Микрофлюидные устройства и способы их подготовки и применения - RU2423073C2
Код документа: RU2423073C2
Чертежи
Описание
ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США № 60/699380, поданной 14 июля 2005 года, содержание которой включено в настоящее описание путем отсылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область изобретения относится, в общем, к микрофлюидным устройствам, способам изготовления микрофлюидных устройств и применению микрофлюидных устройств в биологических исследованиях.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все более широкое распространение получает диагностика в месте наблюдения за пациентом (далее - экспресс-диагностика), которая применяется в больницах, кабинетах врачей, на рабочих местах и в потенциально неблагоприятной среде. Такие задачи, как проводимые на рабочем месте анализы на злоупотребление наркотиками или лекарственными средствами, анализы окружающей среды на наличие загрязняющих веществ и проверка наличия компонентов биологического оружия на поле боя, можно легко и просто проводить с помощью тестов экспресс-диагностики. Поскольку такая диагностика часто проводится лицами, имеющими слабую подготовку или не имеющими подготовки в области клинической диагностики, тесты экспресс-диагностики должны быть простыми, быстрыми и легкими в использовании. Тесты экспресс-диагностики в идеале требуют минимума оборудования.
Большинство современных тестов экспресс-диагностики основаны на мембранных иммунохроматографических анализах, в которых используются преимущества капиллярного действия микропористых мембран. При иммунохроматографических анализах аналиты в растворах образца с подвижной фазой отделяют от других компонентов аффинным связыванием для захвата молекул, иммобилизованных на стационарных твердых фазах. Мембраны, выполненные из нитроцеллюлозы или нейлона, обеспечивают матрицу для твердой неподвижной фазы аффинной хроматографии и жидкой фазы распределительной хроматографии, которая переводит подлежащие отделению частицы иммунного комплекса из других жидких растворов с помощью капиллярного действия.
Микропористые мембраны, выполненные из нейлона или нитроцеллюлозы, использовались для тестов на антиген/антитело примерно с 1979 года, когда впервые было продемонстрировано, что белки могут переноситься сквозь мембрану. Нитроцеллюлоза нашла широкое применение как поверхность для иммобилизации белков в исследовательских методиках, таких как вестерн-блоттинг и иммунодиагностика по растеканию капли в радиальном направлении. Микропористость и нитроцеллюлоза дают много преимуществ для быстрых иммунохроматографических анализов, включая, например, высокую связывающую способность, нековалентное прикрепление белков, долгосрочные стабильные условия иммобилизации и среду, ведущую к стойкому связыванию.
Типичный комплект для экспресс-иммуноанализа согласно уровню техники содержит индикаторную подушку, имеющую первое иммобилизированное антитело, к которому была прикреплена метка, такая как флуоресцентная метка, золотая метка или другая метка. Второе иммобилизированное антитело прикреплено к мембранной полоске из нитроцеллюлозы или нейлона. Один конец этой мембранной полоски из нитроцеллюлозы или нейлона приводят в непосредственный контакт с индикаторной подушкой. Второе иммобилизированное антитело часто связывают с мембраной с образованием конкретного геометрического рисунка, такого как линия. Когда пробу, содержащую подлежащий анализу аналит, наносят на индикаторную подушку, аналит связывается с первым меченым иммобилизированным антителом с образованием связывающего комплекса, а затем раствор, содержащий связывающий комплекс, втягивают сквозь мембранную полоску. Внутри мембранной полоски этот комплекс связывается со вторым связанным с мембраной иммобилизированным антителом. Это второе связывание можно визуализировать благодаря концентрации метки вдоль геометрического рисунка, содержащего связанное с мембраной иммобилизированное антитело, или, альтернативно, это связывание можно обнаружить другими средствами, такими как обнаружение флуоресценции или электрохимическое обнаружение.
Ключевыми параметрами, управляющими интенсивностью сигнала при иммунохроматографических анализах, является скорость капиллярного потока и способность мембраны к связыванию белков. Скорость капиллярного потока и способность к связыванию определяются размерами пор, пористостью и толщиной мембраны. Способность мембраны к связыванию белков зависит от размера ее пор и от свойств поверхности. Нитроцеллюлозные мембраны часто обрабатывают поверхностно-активными веществами, чтобы повысить смачиваемость поверхности. Однако применение поверхностно-активных веществ вызывает озабоченность, поскольку поверхностно-активное вещество изменяет поведение капиллярного потока в мембране и степень такого изменения трудно предсказать.
Способность мембраны связывать белки и скорость миграции частиц сквозь мембрану зависит от размера пор мембраны. К сожалению, производители мембран не могут поддерживать постоянный размер пор и пористость в процессе производства мембран из-за сложного и чувствительного характера производственного процесса. Сильное непостоянство размеров пор и пористости наблюдается между разными партиями продукции и, более того, даже внутри одной и той же партии продукции. Нередко встречается более чем 20%-ное изменение интенсивности сигнала между разными тестовыми комплектами, произведенными в одинаковых условиях. Такое непостоянство является основным фактором, заставляющим считать иммуноанализ на основе мембран неподходящим для количественных тестов. Это сильное непостоянство ограничивает применение тестов экспресс-диагностики для количественных анализов. Несмотря на то, что предпринималось множество попыток улучшить поведение микропористых мембран, сохранение постоянного качества все еще остается проблемой.
Для решения проблемы непостоянства интенсивности сигнала было предложено и исследовано много решений, таких как усовершенствование прибора обнаружения, альтернативное маркирование частиц и оптимизация состава реагентов. К сожалению, результатом явилось лишь небольшое улучшение эксплуатационных показателей.
Ввиду вышеописанных недостатков тестовых комплектов для экспресс-диагностики и способов их изготовления было бы желательно создать более точные тестовые комплекты для экспресс-диагностики и способы изготовления тестовых комплектов для экспресс-диагностики, которые повысят точность тестов и позволят использовать эти тесты для количественного, а также качественного анализа.
В некоторых тестовых комплектах используются микрофлюидные аналитические устройства. Множество материалов было использовано для создания каналов в микрофлюидных устройствах, такие как кремний, стекло и пластик. Каждый из этих материалов имеет свои недостатки. Кремний и стекло экономически не эффективны. Кремний требует применения процесса интенсивного химического травления, который инактивирует биоматериалы во время изготовления микроканалов и поэтому часто несовместим с биоматериалами. Пластик обычно является гидрофобным, так что ему нужна активная система транспортировки, заставляющая аналиты протекать по каналам, в отличие от пористой мембраны, в которой используется пассивное капиллярное действие. Было разработано микрофлюидное устройство пленочного типа, но для изготовления проточных каналов в нем используется высекаемая штампом клейкая лента (см., например, патент США № 6919046, выданный О'Конеру (O'Çoner) и др., и патент США № 6857449, выданный Чоу (Chow) и др.). Альтернативно, в патенте США № 6790599, выданном Маду (Madou) и др., описан способ изготовления микрофлюидного канала с использованием фотолитографии, но это изобретение не предусматривает по существу работоспособного микрофлюидного устройства, предназначенного для анализа биохимических материалов.
Большинство иммунохроматографических анализов выглядят гомогенными анализами, которые являются быстрыми, одноэтапными, без разделения и не требуют предварительной обработки пробы. Однако отделение несвязанных лигандов от лигандов, связанных с рецептором, входит в процедуру теста; это называется псевдогомогенным анализом. Отделение происходит, когда раствор аналита проходит по иммобилизированной тестовой линии. Для количественного определения малых молекул, таких как глюкоза, лактоза и неорганические материалы, широко используют электрохимические анализы, которые также применимы и к большим молекулам ввиду простоты и экономической эффективности этого способа.
Эта технология имеет проблемы при применении для обнаружения больших молекул с помощью одноэтапного анализа, подобного иммунохроматографическому анализу на основе мембраны. Электрохимические реакции требуют субстратов для реакций ферментов с генерированием сигналов. Ферменты, соединенные со связывающими веществами, и субстраты необходимо наносить отдельно и подавать последовательно, чтобы избежать самореакции между ферментом и субстратом еще до связывания с аналитом. Для осуществления этого процесса перед измерением уровня связывания необходим этап промывки для отделения несвязанных лигандов от тех, которые связаны с рецептором. В 1995 г. Ивницкий и другие изобрели одноступенчатый, не требующий разделения амперометрический иммуносенсор, модифицировав предыдущие иммуноанализы с пропусканием ферментов по каналам. Несмотря на такую модификацию, иммунохроматографические анализы на основе мембраны не обеспечивают постоянной скорости потока и продолжительности миграции во времени и, следовательно, в значительной степени неприменимы для количественных анализов.
ЗАДАЧИ И СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является создание новых и улучшенных микрофлюидных устройств и содержащих их комплектов для анализа.
Другой задачей настоящего изобретения является создание новых и улучшенных микрофлюидных устройств, которые устраняют недостатки существующих технологий анализа и являются быстродействующими, недорогими и простыми в использовании и, кроме того, позволяют проводить количественное обнаружение.
Еще одной задачей настоящего изобретения является создание новых и улучшенных способов производства или изготовления одноразовых тестовых комплектов для экспресс-диагностики, которые повышают точность тестов и позволяют использовать эти тесты для количественного, а также качественного анализа.
Другой задачей настоящего изобретения является создание новых и улучшенных способов производства одноразовых тестовых комплектов для экспресс-диагностики, в которых исключены указанные выше недостатки технологий производства согласно уровню техники.
Другой задачей настоящего изобретения является создание микрофлюидных устройств, которые могут обеспечить постоянную скорость потока и продолжительность миграции во времени.
Другой задачей настоящего изобретения является сознание новых и улучшенных способов применения микрофлюидных устройств, которые предназначены решить проблемы, связанные с существующими технологиями анализа и обеспечивают быстродействующие, недорогие, простые в использовании системы количественного анализа.
Другой задачей изобретения является создание новых и улучшенных электрохимических сенсорных устройств.
Для того чтобы решить, по меньшей мере, одну из этих задач, а также другие, одним вариантом воплощения микрофлюидного устройства, способного проводить экспресс-иммуноанализы в соответствии с изобретением, является многослойный ламинат, имеющий, например, три слоя, а именно нижний опорный слой, промежуточный слой фоторезиста и покровный слой. Хотя в качестве опорного слоя может использоваться любая форма опоры, основы, подложки, слоя материала или их комбинации, в одном предпочтительном варианте воплощения опорный слой содержит полимерную пленку, с которой могут быть связаны связывающие агенты. В этом случае к опорному слою прикрепляют несущую подложку для придания большей прочности. На полимерную пленку с одной стороны или на часть одной стороны может быть необязательно нанесено покрытие из металлической пленки или другое покрытие, с которым могут быть связаны связывающие вещества. Металлическая пленка может быть частью электрода. На полимерной пленке, другом покрытии или металлической пленке могут быть иммобилизированы одно или более связывающих веществ, таких как биогенные или иммунореактивные антитела или антигены, путем непосредственной абсорбции или за счет связывания с тонкими монослоями, такими как полипиррол, сульфонированный сополимер тетрафторэтилена (NAFION®), алкоксисилан или их смеси. Промежуточный слой, связанный непосредственно с полимерной пленкой на той же самой стороне, что и металлическая пленка или другое покрытие, содержит пленку фоторезиста, в которой вытравлены микрофлюидные (микропроточные) каналы и камеры. Пленка фоторезиста может содержать пленку полиимидного фоторезиста, такого как RISTON® от DuPont. Травление можно выполнять различными, хорошо известными в данной области техники способами, например, фотолитографией. Покровный слой может содержать полимерную пленку, которая может быть непосредственно связана со слоем фоторезиста с образованием ламината в соответствии с изобретением.
В одном варианте воплощения слой фоторезиста содержит по меньшей мере три микрофлюидные области: камера или область впуска пробы (впускная), камера или область реагента(ов) или реакции(й) (реакционная) и по меньшей мере одна камера или область обнаружения. Могут быть предусмотрены одна или более областей смешивания, например, между впускной камерой и реакционной камерой, могут быть предусмотрены одна или более абсорбирующих областей, например, ниже по потоку относительно последней камеры обнаружения, а также могут быть предусмотрены области воздушной вентиляции. Эти камеры и области, если они присутствуют, соединены друг с другом микрофлюидными каналами для формирования пути протекания для текучей среды пробы.
При основном применении, когда камера впуска пробы принимает жидкую пробу, содержащую подлежащий анализу аналит, эта жидкая проба втягивается в камеру впуска пробы за счет капиллярного действия и течет в реакционную камеру, где проба смешивается со связывающими реагентами, такими как меченые антитела. Метки могут содержать флуоресцентные метки или электрохимические метки, или другие метки, хорошо известные в этой области техники. Когда проба вытекает из камеры реагентов, она втекает в камеру обнаружения. Между реакционной камерой и первой камерой обнаружения может необязательно быть расположен смешивающий канал. Тщательное смешивание пробы и реагентов в смешивающем канале гарантирует реакцию аналита пробы и реагентов. В типичном случае между аналитом и меченым антителом формируется иммунный комплекс. В камере(ах) обнаружения комплекс аналит-антитело связывается со вторым антителом, которое, в свою очередь, непосредственно связано с камерой обнаружения. Таким образом комплекс аналит-антитело захватывается и иммобилизуется в камере обнаружения.
Количество захваченного комплекса может быть измерено детектором флюоресценции, оптическим детектором или электрическим детектором. Жидкая проба может необязательно протекать через камеру обнаружения в абсорбирующую область, которая может принимать форму набора из одного или более абсорбирующих каналов. Течение жидкой пробы продолжается до тех пор, пока абсорбирующая область не заполнится жидкостью. Воздуху в микрофлюидной системе обеспечена возможность выходить через одно или более воздушных вентиляционных отверстий, соединенных с камерой(ами) обнаружения или абсорбирующей областью.
Микрофлюидные устройства по изобретению могут быть изготовлены с помощью поточных процессов с переносом с рулона на рулон. В иллюстративном способе изготовления исходными материалами являются три рулона: рулон пленки из полиэтилентерефталата (ПЭТ) для нижнего слоя, рулон сухого фоторезиста для среднего слоя и рулон верхнего покровного слоя, такого как пленка ПЭТ или клейкая лента. Эти рулоны подвергаются последовательности технологических операций, таких как ламинирование, экспонирование ультрафиолетом (УФ), промывка щелочью, сушка, добавления металлических или других слоев и добавление связывающих реагентов. Затем эти три пленки могут быть заламинированы вместе. Наконец, полученный ламинат может быть разрезан с образованием отдельных полосок ламината для использования в комплектах для быстрого иммуноанализа или экспресс-анализа.
Микрофлюидные устройства в соответствии с изобретением имеют много преимуществ. Материалы, из которых изготовлены эти устройства, легко доступны, недороги, гибки и столь же тонки, как и нитроцеллюлозные мембраны, используемые в настоящее время для экспресс-иммуноанализа в месте наблюдения. Микрофлюидные устройства по изобретению также имеют прецизионно образованные проточные каналы, обеспечивающие неизменность скорости потока от партии к партии и позволяющие использовать эти устройства для количественного, а также качественного анализа.
Боле того, микрофлюидные устройства по изобретению могут легко и быстро определить количественные и качественные свойства конкретных аналитов в растворе пробы, анализируя реакцию связывания между парой связывающих веществ, в частности биогенных или иммунореактивных компонентов, и/или ферментные реакции между субстратом и активным ферментом. Эти компоненты (гаптен, специфичные биогенные репортеры (reporters), специфичные биогенные лиганды, антигены, антитела, нуклеиновые кислоты) обладают способностью специфично связываться друг с другом или вступать в реакцию с другими молекулами (фермент, субстрат, электронный медиатор или нуклеиновые кислоты) в водных тестовых растворах, и количественное значение связанных или вступивших в реакцию компонентов может быть определено путем электрохимического, флуоресцентного или оптического обнаружения.
Поэтому важным признаком изобретения является уникальное формирование серии микрофлюидных каналов и камер, которые взаимодействуют друг с другом, делая возможной и определяя реакцию связывания или ферментативную реакцию между парой связывающих веществ или ферментом и субстратом соответственно.
В системах анализа связывания реакционная камера или область содержит высушенную форму буферного реагента, биохимического реагента, антигена или антитела, меченного частицами золота, ферментами или флуоресцентным пигментом. Камера или область обнаружения может содержать покрытие из иммобилизованных антител или антигенов для захвата комплекса антиген-антитело.
Альтернативно, система электрохимического анализа может содержать камеру впуска пробы, реакционную камеру, по меньшей мере, одну камеру обнаружения и абсорбирующую область или камеру. Каждая камера обнаружения может содержать покрытие из специфичного фермента или субстрата, которые могут специфично реагировать с аналитом в растворе пробы.
В одном аспекте изобретения жидкая проба, содержащая подлежащий анализу аналит, будет протекать через систему до тех пор, пока абсорбирующая область или камера не будет заполнена. Поток прекращается, когда абсорбирующая область или камера заполнена. Следовательно, избыточное заполнение невозможно. Такое явление течения текучей среды является типичным для капиллярного потока и представляет собой ценное свойство: точное дозирование пробы данного конкретного тестового раствора. В отличие от непредсказуемого поведения абсорбирующей подушки при мембранном анализе, микрофлюидное устройство может использоваться для проведения количественного анализа.
Другое преимущество изобретения заключается в том, что когда жидкую пробу, содержащую подлежащий анализу аналит, помещают в камеру впуска пробы, жидкость течет во эту впускную камеру за счет капиллярного действия, сохраняя равномерную и постоянную скорость потока. Проба достигает реакционной камеры и смачивает находящиеся в ней сухие реагенты. Образовавшаяся смесь течет совместно через камеру смешивания, претерпевая интенсивное перемешивание с помощью сконструированного проточного канала. Основной компонент высушенного реагента может содержать меченые антиген или антитело или другой компонент, связывающий аналит. По мере того, как они проходят через камеру смешивания, аналит и реагент образуют прочный комплекс.
В камере или камерах обнаружения, когда имеется более чем одна камера обнаружения, жидкая проба, содержащая комплекс аналита, течет с ламинарным профилем потока. В каждой камере обнаружения находятся иммобилизированные антитело или антиген или другой связывающий аналит агент, способный связать ранее образовавшийся комплекс. При контакте с этим комплексом происходит второе событие связывания, которое приводит к захвату комплекса на поверхность камеры обнаружения. Несвязанные комплексы и другие свободные вещества вымываются в абсорбирующую камеру. Когда абсорбирующая область или камера заполнена, поток прекращается, обеспечивая точное дозирование пробы, необходимое для количественных анализов.
Электрохимическое обнаружение меченого ферментом антигена или антитела или других связывающихся комплексов является уже общепринятым. Можно использовать электрод сравнения серебро/хлорид серебра, а также золотые электроды и углеродные электроды. Альтернативно, другим возможным вариантом является оптическое обнаружение флуоресценции меченного флуоресцентным пигментом или частицей (европием или квантовыми частицами) антигена или антитела или другого связывающего агента.
Соответственно, микрофлюидные устройства в соответствии с изобретением могут измерять аналиты в растворах проб как качественно, так и количественно, анализируя свойства связывания аналита и одного или более из связывающих веществ, например биогенных или иммунореактивных веществ. Эти связывающие вещества, такие как гаптены, специфичные биогенные репортеры, специфичные биогенные лиганды, антигены и антитела, обладают способностью специфично связываться с аналитом в водном растворе пробы. В некоторых вариантах воплощения аналит содержит один или более связывающих эпитопов, и связывание на первом связывающем эпитопе не препятствует связыванию на втором связывающим эпитопе. Связывающие вещества и аналиты соединяются с образованием комплексов, которые могут быть обнаружены путем оптического обнаружения, флуоресцентного обнаружения или электрохимического обнаружения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Изобретение, вместе с его дополнительными задачами и преимуществами, может быть лучше понятно при обращении к нижеследующему описанию, приведенному в сочетании с приложенными чертежами, на которых подобные элементы обозначены подобными ссылочными позициями и на которых:
фиг.1 представляет собой перспективное изображение с пространственным разделением деталей первого варианта воплощения микрофлюидного устройства по изобретению;
фиг.2А представляет собой вид сверху микрофлюидного устройства, показанного на фиг.1, с удаленным покровным слоем для обеспечения видимости слоя фоторезиста;
фиг.2В представляет собой вид сверху альтернативного примера микрофлюидного устройства по изобретению;
фиг.2С представляет собой вид сверху альтернативного примера частей корпуса микрофлюидного устройства, содержащего верхнюю и нижнюю части корпуса по изобретению;
фиг.3А-3С показывают различные альтернативные конфигурации абсорбирующей области слоя фоторезиста;
фиг.3D-3G показывают альтернативные конфигурации реакционного канала или камеры обнаружения в слое фоторезиста;
фиг.4 представляет собой вид в перспективе комплекта для экспресс-анализа, включающего в себя микрофлюидное устройство, показанное на фиг.1;
фиг.5 представляет собой вид в перспективе комплекта для экспресс-анализа, показанного на фиг.4, с удаленной верхней частью корпуса;
фиг.6 представляет собой вид в сечении комплекта для экспресс-анализа, показанного на фиг.4, по линии 6-6 на фиг.4;
фиг.7 показывает пример считывающего блока для использования с комплектом для экспресс-анализа, показанным на фиг.4;
фиг.8 представляет собой вид электрохимического сенсорного устройства по изобретению;
фиг.9 представляет собой перспективное изображение с пространственным разделением деталей электрохимического сенсорного устройства, показанного на фиг.8;
фиг.10-13 показывают стадии производства электрохимического сенсорного устройства, показанного на фиг.8;
фиг.14 представляет собой график зависимости между жесткостью пленки фоторезиста и шириной сформированных в нем каналов как функции времени экспонирования ультрафиолетовым излучением;
фиг.15 показывает точки измерения скорости потока текучей среды пробы;
фиг.16 представляет собой диаграмму, показывающую результаты по скорости потока текучей среды пробы в разных микрофлюидных каналах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Обращаясь к приложенным чертежам, на которых подобные ссылочные позиции относятся к одинаковым или сходным элементам, на фиг. 1 показан и в целом обозначен позицией 10 вариант воплощения микрофлюидного устройства по изобретению. Микрофлюидное устройство 10 содержит опору 22, слой 14 фоторезиста, расположенный над опорой 22, покровный слой 16, расположенный над слоем 14 фоторезиста, и электрический соединительный узел 18, расположенный в соединении с опорой 22.
Опора 22 образует часть или является частью опорной структуры для микрофлюидного устройства 10, которая может принимать любую форму, которая обеспечивает предпочтительно жесткую нижележащую подложку для слоя 14 фоторезиста. Опорная структура может содержать основу, подложку и слой материала, либо по отдельности, либо в различных комбинациях. В показанном варианте воплощения опорная структура содержит жесткую несущую подложку 20, которая обеспечивает прочность и жесткость микрофлюидного устройства 10, и опору 22, которая является первой пленкой ПЭТ, нижняя поверхность которой непосредственно приклеена или иным образом прикреплена к верхней поверхности несущей подложки 20. В одном предпочтительном аспекте изобретения опора 22 является неэлектропроводной полимерной пленкой. Неограничивающий список опоры выбран из группы, состоящей из полиэтилентерефталата (ПЭТ), полиэтилена (ПЭ) и поликарбоната. Опора предпочтительно выполнена из ПЭТ. Несущая подложка 20 может быть выполнена из полипропилена, поликарбоната или полистирола в форме пластиковой карточки. Специалистам понятно, что могут использоваться и другие доступные несущие подложки для обеспечения жесткости и прочности.
Слой 14 фоторезиста может быть выполнен из полиимидного полимера, и его нижняя поверхность непосредственно приклеена или иным образом прикреплена к первой пленке 22 ПЭТ. Верхняя поверхность слоя 14 фоторезиста непосредственно приклеена или иным образом прикреплена к покровному слою 16. В предпочтительном варианте воплощения слой 14 фоторезиста является пленкой сухого фоторезиста, например пленкой с покрытием DuPont RISTON®, Pyralux PC1025, Pylalin PI2721 или SU-8. Пленки сухих полиимидных фоторезистов, таких как RISTON® компании DuPont, широко используются в производстве печатных плат в электронной промышленности. Пленка сухого фоторезиста легко растворяется в слабом щелочном растворе. Однако после экспонирования ультрафиолетовым излучением пленка претерпевает полимеризацию и становится устойчивой к растворению в щелочном растворе. Дополнительно, после того, как фоторезист полимеризован, он является стабильным в водном растворе и обладает хорошими свойствами смачивания. Поэтому такие сухие фоторезистивные материалы прекрасно подходят для формирования каналов, камер и других структур, как обсуждается ниже.
Покровный слой 16 может быть второй пленкой ПЭТ. Покровный слой 16 может быть полимерной пленкой или клейкой пленкой. Покровный слой 16 может быть прозрачным или полупрозрачным. Является целесообразным, чтобы покровный слой 16 был прозрачным, когда используется флуоресцентное или оптическое обнаружение. Неограничивающий список материалов покровного слоя 16 выбран из группы, состоящей из ПЭТ, полиэтилена (ПЭ), поликарбоната, мокрой полиимидной пленки или клейкой пленки. Покровный слой 16, а также другие покровные слои в раскрытых здесь микрофлюидных устройствах, также именуются просто покровом.
В некоторых предпочтительных аспектах изобретения электрический соединительный узел 18 предназначен для электрического соединения области слоя 14 фоторезиста (особой области, которая будет описана ниже) со считывающим блоком 24, который взаимодействует с корпусом 50, в который заключено микрофлюидное устройство 10 (фиг. 7). Электрический соединительный узел 18 содержит электроды 30 и 33. Электрический соединительный узел 18 дополнительно содержит пару, например, по существу Г-образных соединительных штырей 28, выполненных из электропроводного материала. Электроды 30 и 33 сформированы на первой пленке 22 ПЭТ или в соединении с ней любым известным способом изготовления, таким как фотолитография, трафаретная печать или напыление. Например, часть электродов 30 и 33 имеет форму металлической пленки, которой фотолитографически придан рисунок вокруг намеченной части слоя 14 фоторезиста, и выводы, приходящие от этой металлической пленки к штырям 28. Предпочтительно, электроды 30 и 33 непосредственно связаны с верхней поверхностью первой пленки 22 ПЭТ.
Проводящими или металлическими материалами, использованными в электрическом соединительном узле 18, могут быть золото, оксид индия и олова (ITO), серебро, платина, палладий, либо по отдельности, либо в их смесях. Когда микрофлюидное устройство 10 используется для флуоресцентного или оптического обнаружения, электрический соединительный узел 18 не нужен.
В одной иллюстративной конструкции по изобретению электроды 30 и 33 имеют по существу U-образную форму и имеют на одном конце электродную площадку 32, которая находится в непосредственном контакте с соответствующим соединительным штырем 28. На участке, противоположном площадкам 32, рабочие участки 34 и 35 электродов 30 и 33 расположены под намеченной областью слоя 14 фоторезиста. Следует понимать, что формы площадок 32 и рабочих участков 34 и 35 являются лишь примерами и не ограничены теми конкретными формами, что показаны на фиг. 2А. Покровный слой 16 имеет отверстия, совмещенные с площадками 32. Эти отверстия в слое 14 фоторезиста и в покровном слое 16 предпочтительно дают возможность части электродов 30, 33 быть обнаженными с тем, чтобы обеспечить контакт с соединительными штырями 28, как показано на фиг. 2А. Один из электродов 30, 33 должен служить как рабочий электрод, а другой как электрод сравнения, использование которых хорошо понятно специалистам в данной области техники.
Электроды могут быть выполнены из любого электропроводного материала, включая, но, не ограничиваясь перечисленным, золото, оксид индия и олова, серебро, платину, палладий и комбинации этих материалов.
В одном примере соединительных штырей 28 соединительные штыри 28 имеют разделенные фланцы, которые вступают в зацепление с противоположными сторонами опорной пленки 22 ПЭТ и несущей подложки 20 для прижатия площадок 32 к несущей подложке 20 и, тем самым, для обеспечения надежного электрического соединения между соединительными штырями 28 и площадками 32. В изобретении, не выходя за рамки его объема и изобретательской идеи, можно использовать альтернативные механизмы электрического подключения, которые создают электрический путь от площадок 32 к штырям.
В иллюстративной конструкции микрофлюидного устройства 10 толщина покровной и опорной пленок 16 и 22 ПЭТ составляет приблизительно 100 мкм. Толщина слоя 14 фоторезиста составляет от примерно 25 до примерно 100 мкм и, предпочтительно, составляет приблизительно 50 мкм. Как таковое, одно предпочтительное микрофлюидное устройство 10 имеет толщину примерно 250 мкм над несущей подложкой 20. Толщина электродов 30, 33 является предпочтительно меньшей, чем 50 мкм, и должна быть меньше толщины слоя 14 фоторезиста в микрофлюидном устройстве 10. Толщина электродов 30, 33 может более предпочтительно составлять от примерно 2 до 20 мкм. Когда материалом электрода является ITO, толщина электрода может составлять всего 2 мкм.
Фиг. 2В и 2С иллюстрируют альтернативную конструкцию микрофлюидных устройств.
Обращаясь к фиг. 2В, микрофлюидное устройство 210 содержит опору 222, слой 214 фоторезиста, расположенный над опорой 222, покровный слой 216, расположенный над слоем 214 фоторезиста, и электрический соединительный узел 218, расположенный в соединении с опорой 222.
Альтернативно, покров 216 состоит из двух листов со стыковым зазором 201 между этими листами. Этот стыковой зазор 201 подобен задерживающему каналу 38 на фиг. 2А, служащему для ввода задержки или времени запаздывания в тест на аналит, и полезен для стабилизации потока. Однако этот стыковой зазор не столь широк, чтобы вызвать утечку текучей среды пробы. Реакционная область 240 расположена внутри канала, соединяющего впуск 236 пробы и область 242 смешивания.
Электрический соединительный узел 218 содержит электроды 230 и 233. На одном конце каждого из электродов 230 и 233 рабочие участки 234 и 235 электродов расположены под намеченной частью слоя 214 фоторезиста, которая образует камеру 244 обнаружения.
Длина покровного слоя 216 меньше, чем у слоя 214 фоторезиста, и поэтому часть электродов обнажена, что позволяет им контактировать с соединительными штырями (в этом варианте воплощения не показаны, но могут быть аналогичны описанным выше). Открытые концы набора абсорбирующих каналов образуют воздушные вентиляционные отверстия. Длина покровного слоя 216 на электродных площадках предпочтительно немного меньше, чем у слоя 214 фоторезиста, и преимущественно открывает вентиляционные отверстия.
Обращаясь к фиг. 2С, микрофлюидное устройство 310 содержит опору 322, слой 134 фоторезиста, расположенный над опорой 322, и покровный слой 316, расположенный над слоем 314 фоторезиста. Микрофлюидное устройство 310 содержит стыковой зазор 31 между двумя листами покровного слоя 316. В некоторых предпочтительных аспектах изобретения микрофлюидное устройство позволяет одновременно проводить тесты на множество аналитов. Такое микрофлюидное устройство может содержать две или более камеры или области обнаружения. В одной предпочтительной иллюстративной конструкции микрофлюидное устройство 310 содержит три камеры или области 344 обнаружения (см. фиг. 2С). Одна из этих трех камер обнаружения может быть предназначена для эталона, а другие - для подлежащих анализу аналитов. Каждая камера 344 обнаружения может содержать разное вещество, связанное с металлической пленкой или полимерной пленкой. Гидрофобные и электростатические взаимодействия между этим веществом и металлической пленкой или полимерной пленкой достаточны для предотвращения вымывания вещества и его перетока в абсорбирующие каналы. Альтернативно, это вещество может быть связано с металлической пленкой или полимерной пленкой, покрытой самособранным монослоем, таким как полипиррол, сульфонированный сополимер тетрафторэтилена (NAFION®), алкоксисилан или их смеси. Эти самособранные монослои (ССМ) повышают эффективность связывания и прочность. Вещество предпочтительно связано с самособранным монослоем, покрывающим металлический электрод, ITO или полимерную пленку. Для иммобилизации антител или захвата молекул на металлическом электроде или на полимерной пленке в камере обнаружения поверхность металлического электрода или полимерной пленки можно модифицировать самособранными монослоями (ССМ) или печатью гидрофобным полимером. ССМ является однонаправленным слоем, сформированным на поверхности вследствие спонтанного агрегирования образующих ССМ молекул.
Одними из хорошо известных связывающихся с золотом молекул являются образующие ССМ тиолсодержащие молекулы. Соединения карбоксиалкантиола и сукцинимидильные соединения алкандисульфида (оканчивающиеся сложным эфиром сукцинимидила алкилдисульфиды) широко используются для формирования ССМ на поверхности золота для введения реакционных центров карбоксильных групп или аминов. Оканчивающиеся сложным эфиром сукцинимидила алкилдисульфиды являются аминореактивными аналогами карбоксиалкилдисульфида. Карбоксильные группы карбоксиалкантиолов преобразуются в активированный N-гидроксисукцинимидовый эфир для связывания с аминами антител или захвата молекул. Поверхность, покрытая ССМ, не требует каких-либо других соединяющих агентов для иммобилизации антител или захвата молекул. Образующие ССМ молекулы наносят на поверхность золотого электрода или полимерной пленки с помощью процесса крапления и сушки.
Покровные слои 216, 316 в вариантах воплощения, показанных на фиг. 2В и 2С, образуют стыковые зазоры 201, 301, которые обеспечивают задержки во времени протекания между реакционной камерой 240, 340 и смешивающим каналом 242, 342 соответственно.
Обращаясь к фиг. 2А, слой 14 фоторезиста имеет уникальную структуру, которая обеспечивает простое и эффективное осуществление теста на аналит. Более конкретно, будучи сформированным описанным ниже образом, слой 14 фоторезиста снабжен отличительным рисунком камер и каналов, которые, взаимодействуя, позволяют проводить быстрый тест на аналит. На фиг. 2А показан иллюстративный рисунок, в котором слой 14 фоторезиста содержит впускную камеру 36 на одном конце, задерживающий канал 38, соединенный с впускной камерой 36, реакционную камеру 40, соединенную с задерживающим каналом 38 и содержащую смесь реагентов, включая первое связывающее аналит вещество, смешивающий канал 42, соединенный с реакционной камерой 40, который также предпочтительно содержит первое связывающее аналит вещество, камеру 44 обнаружения, соединенную со смешивающим каналом 42, и набор абсорбирующих каналов 46, соединенных с камерой 44 обнаружения. Хотя они и показаны в линейном расположении, различные камеры и каналы можно размещать и в других расположениях, в том числе и в нелинейном расположении. Набор абсорбирующих каналов 46 может содержать лишь единственный канал или множество каналов, примеры чего обсуждаются ниже и показаны на фиг. 2В и 2С.
Впускная камера 36 является той частью слоя 14 фоторезиста, в которую помещают анализируемую текучую среду. Покровный слой 16 снабжен отверстием 48, совмещенным с впускной камерой 36, чтобы исключить препятствование потоку текучей среды в камеру текучей среды (см. фиг. 1).
Задерживающий канал 38 служит для ввода задержки или запаздывания в тест на аналит и также полезен для стабилизации потока, т.е. стабилизации потока текучей среды пробы. Задерживающий канал 38 сформирован последовательностью поперечных секций и продольных секций, соединяющих соседние поперечные секции, образуя тем самым извивающийся путь.
Смешивающий канал 42 сформирован последовательностью поперечных секций, проходящих поперек существенной части ширины слоя 14 фоторезиста, и продольных секций, соединяющих соседние поперечные секции, образуя тем самым извивающийся путь.
Рабочие участки электродов 34 и 35 расположены в камере 44 обнаружения или образуют, по меньшей мере, часть камеры 44 обнаружения. Таким образом, часть слоя 14 фоторезиста, совмещенная с рабочими участками 34 и 35, является камерой 44 обнаружения.
Набор абсорбирующих каналов 46 включает удлиненные продольные секции и поперечную распределительную секцию, проходящие поперек верхних концов продольных секций. Впускная секция из камеры 44 обнаружения ведет к промежуточному положению на поперечном распределительном канале.
Варианты набора абсорбирующих каналов 46 показаны на фиг. 3А, 3В, 3С. В зависимости, например, от конкретного проводимого теста ширина и длина каналов и объемы камер могут меняться. В случае теста, требующего процесса промывки, объем абсорбирующих каналов предпочтительно должен быть больше, чем общий объем другой части канала и камеры, предпочтительно, примерно втрое больше, чем объем другой части канала.
Ширина микрофлюидных каналов 38, 42 и 46 может варьироваться от примерно 50 микрон до примерно 1000 микрон и, предпочтительно, составляет от примерно 50 микрон до примерно 500 микрон, а более предпочтительно - примерно 300 микрон. Высота канала может варьироваться от примерно 25 микрон до примерно 300 микрон и, предпочтительно, составляет примерно 50 микрон.
Каналы 38, 42, 46, а также камеры 36, 40 и 44 образуются частями опоры 22 (дно каналов и камер), частями слоя 14 фоторезиста (стенки каналов и камер) и частями покровного слоя 16 (верх каналов и камер). Ламинирование опоры 22, слоя 14 фоторезиста и покровного слоя 16, например, описанным ниже способом, позволяет получить хорошо определенную траекторию потока через микрофлюидное устройство 10.
Промежуточный слой 14 является пленкой сухого фоторезиста, которая создает точно определенную структуру микрофлюидных каналов. Эта промежуточная пленка содержит материал негативного фоторезиста с типичной толщиной 50 микрон. Пленка, не закрытая маской, полимеризуется под мощным УФ-облучением, в результате чего образуется нерастворимая полимерная пленка. Маскированные участки пленки легко вытравливаются аэрозолем щелочного раствора. Поверхность полимеризованной отвердевшей пленки является гидрофильной, что является преимуществом этого устройства.
На фиг. 3А, 3В и 3С набор абсорбирующих каналов 46, 246 и 346 содержит удлиненные продольные секции и поперечную распределительную секцию, которая проходит поперек верхних концов продольных секций. Впускная секция ведет от камеры 44 обнаружения к поперечному распределительному каналу.
На фиг. 3D и 3Е набор реакционных каналов содержит единственный канал, имеющий последовательность удлиненных продольных секций и коротких соединительных поперечных секций, образуя тем самым извивающийся путь.
На фиг. 3G набор каналов содержит последовательность овальных секций для регулировки скорости потока раствора пробы.
На фиг. 3F набор каналов имеет последовательность продольных секций и соединительных поперечных секций, образуя тем самым извивающийся путь, при этом в середине канала сформирована увеличенная камера.
Как показано на фиг. 2А, реакционная камера 40 и камера 44 обнаружения имеют по существу прямоугольную конфигурацию. Альтернативно, как показано на фиг. 3G, эти камеры могут быть сформированы как последовательность круглых областей увеличивающегося диаметра. Воздух выходит из камер и каналов в слое 14 фоторезиста через участки воздушных вентиляционных отверстий, соединенные с камерой 44 обнаружения и/или набором абсорбирующих каналов 46. Открытые концы одного или более абсорбирующих каналов 46 могу формировать или содержать участки воздушных вентиляционных отверстий.
Микрофлюидное устройство 10 будет в типичном случае устанавливаться в корпус, например, выполненный из пластика, для формирования тем самым полного жесткого комплекта для экспресс-анализа. Как минимум, корпус должен обеспечивать возможность ввода анализируемой текучей среды во впускную камеру 36 и, предпочтительно, визуализации камеры 44 обнаружения (чтобы убедиться, что по меньшей мере часть анализируемой текучей среды достигла камеры 44 обнаружения). Такой корпус может принимать разные формы.
Один такой корпус показан на фиг. 4-6, где микрофлюидное устройство 10 помещено в корпус 50, который имеет верхнюю часть 52 корпуса и нижнюю часть 54 корпуса. Нижняя часть 54 корпуса содержит плоское основание 56, периферийную стенку 58, отходящую вверх от основания 56 и образующую углубление 60, и позиционирующие гребни 62, выполненные на внутренней поверхности основания 56 и разнесенные друг от друга для размещения между ними несущей подложки 20. Нижняя часть 54 корпуса также содержит сопрягаемую структуру 64, которая позволяет ей зацепляться с ответной сопрягаемой структурой на верхней части 52 корпуса, например, отверстиями в верхней части 52 корпуса.
В нижней части 54 корпуса также сформирована пара отверстий (не показаны) в основании 56, сквозь которые соединительные штыри 28 выходят наружу из корпуса 50 для создания электрического соединения с электрическими контактами на считывающем блоке 24 (показан на фиг. 7). Вместо Г-образных штырей 28 штыри 28 могут быть выполнены без перпендикулярного изгиба и поэтому будут отходить прямо от микрофлюидного устройства 10, и в этом случае отверстия для прохода этих штырей наружу из корпуса 50 будут выполнены в одной из нижней и верхней частей 52, 54 корпуса или в них обеих. Специалистам в данной области техники будет понятно, что в комплекте 24 в изобретении можно использовать альтернативные электрические контакты на считывающем блоке 24, не выходя за пределы объема и сущности изобретения.
Перед соединением зацеплением верхней и нижней частей 52, 54 корпуса вместе с получением корпуса 50 поверх впускной камеры 36 устанавливают фильтр 66 для фильтрования анализируемой текучей среды (см. фиг. 5). Фильтр 66 (и фильтры 266, 366) выполнены с возможностью удаления любых частиц, которые могут помешать генерированию сигнала связывания или заблокировать микрофлюидные каналы в слое 14 фоторезиста.
Верхняя часть 52 корпуса содержит по существу плоское основание 68, имеющее лунку 70 для пробы, совмещенную с отверстием 48 в покровном слое 16 и, следовательно, с впускной камерой 36. Основание 68 может содержать окно 74 камеры обнаружения, которое размещено совмещенным с камерой 44 обнаружения. Основание 68 может дополнительно содержать окно 72 реакционной камеры, которое размещено совмещенным с реакционной камерой 40. Чтобы через окна 72, 74 можно было наблюдать реакционную камеру 40 и камеру 44 обнаружения, покровный слой 16 может быть выполнен из прозрачного материала. В некоторых предпочтительных аспектах изобретения целесообразны прозрачный покров 16 и окна 74 камеры обнаружения при использования флуоресцентного или оптического способа обнаружения. Через окно 72 реакционной камеры можно следить за смачиванием сухого реагента, а через окно 74 камеры обнаружения можно выполнять визуальное наблюдение за камерой 44 обнаружения.
В тех вариантах воплощения, где имеется более чем одна камера обнаружения, например на фиг. 2С, где предусмотрены три камеры 344 обнаружения, основание 68 предпочтительно содержит окно камеры обнаружения для каждой камеры 344 обнаружения, как показано на фиг. 2С.
Далее будет описано применение комплекта 26 в качестве теста на аналит, имеющий один или более эпитоп, с которым могут связываться связывающие вещества, причем вещество, связывающееся с первым эпитопом, не препятствует веществу, связывающемуся со вторым эпитопом. Пробу подвергаемой тесту жидкости отбирают и помещают в лунку 70 для пробы на фильтр 66 так, что она протекает через фильтр 66 во впускную камеру 36. Жидкая проба втягивается из впускной камеры 36 через задерживающий канал 38 в реакционную камеру 40 и взаимодействует в этой реакционной камере 40 с первым связывающим аналит веществом. Это первое связывающее вещество помещено в или на реакционную камеру 40. По мере того как жидкая проба смачивает смесь реагентов в реакционной камере, аналит вступает в реакцию с первым связывающим аналит веществом, образуя первый комплекс аналит-связывающее вещество, причем это первое связывающее аналит вещество связывается с первым эпитопом этого аналита. Из реакционной камеры 40 жидкая проба затем течет в смешивающий канал 42, в котором любой непрореагировавший аналит приводится в контакт с первым связывающим аналит веществом. После выхода из смешивающего канала 42 жидкая проба попадает в камеру 44 обнаружения. Второе связывающее аналит вещество на рабочем участке рабочего электрода в камере 44 обнаружения связывается со вторым эпитопом аналита, тем самым захватывая комплекс из первого связывающего аналит вещества и аналита.
По мере продолжения течения жидкой пробы она выходит из камеры 44 обнаружения и попадает в набор абсорбирующих каналов 46. Несвязанные белок, комплексы, реагенты и другие компоненты жидкой пробы протекают через камеру 44 обнаружения в набор абсорбирующих каналов 46. Когда набор абсорбирующих каналов 46 заполнен, поток жидкой пробы останавливается.
Связывание комплекса из первого связывающего аналит вещества и аналита со вторым связывающим аналит веществом приводит к захвату этого комплекса. Связывание этого комплекса со вторым связывающим аналит веществом изменяет электрические емкость, импеданс, сопротивление или ток электрода 30 и (изменение электрического состояния). Величина изменения электрического состояния на электроде связана со степенью связывания и, следовательно, связана с количеством аналита, присутствующего в жидкой пробе. Поскольку электроды 30 и 33 находятся в электрическом контакте с площадками 32, которые, в свою очередь, находятся в электрическом контакте с соединительными штырями 28, разницу в величине изменения электрического состояния между рабочим электродом и электродом сравнения можно измерить, подключив прибор, измеряющий емкость, импеданс, или ток (амперметр), к соединительным штырям 28. Такое считывающее устройство электрического обнаружения расположено в считывающем блоке 24, которое содержит пару электрических контактов для электрического соединения с соединительными штырями 28 и электрическую соединительную структуру для соединения этих контактов со считывающим устройством обнаружения. Специалистам в этой области техники будет понятно, что комплект 26 может содержать поверочный электрод.
Более конкретным применением комплекта 26 будет являться предлагаемое устройство иммуноэлектрохимического анализа, иллюстрирующее механизм работы одноступенчатого устройства иммуноанализа для теста на острый инфаркт миокарда.
Боли в груди могут возникать по самым разным причинам, например, из-за проблем с сердечной мышцей. Когда в кровеносном сосуде сердца образуется небольшой тромб, может возникнуть боль в груди. Если тромб растворяется, боль проходит. Если тромб сохраняется, кровеносный сосуд может оказаться заблокированным и часть сердечной мышцы может перестать получать кислород и питательные вещества. Умирающие клетки сердечной мышцы выделяют тропонин I, поэтому повышенные уровни тропонина I часто указывают на проблемы с сердечной мышцей. Поэтому проверка уровня тропонина I у пациента, жалующегося на боль в груди, может помочь в диагностике этой проблемы. Микрофлюидное устройство по изобретению может быть использовано для построения тестового комплекта на тропонин I.
В случае такого тестового комплекта, в котором аналитом выбран тропонин I, в реакционную камеру 40 осаждают помеченное индикаторными молекулами высушенное антитело антитропонин I, смешанное с детергентами (0,01% tween 20), буферным реагентом (10 мМ фосфата натрия с рН 7,2) и стабилизатором (0,5% трегалозы, 0,5% БСА и 0,5% ПЭГ). В камере 44 обнаружения второе антитело антитропонин I иммобилизовано на поверхности электрода ковалентной или нековалентной связью и будет связываться с иным эпитопом тропонина I. Второе антитело антитропонин I разбавлено до концентрации 30 мкг/мл - 3 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, содержащем 0,5% БСА. Этот раствор второго антитела анти-тропонина I накрапан на поверхность электрода в количестве 50-100 мкл на 1 см2 и высушен при 25°С и относительной влажности 40% в течение 1 часа.
Во время применения, когда в лунку 70 для пробы помещают приблизительно 5-10 микролитров текучих сред пробы цельной крови, содержащей тропонин I, текучие среды плазмы пробы проходят через фильтр 66 разделения крови во впускную камеру 36 и протекают по задерживающему каналу 38 в реакционную камеру 40. По мере того как плазма смачивает высушенные реагенты в реакционной камере 40, антитело тропонина I и тропонин I образуют комплекс антиген-антитело и текут в смешивающий канал 42. Любые несвязанные антитела связываются с молекулами тропонина I с помощью эффекта перемешивания в смешивающем канале 42. В камере 44 обнаружения на поверхности электрода иммобилизовано второе антитело тропонина I, которое будет связывается с другим эпитопом тропонина I. Когда текучая среда проходит в камеру 44 обнаружения, комплексы антиген-антитело связываются с находящимся в ней вторым антителом. Несвязанные комплексы и другие вещества вымываются непрерывным потоком текучей среды пробы. Текучая среда пробы попадает в набор абсорбирующих каналов 46 до тех пор, пока этот набор абсорбирующих каналов 46 не будет заполнен плазмой. Затем поток текучей среды пробы останавливается и в камере 44 обнаружения иммунохимическая реакция стабилизируется.
Количество захваченных на поверхности электрода комплексов антиген-антитело связано с изменением электрических емкости или напряжения рабочего электрода 30. Когда комплекс антиген-антитело захвачен, он вызывает небольшое изменение электрической емкости электрода 30. Это изменение электрической емкости может быть измерено измерителем емкости (фарадметром), когда комплект 26 для экспресс-анализа вставлен в считывающий блок 24. Считывающий блок 24 предназначен для преобразования изменения электрического состояния в показания, указывающие на наличие некоторого количества антигенов тропонина I.
Вышеприведенное является лишь одним пример применения комплекта 26, содержащего микрофлюидное устройство 10 по изобретению. Другие способы обнаружения, которые могут быть реализованы с использованием комплекта 26 с микрофлюидным устройством 10, включают в себя анализы, построенные на флуоресценции, оптическом окрашивании, амперометрии, импедансометрии/потенциометрии и на подсчете частиц.
Для обнаружения флюоресценции реагенты, осажденные в реакционной камере 40, являются связывающими веществами, т.е. антителами или антигенами, соединенными с флуоресцентным пигментом или частицами, такими как quantum или европий. Связывающие вещества, иммобилизованные в камере 44 обнаружения, являются захваченными антителами или антигенами. Для оптического окрашивания реагенты, осажденные в реакционной камере 40, являются антителами или антигенами, соединенными с ферментами окисления или восстановления. Для амперометрического обнаружения реагенты, осажденные в реакционной камере 40, являются антителами или антигенами, соединенными с ферментом пероксидазой хрена и глюкозой в качестве субстрата. Материалы, иммобилизованные в камере 44 обнаружения, являются захваченными антителами или антигенами и глюкозооксидазой на электроде 30. В реакционной камере 40 могут быть осаждены антитела или антигены, соединенные с ферментом щелочной фосфатазой (APase). Предусмотрены и другие варианты вышеизложенного, которые хорошо понятны специалистам в данной области техники.
В случае применений импедансметра/потенциометра в реакционной камере 40 осажденных реагентов нет. Связывающие материалы, иммобилизованные на электроде 30, являются захваченными антителами или антигенами. В этом случае задерживающий канал 38 и реакционная камера 40 могут быть исключены. Специалистам в данной области будет понятно, что связывающие вещества в реакционной камере 40 и в камере 44 обнаружения могут представлять собой одно или более биогенных или иммунореактивных веществ, способных образовывать комплекс, такой как антитело-антиген, антитело-гаптен, фермент-субстрат, репортер-гормон, нуклеотид-нуклеотид.
Когда микрофлюидные устройства 10 по изобретению применяют для способов с оптическим окрашиванием или амперометрическим обнаружением, перекись водорода активного субстрата для фермента пероксидазы хрена генерируется глюкозооксидазой, совместно иммобилизованной на проводящей поверхности электрода 30 с захватывающим антителом. Глюкозу и конъюгированное с пероксидазой хрена антитело помещают в сухой форме в некотором месте перед реакционной камерой 40, где происходит реакция связывания. Растворы пробы будут растворять высушенные реагенты и перемещать их в реакционную камеру 40. Для увеличения чувствительности связывания на электроде вместо захваченного антитела можно иммобилизовать стрептавидин или авидин. В этом случае в реакционную камеру 40 помещают конъюгированное с пероксидазой хрена антитело и второе захваченное антитело, соединенное с биотином.
Описанные выше способы обнаружения являются просто иллюстративными способами обнаружения и их упоминание не ограничивает объем изобретения, а просто предоставляют примеры предпочтительных в настоящее время вариантов воплощения изобретения.
Как показано на фиг. 7, считывающий блок 24 предназначен для считывания электрического сигнала, когда комплект 26 для анализа вставлен в прорезь в нем. Считывающий блок 24 содержит корпус 76, образующий прорезь, дисплей 78, кнопку 80 и процессор или микроконтроллер, расположенный в корпусе 76. Считывающий блок 24 также содержит электрические контакты, выполненные с возможностью входить в зацепление со штырями 28 и соединяться с микроконтроллером для обеспечения создания цепи, включающей в себя электроды 30 и 33. После установки комплекта 26 для анализа в прорезь, образованную корпусом 76, нажимают кнопку 80, чтобы дать команду микроконтроллеру сформировать цепь, включающую в себя электроды 30 и 33, и обнаружить изменение электрического состояния. Изменение электрического состояния коррелируют (т.е. устанавливают его соотношение) с результатом анализа, который отображается на дисплее 78. Более конкретно, микроконтроллер в считывающем блоке 24 создает цифровой сигнал, когда комплект 26 приводится пользователем в контакт с контактами считывающего блока 24 и нажимается кнопка 80. Считывающий блок 24 может быть откалиброван на получение отображаемых результатов, имеющих смысл для пользователей этой системы.
В зависимости от веществ, если таковые имеются, размещенных в реакционной камере 40, если она имеется, и камере 44 обнаружения, и от конструкции считывающего блока 24, микрофлюидные устройства 10 в комплектах 26 по изобретению могут быть использованы в следующих типах анализов.
1. Анализы на злоупотребление наркотиками или лекарственными средствами, где аналитами являются героин, морфин, кокаин, ЛСД, амфетамины, фенилциклидин (РСР), тетрагидроканнабидинол (ТНС), барбитураты и другие седативные средства, наркотики и галлюциногены.
2. Анализы инфекционных заболеваний, таких как стрептококк А, ВИЧ, вирусы гепатита А, В и С, инфекции Helicobacter pylori, мононуклеоз, хламидиоз, гонорея и другие заболевания, передаваемые половым путем.
3. Клиническая апробация лекарственного средства.
4. Анализы, связанные с репродуктивной функцией, включая хорионический гонадотропин человека (hCG), фолликулостимулирующий гормон (FSH), лютеинизирующий гормон (LH).
5. Анализы на диабет, например мониторинг уровня глюкозы, уровней гликозилированного гемоглобина (Hb1Ac) в крови.
6. Сердечные маркеры, такие как миокардиальный изофермент креатинкиназа (CK МВ), тропонин, миоглобин, мозговой натрийуретический пептид (BNP), про-BNP, hCRP, D-димер, гомоцистеин.
7. Мониторинг холестерина, например альфа-липопротеины высокой плотности (HDL), липопротеины низкой плотности (LDL) и аполипопротеины (ApoLP).
8. Анализ коагуляции крови.
9. Маркеры рака, такие как карциноэмбриональный антиген (СЕА), альфа-фетопротеин (AFP), простат-специфический антиген (PSA), Bladder Ca (BTag).
10. Мониторинг остеопороза, такой как проверка резорбции костей.
11. Психические расстройства, такие как тест на болезнь Альцгеймера, обнаруживающий изопростан и белок мозговой ткани (тау-протеин).
12. ДНК-диагностика для генетических исследований с использованием микрочипа и PCR-приборов.
13. Аллергологические тесты.
14. Анализ мочи.
15. Газ/электролит в крови.
16. Ветеринарные исследования.
Микрофлюидное устройство 10 может быть изготовлено самыми разными путями. Один неограничивающий способ изготовления состоит в том, что сначала выбирают опору 22, например пленку ПЭТ, затем на этой пленке ПЭТ печатают электроды 30, 33, покрывают пленку ПЭТ с напечатанными электродами пленкой полиимидного фоторезиста, такой как DuPont RISTON®, используемой для формирования слоя 14 фоторезиста, затем покрывают пленку фоторезиста защитным покрытием с фотомаской, которая имеет контуры рисунка каналов и камер, полимеризуют материал фоторезиста посредством экспонирования УФ-излучением, снимают защитное покрытие, вымывают неэкспонированный, маскированный фоторезист щелочным раствором, наносят любые необходимые реагенты и закрывают слой 14 фоторезиста покровным слоем 16. Покров 16 является неэлектропроводной полимерной пленкой. В качестве покровного слоя 16 можно использовать клейкую пленку, закрепляющую слой 14 фоторезиста.
Покровный слой 16 может быть второй пленкой фоторезиста со снятым его защитным покрытием, которую помещают в непосредственном контакте с первым слоем фоторезиста. Второй слой фоторезиста связывают с первым слоем фоторезиста, например, при подводе теплоты. Во время процесса ламинирования можно использовать температуры в пределах диапазона от примерно 45°С до примерно 110°С, предпочтительно примерно 90°С. Время воздействия теплоты может меняться в зависимости от размеров прижимных нагревающих валков в пределах диапазона от примерно 5 секунд до примерно 500 секунд, предпочтительно менее примерно 30 секунд, наиболее предпочтительно - всего лишь примерно 7 секунд. После связывания слоев фоторезиста всю сборку экспонируют дополнительным УФ-излучением для обеспечения полной полимеризации полиимидных полимеров фоторезиста. Процесс ламинирования при изготовлении микрофлюидных устройств 10 хорошо известен в данной области техники.
После этого к опоре 22 прикрепляют остальные детали микрофлюидного устройства 10. Затем микрофлюидное устройство 10 может быть вставлено в корпус 50 с формированием комплекта 26 для экспресс-анализа.
Обращаясь теперь к фиг. 8-14, на фиг. 8 и 9 показана альтернативная иллюстративная конструкция электрохимического сенсорного устройства 100 по изобретению, которая позволяет проводить амперометрическое или потенциометрическое электрохимическое обнаружение. Электрохимический сенсор 100 предназначен обнаруживать продукт, полученный в результате химической или ферментной реакции аналита. Электрохимическое сенсорное устройство 100 не требует, чтобы аналит был отделен от других несвязанных лигандов промывкой. Устройство выполняет анализ химической или ферментной реакции без сепарации.
Электрохимическое сенсорное устройство 100 содержит нижний опорный слой 102, на котором расположены электрод 104 сравнения и рабочий электрод 106, промежуточный слой 108 фоторезиста, образующий впускной канал 110 и камеру обнаружения, совмещенную с электродом 104 сравнения и рабочим электродом 106, и покровный слой 112, образующий воздушное вентиляционное отверстие 114.
Впускной канал 110 соединен с камерой обнаружения, совмещенной над рабочим электродом 106 и электродом 104 сравнения так, что продукт, образовавшийся при химической или ферментной реакции аналита, если он присутствует в камере обнаружения, влияет на передачу тока электродами 104, 106.
Электрод 104 сравнения и рабочий электрод 106 могут быть изготовлены из электропроводного металла и/или углерода и соединены с заранее напечатанными схемами 116, 118 из ITO, углерода или электропроводного металла, которые зацепляются соединительными штырями считывающего блока 24 (не показано). Обычно электрод 104 сравнения содержит Ag/AgCl, а рабочий электрод 106 содержит золото, ITO или углерод. Для того чтобы часть металлических схем 116, 118 была обнажена с тем, чтобы обеспечить возможность контакта с соединительными штырями считывающего блока 24, длина промежуточного слоя 108 фоторезиста и покровного слоя 112 несколько меньше, чем длина нижнего опорного слоя 102.
На фиг. 10-13 показан один способ изготовления описанного выше электрохимического сенсорного устройства 100, который может также использоваться для изготовления микрофлюидного устройства 10. Различные этапы производственного процесса включают в себя трафаретную печать, напыление для осаждения электрического сенсора, фотолитографию и химическое травление и ламинирование прессованием при нагревании для микрофлюидного производства. Первый этап - это печать или напыление электрода 104 сравнения и/или рабочего электрода 106 на опорном слое 102.
На фиг. 10 показан пример способа печати электрода с помощью трафарета с маской электрода. Пасту или электропроводный материал 120 в жидком состоянии, например золото, серебро, углерод и т.п., наносят на трафарет 122. Трафарет 122 тоньше, чем пленка 108 фоторезиста. Толщина трафарета 122 составляет менее 50 мкм, предпочтительно от примерно 5 мкм до примерно 20 мкм, более предпочтительно - от примерно 8 мкм до примерно 20 мкм.
После печати электрода(ов) пластинку пленки ПЭТ с напечатанным золотым электродом погружают в модифицированный раствор «Пиранья» на 10-15 мин и промывают очищенной водой. Поскольку оригинальный раствор «Пиранья» является сильным окислителем и может вызвать эрозию полимерной пленки, применяют модифицированный раствор «Пиранья». Модифицированный раствор «Пиранья» содержит 1N серную кислоту и 20%-ную перекись водорода в соотношении 1:1. В этаноле готовят раствор образующих самособранный монослой (ССМ) молекул в концентрации примерно от 1 мМ до 20 мМ. Пластинку пленки ПЭТ с напечатанным золотым электродом погружают в этот раствор на период времени, который меняется в зависимости от концентрации образующих ССМ молекул и от размера поверхности обработки. Когда используется 2 мМ раствор N-сукцинимидила гександисульфида, этот период составляет от приблизительно 45 мин до 2 часов. После обработки покрытую ССМ пластинку промывают этанолом и затем водой и, если необходимо, сушат в среде азота.
На фиг. 10 и 11 после печати электрода(ов) и металлических схем 104, 106, 116, 118 на нижнем опорном слое 102 для покрытия опорного слоя 102 с электродом(ами) и схемами 104, 106, 116, 118 используют пленку 108 сухого фоторезиста и ламинируют прижимными нагревающими валками 126 (см. фиг. 11). Способы печати электродов и схем хорошо известны в данной области техники, например, с помощью трафаретной печати. Температуры ламинирования зависят от разных факторов, например характера пленочных материалов, и составляют в диапазоне от примерно 45°С до примерно 110°С.
Как показано на фиг. 12, перед полимеризацией пленки 108 фоторезиста в контакт с ламинированной сборкой пленки 108 фоторезиста и нижнего опорного слоя 102 приводят пленку 128 фотомаски с рисунком микрофлюидных каналов (зачерненная часть). Фотомаску 128 следует расположить над электродом(ами) и схемами 104, 106, 116, 118, закрывая их часть. Пленку 108 сухого фоторезиста, заламинированную на опорном слое 102, полимеризуют облучением УФ-излучением. Полимеризация пленки 108 фоторезиста инициируется при экспонировании УФ-излучением в течение от примерно 5 секунд до примерно 120 секунд, например, источником УФ-излучения мощностью 1 кВт. Время и интенсивность излучения зависят от разных факторов, таких как толщина матрицы, геометрия каналов, подлежащих формированию в слое 108 фоторезиста, и источника УФ-излучения. Длительность экспонирования предпочтительно составляет от примерно 20 секунд до примерно 80 при использовании источника УФ-излучения мощностью 1 кВт. Полимеризованный участок, экспонированный УФ-излучением, образует стенки канала или каналов и камер в пленке 108 фоторезиста. Участок 130, покрытый фотомаской 128 и не экспонированный УФ-излучением, остается мягким и лабильным.
Как показано на фиг. 13, следующим этапом является приведение пленки 108 фоторезиста в контакт со щелочным раствором (например, 0,1 М буфер карбоната натрия, рН 9,2) для вымывания нестабильного неэкспонированного участка 130 пленки 108 фоторезиста и формирования тем самым полости или ячейки 132 в ламинированной сборке. Затем полученную в результате сборку закрывают покровным слоем 112. При изготовлении электрохимического сенсорного устройства 100 формируют стыковую(ые) область(и) 131, а именно стенки канала(ов), между закрытым(и) и обнаженным(и) электродом(ами) и схемами 104, 106, 116, 118. Затем полученную сборку закрывают покровным слоем 112. В качестве покровного слоя 112 может использоваться полимеризованный влажный слой фоторезиста, который герметично закрывает стыковые области и предотвращает проникновение жидкости пробы, когда она присутствует во впускной камере 110 и в камере обнаружения, в зазоры стыковой области. Теперь электрохимическое сенсорное устройство 100 закончено и имеет конструкцию, показанную на фиг. 9.
Длина слоя фоторезиста и покровного слоя 108, 112 меньше, чем у нижнего опорного слоя 102, и поэтому часть каждого из электродов 104, 106 обнажена, что позволяет им войти в контакт с соединительными штырями.
Для изготовления электрохимического сенсорного устройства 100 на поверхность электрода 104, 106, совмещенного с камерой обнаружения, перед закрыванием впускного канала 110 верхним покровным слоем 112 необходимо нанести фермент или связывающее вещество. Для нанесения фермента и/или связывающего вещества на электрод можно использовать ковалентное или нековалентное связывание. Нековалентное связывание заключается в нанесении антитела или фермента на электрод. Этот этап заключается в накрапывании нанолитровых или микролитровых объемов раствора молекул непосредственно на электроды 104, 106. Между молекулами белков и электродами 104, 106 возникают гидрофобные и электростатические взаимодействия. Сила этих взаимодействий достаточна для удержания молекул от вымывания потоком в камере обнаружения. Для увеличения эффективности и силы связывания электроды 104, 106 могут быть предпочтительно покрыты материалами самособранного монослоя, такими как полипиррол, NAFION® или алкоксисилан. Молекулы белка могут быть ковалентно связаны с электродами через функциональные группы путем химической или фотоактивации.
На фиг. 14 представлен график, показывающий времена облучения УФ-излучением, использованные для изготовления каналов шириной примерно 500 мкм и глубиной примерно 50 мкм. Более конкретно, эти данные получены при изготовлении микрофлюидного устройства, в котором пленка фоторезиста с толщиной 50 мкм была заламинирована на пленку ПЭТ с толщиной 100 мкм. Эта сборка была затем накрыта фотомаской, содержащей каналы с шириной примерно 500 мкм, и экспонирована УФ-излучением в течение от примерно 20 до примерно 55 секунд. В назначенное время образцы извлекали и промывали карбонатным буфером. Затем измеряли результаты изготовления каналов. Степень полимеризации измерялась по поглощению пленкой синего света с использованием спектрофотометра на примерно 600 нм, а ширина каналов измерялась калибрами. Поглощение света полимеризованной пленкой на примерно 600 нм увеличивалось, а ширина канала немного уменьшалась с увеличением времени экспонирования. Цвет полимеризованных пленок фоторезиста менялся со светло-синего на темно-синий в соответствии с уровнем полимеризации.
Скорость потока является одним из важнейших параметров, которые определяют разрешающую способность сепарации аналита в хроматографических исследованиях. В отличие от анализов на основе мембраны в микрофлюидных канальных системах скоростью потока и капиллярным усилием можно управлять. Комбинации различных значений ширины и длины камер и каналов, как показано на фиг. 3А-3F, позволяют изготовить устройства различных типов. Когда используется канал с увеличенной площадью поперечного сечения, через него проходит больший поток, чем через канал с меньшей площадью поперечного сечения. Поэтому шириной и глубиной каналов в слое 14 фоторезиста, т.е. задерживающего канала 38 и смешивающего канала 42, можно управлять с тем, чтобы обеспечить адекватный поток через них в реакционную камеру 40 и камеру 44 обнаружения соответственно. При изготовлении микрофлюидных устройств для иммунохроматографических анализов скорость потока пробы должна быть постоянной и достаточно медленной, чтобы связывающие вещества могли вступить в реакцию.
На фиг. 15 и 16 приведены результаты испытаний пятнадцати микрофлюидных устройств. На впуск пробы подавали 10 мкл цветных чернил, а затем измеряли время прибытия в каждую из назначенных точек Р1-Р3. Измеренные времена представлены на радиальной диаграмме. Времена прибытия были пропорциональны длине канала. На фиг. 16 показано, что микрофлюидные устройства обеспечивают постоянную скорость потока и длину миграции среди 15 испытанных устройств.
Возможность точно задать глубину и ширину каналов в слое фоторезиста позволяет таким образом использовать микрофлюидные устройства по изобретению для количественных анализов, а также для качественных анализов, поскольку их можно проектировать для обеспечения постоянной скорости потока и продолжительности миграции во времени.
Когда электрохимическое сенсорное устройство 100 по изобретению используется для обнаружения небольших молекул, таких как кислород, мочевина, наркотики и глюкоза, электрохимическое сенсорное устройство 100 может не требовать этапа сепарации (который необходим в микрофлюидном устройстве 10). Поэтому обнаруживающий сенсор очень прост и легок в использовании. В электрохимическом сенсорном устройстве 100 можно использовать фермент окисления или восстановления. Одним предпочтительным примером электрохимического сенсора 100 является глюкометр. Текучую среду пробы, содержащей подлежащую анализу глюкозу, помещают на впуск 110 пробы, и она течет в область обнаружения, где глюкоза в текучей среде пробы контактирует с глюкозооксидазой (GOD), иммобилизованной в камере обнаружения. Глюкозооксидаза генерирует перекись водорода пропорционально уровню глюкозы в текучей среде пробы. Полученная перекись водорода влияет на ток, и изменение тока передается на считывающий блок 24 по электродам 104, 106.
Реферат
Группа изобретений предназначена для применения в биологических исследованиях. Микрофлюидные устройства содержат слой фоторезиста, в котором находятся сообщающиеся друг с другом впускная камера, необязательная реакционная камера и по меньшей мере одна камера обнаружения, расположенную под слоем фоторезиста опору и расположенный над слоем фоторезиста покров. Устройства дополнительно содержат набор абсорбирующих каналов ниже по потоку относительно последней камеры обнаружения. В реакционную камеру и камеру(ы) обнаружения помещены биогенные или иммунореактивные вещества. Когда жидкая проба вводится по капле во впускную камеру, жидкость пробы протягивается через эти устройства за счет капиллярного действия. Способы обнаружения включают электрохимическое обнаружение, колориметрическое обнаружение и флуоресцентное обнаружение. Данная группа изобретений повышает точность исследований. 8 н. и 21 з.п.ф-лы., 16 ил.
