивным клеточным клоном F206. Экспонируемый на клеточной поверхности IgG метили конъюгированными с аллофикоцианином (АРС) антителами против IgG до проточно-цитометрического анализа (А). Титр IgG в параллельных культурах определенных клеточных клонов (В), или их удельную продуктивность в пикограммах на клетку в сутки (С) определяли с применением ИФА ELISA на секретированный в клеточную культуральную среду IgG.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение, иллюстрирующее принципы проводимого вручную захвата в смешанных популяциях клеток. Смесь экспрессирующих IgG и неэкспрессирующих популяций клеток с плотностью 1×10⁷ клеток/мл инкубировали с конъюгированным с биотином антителом KPL против IgG человека до конечной концентрации 5 мг/мл в течение 20 минут. После 5-минутного промывания 1×ФСБ с последующим центрифугированием указанных клеток при 1000 об/мин, предварительно меченые клетки затем инкубировали с покрытыми стрептавидином суперпарамагнитными гранулами в течение 30 минут. Портативный магнит обеспечивал отделение захваченных гранулами экспонирующих IgG клеток от неэкспрессирующих клеток. Весь процесс осуществляли при комнатной температуре.

На фиг. 4 приведено схематическое изображение, представляющее проводимое вручную обогащение экспрессирующими клетками в смешанной популяции с неэкспрессирующими клетками. Выделенные с помощью проведенного вручную захвата клеток после каждого промывания помещали в культуру и культивировали без отбора в течение 10 дней перед оценкой экспонирования IgG. Троекратное промывание эффективно устраняло большинство неэкспрессирующих клеток, соответственно, оставались только положительные по IgG клетки.

На фиг. 5 представлено схематическое изображение дизайна картриджа для автоматизированного обогащения отличающимися высоким уровнем экспрессии клетками из смешанных популяций клеток с применением оборудования MagPhase™ Приведено схематическое изображение (А), а также реальная фотография (В) картриджа для иллюстрации расположения некоторых его элементов.

На фиг. 7 представлено схематическое изображение для описания типа магнитных микрочастиц, используемых для автоматизированного обогащения экспрессирующих клеток из смешанных популяций клеток.

На фиг. 6 представлено схематическое представление отбора магнитных микрочастиц для автоматизированного обогащения экспрессирующими клетками из смешанных популяций клеток.

Фиг. 7 иллюстрирует проводимый вручную захват клеток с применением суперпарамагнитных гранул размером 2,8 мкм. Суспензию экспрессирующих IgG клеток F206 (1×10⁷ клеток/мл) инкубировали с биотинилированными антителами KPL против IgG человека в течение 20 минут, до проведения 30-минутной инкубации с 30 мкл суперпарамагнитных гранул. Клетки СНО, связанные с суперпарамагнитными гранулами, соответствуют указанным.

Фиг. 8 иллюстрирует проводимый вручную захват клеток с применением ферромагнитных гранул размером 2,0 мкм. Суспензию экспрессирующих IgG клеток F206 (1×10⁷ клеток/мл) инкубировали с биотинилированными антителами KPL против IgG человека в течение 20 минут, до проведения 30-минутной инкубации с 30 мкл суперпарамагнитных гранул. Клетки СНО, связанные с суперпарамагнитными гранулами, соответствуют указанным. Клетки СНО, связанные с ферромагнитными гранулами, не могут высвобождаться в клеточную культуру, поскольку образуют агрегаты.

На фиг. 9 представлено схематическое изображение автоматизированного захвата клеток MagPhase™ с комбинацией суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул: режим смешивания. Режим смешивания с высокой частотой используют для захвата клеток или на этапах промывания. Два типа гранул разделяют и перемешивают по отдельности в следующих условиях: 100-150 Гц и 200-300 мА, в зависимости от использованного типа микрогранул, в течение 10 с.Электромагниты активируют последовательно по кругу, в течение 1 секунды в направлении по часовой стрелке (1-2-3-4), 1 с в направлении против часовой стрелки (4-3-2-1), а затем в течение 10 с в направлении по часовой стрелке, для обеспечения оптимального смешивания. Ферромагнитные гранулы (черного цвета) циркулируют возле стенок камеры, а суперпарамагнитные гранулы (серого цвета) рассеяны по всему объему камеры для инкубации с клетками для связывания или для смешивания в промывочном буфере.

На фиг. 10 представлено схематическое изображение автоматизированной иммобилизации клеток MagPhase™ с комбинацией суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул: режим захвата. Очень высокую магнитную силу (400 мА) и низкую частоту (1 Гц) используют при режиме вращения против часовой стрелки в течение 10 с, что обеспечивает медленную циркуляцию ферромагнитных гранул по всему пространству камеры с захватом суперпарамагнитных гранул и потенциально связанных клеток.

На фиг. 11 представлено схематическое изображение автоматизированной иммобилизации клеток MagPhase™ с комбинацией суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул: режим иммобилизации. Связанные суперпарамагнитные и ферромагнитные микрогранулы иммобилизуют на стенках камеры при очень высокой магнитной силе (400 мА) и нулевой частоте (0 Гц) в течение 10 с, что позволяет закачивать клетки в суспензии или различные промывочные буферы. В ходе указанного процесса электромагниты работают в фиксированном режиме (например, 1 и 4 в качестве отрицательных полюсов, 2 и 3 в качестве положительных полюсов).

На фиг. 12 представлено схематическое изображение автоматизированного извлечения клеток и выделения MagPhase™ с комбинацией суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул: режим разделения гранул. Суперпарамагнитные и ферромагнитные гранулы сначала разделяют путем вращения (100-150 Гц и 200-300 мА), и затем приводят в действие электромагниты, как и при режиме смешивания (см. подписи к фиг. 9).

На фиг. 13 представлено схематическое изображение автоматизированного извлечения клеток MagPhase™ с комбинацией суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул: режим выделения. После разделения гранул на предшествующем этапе (фиг. 12) проводят этап с применением средней частоты и магнитной силы (100 Гц и 100 мА) в течение 3 с, при этом электромагниты работают в режиме иммобилизации гранул (см. фиг. 11), за исключением того, что положительные и отрицательные полюсы переключают с частотой 100 Гц (требует подтверждения). Указанная магнитная сила обеспечивает быстрое перемещение к стенкам камеры ферромагнитных, но не суперпарамагнитных гранул. При значениях частоты в среднем диапазоне суперпарамагнитные гранулы удерживаются в середине камеры, что позволяет откачивать их для сбора связанных клеток. Суперпарамагнитные гранулы извлекают путем закачивания воздуха в камере в течение 4,5 с со скоростью 30 мкл/с.

На фиг. 14 описана определение оптимальной силы магнитного поля и частоты колебаний магнитного поля в MagPhase™ для разделения высокопродуктивных (F206) и среднепродуктивных (BS2, BLC) клеток с применением суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул. Микрогранулы и рабочие условия MagPhase™ соответствовали описанию на фиг. 9-13, за исключением проведения перед использованием режима выделения 3 этапов промывания при различной частоте и интенсивности магнитного поля, в указанных условиях. Это позволило идентифицировать оптимальные условия, с учетом того, что увеличение частоты и/или силы магнитного поля (обозначенное как «быстрый» и «интенсивный» режимы, соответственно) обуславливало более низкие уровни обогащения отличающимися высоким уровнем экспрессии клетками F206. Использовали соотношение отличающихся высоким уровнем экспрессии клеток к отличающимся средним уровнем экспрессии клеткам в исходной популяции, составляющее приблизительно 50:50 для смеси клеток F206:BS2 (А) или 30:70 для смеси клеток F206:BLC (В). Выделенные клетки количественно определяли с помощью флуоресцентной микроскопии.

Фиг. 15 иллюстрирует определение оптимальных установок MagPhase™ в отношении продолжительности инкубации клеток. Осуществляли смешивание гранул с клетками для захвата клеток при 120 Гц, 300 мА на протяжении разных периодов времени (от 2 с до 5 минут), и 3 этапа промывания при 120 Гц, 300 мА в течение 10 с. 1 мкл гранул Chemicell SiMAG (1,0 мкм) и 20 мкл гранул Dynabeads MyOne Т1 предварительно загружали в камеру для смешивания. Клетки F206 и СНО-М смешивали в соотношении 10:90, и указанную смесь клеток метили биотинилированным антителом против IgG KPL до запуска процедур MagPhase™. Выделенные клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом.

Фиг. 16 иллюстрирует определение оптимальных установок MagPhase™ в отношении пропорции ферромагнитных и суперпарамагнитных гранул. 1 или 2 мкл гранул Chemicell SiMAG (1,0 мкм), а также 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл или 30 мкл гранул MyOne T1 Dynabeads предварительно загружали в камеру для смешивания. F206 и клетки СНО-М смешивали в соотношении 10:90 и метили биотинилированным антителом. Выделенные клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом.

Фиг.17 иллюстрирует обогащение экспрессирующими IgG клетками с применением комбинации суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул и оптимальных автоматизированных настроек MagPhase™. Определенную смешанную популяцию клеток предварительно инкубировали с биотинилированными антителами KPL против IgG человека до конечной концентрации 5 мкг/мл. Разделение клеток на основе MagPhase выполняли с использовании 20 мкл суперпарамагнитных гранул (MyOne T1 Dynabeads, покрытые стрептавидином, 1,0 мкм) и 2 мкл ферромагнитных гранул (Chemicell FluidMAG/MP-D, 5,0 мкм, покрытые крахмалом), предварительно загружали в камеру для смешивания. Использовали следующие этапы и параметры оптимизированного MagPhase™: 1. Смешивание для захвата клеток при 120 Гц, 300 мА в течение 10 с, 2. Захват гранул при 1 Гц, 400 мА в течение 10 с, 3. Иммобилизация гранул при 0 Гц, 400 мА в течение 10 с, 4. Три цикла промывания, и 5. Выделение при 100 Гц, 100 мА. Циклы промывания включали введение 100 мкл ФСБ-буфера с последующим применением режимов смешивания, захвата гранул и иммобилизации гранул согласно описанию выше. Выделенные клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом.

На фиг. 18 представлено автоматизированное разделение с применением MagPhase™ экспонирующих высокие уровни (F206) и экспонирующих средние уровни (BS2) клеток, экспонирующих высокие уровни (BLC) и очень высокие уровни (ВНВ) IgG клеток с применением суперпарамагнитных и ферромагнитных гранул. Микрогранулы, получение клеток и рабочие условия MagPhase™ соответствовали описанным на фиг. 17. Выделенные клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом.

На фиг. 19 представлено сравнение автоматизированного захвата MasPhase™ и проводимого вручную захвата. Определенную популяцию клеток (клетки F206 и СНО-М, смешанные в соотношении 10/90 (А); клетки F206 и BS2, смешанные в соотношении 40/60 (В)) предварительно инкубировали с биотинилированными антителами KPL против IgG человека до получения конечной концентрации 5 мкг/мл. Разделение клеток на основе MagPhase выполняли с использованием 20 мкл суперпарамагнитных гранул (MyOne T1 Dynabeads, покрытые стрептавидином, 1,0 мкм) и 2 мкл ферромагнитных гранул (Chemicell FluidMAG/MP-D, 5,0 мкм, покрытые крахмалом), предварительно загруженных в камеру для смешивания. Процедура MagPhase™ и проводимую вручную процедуру захвата осуществляли согласно описанию на фиг. 17 и фиг. 3, соответственно. Выделенные клетки анализировали под флуоресцентным микроскопом.

Фиг. 20 иллюстрирует стерильный захват и обогащение экспрессирующих IgG клеток с применением MagPhase™ первого поколения. Исходные клетки F206 и СНО-М смешивали в соотношении от 10:90 до 20:80, и осуществляли процесс захвата MagPhase™ согласно описанию на фиг. 17 с применением стерилизованных картриджей MagPhase™. (А) Захваченные в MagPhase™ клетки отделяли от извлеченных гранул на 1 день после захвата и помещали в культуру, без отбора с применением антибиотиков, на 16 дней до анализа экспонирования IgG, параллельно с аликвотой исходных клеток, культивированных в качестве контроля. (В) Клетки обрабатывали согласно описанию на панели А, за исключением того, что указанные клетки культивировали при подпитке СВ5 до сортировки с помощью MagPhase™, и клетки, не отделенные от гранул на 1 день, извлекали на 3 день после сортировки. Захваченные клетки и контрольные клетки метили конъюгированным с АРС антителом против IgG для окрашивания клеток F206, которые экспрессируют и экспонируют IgG, и затем анализировали с помощью проточной цитометрии. (С) Проводимую вручную и опосредованную MagPhase™ сортировку осуществляли параллельно с клетками, культивированными или не культивированными в присутствии СВ5 до осуществления сортировки. Выделенные клетки анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Указанные результаты представлены в виде средних значений кратности обогащения клетками F206 для 3 независимых экспериментов.

Фиг. 21 иллюстрирует стерильный захват MagPhase™ и обогащение клетками, как экспрессирующими, так и секретирующими высокие уровни IgG, при отделении от магнитных гранул на 1 день после разделения MagPhase™. Захваченные с применением MagPhase™ клетки согласно фиг. 20 В, отделенные на 1 день или 3 день после захвата, а также аликвоту исходных клеток в качестве контроля помещали в культуру, без отбора с антибиотиками, на 10 дней перед анализом секреции IgG. Удельную продуктивность выражали в пикограммах секретированного IgG на клетку в сутки (пг/клетка/сутки).

Фиг. 22 иллюстрирует стерильный захват MagPhase™ и обогащение клетками, как экспрессирующими, так и секретирующими высокие уровни IgG, из поликлональной популяции. В популяции поликлональных клеток, культивированных без подпитки СВ5, проводили сортировку с применением MagPhase™ согласно описанию на фиг. 21. Захваченные клетки, отделенные от магнитных гранул на 1 день и 4 день после сортировки, а также аликвоту исходных клеток в качестве контроля помещали в культуру с СВ5, но без отбора с применением антибиотиков, на 14 дней перед проведением оценки экспонирования IgG на поверхности клеток и секреции IgG в клеточном супернатанте с применением ИФА ELISA. (А) Процент положительных по IgG клеток, с различением клеток, экспонирующие низкие, средние и высокие уровни IgG. (В) Удельная продуктивность для секретированного IgG в супернатанте клеток, извлеченных на день 1 или день 4 после сортировки (пг/клетка/сутки).

Фиг. 23 иллюстрирует стерильную сортировку MagPhase™ для обогащения клетками, экспрессирующими и секретирующими высокие уровни терапевтического IgG, из поликлональной популяции, с применением разных моноклональных антител (mAb). Захват MagPhase™ выполняли согласно описанию на фиг. 17, с применением меченых mAb Mabtech или Acris поликлональных CMF⁺ клеток в качестве исходных. Захваченные с помощью MagPhase™ клетки, разделение которых проводили на день 1 захвата, а также аликвоту исходных клеток в качестве контрольных, разделяли пополам, соответственно. Каждую половину клеток помещали в культуру с СВ5 или без СВ5, и без отбора с применением антибиотиков в течение 14 дней до анализа экспонирования IgG. Образцы супернатанта культуры клеток собирали в день анализов экспонирования IgG. Титр IgG в образцах супернатанта анализировали с применением ИФА ELISA для дополнительного расчета удельной продуктивности. (А) Процент положительных по IgG клеток при культивировании без СВ5. (В) Процент положительных по IgG клеток при культивировании с СВ5. (С) Удельная продуктивность для IgG (пг/клетка/сутки).

На фиг. 24 представлено обогащение экспрессирующими IgG клетками F206, отделяемых от неэкспрессирующих клеток с применением оптимизированного оборудования MagPhase™ второго поколения и одноразовых стерильных картриджей. Клетки F206 и СНО-М смешивали в соотношении 20:80 в качестве исходных. Старый вариант захвата MagPhase™ осуществляли согласно описанию на фиг. 17. 160 мкл меченого биотинилированным антителом клеток и 1360 мкл 1× раствора ФСБ загружали в пробирку для образцов и пробирку для промывочного раствора нового картриджа MagPhase™, соответственно. Исполняемый сценарий для нового варианта MagPhase™ включал те же этапы, что и сценарий старого варианта MagPhase™, за исключением того, что объемы прокачиваемых жидкостей адаптировали для нового варианта MagPhase™, и амперную нагрузку уменьшали наполовину по сравнению со сценарием старого варианта MagPhase™. Захваченные с помощью MagPhase™ клетки, разделенные на 1 день и 6 день захвата, а также аликвоту исходных клеток в качестве контрольных клеток помещали в культуру без отбора с применением антибиотиков в течение 6 дней. Выделенные клетки и контрольные клетки анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Указанные результаты представляют собой средние значения, полученные для 3 независимых экспериментов. (А) Процент положительных по IgG клеток при захвате с применением антисыворотки KPL. (В) Процент положительных по IgG клеток при захвате с применением моноклональных антител Mabtech.

На фиг. 25 представлено схематическое изображение струйного картриджа в соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения согласно фиг. 24. (Картридж (1), реакционная камера (2), реакционная камера содержит входной (3in) и выходной (3out) каналы (для введения в реакционную камеру и удаления из реакционной камеры жидкой среды), контейнер для образцов клеток (4), контейнер для промывочного реагента (5), воздуховодное отверстие (7), элемент для фильтрации воздуха, контейнер для выделения (9) (куда поступают выбранные клетки из реакционной камеры (2)), второй входной и второй выходной каналы (10in, 10out) (представляющие собой отходящие от первого выходного и первого входного каналов ответвления (3out, 3in) соответственно); контейнер для выделения (9) сообщается через текучую среду с реакционной камерой через второй входной канал (10in) и второй выходной канал (10out), который соединен с вентиляционным отверстием (7recovery) содержащим элемент для фильтрации воздуха (8).

На фиг. 26 представлен анализ популяций клеток, сортируемых с помощью устройства MagPhase™. С применением оборудования для визуализации ClonePix™ проводили анализ, показывающий количество высвобождаемого антитела трастузумаб каждой из анализируемых колоний клеток СНО (т.е. каждым клоном). Была возможна идентификация клонов, отличающихся исключительно высокой продуктивностью.

На фиг. 27 приведена функциональная диаграмма, отражающая последовательные режимы функционирования микрофлюидного устройства, в данном случае - устройства MagPhase™ с картриджем, реализуемые с помощью оборудования для обработки данных согласно настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ, А ТАКЖЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения используют отличающиеся магнитной чувствительностью гранулы (также называемые в настоящем документе «магнитными гранулами», «магнитными частицами», «магнитными микрогранулами» или просто «микрогранулами»). Указанные магнитные гранулы могут быть изготовлены из любого материала, известного в данной области техники, способный к движению под действием магнита (например, постоянного магнита, но предпочтительно электромагнита). Они способны создавать высокие градиенты магнитного поля при намагничивании под воздействием внешнего магнитного поля.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные гранулы полностью или частично покрыты, т.е. функционализированы, аффинной группой. Такая аффинная группа может представлять собой лиганд, который непосредственно присоединяется к белку (рецепторный/маркерный белок, например, стволовых клеток) на поверхности клетки, или к другому экспрессируемому на поверхности фрагменту, такому как трансгенный продукт, например, терапевтический белок. Указанная аффинная группа может также представлять собой полимерный материал, неорганический материал или белок, такой как стрептавидин, отличающийся высоким сродством к другим молекулам, например, витамин биотин, который часто используют в качестве метки для антител. Указанные гранулы могут содержать ферромагнитный, парамагнитный или суперпарамагнитный материал или комбинацию указанных материалов. Указанные магнитные гранулы могут содержать ферритовую сердцевину и покрытие. При этом указанные магнитные гранулы могут также содержать что-либо одно или более из Fe, Со, Mn, Ni, металлов, включающих один или большее количество указанные элементов, упорядоченные сплавы указанных элементов, кристаллы указанных элементов, структуры на основе магнитных оксидов, такие как ферриты, и их комбинации. Согласно другим вариантам реализации указанные гранулы могут быть изготовлены из магнетита (Fe304), магхемита (Y-Fe203) или ферритов двухвалентных металлов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные магнитные гранулы содержат немагнитную сердцевину, например, из материала, выбранного из группы, состоящей из полистирола, полиакриловой кислоты и декстрана, на которую наносят магнитное покрытие. Существуют разные типы гранул; указанные «типы» гранул различают на основании их магнитных свойств:

«Парамагнитная» гранула характеризуется низкой магнитной чувствительностью и быстрой утратой магнетизации при извлечении из магнитного поля.

«Ферромагнитные» гранулы отличаются высокой магнитной чувствительностью и способны сохранять магнитные свойства в отсутствие магнитного поля (постоянный магнетизм). Ферромагнетизм наблюдается, например, в тех случаях, когда неспаренные электроны в материале находятся в кристаллической решетке, что, соответственно, позволяет сопряжение неспаренных электронов. Предпочтительные ферромагнитные материалы включают, не ограничиваясь перечисленными, железо, кобальт, никель, их сплавы и их комбинации.

Так называемые «суперпарамагнитные» гранулы, характеризующиеся высокой магнитной чувствительностью (т.е. они приобретают сильные магнитные свойства при помещении в магнитное поле), однако, как и парамагнитные материалы, они быстро утрачивают магнетизацию в отсутствие магнитного поля. Суперпарамагнетизма у ферромагнитных материалов можно добиться в тех случаях, когда размер кристалла меньше критического значения.

Суперпарамагнитные гранулы отличает двойное преимущество, заключающееся в способности сильно притягиваться к магниту и не слипаться в отсутствие магнитного поля. В частности, способность не слипаться предпочтительно позволяет прикрепленным к гранулам клеткам сохранять жизнеспособность.

Гранулы, поведение которых соответствует разным типам (например. ферромагнитному и суперпарамагнитному) в зависимости от условий среды, были описаны в других источниках, например, в патенте США №8142892, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки, и могут применяться в качестве «типа» магнитных гранул в контексте настоящего изобретения. Другие типы гранул описаны, например, в заявке на патент США 2004/0018611, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно предпочтительному варианту реализации указанные магнитные гранулы имеют очень малые размеры, как правило, приблизительно от 0,1 до 500 мкм, предпочтительно от 0,1 до 100 мкм, более предпочтительно от 0,2 до 50 мкм, от 0,2 до 20 мкм, от 0,2 до 10 мкм; и от 0,2 до 5 мкм. Взаимосвязь между размером частиц и плотностью магнитного поля, генерируемого указанными частицами в ответ на воздействие внешнего магнитного поля задана уравнением: f_m=В₀Iград.НI=В₀ М/а

где f_m - плотность магнитного поля, В0 - внешнее магнитное поле, I град. HI - выражение для локального градиента у поверхности магнитной гранулы, М - магнетизация ячейки матрицы, и а - диаметр гранулы. Соответственно, чем меньше размер магнитных гранул, тем выше градиент магнитного поля. Гранулы меньшего размера генерируют более сильный градиент, однако их эффекты являются более локальными.

Согласно одному варианту реализации указанные магнитные гранулы неоднородны по размеру, согласно другим вариантам реализации они имеют одинаковый размер. В целом, могут использоваться гранулы любой формы, т.е. градиент будут создавать гранулы любой формы, характеризующей углами или кривизной. Хотя магнитные гранулы меньшего размера генерируют магнитное поле большей плотности, гранулы большего размера генерируют магнитное поле с градиентом, обеспечивающим действие на большем расстоянии от их поверхности. Как правило, это объясняется большим радиусом кривизны гранул меньшего размера. Из-за указанного меньшего радиуса кривизны гранулы меньшего размера характеризуются более высоким градиентом на поверхности по сравнению с гранулами большего размера. Гранулы меньшего размера также, как правило, отличаются градиентом, быстрее уменьшающимся с расстоянием. Кроме того, магнитный поток в случае гранул меньшего размера, как правило, отличается меньшей величиной на расстоянии. Смесь магнитных гранул малого и большего размеров, соответственно, захватывает как слабо намагниченные материалы (за счет гранул меньшего размера), так и сильно намагниченные материалы, находящиеся на значительном расстоянии от гранул (за счет гранул большего размера).

Согласно большинству вариантов реализации настоящего изобретения магнитные гранулы имеют достаточно малый размер для того, чтобы производить манипуляции с ними в микрофлюидном устройстве.

Согласно одному из предпочтительных вариантов реализации предпочтительно использование комбинации гранул разных типов, например, двух, трех, четырех или пяти типов гранул.

Согласно определенным вариантам реализации применение магнитных гранул одного типа, например, только ферромагнитных гранул, в микрофлюидном устройстве может приводить к клеточной смерти рекомбинантных клеток в результате, например, агрегации клеток. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ферромагнитные гранулы используют в качестве гранул-носителей, т.е. их функция заключается в оптимизации смешивания клеток с гранулами для захвата и, согласно определенным вариантам реализации, выделения указанных клеток, в частности, жизнеспособных клеток. Согласно одному варианту реализации указанные гранулы-носители не функционализированы. Диаметр гранул-носителей может составлять от 0,1 до 500 мкм, предпочтительно от 0,1 до 100 мкм, более предпочтительно от 0,2 до 50 мкм, от 0,2 до 20 мкм, от 0,2 до 10 мкм; и от 0,2 до 5 мкм. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный диаметр составляет от 1 до 6 мкм.

Гранулы для захвата на самом деле не захватывают представляющие интерес клетки. Указанные гранулы для захвата обычно функционализированы. Указанные гранулы для захвата предпочтительно представляют собой суперпарамагнитные гранулы, которые, согласно описанию выше, не слипаются друг с другом (или слипаются в незначительной степени) что, соответственно, обеспечивает сохранение жизнеспособности прикрепленных к ним клеток. Диаметр гранул-носителей может составлять от 0,1 до 500 мкм, предпочтительно от 0,1 до 100 мкм, более предпочтительно от 0,2 до 50 мкм, от 0,2 до 20 мкм, от 0,2 до 10 мкм; и от 0,2 до 5 мкм. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный диаметр составляет от 0,5 до 2,5 мкм.

Соотношение гранул-носителей и гранул для захвата может составлять от 1:1 до 1:50, предпочтительно от 1:5 до 1:40, от 1:5 до 1:20, от 1:8 до 1:12, от 1:9 до 1:11, или приблизительно 1:10. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что абсолютное количество ферромагнитных гранул и/или не являющихся ферромагнитными гранул зависит от объема реакционной камеры, типа, состава и размера указанных магнитных гранул, и может быть эмпирически определено специалистом в данной области техники. Объем гранул-носителей на объем реакционной камеры может варьировать в диапазоне от 1 мл на 100 мл до 10 мл на 100 мл. В случае реакционной камеры объемом 50 мл объем гранул-носителей может варьировать, например, в диапазоне от 1 мл до 5 мл.

Указанный представляющий интерес белок может представлять собой маркерный белок для идентификации стволовых клеток, в частности, раковой стволовой клетки (РСК), в том числе тканеспецифических РСК, таких как лейкозные стволовые клетки, или циркулирующей опухолевой/раковой или предраковой клетки.

Согласно одному варианту реализации указанный маркерный белок может быть представлен одним или большим числом (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) маркеров стволовых клеток из группы, состоящей из: Lgr5, LGR4, Epcam, Cd24a, Cdca7, аксина, CK19, нестина, соматостатина, DCAMKL-1, CD44, Sord, Sox9, CD44, Prss23, Sp5, Hnfl-альфа, Hnf4a, Sox9, KRT7 и KRT19, Tnfrsf19. Указанные маркеры стволовых клеток могут быть тканеспецифическими. Например, стволовые клетки или органоиды поджелудочной железы могут характеризоваться естественной экспрессией чего-либо одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, например, 1, 2, 3 или 4) из: СK19, нестина, соматостатина, инсулина, глюкагона, Ngn3, Pdx1, NeuroD, Nkx2.2, Nkx6.1, Рах6, Mafa, Hnfl b, необязательно, Tnfrsf19; органоиды желудка могут характеризоваться естественной экспрессией чего-либо одного или более (например, 1, 2, 3 или 4) из: DCAMKL-1, CD44, необязательно, Tnfrsf19; и органоиды ворсин крипт могут характеризоваться экспрессией чего-либо одного или более (например, 1 или 2) из: Sord и/или Prss23, или всего перечисленного. Маркеры РСК включают CD19, CD34, CD44, CD90, ALDH1, PL2L, SOX-2 и N-кадгерин, при этом они могут быть лишены или могут экспонировать незначительные количества других маркеров, таких как CD21, CD24, CD38 или CD133. Лейкозные стволовые клетки могут быть идентифицированы как клетки CD34+/CD387CD19+, стволовые клетки рака молочной железы могут быть идентифицированы как клетки CD44+, но CD24^low, РСК головного мозга как клетки CD133+, РСК яичников как клетки CD44+, CD117+ и/или CD133+, РСК множественной миеломы как клетки CD19+, РСК меланомы как клетки CD20+, РСК эпендимомы как клетки CD133+, РСК предстательной железы как клетки CD44+, а также клетки, секретирующие или экспонирующие на поверхности другие маркерные белки, которые, как известно, экспрессируют раковые стволовые клетки. Дополнительные маркеры РСК включают, не ограничиваясь перечисленными, CD123, CLL-1, комбинации SLAM (рецепторов семейства сигнальных лимфоцит-активирующих молекул) и комбинации перечисленного. С дополнительными примерами маркеров можно ознакомиться в заявке на патент США 2008/0118518, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Циркулирующие опухолевые клетки, в том числе, однако не ограничиваясь указанными, клетки из солидных опухолей, могут происходить либо из первичной опухоли, либо из метастаза, и могут быть идентифицированы по любому маркеру или комбинации маркеров, специфических для указанной опухоли.

«Представляющий интерес ген», или «трансген», предпочтительно кодирует белок (структурный или регуляторный белок). В настоящем документе «белок» относится в общем к пептидам и полипептидам, содержащим более чем приблизительно 10 аминокислот, предпочтительно более чем 100 аминокислот, и включает комплексные белки, такие как антитела или их фрагменты. Указанные белки могут быть «гомологичными» для хозяина (т.е. эндогенными для используемой клетки-хозяина) или «гетерологичными» (т.е. чужеродными для используемой клетки-хозяина). Хотя белки могут быть и незамещенными, они также могут подвергаться преобразованию и могут содержать небелковые фрагменты, такие как сахара.

Клетки млекопитающих, предусмотренные настоящим изобретением, ^модифицированные или рекомбинантные клетки в соответствии с настоящим изобретением, включают, не ограничиваясь перечисленными, РСК, клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка), клетки НЕK 293 (эмбриональные клетки почки человека), стволовые клетки или клетки-предшественники.

Рекомбинантные клетки млекопитающих, т.е. клетки, которые содержат трансген, которые экспрессируют и предпочтительно также экспонируют на поверхности и, согласно определенным вариантам реализации, секретируют (выделяют) высокие уровни продукта экспрессии трансгена, например, терапевтического белка, или целевого белка для терапевтической молекулы, входят в объем настоящего изобретения. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантные клетки, которые секретируют (выделяют) трансген (помимо экспрессии и экспонирования) идентифицируют/отделяют от клеток, которые экспрессируют и экспонируют, экспрессируют и не экспонируют, или даже не экспрессируют представляющий интерес трансгенный продукт (см. патентную публикацию США 20120231449, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). Продуктивная клетка относится к клетке, которая не только экспонирует, но также и секретирует трансгенный продукт, т.е. высвобождает указанный трансгенный продукт в окружающую среду. Фактически «продуцируют» трансгенный продукт только указанные клетки, хотя многие другие клетки могут только экспрессировать или экспонировать указанный трансгенный продукт, однако эффективно не секретируют указанный белок. Таким образом, они могут просто экспонировать трансгенный белковый продукт на поверхности в течение длительного периода времени (более чем 2 дня) без его высвобождения и, соответственно, не классифицируются как «продуктивные клетки» или «отличающиеся высоким уровнем секреции клетки». Рекомбинантные клетки, которые секретируют трансгенный продукт («продуктивные клетки») в количествах более 10, но менее 20 пикограммов белка в день (например, пг/клетка/сутки (pcd)), считаются среднепродуктивными, рекомбинантные клетки, которые секретируют трансгенный продукт в количестве более чем 20, более чем 40 или более чем 60 pcd, считаются высокопродуктивными, а клетки, которые секретируют трансгенный продукт в количестве более чем 80 pcd, считаются очень высокопродуктивными. Очень высокопродуктивные клетки могут предпочтительно секретировать указанный трансгенный продукт на уровне, превышающем 100 pcd. Клетки, которые почти не продуцируют продукта экспрессии (низкопродуктивные клетки), секретируют менее 10 pcd. При выполняемых вручную процедурах для идентификации высокопродуктивных, в том числе очень высокопродуктивных клеток, которые секретируют указанный трансген, в секрецию, т.е. высвобождение, часто осуществляют вмешательство, например, путем корректировки температуры (для клеток СНО, например, путем поддержания окружающей температуры на уровне ниже 20 градусов Цельсия или 4 градусов Цельсия), что обеспечивает экспонирование секретированного белка на поверхности клеток, которыми он был секретирован, на протяжении достаточного периода времени.

Благоприятным образом, в контексте настоящего изобретения благодаря быстрому захвату и высвобождению клеток, экспонирующих значительные количества трансгенного продукта, такие корректировки температуры обычно не являются необходимыми, что позволяет использовать рабочие температуры в диапазоне 18-40 градусов, или 20-37 градусов Цельсия.

Указанный способ и устройство согласно настоящему изобретению предпочтительно позволяет сортировать более чем 100000, предпочтительно более чем 1 млн, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 млн рекомбинантных клеток в пределах менее 1 часа, предпочтительно менее чем 20 минут, еще более предпочтительно - менее чем 5 минут. Жизнеспособность продуктивных клеток, в частности, высокопродуктивных и очень высокопродуктивных клеток, то есть клеток, которые экспрессируют и высвобождают трансгенный продукт, идентифицируемых и/или разделяемых в соответствии с настоящим изобретением, составляет предпочтительно более чем 90%, более предпочтительно более чем 95, 96, 97, 98, 99% или 100% после идентификации и/или сортировки. Согласно предпочтительному варианту изобретения отбор клеток, экспонирующих указанный трансгенный продукт, производится в стерильном микрофлюидном устройстве согласно описанию выше.

В контексте настоящего изобретения интерес представляет только небольшая подгруппа клеток млекопитающих, экспрессирующих высокие уровни представляющего интерес трансгена. Хотя после трансфекции значительное число клеток экспрессируют и даже экспонируют трансгенный продукт, лишь небольшая подгруппа составлена клетками, также фактически представляющими собой продуктивные клетки. Как видно из приводимого ниже списка модельных клеток, подходящими являются только «клетки F206», поскольку они фактически продуцируют, т.е. высвобождают/выделяют указанный трансгенный продукт в пределах 1 дня. Другие клетки, отличающиеся таким же высоким уровнем экспрессии или даже экспонирования на поверхности, нежелательны, поскольку фактически могут не быть продуктивными клетками.

- Суспензионные клетки СНО-М (клетки яичника китайского хомячка): указанные клетки не экспрессируют IgG и GFP.

- Клетки F206: указанные клетки экспрессируют IgG (IgG+) и GFP (GFP+). Указанные клетки экспонируют значительные уровни IgG и продуцируют значительные уровни IgG, и являются хорошо подходящими клетками.

- Клетки BS2: указанные клетки экспрессируют IgG (IgG+) и BFP (BFP+). Указанные клетки экспонируют средние уровни IgG, продуцируют средние уровни IgG и являются нежелательными.

- Клетки BLC: указанные клетки экспрессируют IgG (IgG+) и BFP (BFP+). Указанные клетки экспонируют значительные уровни IgG, продуцируют средние уровни IgG и являются нежелательными.

- Клетки ВНВ: указанные клетки экспрессируют IgG (IgG+) и BFP (BFP+). Указанные клетки экспонируют очень высокие уровни IgG, продуцируют средние уровни IgG и являются нежелательными.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, наибольшую ценность представляют продуктивные клетки, которые экспрессируют и выделяют/высвобождают очень высокие уровни трансгенного продукта. Как правило, высокопродуктивные клетки представлены максимально продуктивными 40%, предпочтительно максимально продуктивными 30%) или максимально продуктивными 25% (четвертая часть) клеток, которые, в определенном образце клеток, например, в образце, содержащем 5000-10 млн клеток, предпочтительно 1-5 млн клеток, экспрессируют и выделяют/высвобождают определенный продукт. В абсолютных величинах это соответствует секретированию трансгенного продукта в количестве более чем 20, предпочтительно, 40, 60, 80 или, еще более предпочтительно, 100 pcd.

Если производится идентификация и, предпочтительно, отбор экспонирующих на поверхности, однако не обязательно секретирующих клеток, интерес может представлять отбор не только экспонирующих высокие уровни, однако также экспонирующих средние и/или низкие уровни клеток. Может быть целесообразным отбор клеток, которые экспонируют высокие уровни одного белка, однако низкие уровни другого белка. Как правило, флуоресценция меченой флуоресцентным антителом экспонирующей высокие уровни клетки может составлять 100-1000 RLU (относительных световых единиц), тогда как флуоресценция экспонирующей средние уровни клетки может составлять 10-100 RLU, а флуоресценция экспонирующей низкие уровни клетки может составлять 1-10 RLU. Показатели RLU предпочтительно сохраняются в течение периода, превышающего 48 часов.

«Микрофлюидное устройство» в настоящем документе относится к любому устройству, позволяющему осуществлять точный контроль и манипулирование текучими средами, геометрически ограниченному структурами, в которых по меньшей мере одна размерность (ширина, длина, высота) может составлять менее чем 1 мм. Как правило, в микрофлюидном устройстве микрофлюидные каналы и камеры взаимосвязаны. Как правило, микрофлюидный канал (в настоящем документе просто «канал») представляет собой истинный канал, бороздку или ход, по меньшей мере одна размерность которого исчисляется микрометрами (мкм), или составляет менее чем 10^-3 м (мм). «Реакционная камера» в настоящем документе относится к пространству в микрофлюидном устройстве, где одна или большее количество клеток могут быть выделены, обычно путем захвата и высвобождения с использованием магнитных гранул, из большей популяции клеток, по мере прохождения указанных клеток через устройство. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения размер реакционной камеры составляет 10-500 мкл, предпочтительно 20-200 мкл, 30-100 мкл или 40-80 мкл, или 40-60 мкл, в том числе 50 мкл. Реакционная камера может иметь любую из множества форм, например, круглую, квадратную или ромбическую.

При том. что поток текучей среды через микрофлюидный канал может быть охарактеризован с помощью числа Рейнольдса (Re), определяемого как:

Re=LV_avgρ/μ

где L - наиболее релевантный линейный размер, μ - вязкость текучей среды, ρ - плотность текучей среды, и V_avg - средняя скорость потока, в реакционной камере указанные характеристики потока нарушаются; потоком в реакционной камере можно манипулировать с использованием внешних источников, например, воздействуя одним или несколькими магнитными полями. Из-за малых размеров каналов значение Re обычно значительно меньше 100, часто менее чем 1,0. При указанных значениях числа Рейнольдса поток является полностью ламинарным и турбулентности не наблюдается. Переход к турбулентному потоку обычно происходит при значениях числа Рейнольдса в диапазоне около 2000.

Реакционная камера обычно содержит входной канал и выходной канал для введения и выведения текучих сред. Текучая среда в соответствии с настоящим изобретением относится предпочтительно к жидкой среде, содержащей клетки. Микрофлюидное устройство и реакционная камера описаны, например, в опубликованных заявках на патент США US 2013/0217144 и US 2010/0159556, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылок, в частности, в отношении конфигурации реакционных камер и установки магнитных устройств (например, четырех электромагнитов) вокруг реакционной камеры, или коммерчески доступны под торговой маркой MagPhase™ (SPINOMIX). Микрофлюидное устройство согласно настоящему изобретению предпочтительно также содержит или соединено по меньшей мере с одним контейнером для образцов клеток, в который могут загружаться клетки для анализа, например, их способности продуцировать белок, и который соединен с входом в реакционную камеру; контейнер для промывочного реагента, который также соединен с входом в реакционную камеру; контейнер для отходов, который соединен с выходом из реакционной камеры; или содержит/соединено с комбинациями перечисленного.

Микрофлюидное устройство согласно настоящему изобретению может также представлять собой картридж или чип, длина которого может составлять менее 1 см и ширина менее 0,5 см. Указанное микрофлюидное устройство может также содержать компоненты, контролирующие движение текучих сред внутри устройства, и может включать магниты, насосы, клапаны, фильтры и компоненты системы обработки данных согласно описанию ниже. Соответственно, устройство MagPhase™ (SPFNOMIX), включая картридж, может считаться микрофлюидным устройством.

Движение текучих сред в микрофлюидном устройстве частично основано на пассивных сил, таких как капиллярные силы. Однако в контексте настоящего изобретения дополнительно используются внешние силы, такие как давление, давление всасывания и магнитные силы, для транспортировки или смешивания текучих сред согласно настоящему изобретению, например, дляпередвижения суспензии магнитных гранул и рекомбинантных клеток в реакционной камере. Указанные внешние силы могут управляться системой обработки данных, в которую входят вычислительные аппаратные средства.

Легкодоступные вычислительные аппаратные средства, задействующие стандартные операционные системы, могут быть использованы и модифицированы в соответствии с принципами, предложенными в настоящем изобретении, например, обычный персональный компьютер (ПК), например, Intel x86 или Pentium с совместимыми с чипами операционными системами DOS™, WINDOWS, LINUX, MACINTOSH или SUN) для применения в интегральных системах согласно настоящему изобретению. Современный уровень техники в области технологий программного обеспечения позволяет реализовать представленные в настоящем описании способы с помощью компьютерной системы. Соответственно, согласно конкретным вариантам реализации настоящее изобретение может предусматривать набор логических команд (кодируемых программным обеспечением либо аппаратными средствами) для осуществления одного или большего числа способов согласно описанию в настоящем документе. Например, специалист может разработать программное обеспечение для получения данных и/или провести статистический анализ с применением стандартного языка программирования, такого как Visual Basic, Fortran, Basic, Java, или т.п. Такое программное обеспечение может также быть создано с использованием различных языков статистического программирования, пакетов инструментальных средств или библиотек.

Разные режимы функционирования в микрофлюидном устройстве, в частности, в реакционной камере, как будет понятно специалисту в данной области техники, могут быть определены с применением системы обработки данных. В частности, указанная система обработки данных может определять показатели частоты и магнитной силы, которые определяют режим функционирования. Последовательность режимов функционирования, направленную на отбор представляющих интерес клеток, называют рабочим циклом. Продолжительность одного рабочего цикла может составлять менее чем 20 минут, менее чем 15 минут, менее чем 10 минут или менее чем 5 минут. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в зависимости от таких показателей, как размер и форма реакционной камеры, размер, форма и/или материал указанных магнитных гранул или дизайн магнитных устройств, разные режимы функционирования, описанные ниже, могут нуждаться в корректировке.

РЕЖИМ СМЕШИВАНИЯ: Режим смешивания в контексте настоящего изобретения относится к режиму функционирования в реакционной камере, при котором содержащиеся в текучей среде частицы перемешивают оптимальным образом, так что гранулы для захвата захватывают клетки, экспонирующие трансгенный продукт. Продолжительность режима смешивания может составлять менее чем 100, 90, 80, 60, 50 или 40 секунд.

Могут быть смешаны гранулы более чем одного типа, предпочтительно два типа гранул, один из которых представлен гранулами-носителями, а другой - функционализированные гранулы для захвата (например, ферромагнитные и суперпарамагнитные гранулы).

Для однородного перемешивания в реакционной камере контролируемое магнитное(ые) устройство(а), например, электромагниты, расположенные вокруг указанной реакционной камеры микрофлюидного устройства, которое было помещено, например, в устройство MagPhase® 4, предпочтительно функционируют, например, в круговом режиме или ином режиме переменного поля, с показателями частоты в диапазоне от 0,1 до 1000 Герц (Гц) и амперной нагрузке в диапазоне от 0,1 до 10000 миллиампер (мА), однако предпочтительно с показателями частоты от средних до высоких (40-500 Гц, например, 100-150 Гц) и высоком показателе магнитной силы (200-500 мА, например, более предпочтительно, 300 мА), таким образом, что, например, гранулы-носители, например, ферромагнитные гранулы, перемешивают в камере возле стенок, тогда как гранулы для захвата, например, суперпарамагнитные гранулы, диспергируют и аккуратно перемешивают в середине камеры. Для оптимизации пространственного распределения суперпарамагнитных гранул, например, электромагниты предпочтительно активируют последовательно, например, в направлении по часовой стрелке и против часовой стрелки, например, в течение 0,5-30 с, например, в течение 1 с в направлении по часовой стрелке, а затем в течение 0,5-30 с, например, 1 с в направлении против часовой стрелки, и затем 5-100 с, например, 10 с в направлении по часовой стрелке. Указанный режим смешивания используют для инкубирования гранул для захвата с клетками для захвата экспонирующих клеток.

РЕЖИМ ЗАХВАТА: Режим захвата в контексте настоящего изобретения относится к режиму функционирования в реакционной камере, при использовании которого гранулы-носители захватывают гранулы для захвата (с присоединенными предпочтительно экспонирующими клетками). В одном рабочем цикле продолжительность режима захвата может составлять менее чем 100, 90, 80, 60, 50 или 40 секунд.

При продолжении использования кругового режима функционирования, но с уменьшением частоты до, например, 0,5-40 Гц, например, до 1 Гц, и увеличении магнитной силы до, например, 300-600mA, например, до 400 мА, гранулы-носители медленно вращаются во всем объеме камеры. Они «сканируют» объем камеры и захватывают гранулы для захвата. Остаточная намагниченность гранул-носителей заставляет их функционировать в качестве постоянных магнитов малого размера, и гранулы для захвата, а также потенциально присоединенные к ним клетки соединяются и связываются с ними. Указанное присоединение предваряет захват указанных комплексов в углах камеры на следующем этапе согласно приводимому описанию.

РЕЖИМ ИММОБИЛИЗАЦИИ: Режим иммобилизации в контексте настоящего изобретения относится к режиму функционирования, при котором комплексы гранул-носителей, гранул для захвата и клеток локализованы в реакционной камере в положениях, позволяющих движение дополнительной текучей среды, например, на этапе промывания, через реакционную камеру без вытеснения из камеры указанных комплексов. В одном рабочем цикле продолжительность режим иммобилизации может составлять менее чем 100, 90, 80, 60, 50 или 40 секунд.

Магнитное(ые) устройство(а) (полюсы) микрофлюидного устройства в указанном режиме функционируют как постоянные магниты, например, 2 на 2 при 0 Гц и высокой магнитной силе (например, 300-600 мА, например, 400 мА). Связанные гранулы-носители и гранулы для захвата удерживаются в углах камеры, что позволяет закачивать в камеру новые растворы (например, клетки в суспензии или отмывочные буферы) и откачивать из камеры присутствующий в ней раствор (например, нежелательные клетки).

РЕЖИМ РАЗДЕЛЕНИЯ ГРАНУЛ: После этапов промывания осуществляют разделение гранул как и при режиме смешивания на этапе 1, при этом высокая частота (например, 40-500 Гц, например, 100-150 Гц) позволяет гранулам-носителям отделиться от гранул для захвата. Пространственное распределение гранул предпочтительно идентично или аналогично распространению при режиме смешивания, т.е. гранулы-носители циркулируют возле стенок, а гранулы для захвата двигаются медленнее в области середины камеры.

Как и режим смешивания, режим функционирования гранул в одном рабочем цикле может продолжаться менее чем 100, 90, 80, 60, 50 или 40 секунд.

РЕЖИМ ВЫДЕЛЕНИЯ: После разделения гранул используют режим «иммобилизация гранул». В указанном режиме гранулы для захвата с присоединенными представляющими интерес клетками, или только представляющими интерес клетками (после утраты магнитной метки) выделяют/извлекают из реакционной камеры, а гранулы-носители иммобилизуют внутри камеры. В одном рабочем цикле режим выделения может продолжаться менее чем 80, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 секунд.

Режим выделения может осуществляться с высокой частотой, например, 40-500 Гц, например, 100 Гц, и средней магнитной силой: 30-300 мА, например, 100 мА. Высокую частоту и среднюю магнитную силу используют на протяжении непродолжительного периода времени (1-50 с, например, 3 с), чтобы обеспечить достаточное время для перемещения только гранул-носителей в углы камеры благодаря их выраженному ответу на магнитные поля. Например, частоту 100 Гц используют таким образом, что внутренние магнитные моменты гранул для захвата меняют направление в ответ на ориентацию магнитного поля, что предотвращает их перемещение в углы камеры. Таким образом, гранулы-носители остаются в суспензии в середине камеры, что позволяет извлекать их вместе со связанными клетками путем закачивания воздуха в камеру.

Магнитные гранулы, связанные с захваченными клетками (например, магнитно-мечеными клетками (ММК)) могут подвергаться дальнейшему разделению. Во время указанного разделения клетки отделяются от магнитных гранул, когда последние утрачивают связь с белками, опосредующими прикрепление к магнитной грануле, за счет того, что указанный белок высвобождается (секретируется) указанными клетками. Клетки, отсоединяющиеся от магнитных гранул менее чем через 48 часов, предпочтительно менее чем через 36 часов или, еще более предпочтительно, менее чем через 24 часа, отделяют от клеток, отсоединяющихся от магнитных гранул позже. Клетки, отсоединяющиеся от магнитных гранул менее чем через 48 часов, менее чем через 36 часов или менее чем через 24 часа относят к категории/тестируют на соответствие высокопродуктивным/отличающимся высоким уровнем секреции или очень высокопродуктивным/отличающимся очень высоким уровнем секреции клеткам.

Экспериментальная работа для обеспечения сортировки экспрессирующих терапевтический белок клеток

Разработка способа, обеспечивающего быстрый и эффективный захват клеток млекопитающих, которые секретируют значительные количества рекомбинантных терапевтических средств, основанного на мечении секретирующих клеток СНО с применением антител, конъюгированных либо с флуоресцентной молекулой, либо с молекулой биотина или с магнитными микрочастицами, подробно описана в настоящем документе для иллюстрации настоящего изобретения.

Ранее было показано, что помещение клеток СНО в условия температуры 20°С или 4°С оказывает временное влияние на секрецию, так что секретированные белки экспонируются на поверхности клеток в течение периода времени, составляющего до 24 часов. Для мечения клеток может применяться флуоресцентное антитело к секретированному белку в количествах, пропорциональных потенциалу экспонирования ими белка (Sen, Нu et al. 1990, Brezinsky, Chiang et al. 2003, Pichler, Hesse et al. 2009).

Соответственно, проводили оценку аналогичного подхода для мечения клеток СНО, которые не только экспонируют, но и фактически секретируют терапевтический белок: клетки метили магнитными частицами в реакционной камере картриджа для отбора MagPhase™. Указанный подход основан на применении магнитных частиц диаметром 1-10 мкм. Контролируемые магнитные поля и их эффект на смешивание магнитных частиц лежат в основе системы MagPhase™, которая предназначена для смешивания клеток и частиц, так что указанные клетки и магнитные частицы связываются с получением магнитно-меченых клеток, и для сортировки и иммобилизации магнитно-меченых в максимальной степени клеток. Другие клетки вымывали через каналы MagPhase™ с применением насосов. После этого прекращали воздействие магнитным полем на отличающиеся высоким уровнем экспрессии клетки и частицы, и, наконец, высокопродуктивные клетки извлекали из реакционного картриджа MagPhase™ в стерильные одноразовые чашки для культивирования клеток. Контролируемые с помощью компьютера магнитные поля и насосы для управления микрофлюидными входами и выходами картриджа обеспечили возможность адаптировать указанный процесс и оптимизировать его для быстрого автоматизированного манипулирования клетками, позволяющего проводить обработку популяций, содержащих более чем 100000, предпочтительно 1 млн или большее число миллионов клеток, в пределах периода времени, исчисляемого минутами, например, менее чем через 30 минут, менее чем через 20 минут, или менее чем через 10 минут.

1. Получение стабильно трансфицированных линий клеток СНО в качестве референсных клеток

Для облегчения разработки указанного способа и оценки эффективности сортировки клеток сначала конструировали репортерные клетки, экспрессирующие как терапевтический белок, а именно, иммуноглобулин, так и флуоресцентный репортерный белок для упрощения отслеживания клеток, которые секретируют указанное антитело. Клетки СНО котрансфицировали экспрессионными векторами с терапевтическим иммуноглобулином гамма (IgG) и селективным маркером устойчивости к антибиотику, а также плазмидой, кодирующей флуоресцентный белок, либо «усиленный зеленый флуоресцентный белок», либо «усиленный синий флуоресцентный белок 2» (EGFP или eBFP2). Поликлональные популяции, стабильно экспрессирующие различные уровни иммуноглобулинов сортировали с применением FACS на основании экспонирования BFP и IgG на поверхности, а затем оценивали продуцирование IgG с применением ИФА ELISA (фиг. 1). Параллельно отбирали популяции моноклональных клеток СНО (например, клеточные клоны), коэкспрессирующие GFP и IgG, или BFP и IgG, с применением метода серийных разведений. Секрецию IgG оценивали с применением ИФА ELISA. Клоны, экспрессирующие различные уровни IgG на поверхности, однако продуцирующие низкие/средние уровни IgG, выбирали в качестве референсных популяций клеток.

Следующие линии клеток получали и использовали в качестве референсных (фиг. 2):

- суспензионные клетки СНО-М (отсутствуют IgG и GFP)

- F206 - IgG+, GFP+: экспонирующий высокие уровни IgG требуемый высокопродуктивный клон.

- BS2 - IgG+ BFP+: экспонирующий средние уровни IgG, продуцирующий средние уровни IgG нежелательный клон.

- BLC - IgG+ BFP+: экспонирующий высокие уровни IgG, продуцирующий средние уровни IgG нежелательный клон.

- ВНВ - IgG+ BFP+: экспонирующий очень высокие уровни IgG, продуцирующий средние уровни IgG нежелательный клон.

Интересно отметить, что установленные характеристики указанных клонов показали, что транзиентное экспонирование белка, согласно приведенному на фиг. 2А анализу, недостаточно коррелируют с фактической скоростью секреции, на которую указывают титры и удельная продуктивность указанных клеток (фиг. 2В и 2С). Это показывает, что способ сортировки должен позволять отличить надлежащую секрецию белка от исключительно экспонирования белка на поверхности рекомбинантной клетки без высвобождения («шеддинга») с поверхности.

2. Валидация анализа проводимого вручную захвата клеток с магнитными частицами

Популяции клеток, либо не экспрессирующих IgG, либо экспрессирующих различные известные уровни IgG, смешивали заданными количествами клеток клона F206, секретирующего значительные количества терапевтического IgG трастузумаба и коэкспрессирующего GFP. Указанные клетки инкубировали с конъюгированным с биотином вторичным антителом, которые связывает константную часть IgG человека, а затем с магнитными микрочастицами, связанными со стрептавидином (Dynabeads MyOne T1®, Invitrogen®, #65601) (фиг. 3). Сохраняли образцы указанных клеток после каждого промывания (называемые выделенными образцами 1-3) и помещали в среду для культивирования клеток, и клетки культивировали без отбора в течение 10 дней. Затем оценивали экспонирование IgG на поверхности клеток для различения неэкспрессирующих клеток от экспрессирующих. Как показано на фиг. 4, после каждой последовательной промывки уменьшался процент негативных клеток; после третьего промывания выделяли почти 100% позитивных клеток.

3. Принципы захвата клеток, экспрессирующих антитело, с использованием микрофлюидного устройства MAGPHASE

После того как был определен процесс проводимого вручную захвата, его реализовали в устройстве MagPhase™ с целью осуществления пробного захвата клеток СНО-М (Selexis ®), экспрессирующих терапевтический IgG человека.

Оборудование MagPhase™ необходимо было адаптировать для применения с одноразовыми картриджами, дизайн которых включает микроканалы и реакционную камеру объемом 50 мкл, в которую загружали магнитные гранулы. На фиг. 5 представлен используемый дизайн картриджа, оптимизированного, в частности, для стерильной сортировки и выделения живых клеток. Конструировали картридж, позволяющий осуществлять загрузку разных растворов (клеток в суспензии, отмывочных буферов), а также для смешивания магнитных частиц, для отмывания неэкспрессирующих клеток и, наконец, для извлечения указанных клеток, которые были связаны с магнитными гранулами. Весь процесс проводимого вручную захвата адаптировали для полностью автоматизированного функционирования, со значимым уменьшением экспериментального времени и риска загрязнения.

Протокол проводимого вручную захвата задействовал суперпарамагнитные гранулы, преимущество которых заключается в отсутствии остаточной намагниченности, ведущие себя как немагнитные частицы после устранения магнитного поля (фиг. 6). Соответственно, суперпарамагнитные гранулы в данном контексте предпочтительны для применения при сортировке клеток, поскольку указанные гранулы могут быть полностью ресуспендированы в растворе, и клетки могут отсоединяться от гранул после выделения антитела с клеточной поверхности, которое может происходить приблизительно через 24 ч при 37°С (фиг. 7).

Однако при адаптации протокола для сортировки вручную для устройства MagPhase™ возникает ряд проблем: Используемыми для протокола проводимого вручную захвата суперпарамагнитными гранулами невозможно манипулировать с помощью электромагнитных полюсов устройства MagPhase™, поскольку его электромагниты создают менее интенсивные магнитные поля по сравнению с портативными постоянными магнитами (фиг. 6). За счет остаточной намагниченности и выраженного отклика на магнитные поля ферромагнитные гранулы хорошо подходят для применения в технологии MagPhase™ и могут быть использованы в камере картриджа в широком диапазоне режимов функционирования.

Покрытые стрептавидином ферромагнитные гранулы, подходящие, как известно, для использования в MagPhase™, смешивали с клетками, экспрессирующими и секретирующими IgG; они были помечены биотинилированным антителом против IgG для захвата экспрессирующих IgG клеток. При этом остаточная намагниченность указанных ферромагнитных микрогранул приводила к их взаимному притяжению и образованию агрегатов, удерживавших клетки и обуславливавших их гибель (фиг. 8).

Более того, отсоединение клеток от гранул после помещения указанных агрегатов в культуру было невозможно (данные не показаны).

Соответственно, использовали смесь магнитных гранул двух типов. Указанный способ позволял осуществлять манипулирование функционализированными суперпарамагнитными гранулами в MagPhase™ в присутствии нефункционализированных ферромагнитных гранул согласно описанию ниже.

Первые попытки не обеспечили сортировку с отбором наилучших клеток, а опосредовали сортировку клеток независимо от уровней экспрессии белка. Соответственно, указанный способ необходимо было усовершенствовать для сохранения только отличающихся высоким уровнем экспрессии клеток. Авторы изобретения проводили оценку изменений различных параметров, таких как частота и магнитная сила при различных режимах функционирования MagPhase™, титры клеток и частиц, доля высокопродуктивных клеток в общей популяции клеток, выбор вторичного антитела, условия захвата, скорость и продолжительность магнитного перемешивания, и условия элюирования магнитно-меченых клеток.

4. Идентификация магнитных гранул, подходящих для эксплуатации MAGPHASE

В ходе указанных исследований тестировали различные типы коммерчески доступных микрогранул и наилучшие соотношения для идентификации условий, обеспечивающих наилучшие результаты в отношении надлежащего манипулирования с применением MagPhase™ и в отношении специфических и неспецифических взаимодействий с клетками СНО. Указанные гранулы включали:

Ферромагнитные микрогранулы:

Chemicell™ FluidMAG (с диаметром 5,0 мкм)

- Chemicell™ SiMAG (с диаметром 1,0 мкм или 2,0 мкм)

Суперпарамагнитные микрогранулы:

Dynabeads™ М280 2,8 мкм

Dynabeads™ MyOne Tl 1,0 мкм

Ademtech™ 300 нм

Визуальное различение микрогранул различных типов в картридже было возможно ввиду их разного цвета, а именно, черного в случае ферромагнитных гранул и светло-коричневого в случае суперпарамагнитных Dynabeads™. Визуальный осмотр микрогранул в ходе работы MagPhase™ указывает на то, что наилучшее объемное соотношение ферромагнитных и суперпарамагнитных микрогранул в заданных условиях составляет приблизительно 1:10 для гомогенного аккуратного смешивания суперпарамагнитных гранул в камере, при объеме ферромагнитных гранул, варьирующем в диапазоне от 1 до 5 мкл. Применение большего количества ферромагнитных гранул затрудняло их удержание возле стенок при перемешивании суперпарамагнитных гранул. Применение меньшего количества ферромагнитных гранул затрудняло эффективный захват суперпарамагнитных гранул и иммобилизацию их на стенках картриджа при промывании, что приводит к утрате связанных с суперпарамагнитными гранулами клеток СНО.

Объемное количество 20-30 мкл суперпарамагнитных гранул было выбрано на основании протокола авторов изобретения для выделения клеток вручную. Было установлено, что подходящая плотность клеток составляет приблизительно 1,0×10⁷ клеток/мл для объема камеры 50 мкл. Использовалось соотношение гранул и клеток, рекомендованное производителями, например: размером Dynabeads™ М-280 2,8 мкм (Invitrogen, #60210) использовали в количестве 6,5×10⁸ гранул/мл и Dynabeads™ MyOne Tl размером 1,0 мкм (Invitrogen, #65601) использовали в количестве 9×10⁹ гранул/мл. Поскольку объем камеры MagPhase™ составляет 50 мкл и в него загружают образцы, содержащие 1×10⁷ клеток/мл, 20 мкл суперпарамагнитных гранул дает, соответственно, соотношение гранул и клеток, составляющее 26:1 для гранул М-280 и 360:1 для гранул MyOne Т1. На основании диаметра и различий в количестве гранул авторы изобретения определили, что равное количество гранул MyOne Т1 обеспечивает почти в 2 раза большую площадь поверхности по сравнению с гранулами М-280; соответственно, они превосходят по емкости гранулы М-280.

Гранулы тестировали с использованием рабочих диапазонов MagPhase™ 0-400 Гц и 0-500 мА. При этом для надлежащего манипулирования магнитными микрогранулами при помощи MagPhase™ требовались оптимальные условия. Например, в надлежащим образом заданных условиях ферромагнитные гранулы циркулируют вокруг стенок камеры и не попадают в центральную часть камеры, при этом происходит аккуратное перемешивание суперпарамагнитных гранул, пространственно распределенных по всему объему камеры. После задания указанных оптимизированных условий они обеспечивали реализацию «режима разделения гранул» согласно описанию ниже, в разделе 5. Однако, как было обнаружено, оптимальные условия варьируют в зависимости от типа и размера микрогранул, и надлежащее манипулирование в MagPhase™ может быть достигнуто только при применении конкретных типов гранул и рабочих условий, согласно описанию в разделах ниже.

Суперпарамагнитные гранулы:

Dynabeads™ М-280 и MyOne Т1: Оба типа гранул могут функционировать в присутствии ферромагнитных гранул при различных режимах функционирования MagPhase™. Однако были выбраны гранулы MyOne Т1, поскольку они демонстрировали более благоприятное пространственное распределение. Их более слабая магнетизация по сравнению с М-280 облегчала отсоединение от ферромагнитных гранул и выделение в конце процесса. Было также обнаружено, что их размер, 1,0 мкм, обеспечивает более специфические взаимодействия, приводящие к связыванию с клетками СНО, по сравнению с микрогранулами размером 2,8 мкм.

Ademtech™ 300 нм: Указанные гранулы не подходили для автоматизированного разделения, поскольку они отличаются слишком слабой магнетизацией, обуславливающей сложность их захвата и иммобилизации ферромагнитными гранулами.

Ферромагнитные гранулы:

Chemicell™ FluidMAG 5,0 мкм: Их магнитные свойства слабее, чем у Chemicell™ SiMAG, но, тем не менее, они обеспечивали эффективное смешивание в заданном диапазоне частоты и магнитной силы, например, в пределах 100-200 Гц и 200-300 мА. Оптимальные условия смешивания для указанных ферромагнитных гранул могут быть определены как 150 Гц и 200 мА, согласно описанию ниже. В таких условиях они циркулируют вокруг стенок камеры и обеспечивают быстрое гомогенное пространственное распределение суперпарамагнитных гранул в режимах смешивания или захвата клеток, как показано в следующем разделе. Однако на гранулы Chemicell FluidMAG необходимо было наносить покрытие из крахмала для уменьшения связывания с неэкспрессирующими клетками СНО, которые неспецифически связываются с кремниевой поверхностью указанных гранул.

Магнитные свойства Chemicell™ SiMAG размером 1,0 мкм и 2,0 мкм более выражены по сравнению с FluidMAG и, соответственно, обеспечивают эффективное смешивание в более широком диапазоне значений параметров MagPhase™, например, при 50-300 Гц и 200-400 мА. Тем не менее, оптимальные условия для указанных микрогранул могут быть определены как 100 Гц и 300 мА в «Режиме разделения гранул» и «Режиме выделения», как показано в следующем разделе. В таких условиях указанные гранулы циркулируют возле стенок камеры для смешивания и быстрее перегруппируются в углах камеры по сравнению с гранулами FluidMAG, что уменьшает вероятность дальнейшего захвата и иммобилизации суперпарамагнитных гранул наряду с ферромагнитными гранулами и обеспечивает, таким образом, выделение большего числа клеток по сравнению с гранулами FluidMAG.

5. Установка и оптимизация параметров функционирования MAGPHASE

Процесс реализации указанного нового способа, предусматривающего смешивание как ферромагнитных, так и суперпарамагнитных частиц в камере MagPhase™ для выделения отличающихся высоким уровнем экспрессии клеток, может быть описан как включающий 5 этапов:

Режим смешивания (фиг. 9): При указанном режиме два типа гранул смешивали отдельно. Для достижения гомогенного смешивания необходима работа 4-х электромагнитов MagPhase™ в круговом режиме при показателях частоты от средних до высоких (например, 100 Гц) и высокой магнитной силе (например, 300 мА). Это обеспечивает вращение ферромагнитных гранул внутри камеры возле стенок, тогда как суперпарамагнитные гранулы диспергированы и медленно вращаются в середине камеры. Для достижения идеального пространственного распределения суперпарамагнитных гранул электромагниты последовательно активировали в направлении по часовой стрелке в течение 1 с, затем в течение 1 с в направлении против часовой стрелке и затем в течение 10 с в направлении по часовой стрелке. Режим смешивания используют для инкубирования гранул для захвата, в данном случае суперпарамагнитных гранул с клетками, для захвата экспрессирующих клеток, а также при проведении этапов промывания.

Режим захвата (фиг. 10): За счет использования кругового режима функционирования MagPhase™, уменьшения при этом частоты до 1 Гц и увеличения магнитной силы (например, 400 мА) ферромагнитные гранулы медленно вращались по всему объему камеры. Они «сканировали» объем камеры и захватывали суперпарамагнитные гранулы. Остаточная намагниченность ферромагнитных гранул заставляет их функционировать в качестве постоянных магнитов малого размера, и суперпарамагнитные гранулы вместе с потенциально присоединенными клетками притягиваются и связываются с ними. Это обеспечивает основу для удержания указанных комплексов в углах камеры, согласно описанию следующего этапа.

Режим иммобилизации (фиг. 11): Электромагнитные полюсы MagPhase™ в указанном режиме функционировали в качестве постоянных магнитов 2 на 2 при 0 Гц и высокой магнитной силе (например, 400 мА). Связанные ферромагнитные и суперпарамагнитные гранулы удерживались в углах камеры, что позволяло закачивать новые растворы (клетки в суспензии или отмывочные буферы) и откачивать из камеры присутствующий в ней раствор (например, нежелательные клетки).

Режим разделения гранул (фиг. 12): После этапов промывания осуществляли разделение гранул как и при режиме смешивания на этапе 1; высокая частота (100-150 Гц) обеспечивала отделение суперпарамагнитных гранул от ферромагнитных. Пространственное распределение гранул идентично распространению при режиме смешивания, т.е. ферромагнитные гранулы циркулируют возле стенок, а суперпарамагнитные гранулы двигаются медленнее в области середины камеры.

Режим выделения (фиг. 13): После разделения гранул используют режим «иммобилизации гранул» с частотой 100 Гц и магнитной силой 100 мА. На протяжении непродолжительного времени (3 с) использовали высокую частоту и среднюю магнитную силу, чтобы обеспечить достаточное время для перемещения только ферромагнитных гранул в углы камеры за счет их выраженного ответа на магнитные поля. Используют частоту 100 Гц для изменения направления внутренних магнитных моментов суперпарамагнитных гранул в ответ на ориентацию магнитного поля, что предотвращает их перемещение в углы камеры. Таким образом, суперпарамагнитные гранулы остаются в суспензии в середине камеры, что позволяет извлекать их вместе со связанными клетками путем закачивания воздуха в камеру.

Требуемые для эффективного обогащения экспрессирующими IgG клетками конкретные режимы функционирования определяли эмпирически, путем оптимизации каждого этапа и параметра процесса захвата клеток MagPhase™. Как будет понятно специалисту в данной области техники, указанные режимы функционирования после определения могут быть легко скорректированы, например, при изменении размера реакционной камеры или конфигурации электромагнита.

Во-первых, оптимизировали режим промывания. Клетки F206 смешивали с клетками BS2 в соотношении 50:50 или с клетками BLC в соотношении 30:70. Указанные смеси клеток инкубировали с биотинилированным антителом KPL против IgG, и в указанных меченых смесях проводили захват MagPhase™ с использованием разных режимов промывания, т.е. режима, который, как было обнаружено, при заданных общих условиях и использовании конкретного оборудования, является «оптимальным» (120 Гц, 300 мА), или «быстрым» (200 Гц), «интенсивным» (400 мА) или «быстрым + интенсивным» (200 Гц, 400 мА). 20 мкл суперпарамагнитных гранул (MyOne Tl Dynabeads™, покрытые стрептавидином, 1,0 мкм) и 2 мкл ферромагнитных гранул (Chemicell™ FluidMAG/MP-D, 5,0 мкм, покрытые крахмалом) предварительно загружали в камеру для смешивания. Все остальные параметры представляли собой параметры по умолчанию согласно фиг. 9-13. Оптимальный режим промывания обеспечивал 2-кратное обогащение клетками F206 относительно клеток BS2 и 2,5-кратное обогащение клетками F206 относительно клеток BLC (фиг. 14В). Оба эксперимента показали, что «быстрый» и/или «интенсивный» режим промывания обуславливал утрату требуемых клеток F206, обеспечивая, соответственно, более низкие уровни обогащения. Таким образом были получены первые свидетельства того, что клетки, которые секретируют высокие уровни IgG (F206), могут быть отделены от клеток BS2, экспрессирующих более низкие уровни IgG, и от клеток BLC, которые экспонируют высокие уровни IgG на поверхности, однако эффективно не секретируют его (фиг. 2). Указанный оптимальный режим промывания использовали для проведения следующих анализов.

Во-вторых, оптимизировали временные характеристики захвата клеток при применении способа сортировки MagPhase™. Предварительно в камеру для смешивания загружали 1 мкл гранул Chemicell™ SiMAG (1,0 мкм) и 20 мкл гранул MyOne T1 Dynabeads™. Клетки F206 смешивали с неэкспрессирующими клетками СНО-М в соотношении 10:90. В смеси меченых биотинилированным антителом против IgG клеток проводили захват MagPhase™ с разной продолжительностью инкубирования, варьирующей в диапазоне от 2 с до 5 минут. В отношении процента выделяемых из клеток СНО-М клеток F206, каждый из периодов инкубации продолжительностью 2 с, 5 с и10 с приводили к 5-кратному обогащению (фиг. 15А). Что касается выхода выделенных клеток F206, при периоде инкубации, составляющий 5 с, наблюдался максимальный для всех протестированных условий выход, что в 2 раза превышает выход, например, при продолжительности инкубации, составляющей 2 с (фиг. 15В). Указанный анализ также показал, что более продолжительное инкубирование приводило к меньшим показателям обогащения по F206, скорее всего, в связи с увеличением уровня неспецифического связывания клеток СНО-М, как показано на фиг. 15В.

Наконец, определяли оптимальное соотношение ферромагнитных гранул и суперпарамагнитных гранул. Клетки F206 и СНО-М смешивали и предварительно метили согласно описанию выше. В камеру для смешивания предварительно загружали 1 или 2 мкл гранул Chemicell™ SiMAG (1,0 мкм), а также 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл или 30 мкл гранул MyOne Т1 Dynabeads™. Как показано на фиг. 16А, при отношении ферромагнитных и суперпарамагнитных гранул, составляющем 1:30, наблюдалось максимальное обогащение клетками F206 относительно клеток СНО-М (а именно, 5-кратное). При увеличении содержания ферромагнитных гранул до 2 мкл, обогащение клетками F206 снижалось в два раза относительно результатов, полученных при содержании ферромагнитных гранул, составляющем 1 мкл (фиг. 16В). Это, вероятно, было обусловлено ранее детектированным неспецифическим связыванием неэкспрессирующих клеток СНО-М с ферромагнитными гранулами.

6. Обогащение экспрессирующими белок клетками с применением MAGPHASE

С применением оптимизированной процедуры захвата клеток MagPhase™, авторы изобретения дополнительно проанализировали возможность обогащения высокопродуктивными клетками (т.е. клетками F206) с отделением от неэкспрессирующих клеток (клеток СНО-М) а также от экспонирующих средние, высокие или очень высокие уровни IgG клеток (т.е. клеток BS2, BLC и ВНВ, соответственно, см. фиг. 2).

Сначала авторы изобретения протестировали MagPhase™ на смеси клеток F206 и СНО-М, с соотношением F206:CHO-M, составляющим 8:92. С применением комбинации 20 мкл суперпарамагнитных гранул (MyOne T1 Dynabeads™, покрытые стрептавидином, 1,0 мкм) и 2 мкл ферромагнитных гранул (Chemicell™ FluidMAG/MP-D, 5,0 мкм, покрытые крахмалом), предварительно загружаемых внутрь камеры для смешивания, MagPhase™ позволяет обеспечить 6-кратное обогащение клетками F206 при выделении, по сравнению с исходной смесью клеток (фиг. 17А). При задании исходного соотношения высокопродуктивных клеток F206 и неэкспрессирующих клеток СНО-М, составляющего 40:60, выход клеток F206 увеличивался до 73% после обработки в MagPhase™, при этом кратность увеличения доли клеток F206 падала до 2-кратного увеличения (фиг. 17В). Указанный результат может объясняться насыщением суперпарамагнитных гранул клетками F206, предполагая, что верхний предел захвата соответствует приблизительно 70% отличающихся высоким уровнем экспрессии клеток в указанных условиях.

Затем с применением тех же соотношений ферромагнитных и суперпарамагнитных гранул и режимов функционирования MagPhase™ авторы изобретения протестировали эффективность MagPhase™ для обогащения отличающимися высоким уровнем секреции/высокопродуктивными клетками F206 относительно экспонирующих средние и высокие уровни клеток BS2, BLC и ВНВ. При смешивании клеток F206 с клетками BS2 в соотношении 40:60 в исходной популяции использование MagPhase™ обеспечивало достижение 2-кратного обогащения клетками F206 (фиг. 18А), аналогично результату обогащения клетками F206 относительно клеток СНО-М, при исходном соотношении 40:60 (фиг. 17В). Аналогичным образом, при смешивании с клетками BLC в соотношении 30/70 в исходной популяции (фиг. 18 В) MagPhase™ обеспечивал 2-кратное обогащение клетками F206 относительно клеток BLC, что хорошо коррелирует с более высокими уровнями секреции, наблюдаемыми для клеток F206. При смешивании отличающихся высоким уровнем секреции/высокопродуктивных клеток F206 с экспонирующими очень высокие уровни клетками ВНВ в исходном соотношении 40:60 использование MagPhase™ не обеспечивало обогащения клетками F206 (фиг. 18С). Это хорошо коррелировало с тем фактом, что клетки ВНВ экспонируют значительно более высокие уровни IgG, чем клетки F206, даже не секретируя большие количества IgG, и, соответственно, представляют собой клетки, экспонирующие, но не секретирующие высокие уровни IgG (фиг. 2). В целом, авторы изобретения пришли к заключению, что MagPhase™ позволяет осуществлять селективное обогащение отличающимися высоким уровнем секреции клетками относительно среднепродуктивных или низкопродуктивных клеток; это также подтолкнуло авторов к проведению дополнительной оптимизации селективности процесса сортировки клеток.

Для сравнения эффективности автоматизированного захвата MagPhase™ и проводимого вручную захвата меченые биотинилированным антителом против IgG клетки F206/CHO-M (в соотношении 10:90) и клетки F206:BS2 (в соотношении 40/60) подвергали захвату MagPhase™ или проводили захват вручную. Что касается кратности увеличения процента клеток F206 в конечной популяции клеток, MagPhase™ обеспечивал 5-кратное обогащение клеток F206 относительно клеток СНО-М, по сравнению с 9-кратным обогащением при проводимом вручную захвате (фиг. 19A). Однако в более благоприятной ситуации со смесью высокопродуктивных и среднепродуктивных клеток, которая может быть получена с помощью стабильной трансфекции, направленной на выделение отличающихся высоким уровнем экспрессии клеток, MagPhase™ обеспечивал значимо более высокую эффективность, чем проводимый вручную захват при сортировке с отделением клеток F206 от клеток BS2 (фиг. 19В). Это указывает на то, что MagPhase™ может обеспечивать более избирательный отбор более высокопродуктивных клеток по сравнению с проводимым вручную процессом, а также требует гораздо меньшего времени, меньшего манипулирования и усилий со стороны экспериментатора.

7. Обогащение с применением стерильного захвата MAGPHASE экспонирующими IgG и секретирующими высокие уровни клетками из моноклональных популяций клеток

7.1 Проведение стерильного захвата MAGPHASE и оптимизация временного режима разделения захваченных клеток/гранул

Поскольку было установлено, что MagPhase™ позволяет обогащение экспрессирующими высокие уровни антитела клетками с отделением от неэкспрессирующих или экспрессирующих средние уровни клеток, сначала авторы изобретения проанализировали возможность проведения захвата в стерильной среде. С указанной целью внутренние микрофлюидные каналы для манипулирования жидкостями оригинального аппарата MagPhase™ сначала стерилизовали в ламинарном шкафу путем промывания 16 мл 8% раствора Javal (лаборатория Reactol™, #99412), 16 мл 10% раствора Contrad 90 (Socochim™, #Decon90) и 32 мл стерильной воды Milli-Q. На последующих этапах, и после разработки оптимизированного процесса и дизайна одноразового картриджа, картриджи стерилизовали гамма-излучением (24 кГр) до осуществления захвата.

В качестве исходных использовали смеси клеток F206 и СНО-М клеток в соотношении от 10:90 до 20:80, и проводили в указанных исходных смесях стерильный захват MagPhase™ с применением параметров, представленных на фиг. 17. Клетки и гранулы, выделенные с использованием захвата MagPhase™, а также аликвоту исходных клеток в качестве контроля помещали в культуру с добавлением 5% добавки Cell Boost 5 (СВ5, Hyclone, Thermo Scientific™, #SH30865.01), однако без отбора с применением антибиотиков, поскольку проведенные авторами предварительные тесты показали, что жизнеспособность клеток, извлеченных с помощью MagPhase™, повышалась при использовании питательной смеси СВ5. Захваченные с помощью MagPhase™ клетки отделяли от отсоединившихся гранул через день после захвата с применением портативного магнита, для выделения только клеток, которые спонтанно отделились от гранул через день после извлечения с помощью MagPhase™. Выделенные возвращали в культуру без отбора с применением антибиотиков и в присутствии СВ5 в течение 16 дней до анализа на экспонируемый на поверхности выделенных клеток IgG (фиг. 20А). Указанные временные характеристики культивирования обеспечивали отсутствие загрязнения микроорганизмами, и, соответственно, подразумевает, что захват в стерильных условиях был выполнен успешно.

7.2 Оптимизация условий предварительного культивирования для стерильного захвата MAGPHASE

При подпитке исходных клеток СВ5 после стерильного захвата с применением MagPhase™, выделенные на 1 день клетки были 5,6-кратно обогащены клетками F206 по сравнению с исходными клетками, не прошедшими стерильный захват MagPhase™ (фиг. 20А). Указанное обогащение соответствовало результатам, полученным при нестерильном захвате MagPhase™ в смеси клеток аналогичного исходного состава (фиг. 17А). Однако при предварительном культивировании исходной смеси клеток F206 и СНО-М в присутствии 5% добавки СВ5 до сортировки MagPhase™, выделенные на 1 день клетки отличались только 2-кратным обогащением клетками F206 (фиг. 20 В). При дальнейшем культивировании оставшейся смеси клеток и гранул до 3 дня перед выделением указанных клеток, отсоединившихся от гранул, получали аналогичные результаты. Это предполагает, что указанная подпитка влияла на захват клеток при добавлении до проведения этапа сортировки клеток.

Указанную возможность непосредственно оценивали путем параллельного проведения вручную или опосредованного устройством MagPhase™ захвата клеток F206, культивированных с подпиткой или без подпитки СВ5 в культуральной среде до проведения процесса сортировки. При этом наличие СВ5 при предварительном культивировании при использовании обоих способов захвата значимо снижало (р<0,01) кратность увеличения содержания клеток F206 в итоговой популяции по сравнению с предварительным культивированием без СВ5 (фиг. 20С). Указанные результаты показывают, что наличие СВ5 при предварительном культивировании с высокой вероятностью нарушало взаимодействие клеток F206 с магнитными гранулами, и, соответственно, культивирование клеток до захвата MagPhase™ должно проводиться без СВ5. Одно из вероятных объяснений заключается в том, что указанная питательная добавка содержит биотин, так как это может влиять на взаимодействие связанного с клетками биотинилированного антитела с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами. Другое заключение состоит в том, что клетки необходимо культивировать в культуральной среде с концентрациями биотина, не превышающими 10 мкМ, предпочтительно с концентрациями биотина, включенного в среду для культивирования клеток CDM4CHO или в специально разработанные среды для культивирования, оценку которых проводили согласно описанию в настоящем документе, составляющими менее 3 мкМ или 0,1 мкМ,

Затем анализировали, произошло ли в извлеченной с помощью опосредованного MagPhase™ захвата клеток популяции обогащение клетками, которые секретируют значительные количества терапевтического IgG. Указанную оценку проводили, поскольку процедура сортировки MagPhase™ основана на временном экспонировании указанного IgG на поверхности клеток, однако указанное экспонирование не обязательно должно быть связано с высоким уровнем секреции IgG. Так, клетки ВНВ и BLC согласно фиг. 2 не секретируют очень высоких уровней IgG по сравнению с клетками F206, хотя и экспонируют высокие или очень высокие уровни указанного IgG согласно оценке с применением окрашивания клеток. Указанную оценку проводили путем культивирования клеток, выделенных на 1 день или на 3 день, согласно фиг. 20 В, а также несортированных контрольных клеток, перед количественным определением секретированного IgG в культуральном супернатанте на 10 день после сортировки.

Процентное содержание положительных по IgG клеток F206 на 1 день или 3 день после сортировки было аналогичным, в 2-3 выше, чем в контрольных клетках, не прошедших обработку MagPhase™ (фиг. 21А). Однако клетки, извлеченные на 1 день, секретировали в 3 раза больше IgG, чем контрольные клетки, тогда как извлеченные на 3 день клетки секретировали только приблизительно половину количества IgG, секретируемого выделенными на день 1 клетками (фиг. 21). Эти результаты показывают, что выделенные на 1 день клетки экспонируют значительное количество IgG, а также быстро высвобождают его в среду, тогда как выделенные на 3 день клетки соответствуют клеткам, которые выраженным образом экспонируют на поверхности IgG, однако эффективно не высвобождают его, и, соответственно, не представляют собой отличающиеся очень высоким уровнем секреции клетки. Соответственно, извлечение указанных клеток на день 1 после захвата MagPhase™ соответствовало, в указанных условиях, наилучшим временным характеристикам для выделения секретирующих высокие уровни IgG клеток. Соответственно, сортировка экспонирующих высокие уровни клеток с применением MagPhase™ в сочетании с оптимальными временными характеристиками отсоединения клеток от магнитных гранул может применяться для выбора клеток, отличающихся требуемым свойством, в указанном случае -секрецией значительных количеств терапевтического белка. Далее, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что настройки и режим функционирования MagPhase™ могут быть адаптированы для выделения преимущественно экспрессирующих средние уровни, экспрессирующих низкие уровни или не экспрессирующих клеток.

8. Обогащение секретирующими IgG клетками в поликлональных популяциях с применением стерильного захвата MAGPHASE

Согласно описанию выше, эффективность устройства и способа MagPhase™ для обогащения экспрессирующими IgG клетками была протестирована на смеси референсных моноклональных клеток. Затем авторы изобретения хотели определить, возможно ли обогащение с помощью MagPhase™ секретирующими высокие уровни IgG клетками в поликлональных популяциях, отличающихся множеством варьирующих в широком диапазоне уровней экспрессии. С указанной целью проводили стерильный захват MagPhase™ для захвата секретирующих высокие уровни IgG клеток из поликлональной популяции клеток, стабильно экспрессирующих терапевтическое антитело трастузумаб.

Как показано на фиг. 22А, при культивировании захваченных клеток без СВ5 наблюдалось 3-кратное увеличение содержания экспонирующих средние, а также высокие уровни IgG клеток в популяции клеток, извлеченных на 1 день, по сравнению с контрольными клетками. Однако в выделенной на 4 день популяции не наблюдалось обогащения экспонирующими средние или высокие уровни клетками. Относительно удельной продуктивности было сделано аналогичное заключение, то есть секретирующие максимальные количества клетки были получены в случае выделенных на 1 день клеток, секретировавших в 2,6 раз больше IgG по сравнению с контрольными клетками (фиг. 22В), несмотря на нежелательное присутствие добавки СВ5 в предварительной культуре клеток.

Таким образом, было сделано заключение, что MagPhase™ позволяет эффективно сортировать клетки в стерильной среде с одноразовыми сменными картриджами, и что он позволяет осуществлять обогащение клетками, которые секретируют значительные количества терапевтического белка, гетерогенной поликлональной популяции. Кроме того, добавление СВ5 в культуру захваченных клеток после сортировки клеток MagPhase™ дополнительно повышало выделение максимально секретирующих клеток на 1 день после захвата.

9. Стерильный захват MAGPHASE с применением моноклональных антител против IgG

Поскольку применение полученного из сыворотки поликлонального вторичного антитела не подходит для условий фармацевтического производства, авторы изобретения дополнительно исследовали осуществимость применения биотинилированных моноклональных антител (mAb) против IgG в способе захвата MagPhase™. Как показано на фиг. 23А, в способе захвата клеток MagPhase™ могут быть протестированы два разных моноклональных антитела. Использование моноклонального антитела Mabtech™ при культивировании захваченных клеток без СВ5 обеспечивало 2-кратное обогащение клетками, экспонирующие как средние, так и высокие уровни IgG на день 1, по сравнению с контрольными клетками (фиг. 23А). При культивировании захваченных с применением моноклональных антител Mabtech™ клеток в содержащей СВ5 среде, на 1 день достигалось 1,4-кратное и 1,6-кратное увеличение уровней экспонирующих средние и высокие уровни клеток, соответственно (фиг. 24 В). При применении для захвата клеток моноклонального антитела Acris достигались более низкие уровни обогащения экспонирующими средние и высокие уровни клетками. Соответственно, удельная продуктивность для IgG у захваченных клеток была выше при применении моноклонального антитела Mabtech™, обеспечивая в 2 раза более высокую продуктивность по сравнению с контрольными клетками, при извлечении клеток при подпитке СВ5 (фиг. 24С). В совокупности указанные анализы показали, что моноклональные антитела могут применяться для стерильного захвата на основе MagPhase™ и обогащения отличающимися высоким уровнем секреции клетками из поликлональной популяции.

10. Новый способ MAGPHASE для обогащения экспрессирующими антитело клетками

Известные варианты способа сортировки MagPhase™ включали стерилизацию MagPhase™ путем прокачивания обеззараживающих растворов. Также в указанных известных способах микрофлюидные каналы не были одноразовыми, что, соответственно, обуславливало риск загрязнения, что обуславливает непригодность для сортировки клеток для фармакологического применения. В настоящем изобретении предложены, в том числе, аппарат MagPhase™ и картриджи нового поколения, предназначенные для стерильной сортировки живых клеток с проведением всех связанных с манипулированием жидкостями и клетками процедур в автономной среде с заданными параметрами, обеспечиваемой одноразовым стерильным картриджем.

После множества проб и усовершенствований, касающихся материала и дизайна картриджа, авторы изобретения обнаружили, что картриджи, изготовленные из полиметилметакрилата (ПММА) с поликарбонатным (ПК) пленочным покрытием, хорошо подходят для стерильного процесса захвата клеток. Окончательный дизайн картриджа представлен на фиг. 5 и фиг. 25.

При использовании поликлональных антител KPL для мечения исходной популяции клеток усовершенствованное устройство MagPhase™ обеспечивало значимое обогащение клетками F206 (увеличение содержания в 5,0 раз) относительно клеток СНО-М на 1 день, по сравнению с 2,4-кратным обогащением, достигаемым при использовании MagPhase™ оригинального дизайна (фиг. 24А). Выделенные на 6 день клетки отличались паттерном обогащения, аналогичным выделенным на 1 день клеткам. Аналогичным образом, усовершенствованное устройство MagPhase™ также обеспечивало значимое обогащение клетками F206 относительно клеток СНО-М при применении моноклональных антител Mabtech™, т.е. 2,8-кратное и 3,6-кратное обогащение в популяции выделенных на 1 день и 6 день клеток, соответственно (фиг. 24В). Указанные результаты показали повышение эффективности для усовершенствованного дизайна MagPhase™ при применении как поликлональной антисыворотки KPL, так и моноклонального антитела Mabtech™.

Таким образом, предложено новое микрофлюидное устройство, в сочетании с картриджами и рабочими процессами, обеспечивающие обогащение клетками, экспрессирующими и секретирующими большие количества терапевтического белка, в стерильных, автономных, совместимых с жизнеспособными клетками одноразовых сосудах, надлежащим образом для манипулирования клетками, которые продуцируют терапевтические белки для применения у человека. Учитывая предшествующие неудачи при обогащении, в частности, высокопродуктивными клетками с применением доступных ранее способов, таких как описанные ранее неавтоматизированные или полуавтоматизированные не основанные на микрофлюидике способы, обеспечивающие только отделение экспрессирующих клеток от неэкспрессирующих клеток, результаты были неожиданными. Другое преимущество предложенного варианта MagPhase™ по сравнению с существующим уровнем техники состоит в том, что он представляет собой полностью автоматизированный и очень быстрый процесс (приблизительно 5 минут автоматизированных процедур в MagPhase, по сравнению по меньшей мере с 45 минутами времени оператора для сортировки вручную), что обеспечивает экономию времени и трудозатрат оператора, а также существенное снижение риска загрязнения, связанного с неавтономными условиями сортировки клеток, известными в данной области техники.

Следует понимать, что настоящим изобретением могут быть охвачены различные варианты реализации предложенных в настоящем изобретении способов и устройств, только некоторые из которых описаны в настоящем документе. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что существуют другие варианты реализации для осуществления без отступления от существа настоящего изобретения. Соответственно, описанные варианты реализации являются иллюстративными и не должны толковаться как ограничивающие.

Ссылочные материалы

[01]. Brezinsky, S.С, G.G. Chiang, A. Szilvasi, S. Mohan, R.I. Shapiro, A. MacLean, W. Sisk and G. Thill (2003). "A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity." J Immunol Methods 277(1-2): 141-155.

[02]. Caron, A.W., C. Nicolas, B. Gaillet, I. Ba, M. Pinard, A. Gamier, B. Massie and R. Gilbert (2009). "Fluorescent labeling in semi-solid medium for selection of mammalian cells secreting high-levels of recombinant proteins." BMC Biotechnol 9: 42.

[03]. Galbete, J.L, M. Buceta and N. Mermod (2009). "MAR elements regulate the probability of epigenetic switching between active and inactive gene expression." Mol Biosyst 5(2): 143-150.

[04]. Girod, P.A., D.Q. Nguyen, D. Calabrese, S. Puttini, M. Grandjean, D. Martinet, A. Regamey, D. Saugy, J.S. Beckmann, P. Bucher and N. Mermod (2007). "Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells." Nat Methods 4(9): 747-753.

[05]. Le Fourn V, Girod PA, Buceta M, Regamey A, and Mermod N. (2014). CHO cell engineering to prevent polypeptide aggregation and improve therapeutic protein secretion. Metab. Eng., 21:91 -102.

[06]. Ley D, Harraghy N, Le Fourn V, Bire S, Girod P-A, Regamey A, Rouleux-Bonnin F, Bigot Y and Mermod N. (2013). MAR Elements and Transposons for Improved Transgene Integration and Expression. PLoS ONE, 8:e62784.

[07]. Pichler, J., F. Hesse, M. Wieser, R. Kunert, S. S. Galosy, J. E. Matt and N. Borth (2009). "A study on the temperature dependency and time course of the cold capture antibody secretion assay." J Biotechnol 141 (1-2): 80-83.

[08]. Sen, S., W.S. Hu and F. Srienc (1990). "Flow cytometric study of hybridoma cell culture: correlation between cell surface fluorescence and IgG production rate." Enzyme Microb Technol 12(8): 571-576.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к идентификации и предпочтительному выбору клеток, на поверхности которых экспонирован представляющий интерес белок, картриджу для отбора клеток на основании уровня экспонирования, интегральной системе для отбора клеток, на основании уровня экспонирования, картриджу и интегральной системе для отбора клеток на основании уровня экспонирования и необязательно секреции ими белка из популяции клеток, содержащей указанные клетки, экспонирующие и необязательно секретирующие указанный белок, а также набору для идентификации и предпочтительного выбора клеток, на поверхности которых экспонирован представляющий интерес белок. Способ включает обеспечение образца, содержащего указанные клетки; обеспечение гранул для захвата, содержащих одну или большее количество аффинных групп, и необязательно гранул-носителей, причем указанная(ые) аффинная(ые) группа(ы) адаптирована(ы) для связывания клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок, где гранулы для захвата представляют собой суперпарамагнитные гранулы, и гранулы-носители представляют собой ферромагнитные гранулы. Затем осуществляют смешивание указанных клеток с указанными гранулами для захвата и необязательно с указанными гранулами-носителями, при этом указанная аффинная группа гранул для захвата связывает указанный белок, который экспонируется на поверхности клеток, с получением магнитно-меченых клеток (ММК), содержащих магнитную метку. Затем осуществляют отделение, например, в ходе по меньшей мере одного этапа промывания, не меченых магнитными частицами клеток от указанных ММК, и идентификацию и предпочтительный выбор клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 4 н. и 30 з.п. ф-лы, 27 ил.

Формула