Белки rsv в предшествующей слиянию конформации и их применение - RU2761631C2

Чертежи

Показать все 97 чертежа(ей)

Описание

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА

По настоящей заявке испрашивается приоритет по временной заявке США № 61/780910, поданной 13 марта 2013 года, № 61/798389, поданной 15 марта 2013 года, № 61/857613, поданной 23 июля 2013 года, и № 61/863909, поданной 9 августа 2013 года, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к полипептидам, полинуклеотидам, композициям и способам их применения для индукции и обнаружения иммунного ответа на респираторно-синцитиальный вирус (RSV).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) представляет собой оболочечный несегментированный РНК-вирус с отрицательной цепью семейства Paramyxoviridae рода Pneumovirus. Он является наиболее распространенной причиной бронхиолита и пневмонии среди детей на первом году жизни. RSV также вызывает повторяющиеся инфекции, включающие тяжелое заболевание нижних дыхательных путей, которое может возникать в любом возрасте, особенно среди пожилых индивидуумов или среди индивидуумов с нарушениями сердечной, легочной или иммунной системы. Для предупреждения тяжелого заболевания, вызываемого инфекцией RSV, в настоящее время используют пассивную иммунизацию, особенно у недоношенных младенцев, у младенцев с бронхолегочной дисплазией или с врожденным заболеванием сердца. Современные способы лечения включают введение RSV-нейтрализующего антитела паливизумаба (SYNAGIS®; MedImmune, Inc.), которое связывает линейный, конформационный эпитоп из 24-аминокислот на белке слияния (F) RSV.

В природе белок F RSV первоначально экспрессируется в качестве единого полипептидного предшественника, обозначаемого как F₀. F₀ тримеризуется в эндоплазматической сети и процессируется клеточной фурин-подобной протеазой в двух консервативных участках с образованием полипептидов F₁, F₂ и Pep27. Полипептид Pep27 вырезается и не составляет часть зрелого белка F. Полипептид F₂ происходит из N-концевой части предшественника F₀, и он связан с полипептидом F₁ через две дисульфидных связи. Полипептид F₁ происходит из C-концевой части предшественника F₀, и он заякоривает зрелый белок F на мембране через трансмембранный домен, который связан с цитоплазматической хвостовой частью из ~24 аминокислот. Три протомера гетеродимера F₂-F₁ собираются с образованием зрелого белка F, который принимает метастабильную предшествующую слиянию конформацию, в которой запускается конформационное изменение, которое обеспечивает слияние мембран вируса и клетки-мишени. Вследствие его неотъемлемой роли в проникновении RSV, белок F RSV является мишенью нейтрализующих антител и объектом для разработки вакцины; однако, подобно другим антигенам RSV, предшествующие попытки разработать вакцину на основе белка F RSV оказались неуспешными.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано в настоящем описании была установлена трехмерная структура белка F RSV в его предшествующем слиянию состоянии. В настоящем описании впервые описаны детали на атомном уровне предшествующей слиянию конформации F RSV, которая представляет собой уникальный антигенный участок ("антигенный участок ∅") на его дистальной относительно мембраны вершине. С использованием трехмерной структуры F в предшествующей слиянию форме в качестве исходных данных, были смоделированы и сконструированы стабилизированные формы F в предшествующей слиянию форме (антигены "PreF"), и их использовали для индукции нейтрализующих иммунных ответов на RSV, в много раз превышающих иммунные ответы, достигаемые с использованием предшествующих иммуногенов на основе белка F RSV, и которые обеспечивают защиту против заражения RSV в моделях на животных. Антигены PreF можно использовать, например, как в качестве потенциальных вакцин от RSV, так и в качестве диагностических молекул.

Описаны выделенные рекомбинантные белки F RSV, которые являются стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, а также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные белки F RSV. В нескольких вариантах осуществления рекомбинантные белки F RSV являются стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, которая может специфически связываться с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, таким как антитело D25, 5C4, AM22 и/или MPE8. В нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV содержит антигенный участок ∅, содержащий остатки 62-69 и 196-209 последовательности белка F RSV, такой как SEQ ID NO: 370. В некоторых вариантах осуществления иммуноген может специфически связываться с антителом после инкубации иммуногена при 20°C в фосфатно-солевом буфере при физиологических значениях pH в течение по меньшей мере 24 часов в отсутствие антитела. В следующих вариантах осуществления иммуноген может образовывать гомогенную популяцию при растворении в водном растворе, где по меньшей мере 90% иммуногена в популяции могут специфически связываться с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления полипептиды F₂ и F₁ содержат положения 62-69 и 196-209 F RSV, соответственно, и полипептид F₂ содержит или состоит из 8-84 остатков в положениях F RSV 26-109, и полипептид F₁ содержит или состоит из 14-393 остатков в положениях F RSV 137-529, где положения F RSV соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанного в качестве SEQ ID NO: 124.

В нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает одну или несколько аминокислотных замен, которые стабилизируют белок в предшествующей слиянию конформации, например, которые стабилизируют дистальную относительно мембраны часть белка F (включая N-концевую область полипептида F1) в предшествующей слиянию конформации. Например, аминокислотная замена может вносить неприродную дисульфидную связь или может представлять собой заполняющую полость аминокислотную замену. В нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает замены S155C и S290C, которые образуют неприродную дисульфидную связь, которая стабилизирует белок в предшествующей слиянию конформации; то есть в конформации, которая специфически связывается с одним или несколькими антителами, специфичными к предшествующей слиянию конформации, и/или презентирует антигенный участок, такой как антигенный участок ∅, который присутствует в предшествующей слиянию конформации, но не образующейся после слияния конформации белка F RSV. В следующих вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV может дополнительно включать замену на F, L, W, Y, H или M в положении 190, в положении 207 или в положениях 190 и 207. В одном неограничивающем примере рекомбинантный белок F RSV включает замены S155C, S290C, S190F и V207L (обозначаемые в настоящем описании как "DSCav1").

В дополнительных вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV может включать одну или несколько модификаций C-конца полипептида F1 (таких как укорочения и аминокислотные замены), которые вместе с модификациями, которые стабилизируют дистальную относительно мембраны область полипептида F, могут усиливать стабилизацию рекомбинантного белка F в предшествующей слиянию конформации. Иллюстративные модификации включают связывание полипептида F₁ с доменом тримеризации (таким как домен Foldon) или внесение одного или нескольких остатков цистеина в C-концевую область полипептида F1 (например, в положениях 512 и 513), которая может образовывать дисульфидные связи между промоторами.

Антиген PreF может быть включен в белковую наночастицу или в вирусоподобную частицу. Также описаны молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антигены PreF. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой одноцепочечный белок F RSV.

Дополнительные варианты осуществления включают белок эпитоп-каркас, включающий положения 62-69 и 196-209 F RSV, или продукт их круговой перестановки, связанный с гетерологичным каркасным белком, где белок эпитоп-каркас специфически связывается с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации.

Также предусматриваются композиции, включающие антигены PreF, белковые наночастицы, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, пригодную для введения индивидууму, а также она может содержаться в единичной дозированной форме. Кроме того, композиции могут включать адъювант.

Описаны способы индукции иммунного ответа в качестве способов лечения, ингибирования или предупреждения инфекции RSV у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способов индивидууму, такому как человек или животное семейства бычьих, вводят эффективное количество описанного антигена и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей описанный антиген. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение иммуногенной композиции, включающей адъювант, выбранный для индукции иммунного ответа у индивидуума, смещенного в сторону Th1. В дополнительных вариантах осуществления способы включают иммунизацию по типу первичной иммунизации-усиливающей иммунизации с использованием белков F RSV подтипа A человека и подтипа B человека, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, с модификациями, описанными в настоящем описании. Описаны способы обнаружения или выделения связывающего RSV антитела у индивидуума, инфицированного RSV. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные белки F RSV можно использовать для обнаружения и количественного определения антител-мишеней при поликлональном сывороточном ответе.

Представленные выше и другие объекты, признаки и преимущества и вариантов осуществления станут более понятными из представленного ниже подробного описания, которое предоставлено с отсылкой на прилагаемые чертежи.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A-1C представлен набор графиков и диаграмма, иллюстрирующие нейтрализацию RSV, распознавание гликопротеина F и кристаллическую структуру антитела человека D25 в комплексе с тримером F RSV в предшествующей слиянию конформации. Предшествующая слиянию конформация F RSV является метастабильной и, когда она экспрессируется в растворимой форме, она легко принимает состояние образующейся после слияния формы; ряд мощных антител, включая D25, связываются с вновь обнаруженным антигенным участком в верхней части гликопротеина F в предшествующей слиянию конформации. (A) Нейтрализация RSV посредством антител, включая паливизумаб, который представляет собой одобренное FDA профилактическое антитело для предупреждения тяжелого заболевания RSV. (B) Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), измеряющий связывание антитела с гликопротеином F в образующейся после слиянию форме. (C) Структура D25-тример F RSV в ленточном представлении и в представлении молекулярной поверхности. Один протомер тримера гликопротеина F показан в ленточном представлении. Молекулярные поверхности показаны для двух других протомеров F. Fab D25, связанный с протомером F, показанным в ленточном представлении, также показан в ленточном представлении, причем тяжелая цепь выделена темно-серым цветом и легкая цепь выделена светло-серым цветом. Другие Fab D25 выделены таким же цветом, но показаны в поверхностном представлении.

На фиг.2A и 2B представлен набор диаграмм и последовательность, выровненная с вторичной структурой RSV, иллюстрирующие структурную перестройку F RSV. Для опосредования вхождения вируса в клетку гликопротеин F RSV переходит из метастабильной предшествующей слиянию конформации в стабильную образующуюся после слияния конформацию. (A) Предшествующие слиянию и образующиеся после слияния структуры. На наружных изображениях представлены тримерные структуры, предшествующие слиянию (слева) и образующиеся после слияния (справа), выделенные так же, как и на фиг.1C. Комплексный гликан, показанный в качестве стержней, смоделирован в каждом из трех участков N-связанного гликозилирования, встречающихся в зрелом белке. На внутренних изображениях показан один промотор F RSV в ленточном представлении. (B) Последовательность F RSV и вторичная структура. Участки N-связанного гликозилирования выделены черными треугольниками, антигенные участки обозначены и направленная вниз стрелка указывает на положение участков расщепления фурина. Вторичные структуры представлены ниже последовательности (SEQ ID NO: 370), причем цилиндры соответствуют α-спиралям и стрелки соответствуют β-цепям. Остатки с нарушенным порядком или отсутствующие остатки указаны как "X"; остатки, которые смещаются более чем на 5 Å между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями, представлены с помощью серой тени и заключены в рамки.

На фиг.3A-3C представлен набор диаграмм и выравнивание последовательностей, иллюстрирующие поверхность контакта F RSV с D25. Антитело D25 связывает четвертичный эпитоп, охватывающий два протомера на вершине тримера F в предшествующей слиянию конформации. (A) Увеличение масштаба поверхности контакта между D25 и F RSV. Боковые цепи остатков F, взаимодействующие с D25, обозначены и показаны в виде стержней. Атомы кислорода выделены светло-серым цветом и атомы азота выделены темно-серым цветом. Водородные связи представлены в качестве пунктирных линий. Два изображения взаимно связаны посредством вращения на 90° вокруг вертикальной оси. (B) Положение и конформация эпитопа D25 на молекулах F в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации. Остатки F RSV на поверхности контакта D25 показаны. Полярность α4 и α5_post указана стрелками, указаны N- и C-концы фрагментов. (C) Консервативность последовательности остатков F в областях, распознаваемых D25. Аминокислоты в RSV подтипа B человека (hRSV/B) или в бычьем RSV (bRSV), которые отличаются от hRSV/A, подчеркнуты. Эктодомен определяют как остатки 26-109 и 137-524 в F.

На фиг. 4A-4D представлены серии графиков и цифровых изображений, касающихся антигенного участка ∅. Высокоэффективные RSV-нейтрализующие антитела нацелены на участок на дистальной относительно мембраны вершине F в предшествующей слиянию конформации. (A) Способность антител блокировать связывание D25 с инфицированными RSV клетками измеряли в качестве функции концентрации антитела. (B) Анализ комплексов F RSV/Fab с помощью электронной микроскопии с негативным окрашиванием: (слева) Перепроецирование 12-Å среза через кристаллическую структуру RSV F+D25 Fab с фильтрацией до разрешения 10 Å и проведением среза для включения полости тримера F. (В середине) Совмещенные в среднем 263 частиц RSV F+D25 Fab. (Справа) Совмещенные в среднем 550 частиц RSV F+AM22 Fab. Масштабная метка на средней панели соответствует 50 Å. (C) Активность ингибирования слияния и (D) активность ингибирования прикрепления для антител, нацеленных на антигенный участок ∅, и F-специфических антител, нацеленных на другие антигенные участки. Для анализа ингибирования прикрепления в качестве положительного контроля использовали гепарин.

На фиг.5 представлена схематическая диаграмма, иллюстрирующая способы, используемые для экспрессии комплексов F RSV и D25. Плазмиды, экспрессирующие RSV F(+) Fd (круг F), легкую цепь D25 (круг L) и тяжелую цепь D25 (со стоп-кодоном или без стоп-кодона в шарнирной области, круг H) одновременно трансфицировали в клетки HEK293 в суспензии. Альтернативно плазмиду RSV F(+) Fd можно было трансфицировать, а очищенный Fab D25 или IgG можно было добавлять в клеткам через 3 часа после трансфекции. Наилучший выход достигали путем одновременной экспрессии F и D25 Fab (~1,0 мг очищенного комплекса на литр клеток).

На фиг.6 представлен набор ленточных диаграмм, иллюстрирующих сравнение связанного с D25 F RSV и F PIV5 в предшествующей слиянию конформации. Ленточное представление связанного с D25 F RSV (+) Fd (слева) и F PIV5-GCNt (справа). Существует превосходная согласованность элементов вторичной структуры между этими двумя белками, несмотря на наличие идентичности последовательностей только ~12%. Одним из наиболее поразительных отличий является положение пептида слияния (N-конец субъединица F₁), также показанное на фиг.7. Структура F PIV5 была описана как состоящая из трех доменов: I, II и III (Yin et al., Nature, 439, 38 (2006)). Домен III был назван дистальной относительно мембраны долей, в то время как домены I и II охватывают центральный бочонок и проксимальную относительно мембраны долю. Расщепленная структура PIV5, представленная здесь, была взята из PDB ID: 4GIP (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 109, 16672 (2012)).

На фиг.7 представлена серия диаграмм, иллюстрирующих вирусные гликопротеины типа I в предшествующей слиянию конформации.Предшествующие слиянию структуры RSV F, PIV5 F (PDB ID: 4GIP (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 109, 16672 (2012)), HA вируса гриппа (PDB ID: 2HMG; Wilson et al., Nature, 289, 366 (1981)) и GP вируса Эбола (PDB ID: 3CSY; Lee et al., Nature, 454, 177 (2008)) представлены в качестве молекулярных поверхностей, причем каждый протомер окрашен по-своему. В нижнем ряду показана сфера для C-концевого остатка F₂ (RSV и PIV5) или HA₁ (Flu), и показана сфера для N-концевого остатка пептида слияния. Как RSV, так и PIV5 представляют собой парамиксовирусы и их белки F обладают идентичностью последовательностей ~12%. Хотя GP вируса Эбола представляет собой белок слияния типа I, он лишен свободного N-концевого пептида слияния на GP2, и вместо этого содержит внутреннюю петлю слияния, которую часто наблюдают в белках слияния типа II и типа III. Таким образом, GP вируса Эбола был исключен из сравнения пептидов слияния.

На фиг.8 представлен набор графиков, касающихся нейтрализации RSV посредством IgG и Fab. D25, AM22 и мотавизумаб нейтрализуют RSV также хорошо, как и IgG или Fab. Следует отметить, что ось x для графика мотавизумаба отличается от других.

На фиг.9A и 9B представлены серии диаграмм и графиков, иллюстрирующих свойства антигенных центров на гликопротеине F RSV.Только антитела, направленные на антигенный участок ∅, специфически связываются с предшествующей слиянию конформацией и обладают исключительной эффективностью нейтрализации. (A) Для участка ∅ показано изображение связывания одного Fab D25 с тримером F RSV в предшествующей слиянию конформации вместе с кривыми нейтрализации для AM22 и D25. Для участка I стрелки указывают на Pro389, известную обеспечивающую ускользание мутацию (Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998)). Показана кривая нейтрализации для антитела 131-2a. Подобно антителу 2F (Magro et al., J. Virol., 84, 7970 (2010)), антитело 131-2a нейтрализует только ~ 50% вируса. (B) Для антигенных участков II и IV, модели связывания мотавизумаба (участок II) и 101F (участок IV) с предшествующими слиянию и образующимися после слияния (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011)) структурами F получали с использованием координат структур антитело-пептид (McLellan et al., J. Virol., 84, 12236 (2010); McLellan et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 17, 248 (2010)).

На фиг.10 представлено изображение полиакриламидного геля, иллюстрирующее экспрессию рекомбинантной конструкции белка F RSV с аминокислотными заменами S155C и S290C и доменом Foldon, связанным с C-концом F₁, и набор диаграмм, иллюстрирующих, что дисульфидная связь между S155C и S290C может образовываться только в предшествующей слиянию конформации белка F RSV.

На фиг.11 представлен набор графиков, демонстрирующих результаты ELISA и гель-фильтрационных анализов с использованием рекомбинантной конструкции белка F RSV с аминокислотными заменами S155C и S290C и доменом Foldon, связанным с C-концом F₁. Данные ELISA указывают на то, что конструкция S155C/S290C специфически связывается антителами, специфичными к предшествующей слиянию конформации F RSV. Профили гель-фильтрации демонстрируют, что конструкция S155C/S290C существует только в качестве тримера, в то время как в растворе с контрольной конструкцией F RSV, лишенной замен S155C/S290C, образуются агрегаты и розетки.

На фиг.12 представлены изображения, полученные с помощью электронной микроскопии с негативным окрашиванием, рекомбинантной конструкции белка F RSV с аминокислотными заменами S155C и S290C и доменом Foldon, связанным с C-концом F1. На изображениях ниже большой панели представлены 2D-усреднения индивидуальных частиц. Результаты указывают на то, что конструкция S155C/S290C является стабилизированной в предшествующей слиянию конформации.

На фиг.13-14 показан набор графиков, иллюстрирующих ответ нейтрализующих антител у мышей, которым вводили нативный RSV (RSV), инактивированный формалином RSV (FI-RSV), рекомбинантную конструкцию белка F RSV с аминокислотными заменами S155C и S290C и доменом Foldon, связанным с C-концом F₁ (F в предшествующей слиянию конформации), или конструкцию белка F RSV, стабилизированную в образующейся после слияния конформации (RSV после слияния). Показан ответ антител через 5 недель (фиг.13) и 7 недель (фиг.14) после первоначальной иммунизации.

На фиг.15 представлены цифровые изображения кристаллов растворимого рекомбинантного белка F RSV, стабилизированного в предшествующей слиянию конформации посредством замен S155C и S290C. Слева, изображения при стандартном освещении; Справа, изображения в ультрафиолетовых лучах, указывающие на белки. Образование кристаллов из водных забуференных растворов демонстрирует, что этот белок является по существу гомогенным в растворе.

На фиг.16 показана конструкция антигена на основе белка F RSV (RSV_A F(+)FdTHS), стабилизированная внесенными способами инженерии мутациями, вносящими дисульфидные связи S155C и S290C ("DS"), заполняющими полость мутациями S190F и V207L ("Cav1") и присоединенным C-концевым гетерологичным доменом тримеризации домен (Fd). Структура F RSV, связанного с D25, представлена в виде двух протомеров, показанных в качестве молекулярной поверхности, окрашенной розовым цветом и желто-коричневым цветом, и третий протомер показан в качестве ленточного представления. Показаны N- и C-концевые остатки F₁, которые смещаются более чем на 5Å между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями. На вставках показана внесенная способами инженерии дисульфидная связь между остатками S155C и S290C (названными "DS"), а также заполняющие полость мутации S190F и V207L (названные "Cav1"). Модель домена тримеризации фибритина фага T4 показана в основании тримера в предшествующей слиянию конформации. Белок F RSV, включающий замены S155C и S290C, и S190F и V207L в RSV человека подтипа A, и присоединенный C-концевой домен Foldon, назван RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Мутации, совместимые с распознаванием D25, но недостаточно стабильные для обеспечения очистки в качестве гомогенного тримера, обозначены и показаны посредством черного стержневого представления.

На фиг.17 представлена антигенная охарактеризация RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Скорость ассоциации и диссоциации взаимодействия Fab растворимого D25, AM22, 5C4, 101F, мотавизумаба и паливизумаба с иммобилизованным RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 измеряли с использованием устройства OctetRED 384™ (ForteBio, Melno Park, CA). Представлены равновесные константы диссоциации для каждого антитела.

На фиг.18 показаны результаты эксклюзионной хроматографии RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Очищенный белок после расщепления тромбином для удаления меток пропускали через колонку эксклюзионной хроматографии 16/70 Superose 6. Объем элюирования согласуется с гликозилированным тримером.

На фиг.19 показана таблица, в которой перечислены антигенные и физические характеристики вариантов RSV_A F(+)FdTHS, стабилизированных изменениями DS, Cav1 или DSCav1. В самом левом столбце указан вариант F RSV и в остальных столбцах представлены свойства вариантов, включая выход из плазмид для временной экспрессии, антигенность против различных антигенных центров и сохранение связывания D25 (представленное в качестве относительного количества) после инкубации в течение 1 часа при различных температурах, значениях pH и осмолярности, или после 10 циклов замораживания-оттаивания. Вариант DSCav1 сохраняет распознавание антигенного участка ∅ с улучшенной физической стабильностью, судя по более высокому сохранению реактивности в отношении D25 после воздействия чрезмерной температуры, значения pH, осмолярности и замораживания-оттаивания, чем у любого из вариантов DS или Cav1.

На фиг.20 показано ленточное представление кристаллической структуры RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 при 3,1 Å. Утолщенные ленты соответствуют увеличению B-факторов. Несмотря на стабилизирующие мутации, антигенный участок ∅ на вершине тримера сохраняет значительную подвижность.

На фиг.21 показано сравнение RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 с F RSV, связанным с D25. На ленточное представление RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 наложено ленточное представление F RSV, связанного с D25, белого цвета (PDB ID 4JHW). Изображения взаимно соотносятся посредством вращения на 90° вокруг вертикальной оси.

На фиг. 22 показаны стабилизирующие мутации в структуре RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Представление в виде шаров и стержней кристаллической структуры RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 с электронной плотностью 2F_o-F_c, контурированной на уровне 1σ, показано в виде сетки. Эти изображения указывают на то, что наблюдают электронную плотность, соответствующую дисульфидной связи между остатками цистеина 155 и 290 (слева), а также заполняющему полость остатку Phe190 (справа).

На фиг.23 показана иммунногенность у мышей RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Десть мышей CB6 на группу иммунизировали посредством 10 мкг белка RSV_A F(+)FdTHS DSCav1, смешанных с 50 мкг адъюванта поли I:C. Иммунизации проводили на 0 и 3 неделях, и сыворотки на 5 неделе и 7 неделе исследовали в отношении нейтрализации RSV подтипа A (RSV_A) и B (RSV_B). Средние значения указаны с помощью горизонтальных линий.

На фиг.24 представлена иммуногенность RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 у не являющегося человеком примата (NHP). Четыре наивных по RSV макака-резус на группу иммунизировали посредством 50 мкг белка RSV_A F(+)FdTHS DSCav1, смешанных с 500 мкг адъюванта поли I:C. Иммунизации проводили на 0 и 4 неделях, и сыворотки на 6 неделе исследовали в отношении нейтрализации RSV подтипа A (слева) и B (справа). Средние значения указаны горизонтальными линиями.

На фиг.25A-25C представлены плазмидные карты экспрессирующих векторов. (A) Карта вектора paH, экспрессирующего RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 (SEQ ID NO: 384), для экспрессии рекомбинантного белка F RSV из подтипа A человека, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. (B) Карта вектора paH, экспрессирующего RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1 (SEQ ID NO: 386), для экспрессии рекомбинантного белка F RSV из подтипа B человека (штамм B1), включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. (C) Карта вектора paH, экспрессирующего RSV_B (18537) F(+)FdTHS DSCav1 (SEQ ID NO: 388), для экспрессии рекомбинантного белка F RSV из подтипа B человека (штамм 18537), включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II.

На фиг.26A-26D проиллюстрирована конструкция вакцины на основе структуры RSV: парадигма суперучастка. (A) Природная инфекция RSV индуцирует разнообразные антитела с диапазоном эффективности нейтрализации вируса. (B) Кластер эпитопов для естественным образом индуцируемых высокоэффективных антител определяет суперучасток уязвимости вируса. Показаны антигенсвязывающие фрагменты антитела D25 с мощной нейтрализацией, распознающие эпитоп на вершине тримера F RSV. Пространственно перекрывающиеся эпитопы на вершине тримера также распознаются антителами AM22 и 5C4, которые обладают общими с D25 желаемыми характеристиками нейтрализации. Эти перекрывающиеся эпитопы определяют антигенный участок ∅ в качестве суперучастка уязвимости RSV. (C) После выбора суперучастка-мишени повторяющийся процесс конструирования, охарактеризации антигенных и физических свойств, определение структуры на атомном уровне и оценка иммуногенности позволяют структурную оптимизацию вакцинных антигенов, кодирующих суперучасток-мишень. (D) Поскольку суперучасток уязвимости вируса естественным образом индуцирует антитела с высокой защищающей способностью, иммунизация "иммуногенами суперучастка" легче индуцирует защитный ответ, чем иммунизация иммуногенами на основе областей вируса, распознаваемых субдоминантными антителами или антителами с невысокой нейтрализующей способностью.

На фиг.27 показана конструкция растворимых F RSV со стабилизированным тримерным участком ∅. Было сконструировано более 100 вариантов F RSV, содержащих домен тримеризации фибритина T4 (foldon), для более стабильного сохранения антигенного участка ∅. Здесь показана структура тримера F RSV в связанной с D25 конформации со смоделированным foldon. Тример показан двумя протомерами, показанными в качестве молекулярной поверхности, окрашенной светло серо-коричневым цветом и розовым цветом, и третий протомер показан в качестве ленточного представления. Лента закрашена белым цветом, где она является относительно фиксированной между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями, в то время как N- и C-концевые остатки, которые смещаются более чем на 5 Å между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями, выделены темно-серым цветом. Мутации, совместимые с экспрессией и первоначальным распознаванием D25, но недостаточно стабильные для обеспечения очистки в качестве гомогенного тримера, показаны в черном стержневом представлении. На вставках показан увеличенный масштаб стабилизирующих мутаций в стержневом представлении для вариантов DS, Cav1 и TriC, все из которых стабильно сохраняют антигенный участок ∅ (фиг.31).

На фиг.28A-28C показаны структуры тримеров F RSV, сконструированные для сохранения антигенного центра ∅. (A-C) Показаны шесть структур для вариантов F RSV с обозначенной стабилизирующей мутацией (DS, Cav1, DS-Cav1, и DS-Cav1-TriC), и решеткой (кубической и четырехугольной), и pH кристаллизации. (A) Тримеры F RSV представлены в качестве Cα-ленточного представления с окрашиванием в соответствии с коэффициентом подвижности атомов. Отсутствующие области указаны пунктирными линиями. Они встречаются в C-концевой проксимальной относительно мембраны области, где мотив foldon отсутствует, за исключением структуры DS-Cav1-TriC (крайняя справа). В структуре DS две петли в головной области также являются разупорядоченными. (B) Антигенный участок ∅ протомера F RSV представлен в ленточной диаграмме, причем структура F RSV, связанного с D25, выделена серым цветом и различные варианты указаны. Стабилизирующие мутации обозначены и показаны в стержневом представлении. (C) Детали атомного уровня показаны в стержневом представлении, причем области F RSV, которые изменяют конформацию между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями, показаны темно-серым цветом, и области, которые остаются неизменными, обозначены более светлым серым цветом. Стабилизирующие атомы углерода для стабилизирующих мутаций указаны. В Cav1 (pH5,5) и в DS-Cav1 (pH5,5) наблюдали новые признаки, вовлекающие взаимодействие C-конца пептида F₂ с сульфатным ионом и пептидом слияния. В структуре DS-Cav1-TriC мутации D486H-E487Q-F488W-D489H взаимодействую с двумя соседними протомерами вокруг оси тримера.

На фиг.29A-29B показаны результаты, касающиеся иммуногенности сконструированных тримеров F RSV. Белки F RSV, сконструированные так, чтобы они стабильно экспонировали антигенный участок ∅, индуцируют нейтрализующие титры, значительно более высокие, чем титры, индуцированные образующимся после слияния F. (A) Нейтрализующие титры сыворотки от мышей, иммунизированных 10 мкг F RSV (слева). Проводили иммунизацию образующимся после слияния F, а также F RSV, связанным антителами AM22 или D25, в количестве 20 мкг на мышь (справа). Геометрическое среднее значение указано горизонтальной линией. (B) Нейтрализующие титры сыворотки из макак-резусов, иммунизированных 50 мкг вариантов белка F RSV. Геометрическое среднее значение указано горизонтальной линией. Защитный порог указан пунктирной линией, и значение p предоставлено для образующийся после слияния конформации против DS-Cav1.

На фиг.30A-30D показано, как физические, структурные и антигенные свойства F RSV со стабилизированным антигенным центром ∅ коррелируют с иммуногенностью. (A) Физическая стабильность участка ∅ против иммуногенности. На вставках показан перенос информации. Физическую стабильность, определяемую путем усреднения 7 показателей сохранения активности D25 на фиг.31 (горизонтальная ось), усредняли и сравнивали с индуцированными защищающими от RSV титрами на фиг.29 (вертикальная ось). (B) Структурная мимикрия участка ∅ против иммуногенности. На вставке показан перенос информации. Структурная мимикрия (горизонтальная ось) представляет собой среднеквадратическое отклонение между различными структурами (фиг.28) и F RSV, связанным с D25, для всех атомов в пределах 10 Å от D25. Это представляет собой сравнение с индуцированными защищающими от RSV титрами, показанными на фиг.29 (вертикальная ось). (C) Антигенный анализ сывороток иммунизированных макак. Связывание сывороток с иммобилизованным DS-Cav1 (слева) или образующимся после слияния F (справа) измеряли прямо (пустой образец, черные столбики) или после инкубации с избытком образующегося после слияния F (темно-серые столбики) или DS-Cav1 (светло-серые столбики). Средний ответ для сывороток четырех макаков нанесен на график с планками погрешностей для стандартного отклонения. (D) Корреляция иммуногенности и антигенности сывороток NHP. Средние титры нейтрализации сывороток четырех макаков в каждой группе нанесены на график против соотношения связывающих ответов на DS-Cav1 и образующийся после слияния F.

На фиг.31A-31B представлена таблица, демонстрирующая результаты антигенной и физической охарактеризация белковых иммуногенов F RSV.^#Определено для тримерного состояния, но, если нельзя было очистить белок в тримерном состоянии, тогда для олигомерного состояния преобладающего типа олигомера. Если общий выход составляет <0,1 мг/л, тогда олигомерное состояние является неопределенным (N.D.). *Выход показан для конкретного олигомерного состояния. >1000 нМ = отсутствие связывания при концентрации Fab 1 мкМ. N/A = неприменимо.

На фиг.32 показано положение S155 и S290 в предшествующих слиянию и образующихся после слияния структурах F RSV. β-атомы углерода остатков серина 155 и 290 находятся на расстоянии 4,4 Å в структуре F RSV, связанного с D25, и находятся на расстоянии 124,2 Å в образующейся после слияния структуре. Мутации S155C и S290C (называемые "DS") удерживали структуру в предшествующей слиянию конформации.

На фиг.33A-33C показано отрицательное окрашивание стабилизированного белка F. На A) и B) показаны репрезентативные поля отрицательно окрашенных образцов для DS и DS-Cav1. Белки являются высокооднородными, причем <1% и <0,1% образующихся после слияния конформаций F наблюдалось для DS и DSCav1, соответственно. Примеры образующихся после слияния конформаций F указаны черными стрелками. Планка = 50 нм. 2D-усреднения частиц показаны на вставках в верхнем правом углу в двукратном увеличении. Планка = 5 нм. На C) показано сравнение 2D-усреднений с усреднением комплекса F+D25 (McLellan et al. 2013). Планка = 5 нм.

На фиг.34 показано, что результаты ELISA на основе антитела D25 для неочищенных культуральных супернатантов коррелировали (R Спирмана = 0,7752 и значение P =0,0041) с выходом очищенных олигомерных вариантов гликопротеина F RSV. Продукцию гликопротеина F RSV клетками 293 Expi определяли посредством ELISA на основе D25 для неочищенных культуральных супернатантов при 4°C через одну неделю после сбора, и было обнаружено, что она коррелирует с выходом чистых олигомерных вариантов гликопротеина F RSV (таблица 1).

На фиг.35 показаны результаты ELISA на основе антитела мотавизумаба для неочищенных культуральных супернатантов против выхода очищенных вариантов гликопротеина F RSV. (A) Продукцию белка F RSV клетками 293 Expi определяли с помощью ELISA на основе мотавизумаба для неочищенных культуральных супернатантов при 4°C непосредственно при сборе и (B) через одну неделю после сбора. Данные ELISA нанесены на график против выхода вариантов гликопротеина F RSV после аффинной хроматографии со стрептацином. Интересно, что три белка: RSV F(+) Fd и два варианта F137W-F140W и T357C-N371C были обнаружены в качестве экспрессирующихся на высоком уровне посредством ELISA на основе мотавизумаба, однако после крупномасштабной очистки были получены низкие выходы (точки, показанные вдоль оси ординат).

На фиг.36 показана охарактеризация сконструированных гликопротеинов F RSV с использованием эксклюзионной хроматографии. Варианты F RSV: a: Cav1; b: Cav1-TriC; c: DS-Cav1-TriC; d: F488W; e: DS-Cav1; f: TriC, g: DS-TriC; h: DS; проявляют профили элюирования, характерные для глобулярного тримерного белка, в то время как варианты F RSV: i: S190F-V296F; j: K87F-V90L; k: V207L-V220L; l: V178N; m: S403C-T420C; n: I506K; o: V185E; p: F137W-F140W- F488W; q: D486H-E487Q-D489H проявляют профили элюирования, характерные для более высокоолигомерных типов. Белковые стандарты с известной молекулярной массой обозначены у основания хроматограммы.

На фиг.37 представлен антигенный участок ∅, показанный сверху. Области DS, которые не видны, обозначены пунктирными линиями.

На фиг.38A-38B показаны результаты, касающиеся антигенной охарактеризации комплексов иммуноген-адъювант для иммунизации не являющегося человеком примата. (A) Реактивность образцов образующегося после слияния RSV F, DS и DS-Cav1 оценивали против 1 мкМ D25 антигенсвязывающего фрагмента в течение менее 3 ч после составления иммуногена с поли I:C и иммунизаций NHP на сутки 0 и (B) 4 неделе.

На фиг.39A-39B показан антигенный анализ сывороток от иммунизированных мышей и макак-резусов. A) Сыворотки мышей, иммунизированных множеством стабилизированных вариантов F RSV, оценивали в отношении связывания с иммобилизованным DS-Cav1, которое измеряли прямо, или с DS-Cav1 после инкубации с избытком антигенсвязывающих фрагментов D25 или мотавизумаба для оценки ответов участка ∅ или участка II. B) Сыворотки от макак-резусов оценивали в отношении связывания с иммобилизованным DS-Cav1 или образующимися после слияния вариантами F RSV, также блокированными антигенсвязывающими фрагментами D25 или мотавизумаба. Показан средний ответ сывороток животных с планками погрешностей для стандартного отклонения.

На фиг.40 показана коллекция кристаллографических данных и уточняющая статистика.

На фиг.41 показан эффект использования конструкций RSV подтипа B с заменами DS, а также то, что адъюванты, включающие агонисты TLR4, могут функционировать со стабилизированным белком F. Мышей CB6F1/J иммунизировали 10 мкг версии DS S155C/S290C стабилизированного предшествующего слиянию F, составленной с 50 мкл Ribi (адъювантная система Ribi, Sigma). Мышам проводили инокуляцию на 0 и 3 неделях либо конструкции подтипа A (SEQ ID NO: 185), либо конструкции подтипа B (SEQ ID NO: 1479), либо обеих из них (по 10 мкг каждой). В момент времени 5 недель (через 2 недели после второй инъекции) получали сыворотку для анализов нейтрализации. Двумя основными результатами этого эксперимента было то, что 1) preF_A-DS и preF_B-DS индуцировали равные уровни нейтрализующей активности против RSV подтипа A, в то время как preF_B-DS индуцировал более высокий уровень нейтрализующей активности, чем preF_B-DS, против RSV подтипа B. Это указывает на то, что использование конструкций RSV подтипа B может обладать лучшим перекрестно-нейтрализующим потенциалом, чем использование конструкций подтипа A, или что гибридные версии F RSV, которые включают элементы из обоих подтипов, могут быть предпочтительными. 2) Адъювант Ribi представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую монофосфориллипид A, который является агонистом TLR4 и является типичным представителем некоторых коммерческих адъювантов. Эти данные показывают, что в дополнение к поли I:C (агонист TLR3), адъюванты, которые включают агонисты TLR4, функционируют со стабилизированным предшествующим слиянию F белком в качестве вакцинного антигена.

На фиг.42 показано, что стабилизированный предшествующий слиянию F может быть составлен в квасцах, а также в поли I:C, и он сохраняет иммуногенность, сообщаемую антительными ответами на антигенный участок ∅. Мышей BALB/c иммунизировали 20 мкг версии DS S155C/S290C стабилизированного предшествующего слиянию F, происходящего из подтипа A, и составляли с квасцами (гель гидроксида алюминия 10 мг/мл, Brenntag, Frederikssund, Danmark) или поли I:C. Мышам проводили инокуляцию на 0 и 3 неделях, и в момент времени 5 недель (через 2 недели после второй инъекции) получали сыворотку для анализа нейтрализации.

На фиг.43 представлена схематическая диаграмма, иллюстрирующая иллюстративную схему конструкции антигенов предшествующего слиянию стабилизированного одноцепочечного F RSV (scF), включающую переменные которые вовлечены в несколько различных конструкций scF RSV. Элементы конструкции, которые относятся к scF RSV № 9 (BZGJ9 DS-Cav1; SEQ ID NO: 669), обозначены темно-серым цветом.

На фиг.44A и 44B проиллюстрирована конструкция одноцепочечной конструкции F RSV № 9 (scF № 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669). Нумерация указывает на положения остатков различных компонентов, описанных ниже. (A) Схематическое представление расщепленного фурином гликопротеина RSV F(+)как показано на фиг.44B (сверху), и конструкции scF RSV № 9 (снизу), демонстрирующей домен тримеризации foldon (серый овал) и искусственный линкер (серый квадрат), являющийся мостиком для полипептидных остовов F₂ (слева) и F₁ (справа). (B) Структурная основа конструкции scF RSV № 9 с использованием структуры предшествующего слиянию стабилизированного RSV F(+) в качестве модели (PBD ID: 4MMV, включенная в настоящее описание в полном объеме). RSV F(+) показан в динамическом представлении и домен тримеризации foldon показан в сферическом представлении. Слева показан предшествующий слиянию стабилизированный тример F(+)RSV с тремя протомерами, закрашенными черным, серым и белым цветом. Справа показан единичный протомер RSV F(+), демонстрирующий F₁ (серый), F₂ (темно-серый), пептид слияния (указан) и домен тримеризации foldon (светло-серый, указан). На вставке показан пептид слияния в стержневом представлении, и положение последовательности подвижного линкера (пунктирная линия), связывающего остатки 104 и 147.

На фиг.45 показана таблица, касающаяся конструкции, олигомерного состояния и выхода продукции полученных способами инженерии конструкций одноцепочечного F RSV, экспрессированных в клетках HEK293-F. Конструкция F RSV № 9 DSCav1 (scF № 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669), конструкция F RSV № 10 DSCav1 (scF № 10; BZGJ10 DSCav1; SEQ ID NO: 670), конструкция F RSV № 11 DSCav1 (scF № 11; BZGJ11 DSCav1; SEQ ID NO: 671) указаны. Представленные линкерные последовательности включают GSGNIGLGG (SEQ ID NO: 364), GSGGNGIGLGG (SEQ ID NO: 359), GSGNVLGG (SEQ ID NO: 361) и GSGNVGLGG (SEQ ID NO: 362). (%) Стабилизирующие предшествующую слиянию конформацию мутации включают следующие: S155C и S290C (DS); S190F и V207L (Cav1); без дополнительных мутаций (a). Все варианты содержат точковую мутацию L373R. (==) Домены тримеризации включают следующие: L512C и L513C (CC); D486C, E487P и F489C (CPC). (#) При эксклюзионной хроматографии часто наблюдали, что варианты существуют в смеси олигомерных состояний. Если наблюдали поддающуюся измерению тримерную фракцию, тогда олигомерное состояние приведено в качестве "тримера". Если не наблюдали тримерной фракции, тогда представлено олигомерное состояние преобладающих типов. Если общий выход перед эксклюзионной хроматографии составлял <0,1 мг/л, тогда олигомерное состояние приведено как неопределенное (N.D.). Если олигомерное состояние было неотличимым при эксклюзионной хроматографии, олигомерное состояние приведено как "агрегат". (*) Показанный выход вычисляли после очистки с использованием StrepTag, и он приведен для указанного олигомерного состояния. (Φ) Выход HEK 293F оценен на основе наблюдаемого соотношения между выходом экспрессии Expi293F и выходом экспрессии Freestyle293F, наблюдаемым для конструкций scF (~2:1).

На фиг.46A и 46B представлен набор графиков, иллюстрирующих охарактеризацию сконструированных одноцепочечных гликопротеинов F RSV эксклюзионной хроматографией. (A) Профили эксклюзионной хроматографии для вариантов scF RSV (scF № 3, 4, 6, 8-11) и F₍₊₎ RSV, содержащего стабилизирующие мутации DS-Cav1. Одноцепочечные конструкции экспрессировали в клетках HEK293F и F(+) DS-Cav1 экспрессировали в клетках Expi 293-F. F(+) DS-Cav1 и scF № 3 DS-Cav1, № 4 DS-Cav1, № 6 DS-Cav1 и № 9 DS-Cav1 проявляют профили элюирования, характерные для глобулярного тримерного белка, в то время как scF № 11 DSCav1 проявляет профиль элюирования, характерный для глобулярного мономерного белка. RSV scF № 8 DS-Cav1 и scF № 10 DS-Cav1 проявляют профили элюирования, указывающие на гетерогенную смесь как мономерных, так и тримерных типов. (B) Профили эксклюзионной хроматографии для RSV F(+) DS-Cav1 и scF RSV № 9, содержащего различные стабилизирующие мутации. F(+) DS-Cav1 и scF № 9 Cav1 экспрессировали в клетках Expi 293-F и остальные варианты scF № 9 экспрессировали в клетках HEK293F. Небольшое отклонение профилей элюирования вариантов scF № 9 указывает на то, что scF № 9 прогоняется при более высокой молекулярной массе, чем тримерный F(+). Звездочкой указано, что метки для очистки отщепляли перед гель-фильтрацией.

На фиг.47 представлена таблица, обобщающая результаты антигенной охарактеризации scF RSV № 9 DS-Cav1.

На фиг.48 представлена таблица, демонстрирующая кристаллографические данные и уточняющую статистику для трехмерной структуры RSV scF № 9 DS-Cav1.

На фиг. 49A и 49B показана серия диаграмм, касающихся кристаллической структуры тримера scF RSV № 9 DS-Cav1. Ориентация протомера, представленного в динамическом представлении (темно-серый), сохранена. Жирные пунктирные линии соответствуют C-концевому мотиву foldon, расположенному в проксимальной относительно мембраны области, которая не видна в кристаллической структуре. (A) ТримерRSV scF № 9 DS-Cav1, протомеры которого показаны в динамическом представлении и ленточном представлении (темно-серый), и в представлении молекулярной поверхности (светло-серый). На вставке показано увеличенное изображение линкерной петли "GS" scF № 9 (указана) и соседнего протомера (темно-серый), оба в стержневом представлении. (B)Предшествующие слиянию стабилизирующие мутации в структуре scF RSV № 9 DS-Cav1. Предшествующие слиянию стабилизирующие мутации DS и Cav1 указаны и показаны в стержневом представлении.

На фиг.50 показана диаграмма, иллюстрирующая структурное выравнивание scF RSV № 9 DS-Cav1 (серый) со структурой F(+) DS-Cav1 (светло-серый; rmsd = 0,839 Å) и со структурой F(+), связанной с D25 (темно-серый; rmsd = 0,534 Å), все из которых показаны в динамическом представлении. На вставке показано увеличенное изображение линкерной петли scF № 9 и пептидов слияния из структуры F(+) DS-Cav1, и структуры F(+), связанной с D25.

На фиг.51 показаны диаграммы, иллюстрирующие сравнение конструкций scF RSV № 3, 4, 6, 8-11 с использованием кристаллической структуры scF RSV № 9 DS-Cav1. Жирные пунктирные линии соответствуют C-концевому мотиву foldon. Протомер scF RSV № 9 DS-Cav1 показан в динамическом представлении (темно-серый). На вставках показано увеличенное изображение линкерной петли "GS" scF № 9 в стержневом представлении, связывающей остатки 105 (F₂) и 145 (F₁). Спрогнозированные положения гибких линкерных последовательностей для конструкций scF № 3, 4, 6 и 8 (тонкая пунктирная линия), связывающих остатки 97 (F₂) и 150 (F₁) нанесены на карту кристаллической структуры scF № 9 DS-Cav1. Спрогнозированные положения линкерных последовательностей для конструкций scF № 3, 4, 6 и 8 (тонкая пунктирная линия) нанесены на карту тримерной структуры scF № 9 DS-Cav1. Концевые положения линкера указаны приблизительно.

На фиг.52 показан набор цифровых изображений, касающихся охарактеризации сконструированных одноцепочечных гликопротеинов F RSV, охарактеризованных гель-электрофорезом SDS-PAGE, после очистки с использованием StrepTag. Конструкции scF RSV экспрессировали в клетках HEK293F и очищали с использованием аффинной хроматографии с His₆-меткой и StrepTag.

На фиг.53 представлен набор графиков и таблица, в которых представлены данные нейтрализации на 5 неделе для указанных конструкций (10 животных/группа). Иммунизации на 0 неделе и 3 неделе посредством 10 мкг белка + 50 мкг поли I:C на животное.

На фиг.54 представлена ленточная и стержневая диаграмма, указывающая на остаток пролина в положении 101 F RSV в трехмерной структуре scF RSV № 9 (SEQ ID NO: 669). Структура указывает на то, что одноцепочечная линкерная область может быть улучшена удалением пролина 101 или укорочением/мутацией линкерных остатков и соседних остатков.

На фиг.55 представлен график и выравнивание последовательностей, иллюстрирующие модификацию конструкции scF № 9 (SEQ ID NO: 669) для получения конструкций с BZG J9-1 по BZG J9-10. На выравнивании последовательностей показаны последовательности с BZG J9-1 по BZG J9-10, соответствующие остаткам 97-159 F RSV SEQ ID NO: 698-707, соответственно. Эти конструкции экспрессировали в клетках Expi и оценивали гель-фильтрацией (слева).

На фиг.56 представлена серия графиков и схематических диаграмм, иллюстрирующих наночистицы ферритина, включающие белок scF № 9, который был получен связыванием C-конца полипептида F1 в scF № 9 с субъединицей ферритина. Эта конструкция названа "BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin" и представлена в качестве SEQ ID NO: 1429.

На фиг.57 представлен набор графиков, иллюстрирующих физическую стабильность BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin по сравнению с RSV F DS-Cav1.

На фиг.58A-58C представлен набор графиков и таблица, иллюстрирующие иммуногенность различных предшествующих слиянию стабилизированных белков F RSV. Три исследованных конструкции представляли собой RSV F DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin (SEQ ID NO: 1429) и scF № 9 (также называемый BZGJ9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). Животным Macaca mulatta индийского происхождения весом 8,26-11,34 кг внутримышечно инъецировали иммуногены на 0 неделе в количестве 50 мкг белка + 500 мкг Ribi на животное, проводили вспомогательную иммунизацию на 4 неделе в количестве 50 мкг белка + 500 мкг Ribi на животное; иммуногенность оценивали на неделе 3, 5.

На фиг.59A и 59B представлен набор диаграмм, иллюстрирующих трехмерную структуру белка F RSV из штамма B18537 с мутациями DSCav1 (SEQ ID NO: 372) (A) Динамическое представление протомера F RSV. (B) Тримерная форма гликопротеина слияния с дополнительными протомерами, показанными в поверхностном и ленточном представлении.

На фиг.60A-60D представлен набор изображений, иллюстрирующих детали на атомном уровне для гликопротеина F RSV B18537 с заменами DSCav1, и показывающих, что замены DSCav1 можно вносить в гликопротеин F RSV подтипа B для стабилизации антигенного участка ∅. (A) Мутации DS-Cav1 выделены. (B) Антигенный участок ∅, расположенный на вершине тримера, показан в стержневом представлении темно-серым цветом. (C) Взаимодействие между пептидом слияния и β-цепями 15, 16 и 19 с образованием и межпротомерного удлиненного слоя. (D) Взаимодействие между C-концом F2 и пептидом слияния.

На фиг.61A и 61B представлен набор графиков и цифровых изображений, иллюстрирующих антигенную охарактеризацию гликопротеина слияния RSV B18537 с заменами DSCav1. (A) Измерение с использованием интерферометрии биослоя для прототипных специфичных к участку антител проводили путем серийного разведения каждой молекулы Fab и измеряли скорости ассоциации и диссоциации в отношении иммобилизованных белков F B18537 DSCav1. (B) Структурное сравнение антигенного участка ∅ из штамма B18537 и A2. Экспонированные на поверхности остатки, которые различаются между двумя штаммами, обозначены.

На фиг.62A и 62B представлены графики, иллюстрирующие очистку белка F RSV штамма B18537 с DSCav1. A. SDS-PAGE элюированной фракции (восстановленной и невосстановленной) и прошедшей фракции после аффинной очистки с помощью StrepTagII. B. Гель-фильтрация гликопротеина F RSV B18537 в буфере GFB на 120-мл эксклюзионной колонке Superdex-200.

На фиг.63-68 проиллюстрирована конструкция и продуцирование тримерных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации без C-концевого домена тримеризации для поддержания стабильности проксимальной относительно мембраны доли RSV F. Вместо C-концевого домена тримеризации в C-конец полипептида F1 внесено кольцо из дисульфидных связей путем замены остатками цистеина аминокислот спирали α10.

На фиг.69A-69E представлен набор таблиц, демонстрирующих данные ELISA для указанных рекомбинантных вариантов F RSV. Экспрессия и антигенная стабильность вариантов F RSV (SEQ ID NO: 859-1018). ДНК, кодирующую эти варианты F RSV, трансфицировали в клетку в 96-луночном формате в условиях, в которых рекомбинантные белки F RSV секретируются из клеток в клеточную среду. Каждая конструкция содержит лидерную последовательность, которая обеспечивает попадание белка в секреторную систему и секрецию. Затем среду центрифугировали и супернатант использовали для исследования антигенности в отношении связывания с антителом D25, специфичным к участку ∅, и антителом мотавизумабом, специфичным к участку II ("Mota", фиг.69A-69E). Исследованные условия включают связывание D25 и Mota на 0 сутки (условия 1 и 2), связывание D25 и Mota на 0 сутки после инкубации при 70°C в течение одного часа (условия 3 и 4), и связывание D25 и Mota после 1 недели при 4°C (условия 5 и 6). Контроль представляет собой конструкцию DSCav1 с доменом foldon. Данные о специфической антигенности для каждой конструкции представлены на фиг.69A-69E, причем исследованные условия приведены в строках заголовков.

На фиг.70A-70E представлен набор схематических диаграмм, иллюстрирующих различные стратегии конструирования для получения иммуногенов антигенного участка ∅ F RSV. Антигенный участок ∅ включает участок распознавания D25 на наружной поверхности спирали α4 и петли, непосредственно N-концевой относительно спирали α1 каждого протомера F RSV в предшествующей слиянию конформации. Использовали пять способов презентации выделенных эпитопов участка ∅ на поверхности иммуногена: A) круговая перестановка (т.е. изменение линкеров вторичной структуры для изменения связности сегментов участка ∅ для простоты конструирования и стабильности), B) включение участка ∅ в небольшой каркасный белок, C) тримеризация круговых перестановок и участка каркаса ∅, чтобы они соответствовали тримеризации нативного участка ∅, наблюдаемой в контексте F RSV в предшествующей слиянию конформации (как на левой панели), D) включение всего домена III для дополнительной стабильности укладки участка ∅ и E) включение A-D в платформу наночастиц для дополнительной иммуногенности.

фиг.71 представляет собой обобщение минимальных иммуногенов с участками ∅, которые конструировали, продуцировали и исследовали в отношении антигенности с помощью антител, специфичных к участку ∅, D25, AN22 и 5C4 способом ELISA в указанных условиях. В таблице представлено число иммуногенов с участком ∅, которые подпадают в каждую категорию, и которые обеспечили результат ELISA, составляющий по меньшей мере 1,5.

На фиг.72A-72F представлен набор таблиц, демонстрирующих данные ELISA для указанных конструкций минимального участка ∅, связывающихся с антителом D25, AN22 или 5C4. Исследованные условия включают связывание D25 после 0 и 1 недели при 4°C (условия 1) и 2), связывание D25 после 1 ч при 60°C (условия 3), 70°C (условия 4), 80°C (условия 5), 90°C (условия 6) или 100°C (условия 7), связывание AM22 после двух недель при 4°C (условия 8), связывание 5C4 на 0 неделе (условия 9). Также показано среднее значение связывания D25, AM22 и D25 после 1 часа при 70°C (условия 10). Показатели ELISA ≥1,5 выделены темно-серым цветом; показатели 0,5-1,5 выделены светло-серым цветом.

На фиг.73 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что иммунизация версией DS стабилизированного предшествующего слиянию F подтипа A или B или обоих из них индуцирует нейтрализующую активность против обоих подтипов.

На фиг.74 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что антительный ответ на DSCav1 является длительным у мышей после двух доз с иммунизацией на 0 и 4 неделях.

На фиг.75 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что иммунизация DS может препятствовать инфицированию RSV у мышей.

На фиг.76 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что иммунизация DS не индуцирует ответы цитокинов 2 типа у мышей после заражения.

На фиг.77 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что нейтрализующий иммунный ответ на DSCav1 усиливается и сохраняется после 3-ей дозы у не являющихся человеком приматов, которых предварительно иммунизировали DS-Cav1 или DS на 0 и 4 неделях.

На фиг.78 представлен график, иллюстрирующий, что DS-CAV1 можно эффективно составлять в квасцах и он сохраняет иммуногенность.

На фиг.79 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что квасцы являются эффективным адъювантом для DSCav1 у не являющихся человеком приматов.

На фиг.80 представлен график, иллюстрирующий, что DS-CAV1 является иммуногенным при экспрессии с вектора на генной основе либо отдельно, либо в качестве первичной иммунизации для усиливающей иммунизации белком.

На фиг.81 представлен набор графиков и таблица, иллюстрирующие, что DS-Cav1 RSV F подтипа A или B могут усиливать первичную иммунизацию с использованием доставки на генной основе белка F дикого типа у не являющихся человеком приматов.

На фиг.82 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что DS-Cav1 RSV F подтипа A или B могут быть усиливающими при первичной иммунизации посредством rAd-F(A)WT не являющегося человеком примата.

На фиг.83 представлен набор графиков, иллюстрирующих, что иммунизация версией DS стабилизированного предшествующего слиянию F подтипа A или B или обоих из них индуцирует нейтрализующую активность против обоих подтипов RSV.

На фиг.84 представлен график, иллюстрирующий, что изменение гликозилирования снижает иммуногенность стабилизированного F в предшествующей слиянию конформации.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот, приведенные в прилагаемом списке последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных обозначений для нуклеотидных оснований, и трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в 37 C.F.R. 1.822. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, однако понятно, что путем предоставления показанной цепи включается и комплементарная цепь. Список последовательностей предоставлен в качестве текстового файла ASCII в форме файла под названием "Sequence.txt" (~3,2 MB), который был создан 12 марта 2014 года и включен в настоящее описание в качестве ссылки. На прилагаемом списке последовательностей:

SEQ ID NO: 1-128 представляют собой аминокислотные последовательности нативных белков F RSV из RSV типа A.

SEQ ID NO: 129-177 представляют собой аминокислотные последовательности нативных белков F RSV из RSV типа B.

SEQ ID NO: 178-184 представляют собой аминокислотные последовательности нативных белков F RSV из бычьего RSV.

SEQ ID NO: 185-350 представляют собой аминокислотные последовательности рекомбинантных белков RSV F.

SEQ ID NO: 351 представляет собой аминокислотную последовательность домена Foldon фибритина T4.

SEQ ID NO: 352 и 355-365 представляют собойаминокислотные последовательности пептидных линкеров.

SEQ ID NO: 353 представляет собой аминокислотную последовательность белка ферритина Helicobacter pylori (номер доступа GENBANK® № EJB64322.1, включенный в настоящее описание в качестве ссылки, как было представлено в базе данных на 28 февраля 2013 года).

SEQ ID NO: 354 представляет собой аминокислотную последовательность белка инкапсулина (номер доступа GENBANK® № YP_001738186.1, включенный в настоящее описание в качестве ссылки, как было представлено в базе данных на 28 февраля 2013 года).

SEQ ID NO: 366 и 367 представляют собой аминокислотные последовательности V_H и V_L mAb AM22, соответственно.

SEQ ID NO: 368 и 369 представляют собой аминокислотные последовательности V_H и V_L mAb D25, соответственно.

SEQ ID NO: 370 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного варианта белка F₀ RSV прототипного штамма A2 (номер доступа GENBANK № P03420, включенный в настоящее описание в качестве ссылки, как было представлено в базе данных на 28 февраля 2013 года), включающего замены P102A, I379V и M447V, по сравнению с последовательностью P03420.

SEQ ID NO: 371 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из подтипа A человека, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. Четыре мутантных остатка и C-концевая вставка подчеркнуты.

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYКДНКGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (RSV_A F(+)FdTHS DSCav1)

SEQ ID NO: 372 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из подтипа B человека, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. Четыре мутантных остатка и C-концевая вставка подчеркнуты.

MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVCKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYINNQLLPILNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYКДНКGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (RSV_B F(+)FdTHS DSCav1)

SEQ ID NO: 373 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из бычьего RSV, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. Четыре мутантных остатка и C-концевая вставка подчеркнуты.

MAATAMRMIISIIFISTYMTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELSKIQKNVCKSTDSKVKLIKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIHYTRNSTKRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKELLPKLNNHDCRISNIETVIEFQQKNNRLLEIAREFSVNAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMCVVKEEVIAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYКДНКGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (bRSV F(+)FdTHS DSCav1)

SEQ ID NO: 374 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из подтипа A человека, включающего аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. Три мутантных остатка и C-концевая вставка подчеркнуты.

SEQ ID NO: 375 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из подтипа B человека, включающего аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (RSV_B F(+)FdTHS DSS190F).

SEQ ID NO: 376 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из бычьего RSV, включающего аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II. (bRSV F(+)FdTHS DSS190F).

SEQ ID NO: 377 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из RSV A, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, V207L, слитого с C-концевым доменом ферритина. (RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 Ferritin).

SEQ ID NO: 378 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из RSV B, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, V207L, слитого с C-концевым доменом ферритина. (RSV_B F(+)FdTHS DSCav1 Ferritin).

SEQ ID NO: 379 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из bRSV, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, V207L, слитого с C-концевым доменом ферритина. (bRSV F(+)FdTHS DSCav1 Ferritin).

SEQ ID NO: 380 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из RSV A, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, слитого с C-концевым доменом ферритина. (RSV_A F(+)FdTHS DSS190F Ferritin).

SEQ ID NO: 381 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из RSV B, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, слитого с C-концевым доменом ферритина. (RSV_B F(+)FdTHS DSS190F Ferritin).

SEQ ID NO: 382 представляет собой аминокислотную последовательность рекомбинантного белка F RSV из bRSV, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, слитого с C-концевым доменом ферритина. (bRSV F(+)FdTHS DSS190F Ferritin).

SEQ ID NO: 383 представляет собой иллюстративную нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный F RSV из подтипа A человека, включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитый с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (ДНК, кодирующая RSV_A F(+)FdTHS DSCav1, экспрессируется из VRC3798).

SEQ ID NO: 384 представляет собой нуклеотидную последовательность экспрессирующего вектора для экспрессии рекомбинантного белка F RSV из подтипа A человека, включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (вектор RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 paH; VRC3798).

SEQ ID NO: 385 представляет собой иллюстративную нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок F RSV из подтипа B человека (штамм B1), включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитый с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (ДНК, кодирующая RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1; экспрессируется из VRC3764 ).

SEQ ID NO: 386 представляет собой нуклеотидную последовательность экспрессирующего вектора для экспрессии рекомбинантного белка F RSV из подтипа B человека (штамм B1), включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (вектор RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1 paH; VRC3764).

SEQ ID NO: 387 представляет собой иллюстративную нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок F RSV из подтипа B человека (штамм 18537), включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитый с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (ДНК, кодирующая RSV_B F(+)FdTHS DSCav1; экспрессируется из VRC3799).

SEQ ID NO: 388 представляет собой нуклеотидную последовательность экспрессирующего вектора для экспрессии рекомбинантного белка F RSV из подтипа B человека (штамм 18537), включающего аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитого с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II (вектор RSV_B F(+)FdTHS DSCav1 paH; VRC3799).

SEQ ID NO: 389-693 представляют собой аминокислотные последовательности рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации.

SEQ ID NO: 694-697 представляют собой аминокислотные последовательности модифицированных полипептидов домена Foldon.

SEQ ID NO: 698-697 представляют собой аминокислотные последовательности модифицированных полипептидов домена Foldon.

SEQ ID NO: 698-828, 1429-1442 и 1474-1478 представляют собой аминокислотные последовательности одноцепочечных рекомбинантных белков F RSV.

SEQ ID NO: 829-1025 и 1456-1468 представляют собой аминокислотные последовательности рекомбинантных белков F RSV, связанных с отщепляющимся доменом foldon, или не связанных с доменом foldon.

SEQ ID NO: 1026 представляет собой аминокислотную последовательность белка F RSV без замен, стабилизирующих предшествующую слиянию конформацию.

SEQ ID NO: 901-968 представляют собой аминокислотные последовательности рекомбинантных белков F RSV. стабилизированных в предшествующей слиянию конформации.

SEQ ID NO: 1027-1088 и 1099-1428 представляют собой аминокислотные последовательности минимальных иммуногенов с участком ∅, которые описаны в примере 14.

СТРУКТУРНЫЕ КООРДИНАТЫ

Атомные координаты кристаллической структуры белка F RSV, связанного с Fab D25, представлены в таблице 1 временной заявки США № 61/780910, поданной 13 марта 2013 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Эти атомные кристаллической структуры белка F RSV, связанного Fab D25, также депонированы под номером доступа Protein Data Bank № 4JHW, который включен в настоящее описание в качестве ссылки, как было представлено в той базе данных на 1 мая 2013 года.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Гликопротеин F RSV представляет собой белок слияния типа I, который способствует слиянию вирусных и клеточных мембран (Walsh and Hruska, J. Virol., 47, 171 (1983)). После первоначального синтеза F RSV принимает метастабильную предшествующую слиянию конформацию, которая аккумулирует энергию сворачивания, которая высвобождается в процессе структурной перестройки в высокостабильную образующуюся после слияния конформацию после контакта с мембранами клеток-хозяев. Было обнаружено, что три антигенных участка (I, II и IV) на белке F RSV индуцируют нейтрализующую активность (Arbiza et al., J. Gen. Virol., 73, 2225 (1992); Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998); López et al., J. Virol., 64, 927 (1990)), и все они существуют в образующейся после слияния форме белка F RSV, как определено в структурных и биофизических исследованиях (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)). Однако поглощение из сыворотки человека образующегося после слияния F RSV не устраняет основную часть F-специфической активности нейтрализации, что указывает на то, что предшествующая слиянию форма F RSV содержит новые нейтрализующие антигенные участки (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 3089 (2012)).

До работы, описанной в настоящем описании, гомогенный препарат растворимого предшествующего слиянию белка F RSV был недоступным, что препятствовало определению структуры предшествующего слиянию F и идентификации новых антигенных участков, специфических для предшествующего слиянию F. Как описано в настоящем описании, были идентифицированы антитела, специфичные к белку F RSV, которые нейтрализуют RSV, но не связываются специфически с образующимся после слияния F RSV, и была получена трехмерная структура предшествующего слиянию F, распознаваемая этими антителами. Эти результаты, представленные в настоящем описании, впервые показали предшествующую слиянию конформацию F RSV и механизм нейтрализации для категории необыкновенно эффективных нейтрализующих антител против предшествующего слиянию F RSV. С использованием трехмерной структуры предшествующего слиянию F в качестве исходной информации, были сконструированы стабилизированные формы предшествующего слиянию F (антигены "PreF") и они были использованы для получения нейтрализующих RSV иммунных ответов, во много раз превышающих ответы, достигаемые с помощью предшествующих иммуногенов на основе белка F RSV.

I. Термины

Если нет иных указаний, технические термины используют в соответствии с общепринятым применением. Определения общих терминов в молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes VII, опубликованной Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994; и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995; и других сходных источниках литературы.

Как используют в рамках изобретения, форма единственного числа относится как к единственному, так и к множественному, числу, если контекст явно не указывает на иное. Например, термин "антиген" включает один антиген или множество антигенов и его можно считать эквивалентным выражению "по меньшей мере один антиген". Как используют в рамках изобретения, термин "содержит" означает "включает". Таким образом, "содержащий антиген" означает "включающий антиген" без исключения других элементов. Кроме того, следует понимать, что любые и все размеры оснований или размеры аминокислот, и все молекулярные массы или величины молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предоставлены только для описательных целей, если нет иных указаний. Хотя можно использовать многие способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем описании, конкретные способы и материалы описаны в настоящем описании. В случае противоречия, настоящее описание, включая пояснения терминов, является решающим. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Для упрощения обзора различных вариантов осуществления предоставлены следующие пояснения терминов:

5C4: Нейтрализующее моноклональное антитело, которое специфически связывается с предшествующей слиянию конформацией белка F RSV, но не с конформацией белка F RSV после слияния. Антитело 5C4 включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей с аминокислотными последовательностями, указанными в качестве SEQ ID NO: 1470 и 1471, соответственно. Как описано в McLellan et al., Science, 340(6136):1113-7, 2013, 5C4 специфически связывается с четвертичным эпитопом, встречающимся на белке F RSV в его предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации. В нескольких вариантах осуществления антитело 5C4 специфически связывается с антигенами PreF, описанными в настоящем описании.

Вариабельный домен тяжелой цепи 5C4:

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFFHWVKQRPEQGLEWIGRIDPADGHTKYDPKFQGKATITADTSSNTAFLQLSSLTSVDTAVYYCATTITAVVPTPYNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 1470)

Вариабельный домен легкой цепи каппа 5C4:

DIVLTQSPASLAVSLGQRTTISCRASESVDSFDNSFIHWYQQKPGQPPKLLIFLASSLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 1471).

Адъювант: Носитель, используемый для усиления антигенности. Адъюванты включают суспензию минералов (квасцы, гидроксид алюминия или фосфат), на которых адсорбирован антиген; или эмульсию типа "вода в масле", например, в которой раствор антигена эмульгирован в минеральном масле (неполный адъювант Фрейнда), иногда с включением убитых микобактерий (полный адъювант Фрейнда) для дальнейшего усиления антигенности (ингибирует деградацию антигена и/или вызывает приток макрофагов). Также в качестве адъювантов можно использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как олигонуклеотиды, включающие мотив CpG). Адъюванты включают биологические молекулы ("биологический адъювант"), такие как костимулирующие молекулы. Иллюстративные адъюванты включают IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL и агонисты toll-подобного рецептора (TLR), такие как агонисты TLR-9. Специалисту в данной области известны адъюванты (см., например, Singh (ed.) Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. Wiley-Interscience, 2007). Адъюванты можно использовать в комбинации с описанными антигенами PreF.

Введение: Введение композиции индивидууму выбранным путем. Введение может быть локальным или системным. Например, если выбранный путь является внутривенным, композицию (такую как a композиция, включающая описанный иммуноген) вводят путем введения композиции в вену индивидуума.

Средство: Любое вещество или комбинация веществ, которые являются пригодными для достижения цели или результата; например, вещество или комбинация веществ, пригодных для ингибирования инфекции RSV у индивидуума. Средства включают белки, молекулы нуклеиновых кислот, соединения, низкомолекулярные соединения, органические соединения, неорганические соединения или другие представляющие интерес молекулы, такие как вирусы, такие как рекомбинантные вирусы. Средство может включать лекарственное средство (такое как средство против RSV), диагностическое средство или фармацевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой полипептидное средство (такое как иммуногенный полипептид RSV) или противовирусное средство. Квалифицированному специалисту будет понятно, что конкретные средства могут быть пригодными для достижения более чем одного результата.

AM22: Нейтрализующее моноклональное антитело, которое специфически связывается с предшествующей слиянию конформацией белка F RSV, но не с образующейся после слияния конформацией белка F RSV. Последовательности белка и нуклеиновой кислоты AM22 известны, например, аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела AM22 указаны в публикации патентной заявки США № 2012/0070446, которая включена в настоящее описание в полном объеме). Как описано в примере 1, AM22 специфически связывается с эпитопом (включенный в антигенный участок ∅), включающим положения, встречающиеся в белке F RSV в его предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации. Этот эпитоп находится в положениях 62-69 и 196-209 F RSV, и расположен на дистальной относительно мембраны вершине белка F RSV в предшествующей слиянию конформации (см., например, фиг.2B и 9A). До настоящего изобретения не было известно, что AM22 является специфичным к предшествующей слиянию конформации. В нескольких вариантах осуществления антитело AM22 специфически связывается с антигенами PreF, описанными в настоящем описании.

Аминокислотные замены: Замена одной аминокислоты в антигене другой аминокислотой или делеция аминокислоты. В некоторых примерах аминокислота в антигене заменена аминокислотой из гомологичного белка.

Животное: Живой многоклеточный позвоночный или беспозвоночный организм; категория, которая включает, например, млекопитающих. Термин "млекопитающее" включает как человека, так и не являющихся человеком млекопитающих.Аналогично термин "индивидуум" включает как человека, так и ветеринарных индивидуумов, таких как не являющиеся человеком приматы. Таким образом, введение индивидууму может включать введение человеку. Неограничивающие примеры ветеринарных индивидуумов включают домашних животных (таких как кошки и собаки), скот (например, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы и козы) и лабораторных животных (например, мышей, крыс, кроликов, песчанок, морских свинок и не являющихся человеком приматов).

Антитело: Полипептид, который в природе по существу кодируется геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулинов или их фрагментами, которые специфически связывают и распознают анализируемое соединение (такое как антиген или иммуноген), такое как белок F RSV или его антигенный фрагмент. Гены иммуноглобулинов включают гены константной области каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также многочисленные гены вариабельных областей иммуноглобулинов. Термин "антитело", как используют в рамках изобретения, включает фрагменты антител, полученные, например, путем модификации целых антител и синтеза de novo с использованием технологий рекомбинантных ДНК.

Антитела существуют, например, в качестве интактных иммуноглобулинов и в качестве ряда хорошо охарктеризованных фрагментов антител. Например, Fab, Fv и одноцепочечные Fv (SCFv), которые связываются с белком F RSV, представляют собой специфичные к белку F RSV связывающие соединения. Они включают интактные иммуноглобулины и их варианты и части, хорошо известные в данной области, такие как Fab'-фрагменты, F(ab) '₂-фрагменты, одноцепочечные белки Fv ("scFv") и стабилизированные дисульфидом белки Fv ("dsFv"). Белок scFv представляет собой слитый белок, в котором вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина и вариабельная область тяжелой цепи иммуноглобулина связаны через линкер, в то время как в dsFv цепи подвергнуты мутации для внесения дисульфидной связи для стабилизации ассоциации цепей. Также термин включает модифицированные способами генной инженерии формы, такие как химерные антитела (такие как гуманизированные антитела мыши), гетероконъюгаты антител (такие как биспецифические антитела). Также см., Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3^rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.

Фрагменты антител определяют следующим образом: (1) Fab - фрагмент, который содержит одновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, полученный путем расщепления целого антитела ферментом папаином до интактной легкой цепи и части одной тяжелой цепи; (2) Fab' - фрагмент молекулы антитела, полученный путем обработки целого антитела пепсином с последующим восстановлением до интактной легкой цепи и части тяжелой цепи; получают два Fab'-фрагмента на молекулу антитела; (3) (Fab')2 - фрагмент антитела, получаемый путем обработки целого антитела ферментом пепсином без последующего восстановления; (4) F(ab')2 - димер двух фрагментов Fab', удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями; (5) Fv - сконструированный способами генной инженерии фрагмент, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, экспрессируемые в качестве двух цепей; и (6) одноцепочечное антитело ("SCA") - сконструированная способами генной инженерии молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, связанные подходящим полипептидным линкером, в качестве генетически слитой одноцепочечной молекулы.

Как правило, встречающийся в природе иммуноглобулин имеет тяжелые (H) цепи и легкие (L) цепи, соединенные друг с другом дисульфидными связями. Существует два типа легкой цепи: лямбда (λ) и каппа (κ). Существует пять основных классов (или изотипов) тяжелой цепи, которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Описанные антитела можно повергать переключению классов.

Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область (эти области также известны как "домены"). В нескольких вариантах осуществления вариабельные домены тяжелой и легкой цепей объединяют для специфического связывания антигена. В дополнительных вариантах осуществления требуется только вариабельный домен тяжелой цепи. Например, встречающиеся в природе антитела животных семейства верблюжьих, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными в отсутствие легкой цепи (см., например, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей содержат "каркасную" область, в которую встроены три гипервариабельные области, также называемые "определяющими комплементарность областями" или "CDR" (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Последовательности каркасных областей различных легких и тяжелых цепей являются относительно консервативными в пределах вида. Каркасная область антитела, которая представляет собой объединенные каркасные области составляющих его легких и тяжелых цепей, служит для размещения и взаимного выстраивания CDR в трехмерном пространстве.

CDR в основном ответственны за связывание эпитопа с антигеном. Границы аминокислотной последовательности данной CDR можно без труда определить с использованием любой из ряда хорошо известных схем, включая схемы, описанные Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; схема нумерации "Kabat"), Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; схема нумерации "Chothia") и Lefranc, et al. ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains", Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; схема нумерации "IMGT").

CDR каждой цепи, как правило, обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3 (от N-конца к C-концу), и их, как правило, также идентифицируют с помощью цепи, в которой конкретная CDR расположена. Таким образом, CDR3 V_H располагается в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором она находится, в то время как CDR1 V_L представляет собой CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором она находится. CDR легкой цепи иногда обозначают как CDR L1, CDR L2 и CDR L3. CDR тяжелой цепи иногда обозначают как CDR H1, CDR H2 и CDR H3.

Антиген: Соединение, композиция или вещество, которые могут стимулировать продукцию антител или T-клеточный ответ у животного, включая композиции, которые инъецируют животному или вводят путем всасывания. Антиген реагирует с продуктами специфического гуморального или клеточного иммунитета, включая продукты иммунитета, индуцируемые гетерологичными антигенами, такими как описанные рекомбинантные белки F RSV.

Примеры антигенов включают, но не ограничиваются ими, полипептиды, пептиды, липиды, полисахариды, их комбинации (такие как гликопептиды) и нуклеиновые кислоты, содержащие антигенные детерминанты, такие как детерминанты, распознаваемые иммунной клеткой. В некоторых примерах антигены включают пептиды, происходящие из представляющего интерес патогена, такого как RSV. В конкретных примерах антиген происходит из RSV, такой как антиген, включающий модифицированный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. "Эпитоп" или "антигенная детерминанта" относятся к области антигена, на которую отвечают B- и/или T-клетки.

Средство против RSV: Средство, которое специфически ингибирует репликацию RSV или инфицирование им клеток. Неограничивающие примеры средств против RSV включают моноклональное антитело паливизумаб (SYNAGIS®; Medimmune, Inc.) и низкомолекулярное противовирусное лекарственное средство рибавирин (изготавливаемый многими источниками, например, Warrick Pharmaceuticals, Inc.).

Атомные координаты или структурные координаты: Математические координаты, полученные из математических уравнений, связанных с паттернами, полученными при дифракции монохроматического пучка рентгеновских лучей атомами (центры рассеяния), такими как атомы антигена или антигена в комплексе с антителом. В некоторых примерах этот антиген может представлять собой белок F RSV (например, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством связывания с антителом, специфическим к предшествующей слиянию конформации, или путем внесения стабилизирующих модификаций) в кристалле. Данные дифракции используют для вычисления карты электронной плотности повторяющегося элемента кристалла. Карты электронной плотности используют для установления положений индивидуальных атомов в единичной ячейке кристалла. В одном примере термин "структурные координаты" относится к декартовым координатам, выведенным из математических уравнений, связанных с паттернами, полученными при дифракции монохроматического пучка рентгеновских лучей, например, атомами белка F RSV в кристаллической форме.

Специалистам в данной области будет понятно, что набор структурных координат, определенных с помощью рентгеновской кристаллографии, имеет стандартную ошибку. Для целей настоящего изобретения любой набор структурных координат, которые имеют среднеквадратичное отклонение для атомов остова белка (N, Cα, C и O), составляющее менее чем приблизительно 1,0 Ангстрем при наложении, как например, приблизительно 0,75, или приблизительно 0,5, или приблизительно 0,25 Ангстрем, при использовании атомов остова будет считаться (в отсутствие явного указания на обратное) идентичным.

Заполняющая полость аминокислотная замена: Аминокислотная замена, которая заполняет полость в центре белка F RSV, например, полость, присутствующую в протомере белка F RSV или полость между протомерами белка F RSV. Полости по существу представляют собой пустоты в свернутом белке, где аминокислоты или боковые цепи аминокислот не присутствуют. В нескольких вариантах осуществления аминокислотную замену с заполнением полости вносят для заполнения полости в центре белка F RSV, присутствующей в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, которая коллапсирует (например, имеет уменьшенный объем) после перехода в образующуюся после слияния конформацию.

Круговая перестановка: Модифицированный рекомбинантный белок, в котором связи между различными областями третичной структуры белка являются модифицированными, так что относительный порядок различных областей в первичной последовательности изменяется, но расположение областей в третичной структуре сохраняется. Например, в случае 4-цепочечного антипараллельного слоя с цепью A, B, C и D, который имеет следующие N- и C-концы и организацию связей,

N-конец- цепь A - линкер - цепь B - линкер - цепь C -линкер - цепь D - C-конец,

круговые перестановки 4 цепей A, B, C и D путем изменения связывания через линкер между цепями включают:

Перестановка с изменением N- и C-концов:

N-конец- цепь C - линкер- цепь D - линкер - цепь A - линкер - цепь B - C-конец

Перестановка с сохранением N-конца:

N-конец- цепь A - линкер - цепь D - линкер - цепь C - линкер - цепь B - C-конец

Перестановка с сохранением C-конца:

N-конец - цепь C - линкер- цепь B - линкер - цепь A - линкер - цепь D - C-конец.

Приведение контакт: Помещение в прямую физическую ассоциацию; в том числе как в твердой форме, так и в жидкой форме. Приведение в контакт включает контакт между одной молекулой и другой молекулой, например, аминокислотой на поверхности одного полипептида, такого как антиген, который контактирует с другим полипептидом, таким как антитело. Приведение в контакт также включает введение, такое как введение описанного антигена индивидууму выбранным путем.

Контроль: Эталонный стандарт. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой отрицательный контрольный образец, полученный от здорового пациента. В других вариантах осуществления контроль представляет собой положительный контрольный образец, полученный от пациента, у которого диагностирована инфекция RSV. В других вариантах осуществления контроль представляет собой исторический контроль или стандартную эталонную величину или диапазон величин (такую как величина для ранее исследованного контрольного образца, такого как группа пациентов с RSV с известным прогнозом или исходом, или группа образцов, которые соответствуют исходным или нормальным величинам).

Различие между исследуемым образом и контролем может представлять собой увеличение или наоборот уменьшение. Различие может представлять собой качественное различие или количественное различие, например, статистически значимое различие. В некоторых примерах различие представляет собой увеличение или снижение относительно контроля, составляющее по меньшей мере приблизительно 5%, как например, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 300%, по меньшей мере приблизительно 350%, по меньшей мере приблизительно 400%, по меньшей мере приблизительно 500% или более 500%.

D25: Нейтрализующее моноклональное антитело, которое специфически связывается с предшествующей слиянию конформацией белка F RSV, но не с образующейся после слияния конформацией белка F RSV. Последовательности белка и нуклеиновой кислоты D25 известны, например аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела D25, указаны в публикации патентной заявки США № 2010/0239593, которая включена в настоящее описание в полном объеме; также см. Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16:123-128, 2009). Как описано в примере 1, D25 специфически связывается с четвертичным эпитопом (включенным в антигенный участок ∅), находящимся на белке F RSV в его предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации. Этот эпитоп включен в положения 62-69 и 196-209 F RSV, и расположен на дистальной относительно мембраны вершине белка F RSV в предшествующей слиянию конформации (см., например, фиг.2B и 9A). До настоящего изобретения было неизвестно, что D25 является специфичным к предшествующей слиянию конформации белка F RSV). В нескольких вариантах осуществления антитело D25 специфически связывается с антигенами PreF, описанными в настоящем описании.

Вырожденный вариант и консервативный вариант: Полинуклеотид, кодирующий полипептид, который включает последовательность, которая является вырожденной благодаря генетическому коду. Например, полинуклеотид, кодирующий описанный антиген, или антитело, которое специфически связывает описанный антиген, который включает последовательность, которая является вырожденной благодаря генетическому коду. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых определяется более чем одним кодоном. Таким образом, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены при условии, что аминокислотная последовательность антигена или антитела, которое связывается с антигеном, кодируемым нуклеотидной последовательностью, является неизмененной. Вследствие вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют любой данный полипептид. Например, все из кодонов CGU, CGC, CGA, CGG, AGA и AGG кодируют аминокислоту аргинин. Таким образом, в каждом положении, где определяется аргинин в кодирующей последовательности белке, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодирующего белка. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие вариации", которые являются одним из типов консервативных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в рамках настоящего изобретения, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы стандартными способами. Таким образом, каждая "молчащая вариация" нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности.

Специалисту в данной области будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот (например, менее 5%, в некоторых вариантах осуществления менее 1%) в кодируемой последовательности, являются консервативными вариациями, где изменения приводят к замене аминокислоты химически сходной аминокислотой.

Консервативные аминокислотные замены, обеспечивающие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга:

1) аланин (A), серин (S), треонин (T);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

Не во всех положениях остатков белка допустима в остальных случаях "консервативная" замена. Например, если аминокислотный остаток необходим для функции белка, даже в остальных случаях консервативная замена может нарушить эту активность, например, специфическое связывание антитела с эпитопом-мишенью может быть нарушено посредством консервативной мутации в эпитопе-мишени.

Эпитоп: Антигенная детерминанта. Они представляют собой конкретные химические группы или пептидные последовательности на молекуле, которые являются антигенными, так что они индуцируют специфический иммунный ответ, например, эпитоп представляет собой область антигена, на которую отвечают B- и/или T-клетки. Антитело связывает конкретный антигенный эпитоп, такой как эпитоп белка F RSV, например, эпитоп D25 или AM22, присутствующий на предшествующей слиянию конформации белка F RSV.

Эпитопы могут быть образованы последовательно расположенными аминокислотами или не расположенными последовательно аминокислотами, находящимися рядом в третичной укладке белка. Эпитопы, образованные последовательно расположенными аминокислотами, как правило, сохраняется под воздействием денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные третичной укладкой, как правило, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, и, более часто, по меньшей мере 5, приблизительно 9 или приблизительно 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и ядерный магнитный резонанс. Эпитопы также могут включать посттрансляционную модификацию аминокислот, такую как N-связанное гликозилирование.

В одном варианте осуществления T-клетки отвечают на эпитоп, когда эпитоп презентируется совместно с молекулой MHC. Эпитопы могут быть образованы как последовательно расположенными аминокислотами, так и не последовательно расположенными аминокислотами, находящимися рядом в третичной укладке белка. Эпитопы, образованные не последовательно расположенными аминокислотами, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные третичной укладкой, как правило, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, и, более часто, по меньшей мере 5, приблизительно 9, или приблизительно 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и ядерный магнитный резонанс.

"Эпитоп-мишень" представляет собой конкретный эпитоп на антигене, который специфически связывает представляющее интерес антитело, такое как моноклональное антитело. В некоторых примерах эпитоп-мишень включает аминокислотные остатки, которые контактируют с представляющим интерес антителом, так что эпитоп-мишень можно выбирать по аминокислотным остаткам, определенным как находящиеся в контакте с представляющим интерес антителом.

Эффективное количество: Количество средства, такого как антиген PreF или нуклеиновая кислота, кодирующая антиген PreF, или другого средства, которое является достаточным для возникновения желаемого ответа, такого как иммунный ответ на белок F RSV, или снижения или устранения признака или симптома состояния или заболевания, такого как инфекция RSV. Например, оно может представлять собой количество, необходимое для ингибирования репликации вируса или для изменения на поддающемся измерению уровне заметных симптомов вирусной инфекции. Как правило, это количество является достаточным для ингибирования на поддающемся измерению уровне репликации или инфекционности вируса (например, RSV). При введении индивидууму, как правило, используют дозировку, которая достигает заданных концентраций в тканях (например, в дыхательной ткани), для которой показано, что она достигает ингибирование репликации вируса in vitro. В некоторых примерах "эффективное количество" представляет собой количество, которое осуществляет лечение (в том числе профилактику) одного или нескольких симптомов и/или основных причин какого-либо из нарушений или заболеваний, например, для лечения инфекции RSV. В одном примере эффективное количество представляет собой терапевтически эффективное количество. В одном примере эффективное количество представляет собой количество, которое препятствует развитию одного или нескольких признаков или симптомов конкретного заболевания или состояния, таких как один или несколько признаков или симптомов, ассоциированных с инфекцией RSV.

Экспрессия: Трансляция нуклеиновой кислоты в белок. Белки могут экспрессироваться и оставаться внутриклеточно, могут становиться компонентом мембраны на клеточной поверхности или могут секретироваться во внеклеточный матрикс или среду.

Экспрессия последовательностей контроля: Последовательности нуклеиновой кислоты, которые регулируют экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, с которой они функционально связаны. Последовательности контроля экспрессии функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, когда последовательности контроля контролируют и регулируют транскрипцию, и, в соответствующих случаях, трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, последовательности контроля экспрессии могут включать соответствующие промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, инициирующий кодон (ATG) перед кодирующим белком геном, сигналы сплайсинга для интронов, поддерживающие правильную рамку считывания этого гена для обеспечения надлежащей трансляции мРНК, и стоп-кодоны. Термин "последовательности контроля" включает, как минимум, компоненты, присутствие которых может влиять на экспрессию, и также могут включать дополнительные компоненты, присутствие которых является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности партнеров по слиянию. Последовательности контроля экспрессии могут включать промотор.

Промотор представляет собой минимальную последовательность, достаточную для обеспечения транскрипции. Также включены промоторные элементы, которые являются достаточными, чтобы обеспечить контролируемую зависимую от промотора экспрессию гена для экспрессии, специфической для типа клеток, тканеспецифической или индуцируемой внешними сигналами или средствами; такие элементы могут быть расположены в 5'- или 3'-областях гена. Включены как конститутивные, так и индуцибельные промоторы (см. например, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Например, при клонировании в бактериальных системах можно использовать индуцибельные промоторы, такие как pL бактериофага лямбда, plac, ptrp, ptac (гибридный промотор ptrp-lac) и т.п. В одном варианте осуществления при клонировании в клеточных системах млекопитающих, можно использовать промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (такие как промотор металлотеонеина) или из вирусов млекопитающих (таких как длинный концевой повтор ретровируса; поздний промотор аденовируса; промотор 7.5K вируса осповакцины). Также можно использовать промоторы, продуцируемые способами рекомбинантных ДНК или синтетическими способами, для обеспечения транскрипции последовательностей нуклеиновых кислот.

Полинуклеотид можно встраивать в экспрессирующий вектор, который содержит промоторную последовательность, которая облегчает эффективную транскрипцию встроенной последовательности гена в хозяине. Экспрессирующий вектор, как правило, содержит ориджин репликации, промотор, а также определенные последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют фенотипическую селекцию трансформированных клеток.

Ферритин: Белок, который накапливает железо и высвобождает его контролируемым образом. Этот белок продуцируется практически всеми живыми организмами. Ферритин собирается в глобулярный белковый комплекс, который в некоторых случаях состоит из 24 белковых субъединиц. В некоторых примерах ферритин используют для формирования наночастиц, презентирующих антигены на их поверхности, например, антиген RSV, такой как описанные антигены белка F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации.

Домен Foldon: Аминокислотная последовательность, которая естественным образом формирует тримерную структуру. В некоторых примерах домен Foldon может быть включен в аминокислотную последовательность описанного антигена белка F RSV, стабилизированного в предшествующей слиянию конформации, чтобы антиген образовывал тример. В одном примере пример домен Foldon представляет собой домен Foldon T4, указанный в качестве SEQ ID NO: 351 (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF). Несколько вариантов осуществления включают домен Foldon, который может отщепляться от очищенного белка, например, путем включения участка расщепления тромбином, соседнего с доменом Foldon, который можно использовать для целей расщепления.

Гликопротеин (gp): Белок, который содержит олигосахаридные цепи (гликаны), ковалентно связанные с боковыми цепями полипептида. Углевод связывается с белком при котрансляционной или посттрансляционной модификации. Этот процесс известен как гликозилирование. В белках, которые имеют сегменты, выходящие за пределы клетки, внеклеточные сегменты часто являются гликозилированными. Гликопротеины часто являются важными интегральными мембранными белками, где они играют роль в межклеточных взаимодействиях. В некоторых примерах гликопротеин представляет собой гликопротеин RSV, такой как антиген белка F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации или его иммуногенный фрагмент.

Участок гликозилирования: Аминокислотная последовательность на поверхности полипептида, такого как белок, которая обеспечивает присоединение гликана. Участок N-связанного гликозилирования представляет собой триплетную последовательность NX(S/T), в которой N представляет собой аспарагин, X представляет собой любые остатки за исключением пролина и (S/T) представляет собой остаток серина или треонина. Гликан представляет собой полисахарид или олигосахарид. Гликан также можно использовать для обозначения углеводной части гликоконъюгата, такого как гликопротеин, гликолипид или протеогликан.

Гомологичные белки: Белки, которые обладают сходной структурой и функцией, например, белки из двух или более видов или вирусных штаммов, которые обладают сходной структурой и функцией в двух или более видах или вирусных штаммах. Например, белок F RSV из RSV A представляет собой белок, гомологичный белку F RSV из бычьего RSV. Гомологичные белки обладают общими характеристиками укладки белка и могут считаться структурными гомологами.

Гомологичные белки, как правило, обладают высокой степенью консервативности последовательности, такой как по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% консервативность последовательности, и высокой степенью идентичности последовательностей, такой как по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичность последовательности.

Клетки-хозяева: Клетки, в которых вектор может увеличиваться в количестве и его ДНК может экспрессироваться. Клетка может быть прокариотической или эукариотической. Термин также включает любое потомство рассматриваемой клетки-хозяина. Понятно, что любое потомство может не быть идентичным исходной клетке, поскольку могут существовать мутации, которые возникают в процессе репликации. Однако такое потомство включается в используемый термин "клетка-хозяин".

Иммуноген: Белок или его часть, которые способны индуцировать иммунный ответ у млекопитающего, такого как млекопитающее, инфицированное или имеющее риск инфицирования патогеном. Введение иммуногена может приводить к защитному иммунитету и/или проактивному иммунитету против представляющего интерес патогена. В некоторых примерах иммуноген включает описанный антиген PreF.

Иммунный ответ: Ответ клетки иммунной системы, такой как B-клетка, T-клетка или моноцит, на стимул. В одном варианте осуществления ответ является специфичным к конкретному антигену ("антигенспецифический ответ"). В одном варианте осуществления иммунный ответ представляет собой T-клеточный ответ, такой как CD4+ ответ или CD8+ ответ. В другом варианте осуществления ответ представляет собой B-клеточный ответ, и он приводит к продуцированию специфических антител.

Иммунный ответ, смещенный в сторону "Th1", характеризуется присутствием CD4⁺ T-хелперных клеток, которые продуцируют IL-2 и IFN-γ, и, таким образом, секрецией или присутствием IL-2 и IFN-γ. Напротив, иммунный ответ, смещенный в сторону "Th2", характеризуется преимуществом CD4⁺ хелперных клеток, которые продуцируют IL-4, IL-5 и IL-13.

Иммуногенная композиция: Композиция, содержащая антиген, который индуцирует иммунный ответ, такой как поддающийся измерению ответ CTL против вируса, экспрессирующего антиген, или поддающийся измерению B-клеточный ответ (такой как продуцирование антител) против антигена. По сути, иммуногенная композиция включает один или несколько антигенов (например, полипептидных антигенов) или антигенных эпитопов. Иммуногенная композиция также может включать один или несколько дополнительных компонентов, способных индуцировать или усиливать иммунный ответ, таких как эксципиент, носитель и/или адъювант. В определенных случаях иммуногенные композиции вводят для индукции иммунного ответа, который защищает индивидуума от симптомов и состояний, индуцируемых патогеном. В некоторых случаях симптомы или заболевание, вызываемые патогеном, предупреждаются (или снижаются или смягчаются) путем ингибирования репликации патогена (например, RSV) после воздействия патогена на индивидуума. В одном примере "иммуногенная композиция" включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, который индуцирует поддающийся измерению ответ CTL против вируса, экспрессирующего белок F RSV, или индуцирует поддающийся измерению B-клеточный ответ (такой как продуцирование антител) против белка F RSV. Кроме того, она относится к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим антиген, таким как нуклеиновая кислота, которую можно использовать для экспрессии антигена (и, таким образом, можно использовать для индукции иммунного ответа против этого полипептида).

Для применения in vitro иммуногенная композиция может включать антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Для применения in vivo иммуногенная композиция, как правило, включает белок, иммуногенный пептид или нуклеиновую кислоту в фармацевтически приемлемых носителях и/или другие средства. Любой конкретный пептид, такой как описанный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, или нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, можно без труда исследовать в отношении способности индуцировать ответ CTL или B-клеточный ответ с помощью известных в данной области анализов. Иммуногенные композиции могут включать адъюванты, которые хорошо известны специалисту в данной области.

Иммунологически реактивные условия: Включают указание на условия, которые позволяют антителу, индуцированному против конкретного эпитопа, связываться с этим эпитопом в поддающейся обнаружению большей степени, чем связывание по существу со всеми другими эпитопами, и/или в степени, по существу исключающей его. Иммунологически реактивные условия зависят от формата реакции связывания антител и, как правило, представляют собой условия, используемые в протоколах иммуноанализа, или условия, встречающиеся in vivo. Иммунологически реактивные условия, используемые в способах, представляют собой "физиологические условия", которые включают указание на условия (такие как температура, осмолярность, pH), которые являются типичными внутри живого млекопитающего или клетки млекопитающего. Хотя является общепризнанным, что некоторые органы подвергаются воздействию чрезмерных условий, внутриорганизменная и внутриклеточная среда обычно представляет собой приблизительно pH 7 (как например, от pH 6,0 до pH 8,0, более конкретно pH от 6,5 до 7,5), содержит воду в качестве преобладающего растворителя и существует при температуре выше 0°C и ниже 50°C. Осмолярность находится в диапазоне, который поддерживает жизнеспособность и пролиферацию клеток.

Иммунологический зонд: Молекула, которую можно использовать для селекции антител из сывороток, которые направлены против конкретного эпитопа или антигена, в том числе из сывороток пациентов-людей. В некоторых примерах описанные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации, можно использовать в качестве иммунологических зондов как в положительной, так и в отрицательной селекции антител, специфичных к белку F RSV в предшествующей слиянию конформации.

Иммуногенная поверхность: Поверхность молекулы, например, белка F RSV, способного индуцировать иммунный ответ. Иммуногенная поверхность включает определяющие признаки этой поверхности, например, трехмерную форму и заряд поверхности. В некоторых примерах иммунногенная поверхность определяется аминокислотами на поверхности белка или пептида, которые контактируют с антителом, таким как нейтрализующее антитело, когда белок и антитело связаны вместе. Эпитоп-мишень включает иммуногенную поверхность. Иммуногенная поверхность является синонимом антигенной поверхности.

Ингибирование или лечение заболевания: Ингибирование полного развития заболевания или состояния, например, у индивидуума, который имеет риск заболевания, такого как инфекция RSV. "Лечение" относится к терапевтическому вмешательству, которое смягчает признак или симптом заболевания или патологического состояния после того, как оно начало развиваться. Термин "смягчение" применительно к заболеванию или патологическому состоянию относится к любому наблюдаемому благоприятному эффекту лечения. О благоприятном эффекте может свидетельствовать, например, отсроченное появление клинических симптомов заболевания у предрасположенного индивидуума, уменьшение тяжести некоторых или всех клинических симптомов заболевания, более медленное прогрессирование заболевание, улучшение общего состояния здоровья или благополучия индивидуума, или другие параметры, хорошо известные в данной области, которые являются специфическими для конкретного заболевания. "Профилактическое" лечение представляет собой лечение, проводимое у индивидуума, который не проявляет признаков заболевания или проявляет только ранние признаки для снижения риска развития патологии.

Термин "снижает" представляет собой относительный термин, так что средство снижает ответ или состояние, если ответ или состояние количественно уменьшаются после введения средства или если они уменьшаются после введения средства по сравнению с эталонным средством. Аналогично, термин "предупреждает" не обязательно означает, что средство полностью устраняет ответ или состояние при условии, что по меньшей мере одна характеристика ответа или состояния устраняется. Таким образом, иммуногенная композиция, которая снижает или предупреждает инфекцию или ответ, такие как патологический ответ, например, усиленное вакциной вирусное заболевание, может, но не обязательно полностью, устранить такую инфекцию или ответ при условии, что инфекция или ответ уменьшаются на поддающемся измерению уровне, например, по меньшей мере приблизительно на 50%, как например, по меньшей мере приблизительно на 70%, или приблизительно на 80%, или даже приблизительно на 90% (т.е. до 10% или менее) относительно инфекции или ответа в присутствии средства или по сравнению с эталонным средством.

Выделенный: "Выделенный" биологический компонент (такой как белок, например, описанный антиген PreF или нуклеиновая кислота, кодирующая такой антиген) по существу отделен или очищен от других биологических компонентов, таких как другие биологические компоненты, в которых компонент встречается в природе, такие как другие хромосомные и внехромосомные ДНК, РНК и белки. Белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, которые являются "выделенными", включают белки, очищенные стандартными способами очистки. Также термин охватывает белки или пептиды, полученные посредством рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы белков, пептидов и нуклеиновых кислот. Выделенный не требует абсолютной чистоты и может включать молекулы белка, пептида или нуклеиновой кислоты, которые являются по меньшей мере на 50% выделенными, например, по меньшей мере на 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или даже 99,9% выделенными. Антигены PreF, описанные в настоящем описании (например, выделенный рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации) являются отделенными от белков F RSV в образующейся после слияния конформации, например, являются по меньшей мере на 80% отделенными, по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или даже на 99,9% отделенными от белков F RSV в образующийся после слияния конформации. В нескольких вариантах осуществления антиген PreF по существу отделен от белков F RSV, которые не включают антигенный участок ∅ и/или не связываются специфически предшествующим слиянию специфическим моноклональным антителом (таким как D25 или AM22), например, антиген PreF может быть отделен по меньшей мере на 80%, отделен по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или даже 99,9% от белков F RSV, которые не включают антигенного участка ∅ и/или не связываются специфически моноклональным антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, таким как D25 или AM22.

K_d: Константа диссоциации для данного взаимодействия, такого как взаимодействие полипептид-лиганд или взаимодействие антитело-антиген. Например, для бимолекулярного взаимодействия антитела (такого как D25) и антигена (такого как белок F RSV), она представляет собой концентрацию индивидуальных компонентов бимолекулярного взаимодействия, деленную на концентрацию комплекса. Способы определения K_d для взаимодействия антитело:антиген известны специалисту в данной области.

Метка: Поддающееся обнаружению соединение или композиция, которые конъюгированы прямо или непрямо с другой молекулой для облегчения обнаружения этой молекулы. Конкретные неограничивающие примеры меток включают флуоресцентные метки, ферментные метки, ферментные связи и радиоактивные изотопы. В некоторых примерах описанный антиген PreF является меченным поддающейся обнаружению меткой. В некоторых примерах метка присоединена к описанному антигену или нуклеиновой кислоте, кодирующей такой антиген.

Линкер: Бифункциональная молекула, которую можно использовать для связывания двух или более молекул в одну непрерывную молекулу, например, для связывания молекулы носителя с иммуногенным полипептидом. Неограничивающие примеры пептидных линкеров включают пептидный линкер (G₄S)₁, (G₄S)₂ или (G₄S)₃.

Термины "конъюгация", "присоединение", "связывание" или "объединение" могут относиться к преобразованию двух молекул в одну непрерывную молекулу; например, к связыванию двух других полипептидов в один непрерывный полипептид или к ковалентному присоединению молекулы носителя или другой молекулы к иммуногенному полипептиду, такому как рекомбинантный белок F RSV, как описано в настоящем описании. Связывание может быть осуществлено либо химическими, либо рекомбинантными способами. "Химические способы" относятся к реакции, например, между иммуногенной полипептидной частью и молекулой носителя, чтобы между двумя молекулами образовывалась ковалентная связь с образованием одной молекулы.

MPE8: Нейтрализующее моноклональное антитело, которое специфически связывается с предшествующей слиянию конформацией белка F RSV, но не с образующейся после слияния конформацией белка F RSV. Как описано в Corti et al. (Nature, 501(7467)439-443, 2013, включенная в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), антитело MPE8 связывается с эпитопом, встречающимся в предшествующей слиянию конформации, но не образующейся после слияния конформации, белка F RSV. Эпитоп MPE8 не является частью антигенного участка ∅. Последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей указаны в качестве SEQ ID NO: 1472 и 1473, соответственно.

Нативный антиген или нативная последовательность: Антиген или последовательность, которые не модифицированы посредством селективной мутации, например, селективной мутации для фокусирования антигенности антигена на эпитопе-мишени. Нативный антиген или нативную последовательность также обозначают как антиген дикого типа или последовательность дикого типа.

Нуклеиновая кислота: Полимер, состоящий из нуклеотидных элементов (рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, сходные встречающиеся в природе структурные варианты и синтетические не встречающиеся в природе их аналоги), связанных фосфодиэфирными связями, их сходными встречающимися в природе структурными вариантами и синтетическими не встречающимися в природе аналогами. Таким образом, термин включает нуклеотидные полимеры, в которых нуклеотиды и связи между ними включают не встречающиеся в природе синтетические аналоги, например такие как, но не ограничиваясь ими, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептидно-нуклеиновые кислоты (PNA) и т.п. Такие полинуклеотиды можно синтезировать, например, с использованием автоматизированного устройства для синтеза ДНК. Термин "олигонуклеотид", как правило, относится к коротким полинуклеотидам, как правило, не превышающим приблизительно 50 нуклеотидов. Будет понятно, что, когда нуклеотидная последовательность представлена в качестве последовательности ДНК (т.е. A, T, G, C), она также включает последовательность РНК (т.е. A, U, G, C), в которой "T" заменен на "U".

"Нуклеотид" включает, но не ограничивается ими, мономер, который включает основание, связанное с сахаром, такое как пиримидин, пурин или их синтетические аналоги, или основание, связанное с аминокислотой, как в пептидно-нуклеиновой кислоте (PNA). Нуклеотид представляет собой один мономер в полинуклеотиде. Нуклеотидная последовательность относится к последовательности оснований в полинуклеотиде.

В настоящем описании используют общепринятое обозначение для описания нуклеотидных последовательностей: левый конец одноцепочечной нуклеотидной последовательности представляет собой 5'-конец; направление в левую сторону двухцепочечной нуклеотидной последовательности обозначают как 5'-направление. Направление от 5' к 3' присоединению нуклеотидов образующихся транскриптов РНК обозначают как направление транскрипции. Цепь ДНК, имеющую такую же последовательность, как и мРНК, обозначают как "кодирующая цепь"; последовательности на цепи ДНК, имеющие такую же последовательность, как и у мРНК, транскрибированной с этой ДНК и которые располагаются с 5'-стороны от 5'-конца РНК-транскрипта, называют "вышележащими последовательностями"; последовательности на цепи ДНК, имеющие такую же последовательность, как и у РНК и которые располагаются с 3'-стороны от 3'-конца кодирующего РНК-транскрипта, называют "нижележащими последовательностями".

"кДНК" относится к ДНК, которая является комплементарной или идентичной мРНК, либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме.

"Кодирующий" относится к неотъемлемому свойству конкретных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таких как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (например, рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательность аминокислот и биологические свойства, являющиеся их результатом. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, продуцируемой с этого гена, продуцирует белок в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в списке последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции, гена или кДНК, может быть указана как кодирующая белок или другой продукт этого гена или кДНК. Если нет иных указаний, "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать интроны. В некоторых примерах нуклеиновая кислота кодирует описанный антиген PreF.

Функционально связанный: Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются непрерывными и, когда необходимо связать две кодирующих белок области, находящимися в одной рамке считывания.

Антитело, специфичное к предшествующей слиянию конформации: Антитело, которое специфически связывается с белком F RSV в предшествующей слиянию конформации, но не связывается специфически с белком F RSV в образующейся после слияния конформации. Иллюстративные предшествующие слиянию специфические антитела включают антитела D25, AM22, 5C4 и MPE8.

Полипептид: Любая цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации (такой как гликозилирование или фосфорилирование). "Полипептид" относится к полимерам аминокислот, включающим встречающиеся в природе полимеры аминокислот и не встречающиеся в природе полимеры аминокислот, а также полимеры аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой неприродную аминокислоту, например, искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты. "Остаток" относится к аминокислоте или миметику аминокислоты, включенным в полипептид через амидную связь или миметик амидной связи. Полипептид имеет амино-конец (N-конец) и карбокси-конец (C-конец). "Полипептид" используют взаимозаменяемо с пептидом или белком, и используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков.

Одна непрерывная полипептидная цепь аминокислотных остатков может включать множество полипептидов. Например, полипептид F₀ RSV включает N-концевой сигнальный пептид, полипептид F₂, полипептид pep27 и полипептид F₁, включающий внеклеточный домен F₁, трансмембранный домен и цитозольный хвостовой домен. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV представляет собой одноцепочечный белок F RSV, включающий полипептид F₂ RSV, связанный с полипептидом F₁ RSV через пептидный линкер.

Во многих случаях полипептид сворачивается в определенную трехмерную структуру и может включать экспонированные на поверхности аминокислотные остатки и не экспонированные на поверхности аминокислотные остатки. В некоторых случаях белок может включать множество полипептидов, которые сворачиваются в функциональный элемент. Например, белок F RSV состоит из гетеродимеров F₁/F₂, которые тримеризуются в мультимерный белок. "Экспонированные на поверхностиаминокислотные остатки" представляют собой аминокислоты, которые имеют некоторую степень экспонирования на поверхности белка, например, так что они могут контактировать с растворителем, когда белок находится в растворе. Напротив, не экспонированные на поверхности аминокислоты представляют собой аминокислотные остатки, которые не экспонированы на поверхности белка, так что они не контактируют с раствором, когда белок находится в растворе. В некоторых примерах не экспонированные на поверхности аминокислотные остатки являются частью сердцевины белка.

"Сердцевина белка" представляет собой внутреннюю часть свернутого белка, которая по существу свободна от воздействия растворителя, такого как растворитель в форме молекул воды в растворе. Как правило, сердцевина белка по большей части состоит из гидрофобных или аполярных аминокислот. В некоторых примерах сердцевина белка может содержать заряженные аминокислоты, например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин и/или лизин. Включение некомпенсированных заряженных аминокислот (компенсированная заряженная аминокислота может быть в форме солевого мостика) в белок может привести к дестабилизации белка. Таким образом, белок имеет более низкую T_m, чем сходный белок без некомпенсированной заряженной аминокислоты в сердцевине белка. В других примерах сердцевина белка может иметь полость в сердцевине белка. Полости по существу представляют собой пустоты в свернутом белке, где аминокислоты или боковые цепи аминокислот не присутствуют. Такие полости также могут дестабилизировать белок относительно сходного белка без полости. Таким образом, при создании стабилизированной формы белка может быть преимущественной замена аминокислотных остатков в сердцевине для заполнения полостей, присутствующих в белке дикого типа.

Аминокислоты в пептиде, полипептиде или белке, как правило, являются химически связанными через амидные связи (CONH). Кроме того, аминокислоты могут быть связаны вместе другими химическими связями. Например, связи аминокислот или аминокислотных аналогов могут включать CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂ -, -CH=CH-- (цис и транс), -COCH₂ --, -CH(OH)CH₂- и -CHH₂SO- (Эти и другие связи могут быть найдены в Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Аcids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (общий обзор); Morley, Trends Pharm Sci pp. 463-468, 1980; Hudson, et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185, 1979; Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249, 1986; Harm J. Chem. Soc Perkin Trans. 1307-314, 1982; Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398, 1980; Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533, 1982; Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404, 1983; и Hruby Life Sci 31:189-199, 1982.

Пептидные модификации: Пептиды, такие как описанные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации, можно модифицировать, например, для включения аминокислотной замены по сравнению с нативной последовательностью белка RSV или различными химическими способами для получения производных, имеющих по существу ту же активность и конформацию, что и немодифицированные пептиды, и необязательно имеющих другие желаемые свойства. Например, группы карбоновой кислоты в белке, как С-концевые, так и боковых цепей, могут находиться в форме соли фармацевтически приемлемого катиона или могут быть этерифицированы с образованием C₁-C₁₆ сложного эфира, или конвертированы в амид формулы NR₁R₂, где каждый из R₁ и R₂ независимо представляет собой H или C₁-C₁₆ алкил, или они объединены с образованием гетероциклического кольца, такого как 5- или 6-членное кольцо. Аминогруппы пептида, как N-концевые, так и боковых цепей, могут находиться в форме фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли, такой как соль HCl, HBr, уксусной, бензойной, толуолсульфоновой, малеиновой, виннокаменной и других органических кислот, или они могут быть модифицированы в C₁-C₁₆ алкил или диалкиламино или далее конвертированы в амид.

Гидроксильные группы боковых цепей пептидов можно конвертировать в C₁-C₁₆ алкокси или в C₁-C₁₆ сложный эфир с использованием общепризнанных способов. Фенильные и фенольные кольца боковых цепей пептидов могут быть замещены одним или несколькими атомами галогена, такими как F, Cl, Br или I, или C₁-C₁₆ алкилом, C₁-C₁₆ алкокси, карбоновыми кислотами и их сложными эфирами, или амидами таких карбоновых кислот. Метиленовые группы боковых цепей пептидов могут быть удлинены до гомологичных C₂-C₄ алкиленов. Тиолы могут быть защищены любыми из ряда общеизвестных защитных групп, таких как ацетамидные группы.

Фармацевтически приемлемые носители: Фармацевтически приемлемые носители для применения являются общеизвестными. В Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995, описаны композиции и составы, пригодные для фармацевтической доставки описанных иммуногенов.

Как правило, природа носителя зависит от конкретного используемого пути введения. Например, парентеральные составы обычно включат инъекционные жидкости, которые включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или сходные с ними, в качестве носителя. Для твердых композиций (например, формы порошка, пилюли, таблетки или капсулы), общепринятые нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической категории. В дополнение к биологически нейтральным носителям, фармацевтические композиции, подлежащие введению, могут содержать небольшие количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие средства или эмульгаторы, консерванты и pH-буферные средства и т.п., например, ацетат натрия или монолаурат сорбитана. В конкретных вариантах осуществления, пригодных для введения индивидууму, носитель может быть стерильным и/или он может быть суспендирован или может иным образом содержаться в единичной дозированной форме, содержащей одну или несколько измеренных доз композиции, пригодной для индукции желаемого иммунного ответа против RSV. Также его могут сопровождать лекарственные вещества для применения для целей лечения. Единичная дозированная форма может находиться, например, в герметично закрытом флаконе, который содержит стерильное содержимое, или в шприце для инъекций индивидууму, или она может быть лиофилизированной для последующей солюбилизации и введения, или она может находиться в твердой форме или в форме с контролируемым высвобождением.

Вакцинация по типу первичной иммунизации-усиливающей иммунизации: Иммунотерапия, включающая введение первой иммуногенной композиции (первичная вакцина), за которой следует введение второй иммуногенной композиции (усиливающая вакцина) индивидууму для индукции иммунного ответа. Первичная вакцина и/или усиливающая вакцина включают вектор (такой как вирусный вектор, РНК-вектор или ДНК-вектор), экспрессирующий антиген, на который направлен иммунный ответ. Усиливающую вакцину вводят индивидууму после первичной вакцины; квалифицированному специалисту будет понятен подходящий временной интервал между ведением первичной вакцины и усиливающей вакцины, и примеры таких временных рамок описаны в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления первичная вакцина, усиливающая вакцина или как первичная вакцина, так и усиливающая вакцина, дополнительно включают адъювант. В одном неограничивающем примере, первичная вакцина представляет собой вакцину на основе ДНК (или другую вакцину на основе генной доставки) и усиливающая вакцина представляет собой вакцину на основе субъединицы белка или белковых наночастиц.

Белковая наночастица: Мультисубъединичная структура на белковой основе многогранной формы. Каждая из субъединиц состоит из белков или полипептидов (например, гликозилированный полипептид), и, необязательно одного или нескольких из следующих элементов: нуклеиновые кислоты, простетические группы, органические и неорганические соединения. Неограничивающие примеры белковых наночастиц включают наночастицы ферритина (см., например, Zhang, Y. Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011, включенную в настоящее описание в качестве ссылки), наночастицы инкапсулина (см., например, Sutter et al., Nature Struct. and Mol. Biol., 15:939-947, 2008, включенную в настоящее описание в качестве ссылки), наночастицы оксигеназы-редуктазы серы (SOR) (см., например, Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006, включенную в настоящее описание в качестве ссылки), наночастицы лумазинсинтазы (см., например, Zhang et al., J. Mol. Biol., 306: 1099-1114, 2001) или наночастсицы пируватдегидрогеназы (см., например, Izard et al., PNAS 96: 1240-1245, 1999, включенную в настоящее описание в качестве ссылки). Ферритин, инкапсулин, SOR, лумазинссинтаза и пируватдегидрогеназа представляют собой мономерные белки, которые самостоятельно собираются в глобулярные белковые комплексы, которые в некоторых случаях состоят из 24, 60, 24, 60 и 60 белковых субъединиц, соответственно. В некоторых примерах мономеры ферритина, инкапсулина, SOR, лумазинсинтазы или пируватдегидрогеназы связаны с описанным антигеном (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации) и самостоятельно собираются в белковые наночастицы, презентирующие описанные антигены на их поверхности, которые можно вводить индивидууму для стимуляции иммунного ответа на антиген.

Рекомбинантный: Рекомбинантная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая имеет последовательность, которая не является встречающейся в природе, или имеет последовательность, которая получена путем искусственного комбинирования двух в ином случае разделенных сегментов последовательности. Это искусственное комбинирование можно осуществлять химическим синтезом или, более часто, искусственным манипулированием выделенных сегментов нуклеиновых кислот, например, способами генной инженерии. Рекомбинантный белок представляет собой белок, который имеет последовательность, которая не является встречающейся в природе, или имеет последовательность, которая получена путем искусственного комбинирования двух в ином случае разделенных сегментов последовательности. В нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок кодируется гетерологичной (например, рекомбинантной) нуклеиновой кислотой, которая введена в клетку, такую как бактериальная или эукариотическая клетка. Нуклеиновую кислоту можно вводить, например, на экспрессирующем векторе, имеющем сигналы, способные экспрессировать белок, кодируемый введенной нуклеиновой кислотой, или нуклеиновая кислота может встраиваться в хромосому клетки-хозяина.

Переупаковывающая аминокислотная замена: Аминокислотная замена, которая увеличивает взаимодействия соседних остатков в белке, например, путем усиления гидрофобных взаимодействий или образования водородных связей, или путем снижения неблагоприятных или отталкивающих взаимодействий соседних остатков, например, путем устранения кластеров сходным образом заряженных остатков. В нескольких вариантах осуществления переупаковывающую аминокислотную замену вносят для увеличения взаимодействий соседних остатков в белке F RSV в предшествующей слиянию конформация, которые не находятся рядом в образующейся после слияния конформации F RSV. Как правило, внесение переупаковывающей аминокислотной замены увеличивает T_m предшествующей слиянию конформации белка F RSV и снижает T_m образующейся после слияния конформации белка F RSV.

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV): Оболочечный несегментированный одноцепочечный РНК-вирус с отрицательной смысловой цепью семейства Paramyxoviridae. Он является наиболее распространенной причиной бронхиолита и пневмонии среди детей в течение первого года жизни и инфицирует практически всех детей к возрасту, составляющему 3 года. RSV также вызывает повторяющиеся инфекции, включающие тяжелое заболевание нижних дыхательных путей, которое может возникнуть в любом возрасте, особенно среди пожилых индивидуумов или индивидуумов с нарушением сердечной, легочной или иммунной системой. В США обусловленный RSV бронхиолит является ведущей причиной госпитализации у младенцев и основной причиной астмы и свистящего дыхания в детском возрасте (Shay et al., JAMA, 282, 1440 (1999); Hall et al., N. Engl. J. Med., 360, 588 (2009)). По всему миру RSV был ответственен за 66000-199000 смертей каждый год у детей младше пяти лет (Nair et al., Lancet, 375, 1545 (2010)), и служит причиной 6,7% смертей среди младенцев в возрасте от одного месяца до одного года - больше чем любой другой отдельно взятый патоген, за исключением малярии (Lozano et al., Lancet, 380, 2095 (2013)).

Геном RSV имеет длину ~15000 нуклеотидов и он включает 10 генов, кодирующих 11 белков, включая гликопротеины SH, G и F. Белок F опосредует слияние, позволяя вхождение вируса в цитоплазму клеток, а также ускоряя образование синцития. Описано два подтипа штаммов RSV человека: подтипы A и B, исходя из различий в антигенности гликопротеина G. Также известны штаммы RSV для других видов, включая RSV быков. Иллюстративные последовательности штаммов RSV известны специалисту в данной области. Кроме того, доступно несколько моделей инфекции RSV человека, включая модельные организмы, инфицированные hRSV, а также модельные организмы, инфицированные видоспецифическим RSV, такие как применение инфекции bRSV у крупного рогатого скота (см., например, Bern et al., Am J, Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 301: L148-L156, 2011).

Известно несколько способов диагностики инфекции RSV, включая применение прямого флуоресцентного обнаружения антител (DFA), хроматографическое быстрое обнаружение антигена и обнаружение вирусной РНК с использованием ОТ-ПЦР. Количественное определение вирусной нагрузки можно определять, например, с помощью анализа бляшкообразования, ферментного иммуноанализа с улавливанием антигена (EIA) или ПЦР. Количественное определение уровней антител можно определять с помощью специфического для подтипа анализа нейтрализации или ELISA. Современный способ лечения RSV представляет собой пассивное введение моноклонального антитела паливизумаба (SYNAGIS®), которое распознает белок F RSV (Johnson et al., J. Infect. Dis., 176, 1215 (1997); Beeler and van Wyke Coelingh, J. Virol., 63, 2941 (1989)) и снижает встречаемость тяжелого заболевания (The IMpact-RSV Study Group, Pediatrics, 102, 531 (1998)). (Также см., например, Nam and Kun (Eds.). Respiratory Syncytial Virus: Prevention, Diagnosis and Treatment. Nova Biomedical Nova Science Publisher, 2011; и Cane (Ed.) Respiratory Syncytial Virus. Elsevier Science, 2007).

Существует несколько подтипов RSV, включая подтип A человека, подтип B человека и бычий подтип. В подтипах RSV существуют индивидуальные штаммы каждого подтипа. Например, SEQ ID NO: 1-128, представленные в настоящем описании, включают последовательности белка F RSV для многих штаммов подтипа A RSV, которые (как показано в таблице 3 ниже) являются высокогомологичными.

Белок слияния (F) RSV: Гликопротеин оболочки RSV, который способствует слиянию вирусной и клеточной мембран. В природе белок F RSV первоначально синтезируется в качестве единого полипептидного предшественника длиной приблизительно 574 аминокислот, обозначаемого как F₀. F₀ включает N-концевой сигнальный пептид, который определяет локализацию в эндоплазматической сети, где сигнальный пептид (приблизительно первые 25 остатков F₀) протеолитически отщепляется. Остальные остатки F₀ олигомеризуются с образованием тримера, который вновь протеолитически процессируется клеточной протеазой в двух консервативных консенсусных последовательностях расщепления фурина (приблизительно положения F₀ 109 и 136; например, RARR₁₀₉ (SEQ ID NO: 124, остатки 106-109) и RKRR₁₃₆ (SEQ ID NO: 124, остатки 133-136) с образованием двух связанных дисульфидной связью фрагментов: F₁ и F₂. Меньший из этих фрагментов, F₂, происходит из N-концевой части предшественника F₀ и включает приблизительно остатки 26-109 F₀. Больший из этих фрагментов, F₁, включает C-концевую часть предшественника F₀ (приблизительно остатки 137-574), включая внеклеточную/люменальную область (~ остатки 137-524), трансмембранный домен (~ остатки 525-550) и цитоплазматический домен (~ остатки 551-574) на C-конце.

Три протомера F₂-F₁ олигомеризуются в зрелый белок F, который принимает метастабильную "предшествующую слиянию" конформацию, которая претерпевает конформационное изменение (в "образующуюся после слияния" конформацию) при контакте с мембраной клетки-мишени. Это конформационное изменение обнажает гидрофобную последовательность, известную как пептид слияния, которая расположена на N-конце полипептида F₁ и которая связывается с мембраной клетки-хозяина и ускоряет слияние мембраны вируса или инфицированной клетки с мембраной клетки-мишени.

Был идентифицирован ряд нейтрализующих антител, которые специфически связываются с антигенными участками на белке F RSV. Они включают моноклональные антитела 131-2a и 2F, которые связываются с антигенным участком I (центром которого является остаток P389); моноклональные антитела паливизумаб и мотавизумаб, которые связываются с антигенным участком II (центром которого являются остатки 254-277); и моноклональные антитела 101F и mAb19, которые связываются с антигенным участком IV (центром которого являются остатки 429-437).

Одноцепочечный белок F RSV: Рекомбинантный белок F RSV, который экспрессируется в качестве единой полипептидной цепи, включающей полипептид F₁ RSV и полипептид F₂ RSV. Одноцепочечный белок F RSV тримеризуется с образованием эктодомена белка F RSV. Одноцепочечный белок F RSV не включает участков расщепления фурином, фланкирующих полипептид pep27 белка F RSV; таким образом, при продуцировании в клетках полипептид F₀ не расщепляется на отдельные полипептиды F₁ и F₂. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечный белок F RSV включает делецию двух участков расщепления фурином, полипептида pep27 и пептида слияния. В одном варианте осуществления положение 103 или 105 связано с положением 145 белка RSV с образованием одноцепочечной конструкции. В нескольких вариантах осуществления остальные части полипептидов F₁ и F₂ связаны через линкер, такой как пептидный линкер.

Полипептид F₀ RSV (F₀): Предшественник белка F RSV, включающий аминокислоты N-концевого сигнального пептида, полипептид F₂, полипептид pep27 и полипептид F₁, включающий внеклеточный домен F₁, трансмембранный домен и цитозольную хвостовую часть. Нативный полипептид F₀ протеолитически процессируется в участке отщепления сигнальной последовательности и двух участках расщепления фурином (приблизительно положения 109 и 136 F₀; например, RARR₁₀₉ (SEQ ID NO: 124, остатки 106-109) и RKRR₁₃₆ (SEQ ID NO: 124, остатки 133-136), с образованием фрагментов F₁ и F₂. Примеры полипептидов F₀ из многих различных подгрупп RSV известны, в том числе из подгруппы A, подгруппы B и подгруппы быков, примеры которых указаны в настоящем описании как SEQ ID NO: 1-128, 129-177 и 178-184, соответственно.

ПолипептидF₁ RSV (F₁): Пептидная цепь белка F RSV. Как используют в рамках изобретения, "полипептид F₁" относится как к нативным полипептидам F₁, так и к полипептидам F₁, включающим модификации (например, аминокислотные замены, инсерции или делеции) нативной последовательности, например, модификации, предназначенные для стабилизации рекомбинантного белка F (включая модифицированный полипептид F₁) в предшествующей слиянию конформации белка F RSV. Нативный F₁ включает приблизительно остатки 137-574 предшественника F₀ RSV, и включает (от N- к C-концу) внеклеточную/люминальную область (~ остатки 137-524), трансмембранный домен (~остатки 525-550) и цитоплазматический домен (~ остатки 551-574). Несколько вариантов осуществления включают полипептид F₁, модифицированный из нативной последовательности F₁, например полипептид F₁, который лишен трансмембранного и цитозольного домена и/или включает одну или несколько аминокислотных замен, которые стабилизируют рекомбинантный белок F (содержащий полипептид F₁) в предшествующей слиянию конформации. В одном примере описанный белок F RSV включает полипептид F₁ с делецией трансмембранного и цитозольного домена и заменами на остатки цистеина в положениях 155 и 290. В другом примере описанный белок F RSV включает полипептид F₁ с делецией одного из трансмембранных и цитозольных доменов, заменами на остатки цистеина в положениях 155 и 290, и заменой на фенилаланин в положении 190. В другом примере описанный белок F RSV включает полипептид F₁ с делецией трансмембранного и цитозольного доменов, заменами на остатки цистеина в положениях 155 и 290, заменой на фенилаланин в положении 190, и заменой на лейцин в положении 207. В нескольких вариантах осуществления полипептид F1 включает связанный с C-концом домен тримеризации. Известны многие примеры нативных последовательностей F₁, которые предоставлены в настоящем описании приблизительно в качестве положений 137-524 SEQ ID NO: 1-184.

Полипептид F₂ RSV (F₂): Полипептидная цепь белка F RSV. Как используют в рамках изобретения, "полипептид F₂" относится как к полипептидам F₂ с нативной последовательностью, так и к полипептидам F₂, включающим модификации (например, аминокислотные замены) нативной последовательности, например, модификации, предназначенные для стабилизации рекомбинантного белка F (включая модифицированный полипептид F₂) в белке F RSV в предшествующей слиянию конформации. Нативный F₂ включает приблизительно остатки 26-109 предшественника F₀RSV. В нативном белке F RSV полипептид F₂ связан с полипептидом F₁ двумя дисульфидными связями. Известны многие примеры нативных последовательностей F₂, которые предоставлены в настоящем описании приблизительно в качестве положений 26-109 SEQ ID NO: 1-184.

Полипептидpep27 RSV (pep27): Полипептид из 27 аминокислот, который вырезается из предшественника F₀ в процессе созревания белка F RSV. pep27 фланкируется двумя участками расщепления фурином, которые расщепляются клеточной протеазой в процессе созревания белка F с образованием полипептида F₁ и F₂. Известны примеры нативных последовательностей pep27, которые предоставлены в настоящем описании в качестве положений 110-136 SEQ ID NO: 1-184.

Предшествующая слиянию конформация белка F RSV: Структурная конформация, принимаемая белком F RSV перед запуском события слияния, которое приводит к переходу F RSV в образующуюся после слияния конформацию и последующему процессингу в зрелый белок F RSV в секреторной системе. Трехмерная структура иллюстративного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации описана в настоящем описании (см. пример 1) и структурные координаты иллюстративного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации, связанного антителом D25, специфичным к предшествующей слиянию конформации, представлены в таблице 1. Как показано в настоящем описании, предшествующая слиянию конформация F RSV является сходной с общей структурой предшествующей слиянию конформации других парамиксовирусов (таких как PIV, см. фиг.7), хотя и с некоторыми значительными отличиями. В предшествующем слиянию состоянии белок F RSV включает антигенный участок на дистальной относительно мембраны вершине ("антигенный участок ∅", см. пример 1), который включает остатки 62-69 и 196-209 F RSV, и также включает эпитопы антител D25 и AM22. Как используют в рамках изобретения, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, может специфически связываться антителом, которое является специфичным к предшествующей слиянию конформации белка F RSV, таким как антитело, которое специфически связывается с эпитопом в антигенном участке ∅, например, антитело D25 или AM22. Дополнительные антитела, специфичные к предшествующей слиянию конформации, включают антитела 5C4 и MPE8.

Образующаяся после слияния конформация белка F RSV: Структурная конформация, которую принимает белок F RSV, которая не является предшествующей слиянию конформацией, и в которой N- и C-концы белка F RSV являются проксимальными в стабильной двойной спирали. Образующаяся после слияния конформация белка F RSV описана на атомном уровне (см., например, McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011; Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619, 2011; и структурные координаты депонированы под номером доступа PDB №3RRR; все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок). Образующаяся после слияния конформация белка F RSV является сходной с конформацией, известной для других гликопротеинов парамиксовирусов, включая белок F PIV5. В образующейся после слияния конформации белок F RSV не включает антигенный участок ∅, и, таким образом, не включает эпитоп D25 и не связывается специфически посредством D25 или AM22. Образующаяся после слияния конформация RSV возникает, например, после слияния белка F с клеточной мембраной. Последовательность белка F RSV, которая при экспрессии может сворачиваться в образующуюся после слияния конформацию, предоставлена в качестве SEQ ID NO: 1469.

Антиген с измененной поверхностью или иммуноген с измененной поверхностью: Полипептидный иммуноген, происходящий из антигена дикого типа, в котором аминокислотные остатки вне или за пределами эпитопа-мишени подвергнуты мутациям системным образом для фокусирования иммуногенности антигена на выбранном эпитопе-мишени. В некоторых примерах антиген с измененной поверхностью обозначают как иммуноген со скрытыми антигенами или антиген со скрытыми антигенами.

Среднеквадратичное отклонение (RMSD): Квадратный корень арифметического среднего значений квадратов отклонений от среднего значения. В нескольких вариантах осуществления RMSD используют в качестве способа выражения отклонения или варьирования от структурных координат эталонной трехмерной структуры. Это число, как правило, вычисляют после оптимального наложения двух структур в качестве квадратного корня среднеквадратических расстояний между эквивалентными атомами Cα. В некоторых вариантах осуществления эталонная трехмерная структура включает структурные координаты белка F RSV, связанного с моноклональным антителом D25, указанные в настоящем описании в таблице 1.

Идентичность/сходство последовательностей: Идентичность/сходство между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот, или двумя или более аминокислотными последовательностями выражают в значениях идентичности или сходства между последовательностями. Идентичность последовательностей можно измерять в значениях процентной идентичности; чем более высоким является процент, тем более идентичными являются последовательности. Гомологи и ортологи последовательностей нуклеиновой кислоты или аминокислотных последовательностей обладают относительно высокой степенью идентичности/сходства последовательностей при выравнивании с использованием стандартных способов.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; и Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. В Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, представлено детальное описание способов выравнивания последовательностей и вычисления гомологии.

После выравнивания количество совпадений определяют путем подсчета количества положений, в которых в обеих последовательностях находится идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток. Процентную идентичность последовательностей определяют путем деления числа совпадений либо на указанную длину последовательности в идентифицированной последовательности, либо на четко определенную длину (такую как 100 последовательно расположенных нуклеотидов или аминокислотных остатков из последовательности, указанной в идентифицированной последовательности), с последующим умножением полученной величины на 100. Например, пептидная последовательность, которая имеет 1166 совпадений при выравнивании с исследуемой последовательностью, имеющей 1554 аминокислоты, на 75,0 процентов идентична исследуемой последовательности (1166÷1554*100=75,0). Величину процентной идентичности последовательности округляют до ближайшей десятой доли. Например, 75,11, 75,12, 75,13 и 75,14 округляют вниз до 75,1, в то время как 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 и 75,19 округляют вверх до 75,2. Величина длины всегда представляет собой целое число.

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990) является доступным из нескольких источников, включая National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) и через Интернет, для применения вместе с программами анализа последовательностей blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx. Описание того, как определить идентичность последовательностей с использованием этой программы, доступно на web-сайте NCBI через Интернет.

Гомологи и варианты полипептида, как правило, характеризуются наличием по меньшей мере приблизительно 75%, например по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательностей, подсчитанной при выравнивании по всей длине с представляющей интерес аминокислотной последовательностью. Белки с еще большим сходством с эталонными последовательностями будут демонстрировать увеличение процентной идентичности при оценке этим способом, как например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99% идентичность последовательностей. Когда менее чем полную последовательность сравнивают для определения идентичности последовательностей, гомологи и варианты, как правило, обладают по меньшей мере 80% идентичностью последовательности на протяжении коротких окон из 10-20 аминокислот, и могут обладать идентичностью последовательностей по меньшей мере 85% или по меньшей мере 90% или 95% в зависимости от их сходства с эталонной последовательностью. Способы определения идентичности последовательностей на протяжении таких коротких окон доступны на web-сайте NCBI через Интернет. Специалисту в данной области будет понятно, что эти диапазоны идентичности последовательностей предоставлены только для сведения; является вполне возможным, что могут быть получены строго достоверные гомологи, которые не входят в предоставленные диапазоны.

Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности, в которой сравнивают исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей исследуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, указывают координаты подпоследовательностей, если необходимо, и указывают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Используют параметры по умолчанию программы. Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с использованием алгоритма локальной гомологии Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, алгоритма выравнивания по гомологии Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, с использованием способа поиска сходства Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, с использованием компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или с использованием выравнивания вручную и визуального исследования (см., например,Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) и Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013). Одним примером пригодного алгоритма является PILEUP. В PILEUP используется упрощение способа прогрессивного выравнивания Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. Используемый способ является сходным со способом, описанным Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. С использованием PILEUP эталонную последовательность сравнивают с другими исследуемыми последовательностями для определения взаимосвязи процентной идентичности последовательностей с использованием следующих параметров: вес пропуска по умолчанию (3,00), вес продолжения пропуска по умолчанию (0,10) и имеющие вес концевые пропуски. Может быть использован PILEUP из пакета программ для анализа последовательностей GCG, например, версии 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984.

Другим примером алгоритмов, которые являются пригодными для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 и Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является общедоступным через National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih.gov). В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используются в качестве параметров по умолчанию длина слова (W) 11, выравнивание (B) 50, ожидание (E) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В программе BLASTP (для аминокислотных последовательностей) используются в качестве параметров по умолчанию длина слова (W) 3 и ожидание (E) 10, и оценочная матрица BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989). Олигонуклеотид представляет собой линейную полинуклеотидную последовательность длиной вплоть до приблизительно 100 нуклеотидных оснований.

Другим признаком сходства последовательностей между двумя нуклеиновыми кислотами является способность к гибридизации. Чем более сходными являются последовательности двух нуклеиновых кислот, тем более жесткими являются условия, при которых они гибридизуются. Жесткость условий гибридизации является зависимой от последовательности и различается при различных внешних параметрах. Таким образом, условия гибридизации, приводящие к конкретным степеням жесткости, будут варьировать в зависимости от природы выбранного способа гибридизации и длины гибридизующихся последовательностей нуклеиновых кислот. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (особенно концентрация Na⁺ и/или Mg⁺⁺) буфера для гибридизации определяют жесткость гибридизации, хотя также на жесткость влияет время промывания. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы они были приблизительно на 5°C-20°C ниже, чем температура плавления (T_m) конкретной последовательности, которая определяется ионной силой и pH. T_m представляет собой температуру (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с полностью совпадающим зондом. Условия гибридизации нуклеиновых кислот и вычисление жесткости могут быть найдены, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993; и Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4^th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

Как используют в рамках изобретения, указание на "по меньшей мере 80% идентичность" относится к "по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или даже 100% идентичности" с указанной эталонной последовательностью.

Сигнальный пептид: Короткая аминокислотная последовательность (например, длиной приблизительно 18-25 аминокислот), которая направляет вновь синтезированные секреторные или мембранные белки на и через мембраны (например, мембрана эндоплазматической сети). Сигнальные пептиды, как правило, располагаются на N-конце полипептида и удаляются сигнальными пептидазами после прохождения полипептида через мембрану. Последовательности сигнальных пептидов, как правило, содержат три общих структурных признака: N-концевая полярная основная область (n-область), гидрофобная сердцевина и гидрофильная c-область). Иллюстративные последовательности сигнальных пептидов представлены в качестве остатков 1-25 SEQ ID NO: 1-182 (сигнальные пептиды белка F RSV из RSV A, B и бычьего RSV).

Специфически связывается: При указании на образование белкового комплекса антитело:антиген, относится к реакции связывания, которая определяет присутствие являющегося мишенью белка, пептида или полисахарида (например, гликопротеин), в присутствии гетерогенной популяции белков и других биологических соединений. Таким образом, в указанных условиях антитело связывается предпочтительно с конкретным являющимся мишенью белком, пептидом или полисахаридом (таким как антиген, присутствующий на поверхности патогена, например F RSV) и не связывается в существенном количестве с другими белками или полисахаридами, присутствующими в образце или у индивидуума. Антитело, которое специфически связывается с предшествующей слиянию конформацией белка F RSV (например, и антитело, которое специфически связывается с антигенным участком ∅), не связывается специфически с образующейся после слияния конформацией белка F RSV. Специфическое связывание можно определять способами, известными в данной области. Ссылаясь на комплекс антитело:антиген или Fab:антиген, специфическое связывание антигена и антитела имеет K_d (или кажущуюся K_d) менее чем приблизительно 10^-6 моль/л, как например, менее чем приблизительно 10^-7 моль/л, 10^-8 моль/л, 10^-9 или даже менее чем приблизительно 10^-10 моль/л.

Растворимый белок: Белок, способный растворяться в водной жидкости при комнатной температуре и оставаться растворенным. Растворимость белка может меняться в зависимости от концентрации белка в жидкости на водной основе, буферных условий жидкости, концентрации других растворимых соединений в жидкости, например, концентраций соли и белка, и нагревания жидкости. В нескольких вариантах осуществления растворимый белок представляет собой белок, который растворяется до концентрации по меньшей мере 0,5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) при комнатной температуре и остается растворенным в течение по меньшей мере 48 часов.

Терапевтическое средство: Химическое соединение, низкомолекулярное соединение или другая композиция, такая как молекула нуклеиновой кислоты, способные индуцировать желаемый терапевтический или профилактический эффект при надлежащем введении индивидууму.

Терапевтически эффективное количество: Количество средства, такого как описанный антиген или иммуногенная композиция, содержащая описанный антиген, которое является достаточным для предупреждения, лечения (в том числе профилактики), снижения и/или смягчения симптомов и/или основных причин любого из нарушений или заболеваний, например, для предупреждения, ингибирования и/или лечения инфекции RSV. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество является достаточным для снижения или устранения симптома заболевания, такого как инфекция RSV. Например, оно может представлять собой количество, необходимое для ингибирования репликации вируса или для изменения на поддающемся измерению уровне заметных симптомов вирусной инфекции. Как правило, это количество является достаточным для ингибирования на поддающемся измерению уровне репликации или инфекционности вируса (например, RSV). При введении индивидууму обычно используют дозировку, которая будет достигать концентраций в ткани-мишени, которые, как было показано, достигают ингибирования репликации вируса in vitro. Понятно, что достижение защитного иммунного ответа против патогена может требовать многократных введений иммуногенной композиции. Таким образом, терапевтически эффективное количество охватывает дробную дозу, которая вносит вклад в комбинацию с предшествующим или последующим введениями для достижения защитного иммунного ответа.

Трансмембранный домен: Аминокислотная последовательность, которая встроена в липидный бислой, такой как липидный бислой клетки, или вируса, или вирусоподобной частицы. Трансмембранный домен можно использовать для заякоривания антигена на мембране. В некоторых примерах трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен белка F RSV. Иллюстративные трансмембранные домены F RSV известны специалисту в данной области и представлены в настоящем описании. Например, аминокислотные последовательности иллюстративных трансмембранных доменов F RSV представлены приблизительно в качестве положений 525-550 SEQ ID NO: 1-183.

Трансформированный: Трансформированная клетка представляет собой клетку, в которую введена молекула нуклеиновой кислоты способами молекулярной биологии. Как используют в рамках изобретения, термин "трансформация" охватывает все способы, посредством которых молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в такую клетку, включая трансфекцию вирусными векторами, трансформацию плазмидными векторами и введение ДНК способом электропорации, липофекции и ускорения с использованием генной пушки.

Вакцина: Фармацевтическая композиция, которая индуцирует профилактический или терапевтический иммунный ответ у индивидуума. В некоторых случаях иммунный ответ представляет собой защитный иммунный ответ. Как правило, вакцина индуцирует антигенспецифический иммунный ответ на антиген патогена, например, вирусный патоген, или на клеточный компонент, связанные с патологически состоянием. Вакцина может включать полинуклеотид (такой как нуклеиновая кислота, кодирующая описанный антиген), пептид или полипептид (такой как описан в настоящем описании), вирус, клетку или один или несколько клеточных компонентов.

Вектор: Молекула нуклеиновой кислоты, введенная в клетку-хозяина, с получением тем самым, трансформированной клетки-хозяина. Рекомбинантные ДНК-векторы представляют собой векторы, имеющие рекомбинантную ДНК. Вектор может включать последовательности нуклеиновой кислоты, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, такие как ориджин репликации. Вектор также может включать один или несколько генов селективных маркеров и другие генетические элементы, известные в данной области. Вирусные векторы представляют собой рекомбинантные ДНК-векторы, имеющие по меньшей мере некоторые последовательности нуклеиновой кислоты, происходящие из одного или нескольких вирусов.

Вирусный вектор включает вирусный вектор с дефектом репликации, который требует комплементации одной или нескольких областей вирусного генома, необходимых для репликации, в результате, например, дефекта функции по меньшей мере одного необходимого для репликации гена. Например, такой вирусный вектор не реплицируется в типичных клетках-хозяевах, особенно в клетках-хозяевах, которые могут быть инфицированы вирусным вектором в процессе выполнения терапевтического способа. Примеры вирусных векторов с дефектом репликации и систем для их применения известны в данной области и включают, например, векторы LCMV с дефектом репликации (см., например, публикацию патента США № 2010/0297172, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) и аденовирусные векторы с дефектом репликации (см., например, публикацию заявки PCT № WO2000/00628, включенную в настоящее описание в качестве ссылки).

Вирус: Вирус по существу состоит из центральной нуклеиновой кислоты, окруженной белковой оболочкой, и он обладает способностью реплицироваться только внутри живой клетки. "Вирусная репликация" представляет собой образование дополнительного вируса путем осуществления по меньшей мере одного жизненного цикла вируса. Вирус может нарушать нормальные функции клеток-хозяев, вынуждая клетку существовать определяемым вирусом образом. Например, вирусная инфекция может приводить к продукции клеткой цитокина или ответу на цитокин, в то время как неинфицированная клетка этого не делает. В некоторых примерах вирус является патогеном.

Вирусоподобная частица (VLP): Нереплицирующаяся вирусная оболочка, происходящая из любого из нескольких вирусов. VLP, как правило, состоит из одного или нескольких вирусных белков, таких как, но не ограничиваясь ими, белки, называемые белками капсида, покровными белками, белками оболочки, поверхностными белками и/или оболочечными белками, или образующих частицы полипептидов, происходящих из этих белков. VLP могут образовываться самопроизвольно при рекомбинантной экспрессии белка в соответствующей экспрессирующей системе. Способы получения конкретных VLP известны в данной области. Присутствие VLP после рекомбинантной экспрессии вирусных белков можно обнаруживать с использованием общепринятых способов, известных в данной области, таких как электронная микроскопия, биофизическая охарактерзация и т.п. Кроме того, VLP можно выделять известными способами, например, центрифугированием в градиенте плотности, и идентифицировать по образованию полос характерной плотности. См., например, Baker et al. (1991) Biophys. J. 60:1445-1456; и Hagensee et al. (1994) J. Virol. 68:4503-4505; Vincente, J Invertebr Pathol., 2011; Schneider-Ohrum и Ross, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 354: 53073, 2012).

II. Описание нескольких вариантов осуществления

В настоящем описании описано, что белок F RSV претерпевает значительную структурную перестройку между его предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией (см. пример 1, ниже). Как показано на фиг.2B, N-концевая область полипептида F₁ в предшествующей слиянию конформации (соответствующая части дистальной относительно мембраны доли, показанной на фиг.2A) включает указанные α2, α3, β3, β4 и α4 спиральные структуры и структуры бета-слоя, в то время как соответствующая область N-конца полипептида F₁ в образующейся после слияния структуре включает удлиненную α5-спиральную структуру. Кроме того, C-концевая область полипептида F₁ в предшествующей слиянию конформации (соответствующая частично проксимальной относительно мембраны доле, показанной на фиг.2A) включает указанные β22, α9 и β23 структуры бета-слоя и спиральные структуры, в то время как соответствующая структура C-концевой области полипептида F₁ в образующейся после слияния конформации включает удлиненную α10-спиральную структуру. Таким образом, дистальная относительно мембраны и проксимальная относительно мембраны доли белка F RSV в предшествующей слиянию конформации включают несколько различных структурных элементов, которые отсутствуют в соответствующих областях белка F RSV в образующейся после слияния конформации. Аминокислотные положения (и последовательности), соответствующие этим областям, выделены серым цветом на фиг.2, включая положения 137-216 и 461-513 полипептида F₁.

Предусматриваются антигены белка F RSV, которые стабилизированы или "закрыты" в предшествующей слиянию конформации, называемые "антигенами PreF". С использованием конструирования на структурной основе, в полипептидах F₁ и F₂RSV были выбраны положения для модификации (например, аминокислотной замены) для препятствования или предотвращения перехода белка F RSV из предшествующей слиянию конформации в образующуюся после слияния конформацию. Такие антигены имеют применимость, например, в качестве иммуногенов, для индукции нейтрализующего ответа на белок F RSV.

A. Нативные белки F RSV

Нативные белки F RSV из различных групп RSV, а также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки, и способы являются известными. Например, последовательность нескольких белков-предшественников F₀ RSV подтипа A, B и бычьего подтипа предоставлена в качестве SEQ ID NO: 1-184. Идентификатор GenInfo (gi) и соответствующий номер доступа для каждой из этих последовательности, а также соответствующая группа RSV, представлены в таблице 3:

Белок F RSV проявляет значительную консервативность последовательности среди подтипов RSV (см. таблице 3, в которой показана попарная идентичность последовательности среди подтипов и сегментов белка F). Например, подтипы A и B RSV обладают 90% идентичностью последовательностей, и каждый из подтипов A и B RSV обладает идентичностью 81% с белком F bRSV, в молекуле-предшественнике F₀. В подтипах RSV идентичность последовательности F₀ является еще более высокой; например, среди каждого из подтипов A, B и бычьего подтипа RSV, белок-предшественник F₀ RSV имеет ~98% идентичность последовательности. Практические все идентифицированные белки-предшественники F₀ RSV имеют длину приблизительно 574 аминокислоты с небольшими отличиями в длине, как правило, вследствие длины C-концевой цитоплазматической хвостовой части. Идентичность последовательностей среди белков F RSV проиллюстрирована в таблице 4:

Ввиду консервативности последовательностей F RSV специалист в данной области может без труда сравнить положения аминокислот между различными нативными последовательностями F RSV для идентификации соответствующих аминокислотных положений F RSV между различными штаммами и подтипами RSV. Например, среди практически всех идентифицированных нативных белков-предшественников F₀ RSV, участки расщеплений фурином находятся в одних и тех же положениях. Таким образом, консервативность последовательностей белка F RSV среди штаммов и подтипов позволяет использовать эталонную последовательность F RSV для сравнения аминокислот в конкретных положениях белка F RSV. Для целей настоящего изобретения (если контекст не указывает на иное), аминокислотные положения белка F RSV приведены относительно полипептида белка-предшественника F₀, представленного в качестве SEQ ID NO: 124 (соответствующий номеру доступа GENBANK® № P03420, включенному в настоящее описание в качестве ссылки, как было представлено в GENBANK® 28 февраля 2013 года).

B. Антигены PreF

В настоящем описании описаны выделенные антигены, которые включают рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации ("антигены PreF"). Антигены PreF содержат рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент, который был модифицирован относительно нативной формы для увеличения иммуногенности. Например, описанные рекомбинантные белки F RSV модифицированы относительно нативной последовательности RSV для стабилизации в предшествующей слиянию конформации. Специалисту в данной области будет понятно, что описанные антигены PreF являются пригодными для индукции иммунологических ответов у позвоночных животных (таких как млекопитающие, например, люди и крупный рогатый скот) на RSV (например, RSV A, RSV B или бычий RSV). Таким образом, в нескольких вариантах осуществления описанные антигены представляют собой иммуногены.

Антитело D25 распознает четвертичный эпитоп, включающий множество протомеров белка F RSV. Этот эпитоп находится в антигенном участке ("антигенный участок ∅"), расположенном на дистальной относительно мембраны вершине гликопротеина F RSV (см., например, фиг.1C), когда он находится в предшествующей слиянию конформации. Хотя вторичные структурные элементы на этом эпитопе остаются по большей части неизменными между предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией F, их относительная ориентация существенно изменяется, причем α4-спираль вращается на ~180° относительно цепи β2 в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации (см., например, фиг.3B). Конформационные изменения структуры белка F RSV между предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией определяют присутствие эпитопа D25 на белке F RSV. Таким образом, в нескольких вариантах осуществления антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, можно идентифицировать путем определения специфического связывания моноклонального антитела D25 с антигеном. Специалисту в данной области будет понятно, что другие антитела, которые специфически связываются с антигенным участком ∅ белка F RSV (такие как антитело AM22 или антитело 5C4), или другие антитела, которые являются специфичными к предшествующей слиянию конформации, но не связывают антигенный участок ∅ (такие как MPE8), также можно использовать для идентификации антигена PreF, включая белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

Таким образом, антигены PreF, описанные в настоящем описании, специфически связываются антителом, которое является специфичным к предшествующей слиянию конформации F RSV, но не к образующейся после слияния конформации. В нескольких вариантах осуществления антиген PreF специфически связывается антителами D25 и/или AM22, которые (как описано в настоящем описании) представляют собой антитела, специфичные к предшествующей слиянию конформации, но не к образующейся после слияния конформации белка F RSV. В нескольких примерах антитело, специфичное к предшествующей слиянию конформации, (такое как D25 или AM22) специфически связывается с антигеном PreF с константой диссоциации менее чем приблизительно 10^-6 моль/л, такой как менее чем приблизительно 10^-7 моль/л, 10^-8 моль/л или менее чем приблизительно 10^-9 моль/л. Специфическое связывание можно определять способами, известными в данной области. Определение специфического связывания можно без труда проводить, используя или адаптируя стандартные методики, такие как ELISA, конкурентный иммуноанализ, поверхностный плазмонный резонанс или другие иммуносорбентные анализы (описанные во многих стандартных текстах, включая Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF не связывается специфически антителом, которое специфически связывает образующуюся после слияния конформацию белка F RSV. Примером является антитело, специфичное к пучку из шести спиралей, присутствующему только в образующейся после слияния конформации белка F RSV (например, как описано в Magro et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A., 109:3089-3094, 2012). В нескольких примерах константа диссоциации для связывания антитела, специфичного к образующемуся после слияния F RSV, с антигеном PreF превышает 10^-5 моль/л, например, составляет по меньшей мере 10^-5 моль/л, 10^-4 моль/л или 10^-3.

В нескольких вариантах осуществления любой из антигенов PreF включает эпитоп предшествующего слиянию белка F RSV (такой как эпитоп D25 или AM22) в конформации, связываемой антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации белка F RSV (такой как конформация, связываемая D25 или AM22). Например, в нескольких вариантах осуществления любой из антигенов PreF включает эпитоп в конформации, связываемой D25 или AM22 (например, конформация, определяемая структурными координатами, представленными в таблице 1), когда антиген PreF не связан с D25 или AM22, т.е. антиген PreF стабилизирован в конформации, связываемой D25- или AM22. Способы определения того, включает ли описанный антиген PreF эпитоп белка предшествующего слиянию F RSV (такой как эпитоп D25 или AM22) в конформации, связываемой моноклональным антителом, специфичным белку F RSV в предшествующей слиянию конформации (такой как конформация, связываемая D25 или AM22), известны специалисту в данной области и дополнительно описаны в настоящем описании (см., например, McLellan et al., Nature, 480:336-343, 2011; и публикацию патентной заявки США № 2010/0068217, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Например, описанную трехмерную структуру Fab-фрагмента D25 в комплексе с белком F RSV можно сравнивать с трехмерной структурой любого из описанных антигенов PreF.

Специалисту в данной области будет понятно, что описанный антиген PreF может включать эпитоп в конформации, связываемой моноклональным антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, даже если структурные координаты антигена не являются строго идентичными структурным координатам предшествующего слиянию белка F, описанного в настоящем описании. Например, в нескольких вариантах осуществления любой из описанных антигенов PreF включает эпитоп, специфический для предшествующего слиянию F RSV (такой как эпитоп D25 или AM22), который в отсутствие моноклонального антитела, специфичного к предшествующему слиянию F RSV, может быть структурно совмещен с соответствующим эпитопом в комплексе с моноклональным антителом, специфичным к предшествующему слиянию F RSV, со среднеквадратическим отклонением (RMSD) их координат, составляющим менее 1,0, 0,75, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3 или 0,25 Å/остаток, где RMSD измеряют на протяжении атомов N, Cα, C, O остова полипептида по меньшей мере для трех последовательно расположенных аминокислот.

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF является растворимым в водном растворе. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF является растворимым в растворе, который лишен детергента. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF растворяется до концентрации по меньшей мере 0,5 мг/мл (такой как по меньшей мере 1,0 мг/мл, 1,5 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, 4,0 мг/мл или по меньшей мере 5,0 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) при комнатной температуре (например, 20-22 градусов Цельсия) и остается растворенным в течение по меньшей мере 12 часов (как например, в течение по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере одной недели, по меньшей мере двух недель или в течение более длительного периода времени). В одном варианте осуществления фосфатно-солевой буфер включает NaCl (137 мМ), KCl (2,7 мМ), Na₂HPO₄ (10 мМ), KH₂PO₄ (1,8 мМ) при pH 7,4. В некоторых вариантах осуществления фосфатно-солевой буфер включает CaCl₂ (1 мМ) и MgCl₂ (0,5 мМ). Специалисту в данной области известны способы определения того, остается ли белок в растворе с течением времени. Например, концентрацию белка, растворенного в водном растворе, можно исследовать с течением времени с использованием стандартных способов.

В нескольких вариантах осуществления любой из описанных антигенов PreF можно использовать для индукции иммунного ответа на RSV у индивидуума. В нескольких таких вариантах осуществления индукция иммунного ответа включает продуцирование нейтрализующих антител к RSV. Способы анализа активности нейтрализации известны специалисту в данной области и дополнительно описаны в настоящем описании, и они включают, но не ограничиваются ими, анализы нейтрализации бляшкообразования (PRNT), анализы микронейтрализации (см. например, Anderson et al., J. Clin. Microbiol., 22: 1050-1052, 1985) или анализы на основе проточной цитометрии (см., например, Chen et al., J. Immunol. Methods., 362:180-184, 2010). Дополнительные анализы нейтрализации описаны в настоящем описании и известны специалисту в данной области.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, который при растворении в водном растворе образует совокупность рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации. Водный раствор может представлять собой, например, фосфатно-солевой буфер при физиологических значениях pH, таких как pH 7,4. В некоторых вариантах осуществления популяция представляет собой гомогенную совокупность, включающую один или несколько рекомбинантных белков F RSV, все из которых, например, стабилизированы в предшествующей слиянию конформации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 90% рекомбинантных белков F RSV (как например, по меньшей мере приблизительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% белков F RSV) в гомогенной совокупности являются стабилизированными в предшествующей слиянию конформации. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 90% рекомбинантных белков F RSV (как например, по меньшей мере приблизительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% белков F RSV) в гомогенной совокупности специфически связываются антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антитело D25 или AM22), и/или включают специфическую конформацию предшествующего слиянию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Будет понятно, что гомогенная совокупность белков F RSV в конкретной конформации может включать вариации (такие как вариации модификации белка, например, состояния гликозилирования), которые не изменяют конформационное состояние белка F RSV. В нескольких вариантах осуществления совокупность рекомбинантных белков F RSV остается гомогенной с течением времени. Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, который при растворении в водном растворе образует совокупность рекомбинантных белков F RSV, которая стабилизирована в предшествующей слиянию конформации в течение по меньшей мере 12 часов, как например, в течение по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере одной недели, по меньшей мере двух недель, или более.

В нескольких вариантах осуществления выделенные антигены PreF по существу отделены от белков F RSV в образующейся после слияния конформации. Таким образом, антиген PreF может быть, например, по меньшей мере на 80% выделенным, по меньшей мере на 90%, 95%, 98%, 99% или даже 99,9% отделенным от белков F RSV в образующейся после слияния конформации. В нескольких вариантах осуществления антигены PreF также отделены от белков F RSV, которые не включают антигенный участок ∅ и/или не связываются специфически моноклональным антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (таким как D25 или AM22). Например, антиген PreF может быть меньшей мере на 80% выделенным, по меньшей мере 90%, 95%, 98%, 99% или даже на 99,9% отделенным от белков F RSV, которые не включают антигенный участок ∅ и/или не связываются специфически моноклональным антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (таким как D25 или AM22).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, который при инкубации в водном растворе образует совокупность рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, где по меньшей мере 70% (как например, по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%) выделенных антигенов в совокупности специфически связываются с антителом против белка F RSV, специфичным к предшествующей слиянию конформации (таким как D25 или AM22), после

(a) инкубации в течение одного часа в 350 мМ NaCl, pH 7,0, при 50°C;

(b) инкубации в течение одного часа в 350 мМ NaCl, pH 3,5, при 25°C;

(c) инкубации в течение одного часа в 350 мМ NaCl, pH 10, при 25°C;

(d) инкубации в течение одного часа при осмолярности 10 мМ, pH 7,0, при 25°C;

(e) инкубации в течение одного часа при осмолярности 3000 мМ, pH 7,0, при 25°C;

(g) комбинации двух или более из (a)-(e); или

комбинации (a) и (b); (a) и (c); (a) и (d); (a) и (e); (b) и (d); (b) и (e); (c) и (d); (c) и (e); (a), (b), и (d); (a), (c), и (d); (a), (b), и (e); или (a), (c), и (e)

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, который при инкубации в водном растворе образует совокупность рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, где по меньшей мере 60% (как например, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%) выделенных антигенов в совокупности специфически связываются с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, после десяти циклов замораживания-оттаивания в 350 мМ NaCl, pH 7,0.

В некоторых вариантах осуществления антигены PreF предоставлены в качестве гомогенной совокупности, которая не включает поддающийся обнаружению белок F RSV в образующейся после слияния конформции. Белок F RSV поддается обнаружению с помощью электронного микроскопа с негативным окрашиванием и/или по специфическому связыванию образующимся после слияния антителом.

1. Рекомбинантные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации

Антигены PreF, описанные в настоящем описании, включают рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и они включают полипептид F₁ и полипептид F₂. Полипептид F₁ полипептид, F₂ или оба из них могут включать по меньшей мере одну модификацию (например, аминокислотную замену), которая стабилизирует рекомбинантный белок F RSV в предшествующей слиянию конформации. В нескольких вариантах осуществления полипептид F₂ и полипептид F₁ связаны пептидным линкером (например, в вариантах осуществления, включающих одноцепочечный белок F RSV). Стабилизация рекомбинантного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации сохраняет по меньшей мере один эпитоп, специфический для предшествующей слиянию конформации (т.е. эпитоп, присутствующий в предшествующей слиянию (но не образующейся после слияния) конформации белка F RSV), который специфически связывается с моноклональным антителом, специфичным к предшествующему слиянию F RSV (т.е. антителом, которое специфически связывается с белком F RSV в предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации). Таким образом, описанные антигены PreF специфически связываются антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую конформацию предшествующего слиянию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁ и/или F₂ из вируса A RSV, например, полипептид F₁ и/или F₂ из белка F₀ RSV, предоставленного в качестве одной из SEQ ID NO: 1-128 или 370, который модифицирован для стабилизации рекомбинантного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации. В некоторых примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁ и/или F₂ из вируса B RSV, например, полипептид F₁и/или F₂ из белка F₀ RSV, представленного в качестве одной из SEQ ID NO: 129-177, который модифицирован для стабилизации рекомбинантного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации. В некоторых примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и/или F₂из вируса бычьего RSV, например, полипептид F₁и/или F₂из белка F₀RSV, представленного в качестве одной из SEQ ID NO: 178-184, который является модифицированным для стабилизации рекомбинантного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации. Также можно использовать полипептиды F₁и/или F₂из других подтипов RSV. Рекомбинантный белок F RSV может включать модификации нативных последовательностей RSV, такие как аминокислотные замены, делеции или вставки, гликозилирование и/или ковалентное связывание с неродственными белками (например, белковой меткой) при условии, что антиген PreF сохраняет рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. Белки F RSV из различных подгрупп RSV, а также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие такие белки, и способы манипулирования и встраивания таких последовательностей нуклеиновых кислот в векторы, описаны в настоящем описании и известны в данной области (см., например, Tan et al., PLOS one, 7: e51439, 2011; Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates и John Wiley & Sons, New York, N. Y. (1994)).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащего аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные аминокислотам 26-103 и 145-310, соответственно, нативной последовательности белка F RSV, указанной в любой из SEQ ID NO: 1-184, такой как SEQ ID NO: 124.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащего аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% (как например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или даже на 100%) идентичные аминокислотам 26-103 и 145-513, соответственно, нативной последовательности белка F RSV, указанной в качестве любой из SEQ ID NO: 1-184, такой как SEQ ID NO: 124.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащего аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% (как например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или даже на 100%) идентичные аминокислотам 26-103 и 145-529, соответственно, нативной последовательности белка F RSV, указанной в качестве любой из SEQ ID NO: 1-184, такой как SEQ ID NO: 124.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащего аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% (как например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или даже на 100%) идентичные аминокислотам 26-103 и 145-551, соответственно, нативной последовательности белка F RSV, указанной в качестве любой из SEQ ID NO: 1-184, такой как SEQ ID NO: 124.

В некоторых примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и/или F₂, включающий полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с полипептидом F₁и/или F₂RSV из вируса RSV A, например, с полипептидом F₁и/или F₂из белка F₀RSV, представленного в качестве одной из SEQ ID NO: 1-128 или 370. В следующих примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и/или F₂, включающий полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с полипептидом F₁и/или F₂RSV из вируса RSV B, например, с полипептидом F₁и/или F₂из белка F₀RSV, представленного в качестве одной из SEQ ID NO: 129-177. В следующих примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и/или F₂, включающий полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с полипептидом F₁и/или F₂RSV из вируса бычьего RSV, например, с полипептидом F₁и/или F₂из белка F₀RSV, представленного в качестве одной из SEQ ID NO: 178-184.

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁, включающий или состоящий из по меньшей мере 300 последовательно расположенных аминокислот (как например, по меньшей мере 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420 или 430 последовательно расположенных аминокислот) из нативной последовательности полипептида F₁, таких как положения 137-513 одной из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая любые полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с нативной последовательностью полипептида F₁, такой как положения 137-513 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F, включающий полипептид F₁, включающий или состоящий из положений 137-513, 137-481, 137-491 или от положения 137 до C-конца, или от положения 137 до трансмембранного домена любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая любые полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с нативной последовательностью полипептида F₁, такой как положения 137-513, или от положения 137 до C-конца, или от положения 137 до трансмембранного домена, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370. Специалисту в данной области будет понятно, что антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включает полипептид F1 с N- или C-концевыми укорочениями (например, делецией 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 или более аминокислот) по сравнению с внеклеточной областью нативного полипептида F1 (например, положения 137-524), при условии, что антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую конформацию предшествующего слиянию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий максимальную длину, например, не более чем 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430 или не более чем 440 аминокислот. Полипептид F₁может включать, состоять или по существу состоять из описанных последовательностей. Описанные непрерывные последовательности полипептида F₁также могут быть связаны на любом конце с другими неродственными последовательностями (например, последовательности не белка F₁RSV, последовательности не белка F RSV, последовательности не RSV, последовательности не оболочки вируса или последовательности не вирусного белка).

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₂, включающий или состоящий из по меньшей мере 60 последовательно расположенных аминокислот (как например, по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 последовательно расположенных аминокислот) из нативной последовательности полипептида F₂, такой как положения 26-109 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с нативной последовательностью полипептида F₁, такой как положения 26-109 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F, включающий полипептид F₂, включающий или состоящий из 70-109 последовательно расположенных аминокислот (как например, 60-100, 75-95, 80-90, 75-85, 80-95, 81-89, 82-88, 83-87, 83-84 или 84-85 последовательно расположенных аминокислот) из нативной последовательности полипептида F₂, такой как положения 26-109 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая любые полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с нативной последовательностью полипептида F₂, такой как положения 137-513 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₂, который также имеет максимальную длину, например, не более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 аминокислот. Полипептид F₂может включать, состоять или по существу состоять из описанных последовательностей. Описанные непрерывные последовательности полипептида F₂также могут быть связаны на любом конце с другими неродственными последовательностями (например, последовательности не белка F₂RSV, последовательности не белка F RSV, последовательности не RSV, последовательности не вирусной оболочки или последовательности невирусного белка).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₂, включающий или состоящий из по меньшей мере 60 последовательно расположенных аминокислот (как например, по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 последовательно расположенных аминокислот) из нативной последовательности полипептида F₂, такой как положения 26-109 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с нативной последовательностью полипептида F₂, такой как аминокислоты 26-109 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает полипептид F₁, включающий или состоящий из по меньшей мере 300 последовательно расположенных аминокислот (как например, по меньшей мере 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420 или 430 последовательно расположенных аминокислот) из нативной последовательности полипептида F₁, такой как положения 137-513 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая любые полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с нативной последовательностью полипептида F₁, такой как положения 137-513 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370.

В одном неограничивающем примере антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, включая полипептидные последовательности, обладающие по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичностью последовательности с положениями 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370.

Как отмечалось выше, белок F RSV первоначально синтезируется в качестве белка-предшественника F₀ и расщепляется во множестве участков (включая два консервативных участка расщепления фурином) в процессе созревания в эукариотических клетках. Таким образом, нативный белок F RSV лишен N-концевого сигнального пептида и пептида pep27 (или его части) белка-предшественника F₀. В нескольких вариантах осуществления описанные рекомбинантные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации, не включают сигнальный пептид (или его часть) и/или не включают пептид pep27 (или его часть). Специалисту в данной области будет понятно, что рекомбинантные белки F RSV, лишенные сигнального пептида F RSV и/или пептида pep27, можно получать путем экспрессии рекомбинантного полипептида F₀ в клетках, где сигнальный пептид и пептид pep27 будут вырезаться из предшественника F₀ клеточными протеазами.

Несколько вариантов осуществления включают антиген PreF, включающий мультимер любого из описанных рекомбинантных белков F RSV, например, мультимер, включающий 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более из описанных рекомбинантных белков F RSV. В нескольких примерах любой из описанных рекомбинантных белков F RSV может быть связан (например, через пептидный линкер) с другими рекомбинантными белками F RSV с образованием мультимера.

В данной области понятно, что в аминокислотную последовательность белка можно вносить некоторые вариации без влияния на активность белка. Такие вариации включают инсерцию аминокислотных остатков, делеции аминокислотных остатков и замены аминокислотных остатков. Эти вариации последовательности могут представлять собой встречающиеся в природе вариации или их можно встраивать с использованием способов генной инженерии, известных специалистам в данной области. Примеры таких способов представлены в Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57, или в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, полипептид F₂или как полипептид F₁, так и полипептид F₂, которые включают одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с соответствующей нативной последовательностью RSV. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид F₁, полипептид F₂или как полипептид F₁, так и полипептид F₂, включают вплоть до 20 (как например, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19) аминокислотных замен по сравнению с нативной последовательностью полипептида F₁, такой как нативная последовательность RSV, указанная в качестве любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации F RSV (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В дополнительных вариантах осуществления полипептид F₁, полипептид F₂или как полипептид F₁, так и полипептид F₂, включают вплоть до 20 (как например, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19) консервативных аминокислотных замен по сравнению с нативной последовательностью полипептида F₁, такой как нативная последовательность RSV, указанная в качестве любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации F RSV (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV в предшествующей слиянию конформации, который модифицирован для увеличения экспрессии белка для целей продукции белка, например, путем устранения одного или нескольких сигналов ядерной локализации, присутствующих в белке F RSV. Для получения таких вариантов можно использовать манипулирование нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидную последовательность F₁ или F₂ (такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид F₀, включая полипептиды F₁и F₂) с использованием стандартных методик, включающих в одном конкретном неограничивающем варианте осуществления сайт-направленный мутагенез или в другом конкретном неограничивающем варианте осуществления ПЦР. Альтернативно полипептиды F₁и F₂можно синтезировать с использованием стандартных способов. Наиболее простые модификации вовлекают замену одной или нескольких аминокислот аминокислотами, имеющими сходные биохимические свойства. Эти так называемые консервативные замены, вероятно, будут иметь минимальное влияние на активность полученного белка.

a. Модификации, стабилизирующиедистальную относительно мембраны область

Как описано в настоящем описании, белок F RSV претерпевает структурную перестройку между предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией. Как показано на фиг.2B, N-концевая область полипептида F₁в предшествующей слиянию конформации (частично соответствующая дистальной относительно мембраны доле, представленной на фиг.2A) включает указанные спиральные и бета-складчатые структуры α2, α3, β3, β4 и α4, в то время как соответствующая область N-конца полипептида F₁в образующейся после слияния структуре включает удлиненную спиральную структуру α5- спиральные и бета-складчатые структуры α2, α3, β3, β4 и α4 отсутствуют. Кроме того, C-концевая область полипептида F₁в предшествующей слиянию конформации (соответствующая частично проксимальной относительно мембраны доле, представленной на фиг.2A) включает указанные бета-складчатые и спиральные структуры β22, α9 и β23, в то время как соответствующая структура C-концевой области полипептида F₁в образующейся после слияния конформации включает удлиненную спиральную структуру α10 и удлиненный виток, а бета-складчатые и спиральные структуры β22, α9, и β23 отсутствуют. Таким образом, дистальная относительно мембраны и проксимальная относительно мембраны доли белка F RSV в его предшествующей слиянию конформации включают несколько различных структурных элементов, которые отсутствуют в соответствующих областях белка F RSV в его образующейся после слияния конформации.

Исходя из структурных признаков, идентифицированных в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации белка F RSV, доступно несколько способов стабилизации белка F RSV в предшествующей слиянию конформации, включая аминокислотные замены, которые вносят одну или несколько неприродных дисульфидных связей, заполняют полости в белке F RSV, изменяют упаковку остатков в белке F RSV, вносят участки N-связанного гликозилирования, и их комбинации. Стабилизирующие модификации, описанные в настоящем описании, представляют собой направленные модификации, которые стабилизируют рекомбинантный белок F RSV в предшествующей слиянию конформации. В нескольких вариантах осуществления белок F RSV не является стабилизированным посредством неспецифического сшивания, такого как сшивание глутаральдегидом, например, сшивание глутаральдегидом мембраносвязанных тримеров F RSV.

В некоторых неограничивающих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации путем внесения дисульфидной связи, где рекомбинантный белок F RSV включает замены S155C и S290C; G151C и I288C; A153C и K461C; A149C и Y458C; G143C и S404S; или аминокислотные замены Y33C и V469C. Неограничивающие примеры белков-предшественников для таких рекомбинантных белков F RSV (включая домен Foldon, связанный с C-концом полипептида F1) указаны в настоящем описании как SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209 и SEQ ID NO: 211. В следующих неограничивающих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации путем внесения дисульфидной связи и одной или нескольких заполняющих полость замен, где рекомбинантный белок F RSV включает замены S155C, S290C и большой гидрофобный остаток в положении 190 и/или положении 207 (например, замена S190F, S190W или S190L, и/или замена V207L, V207F или V207W). Неограничивающие примеры таких рекомбинантных белков-предшественников F RSV (включающих домен foldon, связанный с C-концом полипептида F1) представлены в настоящем описании в качестве SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 и SEQ ID NO: 376.

Многие из последовательностей рекомбинантных белков F RSV, описанных в настоящем описании, включают последовательность участков расщепления протеазами (такие как участки расщепления тромбином), белковые метки (такие как His-метка, Strep Tag II, Avi-метка и т.д.), которые не являются необходимыми для функции белка F RSV, такой как индукция иммунного ответа у индивидуума. Специалисту в данной области известны такие последовательности, и, в соответствующих случаях, будет понятно, что эти метки или участки расщепления протеазами не включены в описанный рекомбинантный белок F RSV.

i. Неприродные дисульфидные связи

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации по меньшей мере одной неприродной дисульфидной связью, включающей пару сшитых остатков цистеина. Неприродная дисульфидная связь представляет собой связь, которая не встречается в нативном белке F RSV и которую вносят способами инженерии белков (например, путем включения одного или нескольких замещенных остатков цистеина, которые образуют неприродную дисульфидную связь). Например, в некоторых вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV является стабилизированным в предшествующей слиянию конформации посредством любого количества из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дисульфидных связей, включающих пару сшитых остатков цистеина. В одном конкретном неограничивающем примере рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации посредством одной пары сшитых остатков цистеина. В другом неограничивающем примере любой из описанных рекомбинантных белков F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации двумя парами сшитых остатков цистеина.

Остатки цистеина, которые образуют дисульфидную связь, можно вносить в нативную белковую последовательность F RSV посредством одной или нескольких аминокислотных замен. Например, в некоторых вариантах осуществления одна аминокислотная замена вносит цистеин, который образует дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим в нативной последовательности белка F RSV. В дополнительных вариантах осуществления два остатка цистеина вносят в нативную последовательность RSV для формирования дисульфидной связи. Положение цистеина (или цистеинов) дисульфидной связи для стабилизации белка F RSV в предшествующей слиянию конформации может без труда определить специалист в данной области с использованием описанной структуры белка F RSV в предшествующей слиянию конформации и ранее идентифицированной структуры белка F RSV в его конформации после слияния.

Например, аминокислотные положения остатков цистеины, как правило, находятся на достаточно близком расстоянии для образования дисульфидной связи в предшествующей слиянию конформации белка F RSV. Способы применения трехмерных структурных данных для определения того, находятся ли два остатка на достаточно близком расстоянии для образования дисульфидной связи, известны (см., например, Peterson et al., Protein engineering, 12:535-548, 1999 и Dombkowski, Bioinformatics, 19:1852-1853, 3002 (в которых описано DISULFIDE BY DESIGN™), все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки). Например, остатки можно выбирать вручную, исходя из трехмерной структуры белка F RSV в предшествующей слиянию конформации, описанного в настоящем описании, или можно использовать программное обеспечение, такое как DISULFIDEBYDESIGN™. Без связи с теорией идеальными расстояниями для образования дисульфидной связи, как правило, считаются приблизительно ~5,6 Å для расстояния Cα-Cα, ~2,02 Å для расстояния Sγ-Sγ, и 3,5-4,25 Å для расстояния Cβ-Cβ (с использованием оптимального ротомера). Специалисту в данной области будет понятно, что предусматриваются отклонения от этих расстояний при выборе остатков в трехмерной структуре, которые можно заменять на остатки цистеина для внесения дисульфидной связи. Например, в некоторых вариантах осуществления выбранные остатки имеют расстояние Cα-Cα менее 7,0 Å и/или расстояние Cβ-Cβ менее 4,7 Å. В некоторых вариантах осуществления выбранные остатки имеют расстояние Cα-Cα 2,0-8,0 Å и/или расстояние Cβ-Cβ 2,0-5,5 Å. В нескольких вариантах осуществления аминокислотные положения остатков цистеина находятся на достаточно близком расстоянии для образования дисульфидной связи в предшествующий слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации белка F RSV.

Специалист в данной области может без труда определить относительное положение конкретной аминокислоты между предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией белка F RSV, например, путем сравнения предшествующих слиянию структур, определенных в настоящем описании структурными координатами, описанными в таблице 1, с ранее идентифицированной образующейся после слияния структурой, описанной в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, со структурными координатами, депонированными в качестве номера доступа PDB № 3RRR). Способы определения относительного положения конкретной аминокислоты между двумя белковыми структурами (например, между трехмерными структурами белка F RSV в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации) известны. Например специалист в данной области может использовать известные способы совмещения для сравнения двух структур (например, способы с использованием программы LSQKAB (Kabsch W. Acta. Cryst.A32 922-923 (1976)). В одном примере структуры предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации можно совмещать с использованием LSQKAB для выравнивания положений 26-60, 77-97, 220-322 и 332-459 белка F, определяемых структурными координатами, представленными в таблице 1, с положениями 26-60, 77-97, 220-322 и 332-459 белка F, определяемыми структурными координатами, депонированными в качестве номера доступа PDB № 3RRR, и сравнения расстояния между атомом Cα для каждого остатка в предшествующей слиянию и образующейся после слияния структурах для идентификации отклонения конкретных остатков между двумя структурами.

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между остатком цистеина, внесенным в положение аминокислоты, которая изменяет конформацию, и остатком цистеина, внесенным в положение аминокислоты, которая не изменяет конформацию, между предшествующей слиянию и образующейся после слияния структурами, соответственно. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотные замены, вносящие пару остатков цистеина, где первый остаток цистеина находится в аминокислотном положении белка F RSV, который имеет среднеквадратическое отклонение по меньшей мере 5 (как например, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10) ангстрем между трехмерными структурами предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями белка F RSV, и второй остаток цистеина находится в аминокислотном положении белка F RSV, которое имеет среднеквадратическое отклонение менее 4 (как например, менее 3, 2 или 1) ангстрем между трехмерными структурами предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформаций белка F RSV, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, D25 или AM22 антитело), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

Исходя из сравнения предшествующей слиянию и образующейся после слияния структур F RSV существует по меньшей мере две области, которые претерпевают значительные конформационные изменения, расположенные на N- и C-концах субъединицы F₁ (остатки 137-216 и 461-513, соответственно). Например, как проиллюстрировано на фиг.2B, положения 137-216 и 461-513 полипептида F₁претерпевают структурную перестройку между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями белка F, в то время как положения 217-460 полипептида F₁остаются относительно неизмененными. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между первым остатком цистеина в одном из положений 137-216 или 461-513 полипептида F₁ и вторым остатком цистеина в одном из положений 217-460 полипептида F₁. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между первым остатком цистеина в одном из положений 137-216 или 461-513 полипептида F₁ и вторым остатком цистеина в положении полипептида F2, таком как одно из положений 26-109 (например, одно из положений 26-61 или 77-97) полипептида F₂.

В дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между остатками цистеина, которые внесены в положения аминокислот, которые изменяют конформацию между предшествующей слиянию и образующейся после слияния структурами, соответственно. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотные замены, вносящие пару остатков цистеина, где первый остаток цистеина и второй остаток цистеина находится в аминокислотном положении белка F RSV, которое имеет среднеквадратическое отклонение по меньшей мере 5 (как например, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10) ангстрем между трехмерными структурами предшествующей слиянию и образующейся после слиянию конформацими белка F RSV, где антиген PreF включает специфическую активность связывания с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации F RSV (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфический эпитоп предшествующего слиянию F RSV (например, эпитоп D25 или AM22). В некоторых таких вариантах осуществления, антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между первым остатком цистеина и вторым остатком цистеина в положениях 137-216 полипептида F₁. В дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между первым остатком цистеина и вторым остатком цистеина в положениях 461-513 полипептида F₁. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации дисульфидной связью между первым остатком цистеина и вторым остатком цистеина в положениях 137-216 и 461-513, соответственно, полипептида F₁.

Специалист в данной области может без труда определить положение конкретной аминокислоты в предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформации белка F RSV (и любое отличие в положении между двумя конформациями) с использованием структурных координат трехмерной структуры белка F RSV в предшествующей слиянию конформации (которые указаны в таблице 1), и структурных координат трехмерной структуры белка F RSV в образующейся после слияния конформации (которые указаны в Protein Databank под номером доступа № 3RRR). Например, такие способы сравнения описаны в примере 1. В таблице 5 представлены примеры пар остатков цистеина и аминокислотных замен, которые можно использовать для стабилизации белка F RSV в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный RSV F белок, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дисульфидных связей, включая дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях F RSV, приведенных в одном или нескольких из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 2 таблицы 5, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дисульфидных связей, включая дисульфидные связи между остатками цистеина, которые внесены посредством аминокислотных замен на цистеин, приведенных в одном или нескольких из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 3 таблицы 5, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в столбце 4 таблицы 5, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, а также сигнальный пептид, полипептид F₂ (положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает белок F RSV, включающий полипептид F₁ и полипептид F₂, указанный в любой из SEQ ID NO, приведенных в столбце 4 таблицы 5, таких как SEQ ID NO, приведенная в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 4 таблицы 5, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, антиген PreF может включать белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, где полипептид F₂и полипептид F₁включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO, приведенных в столбце 4 таблицы 5, таких как SEQ ID NO, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 4 таблицы 5, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дисульфидных связей между протомерами, включая дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях полипептида F₁изF RSV, приведенных в одном или нескольких из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 столбца 2 таблицы 5. Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дисульфидных связей внутри протомера, включая дисульфидные связи между остатками цистеина, которые внесены посредством аминокислотных замен полипептида F₁, приведенных в одном или нескольких из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 столбца 3 таблицы 5. В любом из этих вариантов осуществления антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) дисульфидных связей внутри протомера, включая дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях полипептидов F₂и F₁изF RSV, приведенных в одном или нескольких из рядов 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 столбца 2 таблицы 5. Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) дисульфидных связей внутри протомера, включая дисульфидную связь между остатками цистеина, которые внесены посредством аминокислотных замен в полипептидах F₂и F₁, приведенных в одном или нескольких из рядов 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 столбца 3 таблицы 5. В любом из этих вариантов осуществления антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дисульфидных связей между протомерами, включая дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях полипептида F₁ из F RSV, приведенных в одном или нескольких из рядов 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 столбца 2 таблицы 5. Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) дисульфидных связей между протомерами, включая дисульфидную связь между остатками цистеина, которые внесены посредством аминокислотных замен в полипептиде F₁, приведенных в одном или нескольких из рядов 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 столбца 3 таблицы 5. В любом из этих вариантов осуществления антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между протомерами, образованную между остатками цистеина, расположенными в положениях полипептидов F₂и F₁изF RSV, приведенных в ряду 40 столбца 2 таблицы 5. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный F RSV, включающий дисульфидную связь между протомерами, образованную между остатками цистеина, которые внесены посредством аминокислотных замен в полипептиде F₂и F₁, приведенных в ряду 40 столбца 3 таблицы 5. В любом из этих вариантов осуществления антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления аминокислоты можно встраивать (или удалять) в белковой последовательности F для изменения размещения остатков в структуре белка F, так что конкретная пара остатков находится на достаточно близком расстоянии для образования дисульфидной связи внутри протомера и между протомерами в предшествующей слиянию, но не в образующейся после слияния, конформации. В нескольких таких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях полипептида F₁изF RSV, а также инсерцию аминокислоты, приведенную в одном или нескольких из рядов 41, 42 или 43 столбца 2 таблицы 5. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между остатками цистеина, которые внесены путем аминокислотных замен в полипептиде F₁, а также инсерцию аминокислоты, приведенную в одном или нескольких из рядов 41, 42 или 43 столбца 3 таблицы 5.

В одном примере антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включающий дисульфидную связь между остатками цистеина в положениях 155 и 290 F1, такой как рекомбинантный белок полипептида F1 с заменами S155C и S290C.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий комбинацию двух или более дисульфидных связей между остатками цистеина, приведенными в таблице 5 или таблице 5b, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Понятно, что некоторые комбинации не приводят к белку F RSV, стабилизированному в предшествующей слиянию конформации; такие комбинации могут быть идентифицированы способами, описанными в настоящем описании, путем подтверждения того, что антиген, содержащий такой полипептид, специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий неприродную дисульфидную связь, стабилизирующую белок F в предшествующей слиянию конформации, где белок F включает замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 столбца 3 таблицы 5b, где в белок F встроены остатки цистеина для образования неприродной дисульфидной связи. В любом из этих вариантов осуществления антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в столбце 4 таблицы 5b, соответствуют аминокислотным последовательностям, включающим указанные замены, а также сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, как указано в любой из SEQ ID NO, приведенных в столбце 4 таблицы 5b, таких как SEQ ID NO, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 столбца 4 таблицы 5b, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, антиген PreF может включать белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, где полипептид F₂и полипептид F₁включает аминокислотную последовательность, указанную в положениях 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO, приведенных в столбце 4 таблицы 5b, таких как SEQ ID NO, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 столбца 4 таблицы 5b, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

ii. Заполняющие полость аминокислотные замены

Сравнение структуры предшествующей слиянию конформации белка F RSV (например, в комплексе с Fab D25, как описано в настоящем описании) со структурой образующегося после слияния белка F RSV (описанного, например, в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011) идентифицирует несколько внутренних полостей или карманов в предшествующей слиянию конформации, которые должны сократиться для перехода F в образующуюся после слияния конформацию. Эти полости включают полости, приведенные в таблице 6.

Таким образом, в нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством одной или нескольких аминокислотных замен, которые вносят аминокислоту, которая уменьшает объем внутренней полости, которая сокращается в образующейся после слияния конформации белка F RSV. Например, полости заполняют путем замен аминокислотами с крупными боковыми цепями аминокислот с небольшими боковыми цепями. Полости могут представлять собой полости внутри протомеров или полости между протомерами. Одним примером заполняющей полость аминокислотной замены F RSV для стабилизации белка RSV в предшествующей слиянию конформации является белок F RSV с заменами S190F и V207L. В другом варианте осуществления заполняющая полость аминокислотная замена для стабилизации белка RSV в предшествующей слиянию конформации белка F RSV включает замену S190F, S190L, S190W, S190H, S190M или S190Y.

Специалист в данной области может использовать способы, описанные в настоящем описании, для сравнения структур белка F RSV в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации для идентификации подходящих полостей и аминокислотных замен для заполнения указанных полостей. Иллюстративные полости и аминокислотные замены для уменьшения объема этих полостей представлены в таблице 6.

Указанные полости обозначают по небольшому остатку, выступающему в полость, который можно заменять на более крупный остаток для заполнения полости. Будет понятно, что другие остатки (помимо одного остатка, по которому называют полость) можно заменять для заполнения указанной полости.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько аминокислотных замен, которые уменьшают объем одной или нескольких полостей, приведенных в столбце 2 таблицы 6, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий одну или несколько из аминокислотных замен, приведенных в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 столбца 3 таблицы 6, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в таблице 6, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие идентичные замены, а также сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂,как указано в любой из SEQ ID NO, приведенных в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 или 8 столбца 4 таблицы 6, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, указанные в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, как указано в любой из SEQ ID NO, приведенных в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 столбца 4 таблицы 6, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 3 таблицы 6b, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в таблице 6a, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, указанный в любой из SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 4 таблицы 6b, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, как указано в положениях 26-109 и 137-513, соответственно, как указано в любой из SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 4 таблицы 6b, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

iii. Переупаковывающие замены

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством одной или нескольких переупаковывающих замен. Переупаковывающие замены увеличивают притягивающие взаимодействия (такие как гидрофобные взаимодействия или образование водородных связей) или снижают отталкивающие взаимодействия (такие как силы отталкивания между кластерами сходным образом заряженных остатков) между аминокислотами в белке.

Специалист в данной области может использовать способы, описанные в настоящем описании, для сравнения структур предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформаций белка F RSV для идентификации подходящих участков для сил отталкивания и/или сил притяжения между остатками белка F RSV и аминокислотных замен для уменьшения или увеличения этих взаимодействий, соответственно, например, посредством идентификации отталкивающих сил в структуре белка RSV F в предшествующей слиянию конформации, описанной в настоящем описании, и внесения замен, которые уменьшают эти отталкивающие взаимодействия. Альтернативно белок F RSV может включать замены, которые увеличивают притягивающие взаимодействия между остатками белка F RSV в предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации белка F RSV. Иллюстративные аминокислотные замены представлены в таблице 7.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47 столбца 2 таблицы 7, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в таблице 7, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, а также сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, как указано в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47 столбца 3 таблицы 7, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂, как указано в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, в любой из SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47 столбца 3 таблицы 7, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

Несколько вариантов осуществления включают комбинации аминокислотных замен, приведенных выше.

iv. Участки N-связанного гликозилирования

Сравнение структуры предшествующей слиянию конформации белка F RSV (например, в комплексе с D25 или AM22, как описано в настоящем описании) со структурой образующегося после слияния белка F RSV (описанного, например, в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011) идентифицирует несколько областей белка F RSV, которые являются доступными для растворителя в предшествующей слиянию конформации F RSV, описанной в настоящем описании, но не доступным для растворителя в образующейся после слияния конформации F RSV (как описано в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотную замену, которая вносит участок N-связанного гликозилирования в положение, которое является доступным для растворителя в предшествующей слиянию конформации F RSV, описанной в настоящем описании, но недоступной для растворителя в образующейся после слияния конформации F RSV (как описано в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011). Эти аминокислотные замены стабилизируют рекомбинантный белок F RSV в предшествующей слиянию конформации путем увеличения энергии, требуемой для принятия белком образующегося после слияния состояния.

Для создания участка N-связанного гликозилирования необходимо внести последовательность Asn-X-Ser/Thr (где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением Pro). Это можно осуществлять путем замены аминокислотами Ser/Thr двух остатков, находящихся со стороны C-конца относительно нативного остатка Asn, или путем замены аминокислотой Asn двух остатков, находящихся со стороны N-конца относительно нативного остатка Ser/Thr, или путем замены как остатком Asn, так и остатком Ser/Thr, остатков, разделенных одной не являющейся пролином аминокислотой. Таким образом, в нескольких вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV является гликозилированным. Например, белок F RSV включает аминокислотную замену, которую вносит участок N-связанного гликозилирования, в белке F RSV, который является доступным для растворителя в предшествующей слиянию конформации F RSV, описанной в настоящем описании, но недоступным для растворителя в образующейся после слияния конформации F RSV, как описано в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011). Иллюстративные модификации участка N-связанного гликозилирования представлены в таблице 8.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством участка N-связанного гликозилирования в одном или нескольких (как например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) из положений 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503 или 157 полипептида F₁, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Например, полипептид F₁может включать аминокислотную замену, которая вносит участок N-связанного гликозилирования в одно или несколько (как например, в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) положений 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503 или 157 полипептида F₁.

SEQ ID NO, приведенные в таблице 8, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, а также сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), положения pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замены I506N и K508T для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 506. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замену A177S для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 175. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замену V178N для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 178. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замену V278T для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 276. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замену Y478T для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 476. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замены V185N и V187T для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 185. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замены L160N и G162S для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 160. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замены L503N и F505S для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 503. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает полипептид F₁, включающий замену V157N для внесения участка N-связанного гликозилирования в положение 157. В любом из этих вариантов осуществления антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В дополнительных вариантах осуществления полипептид F₁содержит остатки 137-513 SEQ ID NO: 198 (участок N-связанного гликозилирования в положении 506); SEQ ID NO: 199 (участок N-связанного гликозилирования в положении 175); SEQ ID NO: 200 (участок N-связанного гликозилирования в положении 178); SEQ ID NO: 203 (участок N-связанного гликозилирования в положении 276); SEQ ID NO: 204 (участок N-связанного гликозилирования в положении 476); SEQ ID NO: 214 (участок N-связанного гликозилирования в положении 185); SEQ ID NO: 215 (участок N-связанного гликозилирования в положении 160); SEQ ID NO: 216 (участок N-связанного гликозилирования в положении 503) или SEQ ID NO: 217 (участок N-связанного гликозилирования в положении 157), где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

Способы получения гликозилированных полипептидов описаны в настоящем описании и известны специалисту в данной области. Например, такие способы описаны в публикации патентной заявки США № 2007/0224211, патентах США № 7029872; 7834159, 7807405, Wang and Lomino, ACS Chem. Biol., 7:110-122, 2011, и Nettleship et al., Methods Mol. Biol, 498:245-263, 2009, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок. В некоторых вариантах осуществления гликозилированные антигены PreF получают путем экспрессии рекомбинантного белка F RSV в клетках млекопитающих, таких как клетки HEK293 или их производные, такие как клетки GnTI^-/- (ATCC® № CRL-3022). В некоторых вариантах осуществления антигены белка F RSV продуцируют путем экспрессии антигенов белка F RSV в клетках млекопитающих, таких как клетки HEK293 или их производные, с добавлением в среду сваинсонина для ингибирования определенных аспектов аппарата гликозилирования, например, для ускорения продуцирования гибридных гликанов.

В нескольких вариантах осуществления полипептид F1 включает два или более участков N-связанного гликозилирования, приведенных в таблице 8.

v. Иллюстративные стабилизирующие модификации

Специалисту в данной области будет понятно, что антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством комбинаций одной или нескольких стабилизирующих аминокислотных замен, описанных в настоящем описании, таких как комбинация аминокислотных замены, которые вносят одну или несколько дисульфидных связей, заполняют полости в белке F RSV, изменяют упаковку остатков в белке F RSV, вносят участки N-связанного гликозилирования. Например, в нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает аминокислотные замены, которые вносят дисульфидную связь и которые заполняют полости в белке F RSV.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290 и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190 и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 207. Например, заполняющая полость замена в положении 190 и/или положении 207 может представлять собой крупную ароматическую или гидрофобную аминокислотную замену (такую как тирозин, лейцин, фенилаланин, гистидин или триптофан).

В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190F. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190W. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190L.

В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W. В некоторых вариантах осуществления полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

В нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₁и полипептид F₂из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где полипептид F₁включает одну из описанных выше комбинаций стабилизирующих замен.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190F. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190H. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F_1, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190M. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190Y.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190H и V207L. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190M и V207L. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190Y и V207L.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190H и V207F. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190M и V207F. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190Y и V207F.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающий положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190H и V207W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190M и V207W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190Y и V207W.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, V207L и F488W. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, и дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и F488W.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, включает полипептид F₂и полипептид F₁, включающие положения 26-109 и 137-513, соответственно, SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F); или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, которая включает аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 3 таблицы 8b. Стабилизированный белок F RSV может специфически связываться антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в таблице 8b, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))) или участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)), домен тримеризации (домен Foldon), и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁(например, приблизительно положения 137-513) и полипептид F₂(например, приблизительно положения 26-109), как указано в SEQ ID NO одного из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 4 (без домена Foldon) или столбца 5 (с отщепляемым доменом Foldon) таблицы 8b.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, который включает аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, столбца 3 таблицы 8c. Стабилизированный белок F RSV может специфически связываться антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

SEQ ID NO, приведенные в таблице 8c, представляют собой аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)), и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁(например, приблизительно положения 137-513) и полипептид F₂(например, приблизительно положения 26-109), как указано в SEQ ID NO одного из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 столбца 4 таблицы 8c.

b. Проксимальные относительно мембраны стабилизирующие модификации

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает заякоренную на мембране форму рекомбинантного белка F RSV (например, с трансмембранным доменом). В других вариантах осуществления антиген PreF включает растворимую форму рекомбинантного белка F RSV (например, без трансмембранного домена или другого мембранного якоря). Будет понятно, что существует несколько различных подходов для получения растворимого или заякоренного на мембране рекомбинантного белка F RSV, включая подходы, обсуждаемые ниже. Примеры включают введение домена тримеризации, внесение пар остатков цистеина, которые образуют дисульфидную связь, которая стабилизирует C-концевую область F₁, и внесение трансмембранного домена (например, для применений, включающих заякоренный на мембране антиген PreF).

Кроме того, как описано в настоящем описании, структура белка F RSV в комплексе с Fab D25 (т.е., в предшествующей слиянию конформации) по сравнению со структурой образующегося после слияния белка F RSV (описанной, например, в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, с координатами, депонированными в качестве номера доступа PDB № 3RRR) демонстрирует структурные перестройки между предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией как в проксимальной относительно мембраны, так и в дистальной относительно мембраны долях. Несколько вариантов осуществления включают модификацию, направленную на стабилизацию проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV в предшествующей слиянию конформации. Будет понятно, что эти модификации не являются строго необходимыми для стабилизации рекомбинантного белка F RSV в предшествующей слиянию конформации, но, что в некоторых случаях их комбинируют с другими предшествующими слиянию стабилизирующими модификациями, такими как модификации, описанные выше.

i. Домен тримеризации

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF связан с доменом тримеризации, например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид RSV с доменом тримеризации, связанным с его C-концом. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации ускоряет тримеризацию трех мономеров F1/F2 в рекомбинантном белке F RSV. Несколько экзогенных доменов мультимеризации обеспечивают стабильные тримеры растворимых рекомбинантных белков: лейциновая молния GCN4 (Harbury et al. 1993 Science 262:1401-1407), мотив тримеризации из белка сурфактанта легкого (Hoppe et al. 1994 FEBS Lett 344:191-195), коллагена (McAlinden et al. 2003 J Biol Chem 278:42200-42207) и Foldon фибритина фага T4 (Miroshnikov et al. 1998 Белок Eng 11:329-414), любой из которых может быть связан с полипептидом F1 в антигене PreF для обеспечения тримеризации рекомбинантного белка F при условии, что антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых примерах антиген PreF может быть связан с доменом лейциновой молнии GCN4, например антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1 с доменом лейциновой молнии GCN4, связанным с его C-концом. В конкретных примерах домен лейциновой молнии GCN4 предоставлен в конструкциях серии CSGJ, описанных в настоящем описании.

В некоторых примерах антиген PreF может быть связан с доменом Foldon, например, антиген PreF может включать рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1 с доменом Foldon, связанным с его C-концом. В конкретных примерах домен Foldon представляет собой домен Foldon фибритина T4, такой как аминокислотная последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 351), которая принимает конформацию β-пропеллера и может укладываться и тримеризоваться автономно (Tao et al. 1997 Structure 5:789-798).

В некоторых конкретных примерах антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, связанный с доменом Foldon фибритина T4, и включает полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, как указано в любой из SEQ ID NO: 185, 189-303 или 371-376. Как правило, гетерологичный мотив мультимеризации располагается со стороны C-конца домена F₁. Необязательно, домен мультимеризации связан с полипептидом F₁через линкер, такой как аминокислотный линкер, такой как последовательность GG. Линкер также может представлять собой более длинный линкер (например, включающий последовательность GG, такую как аминокислотная последовательность: GGSGGSGGS; SEQ ID NO: 352). В данной области известны многочисленные конформационно нейтральные линкеры, которые можно использовать в этом контексте без нарушения конформации антигена PreF. Некоторые варианты осуществления включают участок расщепления протеазой для удаления домена Foldon из полипептида F1 такого как, но не ограничиваясь ими, участок тромбина между полипептидом F1 и доменом Foldon.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций домена тримеризации, приведенных выше, в комбинации с любой из модификаций, приведенных в разделе II.B.1.a. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций домена тримеризации, приведенных выше, в комбинации с одной или несколькими модификациями дисульфидной связью, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51 таблицы 5, и/или одной или несколькими заполняющими полость модификациями, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 таблицы 6, и/или одной или несколькими переупаковывающими модификациями, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47 таблицы 7, и/или одной или несколькими модификациями гликозилирования, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 таблицы 8, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22 антитело), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций домена тримеризации, приведенных выше, связанных с полипептидом F1, включая дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190, и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 207.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций домена тримеризации, приведенных выше, связанных с полипептидом F1, включая аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, аминокислотные замены S155C, S290C и S190W или аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций домена тримеризации, приведенных выше, связанных с полипептидом F1, включающих аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W или аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, или SEQ ID NO: 263; или положений 26-109 и 137-545, соответственно, любой из SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298 или SEQ ID NO: 299, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F) или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F), где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где полипептид F₁ связан с любой из модификаций домена тримеризации, приведенных выше, и полипептид F1 дополнительно включает любую из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании (например, одна из комбинаций стабилизирующих замен, таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, и включает одну или несколько заполняющих полость аминокислотных замен и домен Foldon, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193 , SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195 или SEQ ID NO: 194; где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, и включает одну или несколько переупаковывающих аминокислотных замен и домен foldon, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336 или SEQ ID NO: 337; где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, и включает один или несколько участков N-связанного гликозилирования и домен Foldon, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216 или SEQ ID NO: 217; где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 столбца 3 таблицы 5b, где полипептид F1 рекомбинантного белка RSV F связан с доменом Foldon. Некоторые варианты осуществления включают участок расщепления протеазой для удаления домена Foldon из полипептида F1, например, участок расщепления тромбином.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, одной из SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, или 16 столбца 4 таблицы 5b. В нескольких вариантах осуществления полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, дополнительно включает участок расщепления протеазой, такой как, но не ограничиваясь ими, участок расщепления тромбином, между полипептидом F1 и доменом Foldon.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 3 таблицы 6b, где полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV связан с доменом Foldon.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, одной из SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 4 таблицы 6b.

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, где рекомбинантный белок F RSV включает аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 3 таблицы 8b, где полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV связан с доменом Foldon. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, одной из SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 5 таблицы 8b. Эти последовательности включают участок расщепления тромбином между полипептидом F1 и доменом Foldon.

В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, где рекомбинантный белок F RSV включает аминокислотные замены, приведенные в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 столбца 3 таблицы 8c, где полипептид F1 рекомбинантного белка F RSV связан с доменом Foldon. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, SEQ ID NO, приведенных в рядах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 столбца 4 таблицы 8c.

Также можно использовать модифицированные домены Foldon, такие как домен Foldon, включающий аминокислотную последовательность, указанную в качестве GYIPEAPRDGQCYVRCDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 694), GYIPECPRDGQAYVCKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 695), GYIPEAPRDGQCYCRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 696) или GYIPEAPRDGQACVRKDGECVLLSTF (SEQ ID NO: 697). Эти модифицированные домены Foldon включают аминокислотные замены, которые добавляют два остатка цистеина для образования стабилизирующих дисульфидных связей. Иллюстративные последовательности белка F RSV, включающие аминокислотные замены DSCav1, связанные с модифицированными доменами Foldon, включают последовательности, указанные в качестве SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653, и SEQ ID NO: 654. В некоторых вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV может быть связан с модифицированным доменом Foldon, как описано в настоящем описании.

ii. Дисульфидные связи

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1, включающий одну или несколько дисульфидных связей, которые используют для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли рекомбинантного белка F RSV. Остатки цистеина, которые образуют дисульфидную связь, можно вносить в рекомбинантный белок F RSV посредством одной или нескольких аминокислотных замен.

Положение остатка цистеина (или остатков цистеина) дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV в предшествующей слиянию конформации может без труда определить специалист в данной области с использованием способов, описанных в настоящем описании и известных специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления кольцо дисульфидных связей вносят на C-конец полипептида F1 путем замены остатками цистеина аминокислот спирали α10. Три спирали α10 эктодомена F RSV для двойной спирали стабилизируют проксимальную относительно мембраны часть белка. При экспрессии в клетках дисульфидные связи между протомерами образуются между остатками цистеина, внесенными в спираль α10, тем самым "фиксируя" три спирали α10 близко друг к другу и препятствуя движению проксимального относительно мембраны домена из предшествующей слиянию конформации в образующуюся после слияния конформацию. Спираль α10 белка F RSV включает остатки от 492 до трансмембранного домена (остаток 529).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях 486 и 487 F RSV, или между остатками цистеина, расположенными в положениях 512 и 513 F RSV, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В некоторых таких вариантах осуществления, полипептид F₁включает замены D486C и E487C, замены L512C и L513C или замены D486C, E487C, L512C и L513C, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления аминокислоты можно встраивать (или удалять) в последовательности белка F для корректирования размещения остатков в структуре белка F, чтобы конкретные пары остатков находились на достаточно близком расстоянии для образования дисульфидной связи. В некоторых таких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между остатками цистеина, расположенными в положениях 486 и 487; с вставкой пролина между положениями 486 и 487, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В некоторых таких вариантах осуществления полипептид F₁включает замены D486C и E487C и вставку пролина между положениями 486 и 487.

В дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между остатком цистеина, расположенным в положении 493, и остатком цистеина, встроенным между положениями 329 и 330, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В некоторых таких вариантах осуществления полипептид F₁включает замену S493C и остаток цистеина, встроенный между положениями 329 и 330.

В дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий дисульфидную связь между остатком цистеина, расположенным в положении 493, и остатком цистеина, встроенным между положениями 329 и 330, и дополнительно включает вставку глицина между остатками 492 и 493, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В некоторых таких вариантах осуществления полипептид F₁включает замену S493C, остаток цистеина, встроенный между положениями 329 и 330, и вставку глицина между остатками остатки 492 и 493.

В дополнительных вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает замены на цистеин в спирали α10 в положениях 525 и 526, 512 и 513, и/или 519 и 520, которые могут образовывать дисульфидные связи между протомерами для стабилизации C-концевой области полипептида F1. Например, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает любой из "мотивов", приведенных в таблице 23. В дополнительных вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% (как например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98%) идентичную аминокислотной последовательности, указанной в качестве одной из SEQ ID NO: 829-1025 или 1456-1468, необязательно не включая метки для очистки или домены тримеризации, включенные в эти последовательности.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает аминокислотную последовательность, находящуюся с C-концевой стороны от положения 512, указанную в качестве одной из CCHNVNAGKSTTN (остатки 512-524 SEQ ID NO: 844) или CCHNVNACCSTTN (остатки X-Y SEQ ID NO: 849); или CCHNVNACCSTTNICCTT (остатки 512-529 SEQ ID NO: 853).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV в комбинации с любой из стабилизирующих модификаций, приведенных в разделе II.B.1.a. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка RSV F, приведенных выше, в комбинации с заменами для образования дисульфидной связи, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51 таблицы 5, или рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 таблицы 5b, или заполняющими полость заменами, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 таблицы 6, или в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 3 таблицы 6b, или переупаковывающими заменами, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47 таблицы 7, или модификациями гликозилирования, приведенными в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 таблицы 8, или заменами, приведенными в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 3 таблицы 8b, или заменами, приведенными в рядах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 столбца 3 таблицы 8c, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV, приведенных выше, и дополнительно включает полипептид F1, включающий дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющую полость замену в положении 190 и заполняющую полость замену в положении 207.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV, приведенных выше, и дополнительно включает полипептид F1, включающий аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, аминокислотные замены S155C, S290C и S190W или аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV, приведенных выше, и дополнительно включает полипептид F1, включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W или аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, включающие аминокислотные последовательности, указанные в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F); или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F), где рекомбинантный белок F RSV дополнительно включает любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV, приведенных выше, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где рекомбинантный белок F RSV дополнительно включает любую из модификаций дисульфидной связи для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV, приведенных выше, и где полипептид F1 дополнительно включает любую из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании (например, одна из описанных выше комбинаций стабилизирующих замен, таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

iii. Трансмембранные домены

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает трансмембранный домен, связанный с полипептидом F₁, например, для применения, включающего заякоренный на мембране антиген PreF). Например, присутствие трансмембранных последовательностей является пригодным для экспрессии в качестве трансмембранного белка для получения мембранных везикул. Трансмембранный домен может быть связан с белком F₁, содержащим любую из стабилизирующих мутаций, приведенных в настоящем описании, например, мутаций, описанных в настоящем описании, таким как белок F₁с заменой на цистеин S155C/S290C. Кроме того, трансмембранный домен может быть дополнительно связан с цитозольным хвостовым доменом F₁RSV. Примеры, включающие сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), трансмембранный домен RSV, представлены в качестве SEQ ID NO: 323 (без цитозольного домена) и SEQ ID NO: 324 (с цитозольным доменом).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом, в комбинации с любой из стабилизирующих модификаций, приведенных в разделе II.B.1a. Например, в некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом, и дополнительно включает замены для образования дисульфидной связи, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51 таблицы 5, или в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 таблицы 5b, или заполняющие полость замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 таблицы 6, или в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 или 84 столбца 3 таблицы 6b, или переупаковывающие замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, или 47 таблицы 7, или модификации гликозилирования, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 таблицы 8, или замены, приведенные в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 или 54 столбца 3 таблицы 8b, или замены, приведенные в ряду 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 столбца 3 таблицы 8c, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом, где полипептид F1 дополнительно включает дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190 и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 207.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом, где полипептид F1 дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, аминокислотные замены S155C, S290C и S190W, или аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В следующих вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом, где полипептид F1 дополнительно включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W, или аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с трансмембранным доменом, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с трансмембранным доменом, включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F); или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F), где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где полипептид F₁ связан с любым из трансмембранны доменов, приведенных выше, и полипептид F₁ дополнительно включает любую из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании (например, одна из описанных выше комбинаций стабилизирующих замен, таких как замены S155C, S290C, и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

iv. заполняющие полость замены

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁, включающий одну или несколько заполняющих полость замен, которые используют для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли рекомбинантного белка F RSV. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁ с заменами V207L и L512F; L513F; L512F и L513F; L512Y и L513Y; L512F и L513Y; L512W и L513W; L5132W и L513Y; S509W; S509F; S509W и L512F; или S509W, L512F и L513F, где антиген PreF специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Иллюстративные последовательности с такими заменами включают SEQ ID NO: 672-682.

c. Антигенные участки

В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, который является стабилизированным в предшествующей слиянию конформации и включает дополнительную модификацию для устранения известного антигенного участка, отличного от антигенного участка ∅. Например, рекомбинантный белок F RSV может включать модификацию, которая нарушает антигенный участок I, II или IV. Такие модификации можно идентифицировать, например, с помощью связывающих антител, специфичных к этим участкам.

В некоторых вариантах осуществления предусматриваются антигены, которые включают рекомбинантный белок F RSV, который включает модификацию для устранения антигенного участка ∅. Такие антигены пригодны, например, в качестве контрольных реагентов.

Иллюстративные модификации для устранения антигенного участка ∅ и/или антигенного участка II приведены в таблице 8c1.

d. Одноцепочечные белки F RSV

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV представляет собой одноцепочечный белок F RSV, который включает одну полипептидную цепь, включающую полипептид F₁ RSV и полипептид F₂ RSV. Описанные одноцепочечные белки F RSV не включают участков расщепления фурином, фланкирующих полипептид pep27 белка F RSV; таким образом, при продуцировании в клетках полипептид F не расщепляется на отдельные полипептиды F₁ и F₂. В нескольких вариантах осуществления остальные участки полипептидов F₁и F₂связаны линкером, таким как пептидный линкер.

В нескольких вариантах осуществления продуцируется единая полипептидная цепь, включающая последовательности F₂, pep27 и F₁. Одноцепочечные белки F RSV могут включать последовательность pep27 или эта последовательность может быть удалена. Кроме того, в примерах, где последовательность pep27 удалена, линкер (такой как пептидный линкер) необязательно может быть помещен между полипептидами F₂ и F₁в рекомбинантном одноцепочечном белке F RSV. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечный белок F RSV включает делецию положений 98-149 или 106-149 F RSV, которая устраняет два участка расщепления фурином, полипептид pep27 и пептид слияния. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечный белок F RSV включает делецию положений 98-136, 98-144, 98-149, 106-136, 104-144 или 106-144 F RSV.

В нескольких вариантах осуществления в одноцепочечный белок F RSV могут быть включены стабилизирующие мутации, описанные в настоящем описании (например, в разделах с (B.1.a) по (B.1.c) выше). Например, в некоторых вариантах осуществления одноцепочечный белок F RSV включает замены S155C и S290C; замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L. В некоторых вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV в одноцепочечном формате, стабилизированный предшествующей слиянию конформации, который включает аминокислотные замены, приведенные в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 столбца 3 таблицы 8d. Стабилизированный белок F RSV может специфически связываться антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

Иллюстративные последовательности приведены в таблице 8d. В SEQ ID NO, приведенных в таблице 8d, указаны аминокислотные последовательности, включающие указанные замены, сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))) или участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)), домен тримеризации (домен Foldon) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления антиген PreF включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁(например, приблизительно положения 137-513) и полипептид F₂(например, приблизительно положения 26-109), как указано в SEQ ID NO, приведенных в одном из рядов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 столбца 4 (без домена Foldon) или столбца 5 (с отщепляемым доменом Foldon) таблицы 8d. Дополнительные иллюстративные одноцепочечные мутации и последовательности белка F RSV описаны в настоящем описании, например, как описано в таблице 8e (например, ряды 34-43) и в таблице 18.

Последовательности дополнительных одноцепочечных белков F RSV, которые являются стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, представлены в таблице 19, включая одноцепочечные белки F RSV с неотщепляемыми доменами Foldon, отщепляемыми доменами Foldon, и связанные с субъединицами наночастиц белка.

2. Иммуногены с минимальным участком ∅

Эпитоп участка ∅ F RSV расположен на вершине выступа тримера и включает область, распознаваемую тремя нейтрализующими антителами: D25, AM22 и 5C4. Более конкретно, как определено из кристаллической структуры комплекса RSV F/D25, этот эпитоп содержит наружную поверхность спирали α4 (остатки 196-209) и соседнюю петлю (остатки 63-68) между β2 и α1. В рамках настоящего изобретения предусматриваются иммуногены, которые включают эти минимальные аспекты белка F RSV и которые пригодны, например, для индукции иммунного ответа на RSV, и также для специфического связывания антителами против F RSV, например, в качестве зондов для идентификации и обнаружения таких антител.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV включает минимальную область, необходимую для стимуляции иммунного ответа на RSV. В некоторых вариантах осуществления белок F RSV содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности, указанной в таблице 20. В дополнительных вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV содержит круговую перестановку антигенного участка ∅, как указано в таблице 20, такую как указано в SEQ ID NO: 1027-1052.

Область минимального эпитопа может быть связана с каркасным белком для стабилизации эпитопа в антигенной конформации. Например, любой из антигенов с минимальным участком ∅, приведенных в настоящем описании, может быть связан с каркасным белком 2KNO, 2A90, 2W59, 3U2E, 2VJ1, 1CHD, 1PQZ или 2MOE. Эти обозначения являются справочными идентификаторами для конкретных последовательностей, расположенных в базе данных PDB, и они включены в настоящее описание в качестве ссылок, как было представлено в базе данных на 11 марта 2014 года. Конкретные примеры антигена с минимальным участком ∅, связанного с каркасным белком, представлены в настоящем описании в таблице 20.

Любой из антигенов с минимальным участком ∅ может быть связан с субъединицей белковых наночастиц, например, субъединицей ферритина или субъединицей синтазы лумазина, для получения белковой наночастицы. Конкретные примеры антигенов с минимальным участком ∅, связанным с субъединицей белковой наночастицы, представлены в настоящем описании в таблице 21.

В нескольких вариантах осуществления антиген PreF включает белок эпитоп-каркас, включающий эпитоп, специфический для предшествующей слиянию конформации белка F RSV, в специфической предшествующий слиянию конформации. В некоторых примерах белок эпитоп-каркас включает любой из рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, как описано в настоящем описании. Эпитоп, специфический для предшествующей слиянию конформации, может быть помещен в любое место каркасного белка (например, на N-конце, C-конце или во внутренней петле), при условии, что антиген PreF, включающий конструкцию белок эпитоп-каркас, специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

Способы идентификации и выбора каркасов описаны в настоящем описании и известны специалисту в данной области. Например, способы совмещения, пересадки и конструирования de novo конструкций эпитоп-каркас описаны в публикации патентной заявки США № 2010/0068217, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

"Совмещающиеся" конструкции эпитоп-каркас основаны на каркасных белках, имеющих экспонированный сегмент со сходной коформацией с эпитопом-мишенью - атомы остова в этой "совмещающейся области" могут структурно совмещаться с эпитопом-мишенью с минимальным среднеквадратическим отклонением (RMSD) их координат. Пригодные каркасы идентифицируют посредством компьютерного поиска в библиотеке кристаллических структур белков; конструкции эпитоп-каркас конструируют путем помещения остатков эпитопа в совмещающуюся область и внесения дополнительных мутаций на окружающей поверхности каркаса для предупреждения столкновений или других взаимодействий с антителом.

В "пересадке" конструкций эпитоп-каркас используются каркасные белки, в которых может быть осуществлена замена экспонированного сегмента кристаллизованной конформацией эпитопа-мишени. Для каждого подходящего каркаса, идентифицированного с использованием компьютерного поиска во всех белковых кристаллических структурах, экспонированный сегмент заменяют эпитопом-мишенью и окружающие боковые цепи переконструируют (подвергают мутации) для вмещения и стабилизации встроенного эпитопа. Наконец, как и в случае совмещающихся конструкций эпитоп-каркас, вносят мутации на поверхности каркаса и вне эпитопа для предупреждения столкновений и других взаимодействий с антителом. Каркасы с пересадкой требуют, чтобы замененный сегмент и встроенный эпитоп имели сходные преобразования при трансляции и вращении между N- и C-концами, и чтобы окружающий пептидный остов не сталкивался со встроенным эпитопом. Одним различием между пересадкой и совмещением является то, что при пересадке пытаются точно имитировать конформацию эпитопа, в то время как совмещение позволяет небольшие структурные отклонения.

Конструкции эпитоп-каркас "de novo" получают компьютерным моделированием с нуля для оптимального присутствия кристаллизованной конформации эпитопа. Этот способ основан на компьютерном моделировании новой укладки (Kuhlman, B. et al. 2003 Science 302:1364-1368). Моделирование de novo позволяет конструирование иммуногенов, которые как имеют минимальный размер, так что они не презентируют нежелательных эпитопов, так и являются высокостабильными против термической и химической денатурации.

Каркас может представлять собой гетерологичный каркас. В нескольких вариантах осуществления нативный каркасный белок (без встраивания эпитопа) не является белком оболочки вируса. В дополнительных вариантах осуществления каркасный белок не является белком RSV. В других вариантах осуществления каркасный белок не является вирусным белком.

В дополнительных вариантах осуществления белок эпитоп-каркас включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве любой из SEQ ID NO: 341-343, или полипептид по меньшей мере с 80% идентичностью последовательности (такой как по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности) с любой из SEQ ID NO: 341-343, и где белок эпитоп-каркас специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). В дополнительных вариантах осуществления белок F RSV представляет собой любую из SEQ ID NO: 341-343, где аминокислотная последовательность белка F RSV имеет вплоть до 20 аминокислотных замен и где белок эпитоп-каркас специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅), в отсутствие связывания соответствующим антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22). Альтернативно полипептид может не иметь или может иметь вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 аминокислотных замен.

Рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, может быть помещен в любое место каркаса при условии, что полученная белок эпитоп-каркас специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅), в отсутствие связывания соответствующим антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22). Способы определения того, связывается ли конкретная белок эпитоп-каркас специфически антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) описаны в настоящем описании и известны специалисту в данной области (см., например, публикации международных заявок № WO 2006/091455 и WO 2005/111621). Кроме того, образование комплекса антитело-антиген можно оценивать с использованием ряда хорошо определенных диагностических анализов, включающих общепринятые форматы иммуноанализа, для обнаружения и/или количественного определения антигенспецифических антител. Такие анализы включают, например, ферментные иммуноанализы, например, ELISA, клеточные анализы, проточную цитометрию, радиоиммунные анализы и иммуногистохимическое окрашивание. Многочисленные конкурентные и неконкурентные анализы связывания белков известны в данной области и многие из них являются коммерчески доступными. Способы определения того, включает ли конкретный белок эпитоп-каркас специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅), в отсутствие связывания соответствующим антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), также описаны в настоящем описании и, кроме того, известны специалисту в данной области.

3. Вирусоподобные частицы

В некоторых вариантах осуществления предусматривается вирусоподобная частица (VLP), которая включает описанный рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. VLP лишены вирусных компонентов, которые требуются для репликации вируса и, таким образом, они представляют собой в высокой степени ослабленную форму вируса. VLP могут экспонировать полипептид (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации), который способен индуцировать иммунный ответ на RSV при введении индивидууму. Вирусоподобные частицы и способы их получения известны и знакомы специалисту в данной области и известно, что вирусные белки из нескольких вирусов образуют VLP, включая вирус папилломы человека, ВИЧ (Kang et al., Biol. Chem. 380: 353-64 (1999)), вирус леса Семлики (Notka et al., Biol. Chem. 380: 341-52 (1999)), полиомавирус человека (Goldmann et al., J. Virol. 73: 4465-9 (1999)), ротавирус (Jiang et al., Vaccine 17: 1005-13 (1999)), парвовирус (Casal, Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol 29, Part 2, pp 141-150 (1999)), парвовирус собаки (Hurtado et al., J. Virol. 70: 5422-9 (1996)), вирус гепатита E (Li et al., J. Virol. 71: 7207-13 (1997)), и вирус болезни Ньюкасла. Например, химерная VLP, содержащая антиген RSV, может представлять собой VLP на основе вируса болезни Ньюкасла. Ранее было показано, что VLP на основе вируса болезни Ньюкасла индуцирует нейтрализующий иммунный ответ на RSV у мышей. Образование таких VLP можно обнаруживать любым подходящим способом. Примеры подходящих способов для обнаружения VLP в среде, известные в данной области, включают,например, способы электронной микроскопии, динамическое рассеяние света (DLS), селективное хроматографическое разделение (например, ионообменное хроматографическое разделение, хроматографическое разделение гидрофобного взаимодействия и/или эксклюзионное хроматографическое разделение VLP) и центрифугирование с градиентом плотности.

В некоторых вариантах осуществления вирусоподобная частица включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1 (такой как полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом), где полипептид F1 включает дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290 и заполняющую полость аминокислотную замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющей полость аминокислотной заменой в положении 190 и заполняющей полость аминокислотной заменой в положении 207.

В некоторых вариантах осуществления вирусоподобная частица включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1 (такой как полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом), где полипептид F1 включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, аминокислотные замены S155C, S290C и S190W, или аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В следующих вариантах осуществления вирусоподобная частица включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1 (такой как полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом), где полипептид F1 включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W или аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

В некоторых вариантах осуществления вирусоподобная частица включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1 (такой как полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом), где полипептид F₂и полипептид F₁включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F); или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F).

В нескольких вариантах осуществления вирусоподобная частица включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁(такой как полипептид F1, связанный с трансмембранным доменом) и полипептид F₂из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где полипептид F1 включает любую из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании (например, одну из описанных выше комбинаций стабилизирующих замен, таких как замены S155C, S290C и S190F, или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

4. Белковые наночастицы

В некоторых вариантах осуществления предусматривается белковая наночастица, которая включает один или несколько из любых из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, где белковая наночастица специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Неограничивающий пример наночастиц включает наночастицы ферритина, наночастицы инкапсулина и наночастицы оксигеназы/редуктазы серы (SOR), которые состоят из сборки мономерных субъединиц, включающих белки ферритина, белки инкапсулина и белки SOR, соответственно. Для конструирования белковых наночастиц, включающих описанный рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, антиген связывают с субъединицей белковой наночастицы (такой как белок ферритин, белок инкапсулин или белок SOR). Слитый белок самостоятельно собирается в наночастицы в соответствующих условиях.

Наночастицы ферритина и их применение для целей иммунизации (например, для иммунизации против антигенов вируса гриппа) описаны в данной области (см., например, Kanekiyo et al., Nature, 499:102-106, 2013, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

В некоторых вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связан с полипептидом ферритина или гибридом различных полипептидов ферритина для конструирования белковой наночастицы ферритина, где наночастица ферритина специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Ферритин представляет собой глобулярный белок, который встречается у всех животных, бактерий и растений и который действует, в основном контролируя скорость и положение образования полинуклеарного Fe(III)₂O₃ через транспортировку гидратированных ионов железа и протонов и образование минерализованной сердцевины. Глобулярная форма ферритина состоит из мономерных субъединиц, которые представляют собой полипептиды, обладающие молекулярной массой приблизительно 17-20 кДа. Пример последовательности такой мономерной субъединицы представлен в SEQ ID NO: 353. Каждая мономерная субъединица имеет топологию спирального пучка, который включает мотив из четырех антипараллельных спиралей с пятой более короткой спиралью (c-концевая спираль), располагающейся приблизительно перпендикулярно оси пучка из 4 спиралей. В соответствии с условными обозначениями, спирали обозначают как "A, B, C, D и E" от N-конца, соответственно. N-концевая последовательность располагается рядом с осью третьего порядка капсида и выходит на поверхность, в то время как спирали E упаковываются вместе у четверной оси с C-концом, выходящим в сердцевину капсида. Последствием этого упаковывания являются две поры на поверхности капсида. Ожидается, что одна или обе из этих пор соответствуют точке, в которой гидратированное железо диффундирует внутрь и наружу капсида. После продуцирования эти мономерные субъединичные белки подвергаются самосборке в глобулярный белок ферритин. Таким образом, глобулярная форма ферритина содержит 24 мономерных субъединичных белка и имеет подобную капсиду структуру, имеющую симметрию 432. Способы конструирования наночастиц ферритина известны специалисту в данной области и дополнительно описаны в настоящем описании (см., например, Zhang, Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

В конкретных примерах полипептид ферритина представляет собой ферритин E. coli, ферритин Helicobacter pylori, легкую цепь ферритина человека, ферритин роющей лягушки или их гибрид, такой как ферритин E. coli-человека, ферритин E. coli-роющей лягушки, или гибридный ферритин человека-роющей лягушки. Иллюстративные аминокислотные последовательности полипептидов ферритина и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды ферритина, для применения в описанных антигенах белка F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, могут быть найдены в GENBANK®, например, под номерами доступа ZP_03085328, ZP_06990637, EJB64322.1, AAA35832, NP_000137 AAA49532, AAA49525, AAA49524 и AAA49523, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме в том виде, как они были доступны на 28 февраля 2013 года. В одном варианте осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связан с белком ферритином, включающим аминокислотную последовательность по меньшей мере на 80% (как например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 97%) идентичную аминокислотной последовательности, указанной в качестве SEQ ID NO: 353. Конкретный пример описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связанных с белком ферритином, включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве SEQ ID NO: 350.

В некоторых вариантах осуществления полипептид ферритина представляет собой ферритин Helicobacter pylori (такой как полипептид ферритин, указанный в качестве SEQ ID NO: 353) и включает замену остатка цистеина в положении 31, такую как замена C31S, C31A или C31V. Любой из описанных рекомбинантных белков F RSV (например, полипептид F RSV с заменами S155C, S290C и S190F или с заменами S155C, S290C, S190F и V207L) может быть связан с ферритином Helicobacter pylori (таким как полипептид ферритина, указанный в качестве SEQ ID NO: 353), который дополнительно включает замену остатка цистеина в положении 31 полипептида ферритина, такую как замена C31S, C31A или C31V.

В некоторых вариантах осуществления наночастица белка ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином, и где полипептид F1 включает дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290 и заполняющую полость замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющую полость замену в положении 190, и заполняющую полость замену в положении 207.

В некоторых вариантах осуществления белковая наночастица ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином и где полипептид F1 включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, аминокислотные замены S155C, S290C и S190W аминокислота или аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В следующих вариантах осуществления белковые наночастицы ферритина включают рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином и где полипептид F1 включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W, или аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

Белок F RSV, включенный в наночастицу ферритина, может представлять собой белок F RSV подтипа A человека, подтипа B человека или бычьего RSV и может включать замены, описанные в настоящем описании, для стабилизации в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления белковая частица ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином, и где полипептид F₂и полипептид F₁включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F); или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F).

В нескольких вариантах осуществления белковая наночастица ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F₁и полипептид F₂из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где полипептид F1 включает любую из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании (например, одна из описанных выше комбинаций стабилизирующих замен, таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В некоторых вариантах осуществления наночастица ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином и где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с белком ферритином, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-679, соответственно SEQ ID NO: 377 (RSV A, включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, V207L с C-концевым доменом ферритина) или SEQ ID NO: 378-382.

В некоторых вариантах осуществления наночастица ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с ферритином, и где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с ферритином, включают аминокислотные замены, приведенные в рядах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 столбца 3 таблицы 8e. В некоторых вариантах осуществления наночастица ферритина включает рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином и где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с белком ферритином, включают аминокислотную последовательность полипептида F1 и F2, указанную в SEQ ID NO, приведенных в рядах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 столбца 4 таблицы 8e. Будет понятно, что SEQ ID NO 602-617 и 620-634 и 645-650, приведенные в таблице 8e, включают сигнальную последовательность и последовательности полипептида pep27, которые удаляются путем протеолитического процессинга, когда соответствующий белок F продуцируется в эукариотических клетках, а также C-концевые белковые метки.

В дополнительных вариантах осуществления любой из описанных выше антигенов белка F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связывают с полипептидом инкапсулина для конструирования наночастицы инкапсулина, где наночастица инкапсулина специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22) и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Белки инкапсулины представляют собой консервативное семейство бактериальных белков, также известных как линоцин-подобные белки, которые образуют крупные белковые агрегаты, которые функционируют в качестве минимального компартмента для упаковывания ферментов. Сборка инкапсулина осуществляется из мономерных субъединиц, которые представляют собой полипептиды, обладающие молекулярной массой приблизительно 30 кДа. Пример последовательности одной такой мономерной субъединицы представлен в качестве SEQ ID NO: 354. После продуцирования мономерные субъединицы подвергаются самосборке в глобулярный ансамбль инкапсулина, включающий 60 мономерных субъединиц. Способы конструирования наночастиц инкапсулина известны специалисту в данной области и дополнительно описаны в настоящем описании (см., например, Sutter et al., Nature Struct. и Mol. Biol., 15:939-947, 2008, которая включена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме). В конкретных примерах полипептид инкапсулина представляет собой бактериальный инкапсулин, такой как инкапсулин E. coli или Thermotogamaritime. Иллюстративная последовательность инкапсулина для применения с описанными антигенами белка F RSV, стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, указана в качестве SEQ ID NO: 354.

В дополнительных вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связывают с полипептидом оксигеназы/редуктазы серы (SOR) для конструирования наночастицы SOR, где наночастица SOR специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Белки SOR представляют собой микробные белки (например, из термоацидофильных архей Acidianus ambivalens, которые образуют сборки белков из 24 субъединиц). Способы конструирования наночастиц SOR известны специалисту в данной области (см., например, Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Конкретные примеры описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связанных с белком SOR, включают аминокислотные последовательности, указанные в качестве SEQ ID NO: 344 и SEQ ID NO: 345.

В дополнительных вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связывают с полипептидом синтазы лумазина для конструирования наночастицы синтазы лумазина, где наночастица синтазы лумазина специфически связывается антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включает специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Конкретные примеры описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связанных с белком синтазы лумазина, включают аминокислотные последовательности, указанные в качестве SEQ ID NO: 346-348.

В дополнительных вариантах осуществления любой из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связывают с полипептидом пируватдегидрогеназы для конструирования наночастиц пируватдегидрогеназы, где наночастицы пируватдегидрогеназы специфически связываются антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включают специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅). Конкретный пример описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связанных с белком пируватдегидрогеназы, включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве SEQ ID NO: 349.

В некоторых примерах любой из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, связан с N- или C-концом белка ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы, например, с линкером, таким как линкер Ser-Gly. Когда конструкции конструируют в клетках HEK 293 Freestyle, слитые белки секретируются из клеток и подвергаются самосборке в наночастицы. Наночастицы можно очищать с использованием известных способов, например, с использованием нескольких различных методик хроматографии,например, хроматографии Mono Q (анионообменная), за которой следует эксклюзионная (SUPEROSE® 6) хроматография.

Несколько вариантов осуществления включают мономерную субъединицу белка ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы или любой их части, которая способна направлять самосборку мономерных субъединиц в глобулярную форму белка. Аминокислотные последовательности из мономерных субъединиц любого известного белка ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы можно использовать для получения слитых белков с описанными рекомбинантными белками F RSV, стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, при условии, что мономерная субъединица способна к самосборке в наночастицу, экспонирующую рекомбинантные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации, на ее поверхности.

Слитые белки не должны содержать полноразмерную последовательность полипептида мономерной субъединицы белка ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы. Можно использовать части или области полипептида мономерной субъединицы при условии, что часть содержит аминокислотные последовательности, которые направляют самосборку мономерных субъединиц в глобулярную форму белка.

В некоторых вариантах осуществления может быть пригодным внесение способами инженерии мутаций в аминокислотную последовательность мономерных субъединиц ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы. Например, может быть пригодным изменение участков, таких как участки распознавания ферментом или участки гликозилирования, для достижения благоприятных свойств слитого белка (например, время полужизни).

Специалистам в данной области будет понятно, что слияние любого из описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, с белком ферритином, инкапслуином, SOR, синтазой лумазина или пируватдегидрогеназой следует проводить так, чтобы описанные части рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, в слитом белке не препятствовали самосборке мономерных субъединиц ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы в глобулярный белок, и чтобы часть белка ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы в слитом белке не препятствовала способности описанного антигена рекомбинантного белка F RSV, стабилизированного в предшествующей слиянию конформации, индуцировать иммунный ответ на RSV. В некоторых вариантах осуществления белок ферритин, инкапсулин, SOR, синтаза лумазина или пируватдегидрогеназа и описанный рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, могут быть связаны вместе прямо без влияния на активность любой из частей. В других вариантах осуществления белок ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы и рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, связаны с использованием линкерной (также обозначаемой как спейсерная) последовательности. Линкерную последовательность конструируют для размещения части ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы в слитом белке и описанной части рекомбинантного белка F RSV, стабилизированного в предшествующей слиянию конформации, в слитом белке относительно друг друга так, чтобы слитый белок сохранял способность собираться с наночастицы, а также индуцировать иммунный ответ на RSV. В нескольких вариантах осуществления линкерные последовательности содержат аминокислоты. Предпочтительные для применения аминокислоты представляют собой аминокислоты, имеющие небольшие боковые цепи, и/или аминокислоты, которые являются незаряженными. Такие аминокислоты с меньшей вероятностью будут препятствовать надлежащему сворачиванию и активности слитого белка. Таким образом, предпочтительными аминокислотами для применения в линкерных последовательностях, либо отдельно, либо в комбинации, являются серин, глицин и аланин. Одним примером такой линкерной последовательности является SGG. Аминокислоты при необходимости можно добавлять или устранять. Специалисты в данной области способны определять соответствующие линкерные последовательности для конструирования белковых наночастиц.

В определенных вариантах осуществления белковые наночастицы имеют молекулярную массу от 100 до 5000 кДа, такую как приблизительно от 500 до 4600 кДа. В некоторых вариантах осуществления наночастица ферритина имеет приблизительную молекулярную массу 650 кДа, наночастица инкапсулина имеет приблизительную молекулярную массу 2100 кДа, наночастица SOR имеет приблизительную молекулярную массу 1000 кДа, наночастица синтазы лумазина имеет приблизительную молекулярную массу 4000 кДа, и наночастица пируватдегидрогеназы имеет приблизительную молекулярную массу 4600 кДа, когда белковая наночастица включает рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

Описанные рекомбинантные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации, связанные с белками ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы, могут подвергаться самосборке в мультисубъединичные белковые наночастицы, называемые наночастицами ферритина, наночастицами инкапсулина, наночастицами SOR, наночастицами синтазы лумазина и наночастицами пируватдегидрогеназы, соответственно. Наночастицы включают описанные рекомбинантные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации, которые обладают по существу такими же структурными характеристиками, как и наночастицы нативного ферритина, инкапсулина, SOR, синтазы лумазина или пируватдегидрогеназы, которые не включают описанных рекомбинантных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации. А именно, они содержат 24, 60, 24, 60 или 60 субъединиц (соответственно) и обладают сходной соответствующей симметрией. В случае наночастиц, сконструированных из мономерных субъединиц, включающих описанный рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, такие наночастицы специфически связываются антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации (например, антителом D25 или AM22), и/или включают специфическую предшествующую слиянию конформацию F RSV (как например, антигенный участок ∅).

C. Полинуклеотиды, кодирующие Антигены

Также предусматриваются полинуклеотиды, кодирующие описанные антигены PreF (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, или белок эпитоп-каркас, или вирусоподобная частица, или белковая наночастица, содержащие такие белки). Эти полинуклеотиды включают последовательности ДНК, кДНК и РНК, которые кодируют антиген.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, где полипептид-предшественник F₀ включает, от N-конца к C-концу, сигнальный пептид, полипептид F₂, полипептид Pep27 и полипептид F₁. В некоторых вариантах осуществления полипептид Pep27 включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 110-136 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124. В некоторых вариантах осуществления сигнальный пептид включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 1-25 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанного в качестве SEQ ID NO: 124.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, где полипептид-предшественник F₀ включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве любой из SEQ ID NO: 185 или 189-303. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, где полипептид-предшественник F₀ включает аминокислотную последовательность, указанную в качестве остатков 1-513 любой из SEQ ID NO: 185, или 189-303.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включающий полипепитид F2 и полипептид F1, и где полипептид F1 включает дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, и заполняющую полость замену в положении 190; или дисульфидную связь между парой остатков цистеина в положениях 155 и 290, заполняющую полость замену в положении 190 и заполняющую полость замену в положении 207.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, и где полипептид F1 включает аминокислотные замены S155C, S290C и S190F, аминокислотные замены S155C, S290C и S190W, или аминокислотные замены S155C, S290C и S190L. В следующих вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, и где полипептид F1 включает аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207L, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207F, аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207W, аминокислотные замены S155C, S290C, S190W и V207W, или аминокислотные замены S155C, S290C, S190L и V207W.

В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F₂и полипептид F₁включают аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, любой из SEQ ID NO: 371 (RSV A с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 373 (бычий RSV с заменами S155C, S290C, S190F и V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A с заменами S155C, S290C и S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B с заменами S155C, S290C и S190F); или SEQ ID NO: 376 (бычий RSV с заменами S155C, S290C и S190F).

В нескольких вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1 из RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьего RSV, где полипептид F1 включает любую из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании (например, одна из описанных выше комбинаций стабилизирующих замен, таких как замены S155C, S290C и S190F, или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В одном неограничивающем примере молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид-предшественник F₀, который при экспрессии в соответствующей клетке процессируется в описанный антиген PreF, включающий рекомбинантный белок F RSV, включающий полипептид F2 и полипептид F1, где полипептид F1 связан с белком ферритином, и где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с белком ферритином, включают аминокислотные последовательности, указанные в качестве положений 26-109 и 137-679, соответственно, SEQ ID NO: 377 (RSV A, включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F, V207L с C-концевым доменом ферритина), или SEQ ID NO: 378-382.

В одном неограничивающем примере молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, указанную в качестве SEQ ID NO: 383 (белок F RSV из подтипа A, включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитый с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II).

В другом неограничивающем примере молекула нуклеиновой кислоты представляет собой экспрессирующий вектор и включает последовательность, указанную в качестве SEQ ID NO: 384 (белок F RSV из подтипа A человека, включающий аминокислотные замены S155C, S290C, S190F и V207L, слитый с C-концевым доменом Foldon, участком расщепления тромбином, 6xHis-меткой и StrepTag II).

Способы манипулирования и встраивания нуклеиновых кислот по изобретению в векторы хорошо известны в данной области (см. например, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, и Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1994).

Нуклеиновую кислоту, кодирующую антигены PreF (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, или белок эпитоп-каркас, или вирусоподобная частица, или белковая наночастица, содержащие такие белки) можно клонировать или амплифицировать способами in vitro, такими как полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (LCR), система амплификации на основе транскрипции (TAS), самоподдерживающаяся система репликации последовательностей (3SR) и система амплификации с репликазой Qβ (QB). Например, полинуклеотид, кодирующий белок, можно выделять полимеразной цепной реакцией кДНК с использованием праймеров на основе последовательности ДНК молекулы. Широкое множество методологий клонирования и амплификации in vitro хорошо известно специалистам в данной области. Способы ПЦР описаны, например, в патенте США № 4683195; Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; и Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Полинуклеотиды также можно выделять путем скрининга геномных библиотек или библиотек кДНК с помощью зондов, выбираемых из последовательностей желаемого полинуклеотида в жестких условиях гибридизации.

Полинуклеотиды, кодирующие антигены PreF (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, или белок эпитоп-каркас, или вирусоподобная частица или белковая наночастица, содержащая такие белки) включают рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариот или эукариот, или которая существует в качестве отдельной молекулы (такой как кДНК), независимо от других последовательностей. Нуклеотиды могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или модифицированные формы любого нуклеотида. Термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК.

Последовательности ДНК, кодирующие антигены PreF (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, или белок эпитоп-каркас, или вирусоподобная частица, или белковая наночастица, содержащие такие белки) могут быть экспрессированы in vitro посредством переноса ДНК в подходящую клетку-хозяина. Клетка может быть прокариотической или эукариотической. Термин также включает любых потомков рассматриваемой клетки-хозяина. Понятно, что все потомки могут не быть идентичными родительской клетке, поскольку могут существовать мутации, которые возникают в процессе репликации. Способы стабильного переноса, что означает, что чужеродная ДНК постоянно поддерживается в хозяине, известны в данной области.

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие антигены PreF (например, рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, или белок эпитоп-каркас, или вирусоподобная частица, или белковая наночастица, содержащие такие белки) могут быть функционально связаны с последовательностями контроля. Последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с кодирующей последовательностью, лигируют так, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась в условиях, совместимых с последовательностями контроля экспрессии. Последовательности контроля экспрессии включают, но не ограничиваются ими, соответствующие промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, инициирующий кодон (т.е. ATG) перед кодирующим белок геном, сигнал сплайсинга для интронов для поддержания правильной рамки считывания этого гена, чтобы обеспечить надлежащую трансляцию мРНК, и стоп-кодоны.

Хозяева могут включать организмы микробов, дрожжей, насекомых и млекопитающих. Способы экспрессии последовательностей ДНК, имеющих эукариотические или вирусные последовательности, в прокариотах хорошо известны в данной области. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев включают клетки бактерий, архей, насекомых, грибов (например, дрожжей), растений и животных (например, клетки млекопитающих, таких как человек). Иллюстративные используемые клетки включают Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium, клеткиSF9, клетки C129, клетки 293, Neurospora и иммортализованные миелоидные и лимфоидные клеточные линии млекопитающих. Способы увеличения в количестве клеток млекопитающих в культуре являются хорошо известными (см., Jakoby and Pastan (eds), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, N.Y.). Примерами широко используемых линий клеток-хозяев являются клетки VERO и HeLa, клетки CHO, и клеточные линии WI38, BHK и COS, хотя можно использовать клеточные линии, такие как клетки, предназначенные для обеспечения более высокой экспрессии, желаемых профилей гликозилирования или других признаков. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева включают клетки HEK293 или их производные, такие как клетки GnTI^-/- (ATCC® № CRL-3022).

Трансформацию клетки-хозяина рекомбинантной ДНК можно проводить общепринятыми способами, которые хорошо известны специалистам в данной области. Когда хозяин является прокариотическим, например, но не ограничиваясь ими, таким как E. coli, клетки, которые способны захватывать ДНК, можно получать из клеток, собранных после экспоненциальной фазы роста, а затем обрабатывать способом с CaCl₂ с использованием методик, хорошо известных в данной области. Альтернативно можно использовать MgCl₂ или RbCl. Трансформацию также можно проводить после формирования протопласта клеток-хозяева, если желательно, или способом электропорации.

Когда хозяином является эукариотическая клетка, можно использовать такие способы трансфекции ДНК, как совместная преципитация с фосфатом кальция, общепринятые механические методики, такие как микроинъекция, электропорация, встраивание плазмиды, заключенной в липосомы, или вирусные векторы. Эукариотические клетки также можно совместно трансформировать полинуклеотидными последовательностями, кодирующими описанный антиген, и второй чужеродной молекулой ДНК, кодирующей селективный фенотип, такой как ген тимидинкиназы простого герпеса. Другим способом является использование эукариотического вирусного вектора, такого как вирус обезьян 40 (SV40) или вирус папилломы крупного рогатого скота, для временного инфицирования или трансформации эукариотических клеток и экспрессии белка (см. например, Eucariotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).

D. Вирусные векторы

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, могут быть включены в вирусный вектор, например, для экспрессии антигена в клетке-хозяине или для иммунизации индивидуума, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления вирусные векторы вводят индивидууму в качестве части вакцинации с первичной иммунизацией-усиливающей иммунизацией. В нескольких вариантах осуществления вирусные векторы включены в вакцину, такую как первичная вакцина или усиливающая вакцина, для применения в вакцинации с первичной иммунизацией-усиливающей иммунизацией.

В нескольких примерах вирусный вектор, кодирующий рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, может быть компетентным по репликации. Например, вирусный вектор может иметь мутацию (например, инсерцию нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген PreF) в вирусном геноме, которая не ингибирует репликацию вируса в клетках-хозяевах. Вирусный вектор также может быть кондиционально компетентным по репликации. В других примерах вирусный вектор является дефектным по репликации в клетках-хозяевах.

В нескольких вариантах осуществления рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, экспрессируется вирусным вектором, который можно доставлять через дыхательные пути. Например, для экспрессии описанного антигена используют вектор на основе парамиксовируса (PIV), такой как вектор на основе бычьего парагриппа (BPIV) (например, вектор BPIV-1, BPIV-2 или BPV-3) или вектор на основе PIV человека, вектор на основе метапневмовируса (MPV), вектор на основе вируса Сендай или вектор на основе вируса кори. Вирусный вектор BPIV3, экспрессирующий белки F RSV и F hPIV (MEDI-534) в настоящее время проходит клинические испытания в качестве вакцины против RSV. Примеры вектора на основе парамиксовируса (PIV) для экспрессии антигенов известны специалисту в данной области (см., например, публикации патентов США 2012/0045471, 2011/0212488, 2010/0297730, 2010/0278813, 2010/0167270, 2010/0119547, 2009/0263883, 2009/0017517, 2009/0004722, 2008/0096263, 2006/0216700, 2005/0147623, 2005/0142148, 2005/0019891, 2004/0208895, 2004/0005545, 2003/0232061, 2003/0095987 и 2003/0072773; все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). В другом примере для экспрессии описанного антигена используют вектор на основе вируса болезни Ньюкасла (см., например, McGinnes et al., J. Virol., 85: 366-377, 2011, в которой описаны белки F и G RSV, экспрессированные на вирусоподобных частицах на основе вируса болезни Ньюкасла, включенная в качестве ссылки в полном объеме). В другом примере для экспрессии описанного антигена используют вектор на основе вируса Сендай (см., например, Jones et al., Vaccine, 30:959-968, 2012, включенную в настоящее описание в полном объеме, в которой описана вакцина на основе вируса Сендай против RSV для индукции иммунного ответа у приматов).

Дополнительные вирусные векторы также доступны для экспрессии описанных антигенов, включая вирус полиомы, т.е. SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol., 73:15331536), аденовирус (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), вирус коровьей оспы (Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499), аденоассоциированный вирус (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), вирус герпеса, включая HSV и EBV и CMV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199), вирусы Синдбис (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; патенты США № 5091309 и 52217879), альфа-вирусы (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377) и ретровирусы птиц (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391-3397), мышей (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401-407) и человека (Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol., 66:2731-2739). Также в данной области известны бакуловирусные (вирус ядерного полиэроза Autographa californica; AcMNPV) векторы, и они могут быть получены из коммерческих источников (таких как PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.). Дополнительные вирусные векторы известны специалисту в данной области.

В нескольких вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, включают аденовирусный вектор, который экспрессирует рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. Аденовирус из различных источников, подтипов или смеси подтипов можно использовать в качестве источника вирусного генома для аденовирусного вектора. Также для получения аденовирусного вектора можно использовать не являющийся человеческим аденовирус (например, аденовирусы обезьяны, шимпанзе, гориллы, птиц, собак, овец или крупного рогатого скота). Например, в качестве источника вирусного генома аденовирусного вектора можно использовать аденовирус обезьян. Аденовирус обезьян может иметь серотип 1, 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39, 48, 49, 50 или любой другой серотип аденовируса обезьян. Аденовирус обезьян может быть указан с использованием любого подходящего сокращенного обозначения, известного в данной области, например, такого как SV, SAdV, SAV или sAV. В некоторых примерах аденовирусный вектор обезьян представляет собой аденовирусный вектор обезьян серотипа 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38 или 39. В одном примере используют вектор серотипа C Ad3 шимпанзе (см., например, Peruzzi et al., Vaccine, 27:1293-1300, 2009). В качестве источника вирусного генома для аденовирусного вектора можно использовать аденовирус человека. Аденовирус человека может представлять собой вирус любых подгрупп или серотипов. Например, аденовирус может представлять собой вирус подгруппы A (например, серотипы 12, 18 и 31), подгруппы B (например, серотипы 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 и 50), подгруппы C (например, серотипы 1, 2, 5 и 6), подгруппы D (например, серотипы 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36-39 и 42-48), подгруппы E (например, серотип 4), подгруппы F (например, серотипы 40 и 41), неуточненной серогруппы (например, серотипы 49 и 51), или любой другой серотип аденовируса. Специалисту в данной области известны компетентные и дефектные по репликации аденовирусные векторы (включая аденовирусные векторы с единичным и множественным дефицитом репликации). Примеры аденовирусных векторов с дефектом репликации, включая аденовирусные векторы с множественным дефектом репликации, описаны в патентах США № 5837511; 5851806; 5994106; 6127175; 6482616 и 7195896, и международных патентных заявках № WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/22378, WO 97/12986, WO 97/21826 и WO 03/02231 1.

E. Композиции

Описанные антигены PreF, вирусные векторы и молекулы нуклеиновых кислот могут быть включены в фармацевтическую композицию, включая терапевтические и профилактические составы, и их можно комбинировать с одним или несколькими адъювантами и, необязательно, другими терапевтическими ингредиентами, такими как противовирусные лекарственные средства. В нескольких вариантах осуществления композиции, включающие один или несколько из описанных антигенов PreF, вирусных векторов или молекул нуклеиновых кислот, представляют собой иммуногенные композиции. Композиция может включать любой из антигенов PreF, включающих рекомбинантный белок F RSV, как описано в настоящем описании (такой как белковая наночастица, включающая любой из рекомбинантных белков F RSV, как описано в настоящем описании), вирусоподобную частицу, включающую любой из рекомбинантных белков F RSV, как описано в настоящем описании, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из рекомбинантных белков F RSV, как описано в настоящем описании, или вектор, кодирующий или включающий любой из рекомбинантных белков F RSV, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает первый выделенный антиген, включающий рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа A, и второй выделенный антиген, включающий рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает первую белковую наночастицу, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F подтипа A RSV, и вторую белковую наночастицу, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает первый вирусный вектор, включающий рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F подтипа A RSV, и второй вирусный вектор, включающий рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает первую вирусоподобную частицу, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F подтипа A RSV, и вторую вирусоподобную частицу, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает первую молекулу нуклеиновой кислоты (такую как экспрессирующий вектор), кодирующую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа A, и вторую молекулу нуклеиновой кислоты (такой как экспрессирующий вектор), включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (такой как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

Такие фармацевтические композиции можно вводить индивидууму различными способами введения, известными специалисту в данной области, например, назальным, легочным, внутримышечным, подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным или парентеральным путями.

Для составления композиций описанные антигены PreF, вирусные векторы или молекулы нуклеиновых кислот можно комбинировать с различными фармацевтически приемлемыми добавками, а также с основами или носителями для диспергирования конъюгата. Желаемые добавки включают, но не ограничиваются ими, средства контроля pH, такие как аргинин, гидроксид натрия, глицин, хлористоводородная кислота, лимонная кислота и т.п. Кроме того, можно включать местные анестетики (например, бензиловый спирт), обеспечивающие изотоничность средства (например, хлорид натрия, маннит, сорбит), ингибиторы адсорбции (например, TWEEN® 80), повышающие растворимость средства (например, циклодекстрины и их производные), стабилизаторы (например, сывороточный альбумин) и восстановители (например, глутатион). В композиции могут быть включены адъюванты, такие как гидроксид алюминия (ALHYDROGEL®, доступный от Brenntag Biosector, Copenhagen, Denmark, и Amphogel®, Wyeth Laboratories, Madison, NJ), адъювант Фрейнда, MPL™ (3-O-деацилированный монофосфориллипид A; Corixa, Hamilton, IN), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), агонисты TLR (такие как агонисты TLR-9), среди многих других пригодных адъювантов, хорошо известных в данной области.

Когда композиция является жидкой, тоничность состава при измерении относительно тоничности 0,9% (масс./об.) физиологического солевого раствора, взятой в качестве единицы, как правило, доводят до величины, при которой не происходит существенного необратимого повреждения ткани в области введения. Как правило, тоничность раствора доводят до величины от приблизительно 0,3 до приблизительно 3,0, как например, от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,0, или от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,7.

Описанные антигены PreF, вирусные векторы или молекулы нуклеиновых кислот могут быть диспергированы в основе или носителе, которые включают гидрофильное соединение, обладающее способностью диспергировать антигены, и любые желаемые добавки. Основу можно выбирать из широкого диапазона подходящих соединений, включая, но не ограничиваясь ими, сополимеры поликарбоновых кислот и их солей, ангидриды карбоновых кислот (например, малеиновый ангидрид) с другими мономерами (например, метил(мет)акрилат, акриловая кислота и т.п.), гидрофильные виниловые полимеры, такие как поливинилацетат, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, производные целлюлозы, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и т.п., и природные полимеры, такие как хитозан, коллаген, альгинат натрия, желатин, гиалуроновая кислота и их нетоксичные соли металлов. Часто, в качестве основы или носителя выбирают биодеградируемый полимер, например, полимолочную кислоту, сополимер молочной и гликолевой кислоты, полигидроксимасляную кислоту, сополимер гидроксимасляной кислоты и гликолевой кислоты и их смеси. Альтернативно или дополнительно, в качестве носителей можно использовать синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, сложные эфиры жирных кислот и сахарозы и т.п. Гидрофильные полимеры и другие носители можно использовать отдельно или в комбинации и увеличенную структурную целостность можно сообщать носителю посредством частичной кристаллизации, образования ионных связей, сшивания и т.п. Носитель может быть предоставлен в различных формах, включая жидкие или вязкие растворы, гели, пасты, порошки, микросферы и пленки, например, для прямого нанесения на поверхность слизистой оболочки.

Описанные антигены PreF, вирусные векторы или молекулы нуклеиновых кислот можно комбинировать с основой или носителем в соответствии с различными способами, и высвобождение антигенов может осуществляться путем диффузии, дезинтеграции носителя или ассоциированного с ними образования водных каналов. В некоторых случаях описанные антигены, или нуклеиновую кислоту или вирусный вектор, кодирующие, экспрессирующие или включающие антиген, диспергируют в микрокапсулах (микросферах) или нанокапсулах (наносферах), полученных из подходящего полимера, например, изобутил-2-цианоакрилата (см., например, Michael et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43:1-5, 1991), и диспергируют в биосовместимой диспергирующей среде, которая обеспечивает непрерывную доставку и биологическую активность на протяжении длительного периода времени.

Фармацевтические композиции могут содержать в качестве фармацевтически приемлемых носителей вещества, требуемые для приближения к физиологическим условиям, такие как корректирующие pH и буферные средства, корректирующие тоничность средства, смачивающие вещества и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, монолаурат сорбитана и триэтаноламинолеат. Для твердых композиций можно использовать общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, которые включают, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и т.п. фармацевтической категории.

Фармацевтические композиции для введения описанных антигенов PreF, вирусных векторов или молекул нуклеиновых кислот также можно составлять в качестве раствора, микроэмульсии или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации активных ингредиентов. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть растворов можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, путем поддержания надлежащего размера частиц в случае диспергируемых составов и с использованием поверхностно-активных веществ. Во многих случаях является желательным включение в композицию обеспечивающих изотоничность средств, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированного всасывания описанных антигенов можно достигать путем включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, моностеаратов и желатина.

В определенных вариантах осуществления описанные антигены PreF, вирусные векторы или молекулы нуклеиновых кислот можно вводить в составе с пролонгированным высвобождением, например, в композиции, которая включает полимер для замедленного высвобождения. Эти композиции можно приготавливать с носителями, которые защищают от быстрого высвобождения, например, с носителем для контролируемого высвобождения, таким как полимер, микроинкапсулированная система доставки или биоадгезивный гель. Пролонгированной доставки в различных композициях по изобретению можно достигать путем включения в композицию средств, которые замедляют всасывание, например, гидрогелей на основе моностеарата алюминия и желатина. Когда являются желательными составы с контролируемым высвобождением, связующие вещества с контролируемым высвобождением, пригодные для применения в соответствии с изобретением, включают любой биосовместимый материал с контролируемым высвобождением, который является инертным к активному веществу и который способен содержать в себе описанный антиген и/или другое биологически активное вещество. Многочисленные такие материалы известны в данной области. Пригодные связующие вещества с контролируемым высвобождением представляют собой материалы, которые медленно метаболизируются в физиологических условиях после их доставки (например, на поверхность слизистой оболочки или в присутствии жидкостей организма). Подходящие связующие вещества включают, но не ограничиваются ими, биосовместимые полимеры и сополимеры, хорошо известные в данной области для применения в составах с замедленным высвобождением. Такие биосовместимые соединения являются нетоксичными и инертными для окружающих тканей и не запускают значительных неблагоприятных явлений, таких как раздражение полости носа, иммунный ответ, воспаление или сходные с ними. Они метаболизируются в метаболические продукты, которые также являются биосовместимыми и без труда элиминируются из организма. Многочисленные системы для контролируемой доставки терапевтических белков известны (например, патент США № 5055303; патент США № 5188837; патент США № 4235871; патент США № 4501728; патент США № 4837028; патент США № 4957735; и патент США № 5019369; патент США № 5055303; патент США № 5514670; патент США № 5413797; патент США № 5268164; патент США № 5004697; патент США № 4902505; патент США № 5506206; патент США № 5271961; патент США № 5254342; и патент США № 5534496).

Иллюстративные полимерные материалы для применения включают, но не ограничиваются ими, полимерные матрицы, происходящие из сополимерных и гомополимерных полиэфиров, имеющих поддающиеся гидролизу сложноэфирные связи. В данной области известно, что ряд из них являются биодеградируемыми и приводят к продуктам деградации, имеющим низкую токсичность или не имеющим токсичности. Иллюстративные полимеры включают полигликолевые кислоты и полимолочные кислоты, сополимер DL-молочной кислоты и гликолевой кислоты, сополимер D-молочной кислоты и гликолевой кислоты, и сополимер L-молочной кислоты и гликолевой кислоты. Другие пригодные биодеградируемые или биоразлагающиеся полимеры включают, но не ограничиваются ими, такие полимеры, как полимер эпсилон-капролактона, сополимер эпсилон-капролактона и молочной кислоты, сополимер эпсилон-капролактона и гликолевой кислоты, сополимер бета-гидроксимасляной кислоты, полиалкил-2-цианоакрилат, гидрогели, такие как поли(гидроксиэтилметакрилат), полиамиды, поли(аминокислоты) (например, L-лейцин, глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота и т.п.), полиэфир-мочевина, поли(2-гидроксиэтил-DL-аспартамид), полимеры полиацеталя, сложные полиортоэфиры, поликарбонат, полималеамиды, полисахариды и их сополимеры. Многие способы получения таких составов хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Другие пригодные составы включают микрокапсулы с контролируемым высвобождением (патенты США № 4652441 и 4917893), сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, пригодные для получения микрокапсул и других составов (патенты США № 4677191 и 4728721) и композиции с замедленным высвобождением для растворимых в воде пептидов (патент США № 4675189).

Фармацевтические композиции, как правило, являются стерильными и стабильными в условиях изготовления, хранения и применения. Стерильные растворы можно получать путем включения описанных антигенов PreF, вирусных векторов или молекул нуклеиновых кислот в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных в настоящем описании, как требуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем включения описанного антигена и/или другого биологически активного средства в стерильный носитель, который содержит основную дисперсную среду и другие требуемые ингредиенты из ингредиентов, перечисленных выше. В случае стерильных порошков способы получения включают вакуумную сушку и лиофилизацию, которая дает порошок описанного антигена, плюс какой-либо дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрации раствора. Предупреждения действия микроорганизмов можно осуществлять с использованием различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабменов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п.

Актуальные способы получения вводимых композиций известны или очевидны специалистам в данной области и более подробно описаны в таких публикациях, как Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19^th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995.

В нескольких вариантах осуществления композиции включают адъювант. Специалисту в данной области известны адъюванты, например, адъюванты, которые можно включать в иммуногенную композицию. В нескольких вариантах осуществления адъювант выбирают так, чтобы он индуцировал иммунный ответ, смещенный в сторону Th1, у индивидуума, которому вводят иммуногенную композицию, содержащую адъювант и описанные антигены, или нуклеиновую кислоту или вирусный вектор, кодирующие, экспрессирующие или включающие антиген.

Одним пригодным адъювантом является нетоксичное производное бактериального липополисахарида. Примером подходящего нетоксичного производного липида A является монофосфориллипид A или, более конкретно, 3-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL). См., например, патенты США № 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094. 3D-MPL в основном стимулирует CD4+ T-клеточные ответы с фенотипом IFN-y (Th1). 3D-MPL можно получать в соответствии со способами, описанными в GB2220211 A. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида A с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В композициях можно использовать небольшие частицы 3D-MPL. Небольшие частицы 3D-MPL имеют такой размер частиц, чтобы их можно быть стерилизовать фильтрацией через 0,22-мкм фильтр. Такие препараты описаны в WO94/21292.

В других вариантах осуществления липополисахарид может представлять собой β (1-6) глюкозаминдисахарид, как описано в патенте США № 6005099 и патенте EP № 0 729 473 B1. Специалист в данной области без труда способен получить различные липополисахариды, такие как 3D-MPL, на основе указаний в этих ссылках. В дополнение к упомянутым выше иммунным стимуляторам (которые являются сходными по структуре с LPS или MPL или 3D-MPL), ацилированные моносахаридные и дисахаридные производные, которые являются субфрагментом описанной выше структуры MPL, также являются подходящими адъювантами.

В нескольких вариантах осуществления в качестве адъюванта используют агонист Toll-подобного рецептора (TLR). Например описанный антиген PreF можно комбинировать с агонистом TLR в иммуногенной композиции, используемой для индукции нейтрализующего иммунного ответа на RSV. Например, агонист TLR может представлять собой агонист TLR-4, такой как синтетическое производное липида A (см., например, WO 95/14026 и WO 01/46127), алкилглюкозаминидфосфат (AGP; см., например, WO 98/50399 или патент США № 6303347; 6764840). Другие пригодные лиганды TLR-4, способные вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-4, представляют собой, например, липополисахарид из грамотрицательных бактерий и его производные, или его фрагменты, в частности нетоксичное производное LPS (такое как 3D-MPL). Другие пригодные агонисты TLR представляют собой: белок теплового шока (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 или 90; белок сурфактанта A, олигосахариды гиалуронана, фрагменты гепарансульфата, фрагменты фибронектина, пептиды фибриногена и β-дефензин-2 и мурамилдипептид (MDP). В одном варианте осуществления агонист TLR представляет собой HSP 60, 70 или 90. Другие пригодные лиганды TLR-4 являются такими, как описано в WO 2003/011223 и в WO 2003/099195.

Дополнительные агонисты TLR (такие как средство, которое способно вызывать ответ в виде передачи сигнала через каскад передачи сигнала TLR) также являются пригодными в качестве адъювантов, такие как агонисты для TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 и/или TLR9. Таким образом, в одном варианте осуществления композиция дополнительно включает адъювант, который выбран из группы, состоящей из: агониста TLR-1, агониста TLR-2, агониста TLR-3, агониста TLR-4, агониста TLR-5, агониста TLR-6, агониста TLR-7, агониста TLR-8, агониста TLR-9 или их комбинации.

В одном варианте осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-1, например один или несколько из: триацилированных липопептидов (LP); фенол-растворимого модулина; LP Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-бис(пальмитоилокси)-(2-RS)-пропил)-N-пальмитоил-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)--OH тригидрохлорида (Pam3Cys) LP, который имитирует ацетилированный N-конец бактериального бипопротеина и OspA LP из Borrelia burgdorferi. В другом варианте осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-2, такой как один или несколько из липопротеина, пептидогликана, бактериального липопептида из M tuberculosis, B burgdorferi или T pallidum; пептидогликанов из вида, включающего Staphylococcus aureus; липотейхоевых кислот, маннуроновых кислот, поринов Neisseria, бактериальных фимбрий, факторов вирулентности Yersina, вирионов CMV, гемагглютинина вируса кори и зимозана из дрожжей. В некоторых вариантах осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-3, такой как один или несколько из двухцепочечной РНК (дцРНК) или полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (поли IC), которая представляет собой молекулярный паттерн нуклеиновых кислот, ассоциированный с вирусной инфекцией. В следующих вариантах осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-5, такой как бактериальный флагеллин. В дополнительных вариантах осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-6, такой как один или несколько из микобактериального липопротеина, диацилированного LP и растворимого в феноле модулина. Дополнительные агонисты TLR6 описаны в WO 2003/043572. В одном варианте осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-7, такой как один или несколько из одноцепочечной РНК (оцРНК), локсорибина, аналога гуанозина в положениях N7 и C8, или соединения имидазохинолина, или их производных. В одном варианте осуществления агонист TLR представляет собой имиквимод. Кроме того, агонисты TLR7 описаны в WO 2002/085905. В некоторых вариантах осуществления используют агонист TLR, который способен вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-8. Соответственно, агонист TLR, способный вызывать ответ в виде передачи сигнала через TLR-8, представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК), молекулу имидазохинолина с противовирусной активностью, например, резиквимод (R848); резиквимод также может распознаваться TLR-7. Другие агонисты TLR-8, которые можно использовать, включают агонисты TLR-8, описанные в WO 2004/071459.

В следующих вариантах осуществления адъювант включает агонист TLR, способный индуцировать ответ в виде передачи сигнала через TLR-9. Например, адъювант может включать HSP90, бактериальную или вирусную ДНК, и/или ДНК, содержащую неметилированные CpG-нуклеотиды (например, CpG-олигонуклеотид). Например, CpG-содержащие олигонуклеотиды преимущественно индуцируют ответ Th1. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 95/26204, WO 96/02555, WO 99/33488 и патентах США № 5278302, 5666153, и 6008200, и 5856462. Таким образом, олигонуклеотиды для применения в качестве адъювантов в описанных композициях включают CpG-содержащие олигонуклеотиды, например, содержащие два или более динуклеотидных CpG-мотива. Также включены олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями.

Другие адъюванты, которые можно использовать в иммуногенных композициях с антигенами, или нуклеиновой кислотой или вирусным вектором, кодирующими, экспрессирующими или включающими антиген, например, самостоятельно или в комбинации с 3D-MPL, или другим адъювантом, описанным в настоящем описании, представляют собой сапонины, такие как QS21. В некоторых примерах сапонины используют в качестве адъюванта, например, для системного введения антигена PreF. Применение сапонинов (например, применение Quil A, источником которого является кора южноамериканского дерева Quillaja Saponaria Molina) в качестве адъювантов известно специалисту в данной области (см., например, US 5057540 и EP 0 362 279 Bl. EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Гемолитические сапонины QS21 и QS17 (очищенные способом ВЭЖХ фракции Quil A) описаны в качестве мощных системных адъювантов, и способ их получения описан в патенте США № 5057540 и EP 0 362 279 B1.

Адъювант также может включать минеральные соли, такие как соли алюминия или кальция, в частности гидроксид алюминия, фосфат алюминия и фосфат кальция.

Другой класс пригодных адъювантов со смещением в сторону Th1 для применения в композициях включает иммуностимулирующие композиции на основе белков наружной мембраны (OMP). Иммуностимулирующие композиции на основе OMP являются особенно пригодными в качестве мукозальных адъювантов, например, для интраназального введения. Иммуностимулирующие композиции на основе OMP представляют собой род препаратов (OMP, включающие некоторые порины) из грамотрицательных бактерий, например, видов Neisseria, которые являются пригодными в качестве носителя в композициях иммуногенов, таких как бактериальные или вирусные антигены (см., например, патент США № 5726292; патент США № 4707543). Кроме того, протеасомы обладают способностью к самосборке в везикулы или в подобные везикулам кластеры OMP размером от приблизительно 20 нм до приблизительно 800 нм, и к нековалентному включению, координированию, ассоциации (например, электростатических или вследствие гидрофобных свойств), или к кооперированию иным образом с белковыми антигенами (Ag), в частности, антигенами, которые имеют гидрофобную часть. Протеасомы можно получать, например, как описано в данной области (см., например, патент США № 5726292 или патент США № 5985284; 2003/0044425).

Протеасомы состоят в основном из химически экстрагированных белков наружной мембраны (OMP) из Neisseria meningitidis (в основном порины A и B, а также OMP класса 4), поддерживаемые в растворе посредством детергента (Lowell G H. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine M M, Woodrow G C, Kaper J B, Cobon G S, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). Протеосомы можно составлять с различными антигенами, такими как очищенные или рекомбинантные белки, происходящие из вирусных источников, включая полипептиды PreF, описанные в настоящем описании. Постепенное удаление детергента позволяет образование гидрофобных комплексов в форме частиц диаметром приблизительно 100-200 нм (Lowell G H. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine M M, Woodrow G C, Kaper J B, Cobon G S, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206).

Также в композициях с описанными антигенами PreF, вирусными векторами или молекулами нуклеиновых кислот в композиции можно использовать комбинации различных адъювантов. Например, как уже отмечалось QS21 можно составлять вместе с 3D-MPL. Соотношение QS21:3D-MPL, как правило, составляет порядка от 1:10 до 10:1; как например, от 1:5 до 5:1, и часто по существу 1:1. Как правило, соотношение находится в диапазоне от 2,5:1 до 1:1 3D-MPL:QS21 (как например, AS01 (GlaxoSmithKline). Другой состав комбинации адъювантов включает 3D-MPL и соль алюминия, такую как гидроксид алюминия (как например, AS04 (GlaxoSmithKline). При составлении в комбинации эта комбинация может усиливать антигенспецифический иммунный ответ Thl.

В некоторых случаях состав адъюванта представляет собой минеральную соль, такую как соль кальция или алюминия (квасцы), например, фосфат кальция, фосфат алюминия или гидроксид алюминия. В некоторых вариантах осуществления адъювант включает эмульсию масла и воды, например, эмульсию типа "масло в воде" (как например, MF59 (Novartis) или AS03 (GlaxoSmithKline). Один пример эмульсии типа "масло в воде" включает метаболизируемое масло, такое как сквален, токол, такой как токоферол, например, альфа-токоферол и поверхностно-активное вещество, такое как сорбитан триолеат (Span 85) или полиоксиэтилен сорбитан моноолеат (Tween 80), в водном носителе.

Фармацевтическая композиция, как правило, содержит терапевтически эффективное количество описанного антигена PreF, вирусного вектора, или молекулы нуклеиновой кислоты и ее можно получать общепринятыми способами. Получение иммуногенных композиций, включая композиции для введения человеку, в общем описано в Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, под редакцией Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, под редакцией Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Инкапсулирование в липосомы описано, например, Fullerton в патенте США № 4235877. Конъюгация белков с макромолекулами описана, например, Likhite в патенте США № 4372945 и Armor et al., в патенте США № 4474757. Как правило, количество антигена в каждой дозе иммуногенной композиции выбирают в качестве количества, которое индуцирует иммунный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов.

Количество описанного антигена PreF, вирусного вектора или молекулы нуклеиновой кислоты может варьировать в зависимости, например, от конкретного используемого антигена, пути и протокола введения, и целевой популяции. Как правило, каждая доза у человека будет включать 1-1000 мкг белка, как например, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мкг, например, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 50 мкг, как например, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 40 мкг или приблизительно 50 мкг. Количество, используемое в иммуногенной композиции, выбирают, исходя из рассматриваемой популяции (например, дети младшего возраста или пожилые). Оптимальное количество для конкретной композиции можно определять с использованием стандартных исследований, вовлекающих наблюдение титров антитела и других ответов у индивидуумов. Понятно, что терапевтически эффективное количество антигена в иммуногенной композиции может включать количество, которое является неэффективным для индукции иммунного ответа при введении однократной дозы, но которое является эффективным при введении множества доз, например, в протоколе первичная иммунизация-вторичное введение.

В нескольких примерах фармацевтические композиции для индукции иммунного ответа против RSV у человека включают терапевтически эффективное количество описанных антигенов PreF, вирусных векторов, молекул нуклеиновой кислоты для введения детям младшего возраста (например, детям от момента рождения до 1 года, как например, от 0 до 6 месяцев, на момент первоначальной дозы) или пожилым пациентам (таким как индивидуумы в возрасте старше 65 лет). Будет понятно, что выбор адъюванта может различаться при этих различных применениях, и оптимальный адъювант и концентрацию для каждой ситуации могут эмпирически определять специалисты в данной области.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции представляют собой вакцины, которые уменьшают или предотвращают инфекцию RSV. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции представляют собой вакцины, которые уменьшают или предотвращают патологический ответ после инфицирования RSV. Необязательно, фармацевтические композиции, содержащие описанный антиген PreF, вирусный вектор или молекулу нуклеиновой кислоты составляют по меньшей мере с одним дополнительным антигеном патогенного организма, отличного от RSV. Например, патогенный организм может представлять собой патоген дыхательных путей (такой как вирус или бактерия, которые вызывают респираторную инфекцию). В определенных случаях фармацевтическая композиция содержит антиген, происходящий из патогенного вируса, отличного от RSV, такого как вирус, который вызывает инфекцию дыхательных путей, такую как грипп или парагрипп. В других вариантах осуществления дополнительные антигены выбирают для облегчения введения или снижения числа инокуляций, требуемых для защиты индивидуума от множества инфекционных организмов. Например, антиген может происходить из любого одного или нескольких из вируса гриппа, вируса гепатита B, возбудителя дифтерии, столбняка, коклюша, гемофильной палочки, вируса полиомиелита, Streptococcus или Pneumococcus, среди прочих.

F. Способы лечения

В нескольких вариантах осуществления описанные антигены PreF или нуклеиновая кислота или вирусный вектор, кодирующие, экспрессирующие или включающие антиген PreF, используют дли индукции иммунного ответа на RSV у индивидуума. Таким образом, в нескольких вариантах осуществления терапевтически эффективное количество иммуногенной композиции, включающей один или несколько из описанных антигенов PreF, или нуклеиновую кислоту или вирусный вектор, кодирующие, экспрессирующие и включающие антиген, можно вводить индивидууму для достижения иммунного ответа на RSV.

В соответствии с описанием, представленным в настоящем описании, профилактически или терапевтически эффективное количество иммуногенной композиции, включающей антиген PreF, или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспресирующих или включающих антиген, вводят индивидууму, нуждающемуся в таком лечении в течение периода времени и в условиях, достаточных для предупреждения, ингибирования и/или смягчения инфекции RSV у индивидуума. Иммуногенную композицию вводят в количестве, достаточном для индукции иммунного ответа против антигена RSV, такого как белок F RSV, у индивидуума.

В некоторых вариантах осуществления композиция, вводимая индивидууму, включает (или кодирует) первый рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и второй рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. В нескольких вариантах осуществления композиция, вводимая индивидууму, включает смесь (такую как смесь приблизительно 1:1, 1:2, 2:1, 2:3, 3:2, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 3:5, 5:3, 1:5, 5:1, 5:7, 7:5) первого рекомбинантного белка F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и второго рекомбинантного белка F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления композиция, вводимая индивидууму, включает первую белковую наночастицу, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа A, и вторую белковую наночастицу, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

В некоторых вариантах осуществления композиция, вводимая индивидууму, включает первую молекулу нуклеиновой кислоты (такую как экспрессирующий вектор), кодирующую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа A, и вторую молекулу нуклеиновой кислоты (такую как экспрессирующий вектор), включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B.

В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят композицию, включающую наночастицы ферритина, включающие рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L). В некоторых вариантах осуществления композиция, вводимая индивидууму, включает первую наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа A, и вторую наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), где стабилизированный белок F RSV основан на белке F RSV подтипа B. Способы получения наночастиц ферритина, включающих вирусный антиген, и их применения для целей иммунизации (например, для иммунизации против антигенов вируса гриппа) описаны в данной области (см., например, Kanekiyo et al., Nature, 499:102-106, 2013, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

В некоторых вариантах осуществления для лечения выбирают индивидуума, который имеет инфекцию RSV или имеет риск ее развития, например, вследствие воздействия или возможности воздействия RSV. После введения терапевтически эффективного количества описанных терапевтических композиций можно проводить мониторинг индивидуума в отношении инфекции RSV, симптомов, ассоциированных с инфекцией RSV, или обоих из них. Поскольку практически все люди инфицируются RSV к возрасту 3 лет, полная возрастная когорта включена в качестве соответствующей популяции для иммунизации. Ее можно проводить, например, путем начала режима иммунизации в любой момент времени от рождения до 6 месяцев, от 6 месяцев до 5 лет, у беременной женщины (или женщины детородного возраста) для защиты их детей посредством пассивного переноса антитела, у членов семей новорожденных или у тех, кто еще находится в матке, и у индивидуумов в возрасте старше 50 лет.

Индивидуумы, имеющие наибольший риск инфекции RSV с тяжелыми симптомами (например, требующие госпитализации) включают недоношенных детей, детей с бронхолегочной дисплазией и врожденным заболеванием сердца, которые являются наиболее подверженными тяжелому заболеванию. Атопия или наличие атопии в семейном анамнезе также ассоциированы с тяжелым заболеванием у детей младшего возраста. В детском и взрослом возрасте заболевание является более мягким, но может быть ассоциировано с заболеванием нижних дыхательных путей и часто осложнено синуситом. Заболевание является значительно более тяжелым у больничных пожилых пациентов (например, людей в возрасте свыше 65 лет). Тяжелое заболевание также возникает у людей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом или после трансплантации костного мозга или легкого. (См., например, Shay et al., JAMA,282:1440-6, 1999; Hall et al., N Engl J Med. 2009;360:588-598; Glezen et al., Am J Dis Child., 1986;140:543-546; и Graham, Immunol. Rev., 239:149-166, 2011, все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылки). Таким образом, этих индивидуумов можно выбирать для введения описанных антигенов PreF или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген PreF.

Типичные индивидуумы, предназначенные для лечения композициями и способами по настоящему изобретению, включают людей, а также не являющихся человеком приматов и других животных, таких как крупный рогатый скот. Для идентификации индивидуумов для профилактики или лечения в соответствии со способами по изобретению используют способы скрининга для определения факторов риска, ассоциированных с заданным или предполагаемым заболеванием или состоянием, или для определения статуса предшествующего заболевания или состояния у индивидуума. Эти способы скрининга включают, например, общепринятые исследования для определения факторов риска окружающей среды, семейных, профессиональных и других факторов риска, которые могут быть ассоциированы с заданным или предполагаемым заболеванием или состоянием, а также диагностические способы, такие как различные способы ELISA и другие способы иммуноанализа, которые доступны и хорошо известны в данной области для обнаружения и/или охарактеризации инфекции RSV. Эти и другие стандартные способы позволяют врачу выбирать пациентов, нуждающихся в терапии, с использованием способов и фармацевтических композиций по изобретению. Иммуногенную композицию можно вводить в качестве независимой программы профилактики или лечения, или в качестве последующего, вспомогательного или равноправного режима лечения относительно других способов лечения.

Иммуногенную композицию можно использовать в координированных протоколах вакцинации или комбинаторных составах. В определенных вариантах осуществления в комбинаторных иммуногенных композициях и координированных протоколах иммунизации используются отдельные иммуногены или составы, каждый из которых направлен на индукцию иммунного ответа на антиген RSV, такого как иммунный ответ на белок F RSV. Отдельные иммуногенные композиции, которые индуцируют иммунный ответ на антиген RSV, можно комбинировать в поливалентной иммуногенной композиции, вводимой индивидууму в единственной стадии иммунизации, или их можно вводить раздельно (в одновалентных иммуногенных композициях) в координированном протоколе иммунизации.

Введение иммуногенных композиций может быть предназначено либо для профилактической, либо для терапевтической цели. При профилактическом предоставлении иммуногенную композицию предоставляют до появления какого-либо симптома, например, до инфицирования. Профилактическое введение иммуногенных композиций служит для предупреждения или смягчения какой-либо последующей инфекции. При терапевтическом предоставлении иммуногенную композицию предоставляют при возникновении или после возникновения симптома заболевания или инфекции, например, после развития симптома инфекции RSV или после диагностирования инфекции RSV. Иммуногенная композиция, таким образом, может быть предоставлена до предполагаемого воздействия RSV, чтобы ослабить ожидаемую тяжесть, длительность или степень инфицирования и/или ассоциированных с ним симптомов заболевания, после воздействия или предположительного воздействия вируса или после фактического начала инфекции.

Введение индуцирует достаточный иммунный ответ для лечения или предупреждения патогенной инфекции, например, для ингибирования инфекции и/или снижения признаков и/или симптомов инфекции. Количества, эффективные для их применения, зависят от тяжести заболевания, общего состояния здоровья индивидуума и здоровья иммунной системы индивидуума. Терапевтически эффективное количество описанных иммуногенных композиций представляет собой количество, которое обеспечивает либо субъективное смягчение симптома(ов), либо объективно идентифицируемое улучшение, отмечаемое врачом или другим квалифицированным ведущим наблюдение лицом.

Для профилактических и терапевтических целей иммуногенную композицию можно вводить индивидууму посредством однократной болюсной доставки, посредством непрерывной доставки (например, непрерывная чрескожная, мукозальная или внутривенная доставка) в течение более длительного периода времени или в протоколе повторяющегося введения (например, в протоколе введения, повторяющемся на часовой, суточной или недельной основе). Терапевтически эффективная дозировка иммуногенной композиции может быть предоставлена в качестве повторяющихся доз в течение пролонгированного профилактического или терапевтического режима лечения, который приводит к клинически значимым результатам, для смягчения одного или нескольких симптомов или поддающихся обнаружению состояний, ассоциированных с заданным заболеванием или состоянием, как указано в настоящем описании. Определение эффективных дозировок в этом контексте, как правило, основано на исследованиях в моделях на животных, за которыми следуют клинические испытания у человека, исходя из протоколов введения, которые значительно снижают возникновение или тяжесть заданных симптомов заболевания или состояний у индивидуума. Пригодные в этом отношении модели включают, например, мышей, крыс, свиней, кошек, хорьков, не являющихся человеком приматов и других признанных модельных животных, известных в данной области. Альтернативно эффективные дозировки можно определять с использованием моделей in vitro (например, иммунологические и гистопатологические анализы). С использованием таких моделей требуются только обычные вычисления и внесение поправок для определения соответствующей концентрации и дозы для введения терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции (например, количества, которые являются эффективными для индукции желаемого иммунного ответа или смягчения одного или нескольких симптомов заданного заболевания). В альтернативных вариантах осуществления эффективное количество или эффективная доза иммуногенной композиции могут просто ингибировать или усиливать один или несколько выбранных видов биологической активности, которые коррелируют с заболеванием или состоянием, как указано в настоящем описании, либо для терапевтических, либо для диагностических целей.

В одном варианте осуществления пригодный режим иммунизации включает по меньшей мере три отдельных инокуляции одной или нескольких иммуногенных композиций, причем вторую инокуляцию проводят более чем приблизительно через две, приблизительно через от трех до восьми или через приблизительно четыре недели после первой инокуляции. Как правило, третью инокуляцию проводят через несколько месяцев после второй инокуляции и в конкретных вариантах осуществления более чем приблизительно через пять месяцев после первой инокуляции, более чем через от приблизительно шести месяцев до приблизительно двух лет после первой инокуляции или от приблизительно восьми месяцев до приблизительно одного года после первой инокуляции. Также являются желательными периодические инокуляции после третьей инокуляции для усиления "иммунной памяти" у индивидуума. Достаточность выбранных параметров вакцинации, например, состава, дозы, режима и т.п., можно определять путем взятия аликвот сыворотки от индивидуума и анализа титров антител в ходе программы иммунизации. Если такой мониторинг указывает на то, что вакцинация является субоптимальной, у индивидуума можно проводить усиливающую иммунизацию посредством дополнительной дозы иммуногенной композиции, и параметры вакцинации можно модифицировать ожидаемым образом для усиления иммунного ответа. Предусматривается, что может существовать несколько усиливающих иммунизаций и что каждая усиливающая иммунизация может включать тот же или отличающийся антиген PreF.

Для протоколов первичная иммунизация-усиливающая иммунизация, первичную иммунизацию можно проводить в качестве однократной дозы или в качестве многократных доз, например, двух доз, трех доз, четырех доз, пяти доз, шести доз или более можно вводить индивидууму в течение суток, недель или месяцев. Усиливающую иммунизацию можно проводить в качестве однократной дозы или многократных доз, например, от двух до шести доз или более можно вводить индивидууму в течение суток, недель или месяцев. Также можно проводить многократные усиливающие иммунизации, такие как от одной до пяти или более. Можно использовать различные дозировки в серии последовательных инокуляций, например, относительно большую дозу при первичной инокуляции, а затем усиливающую иммунизацию с относительно меньшими дозами. Иммунный ответ против выбранной антигенной поверхности можно получать посредством одной или нескольких инокуляций индивидууму иммуногенной композиции, описанной в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления композиция для первичной иммунизации, вводимая индивидууму, включает (или кодирует) рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и композиция для усиливающей иммунизации, вводимая индивидууму, включает (или кодирует) рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. В некоторых вариантах осуществления композиция для первичной иммунизации, вводимая индивидууму, включает (или кодирует) рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и композиция для усиливающей иммунизации, вводимая индивидууму, включает (или кодирует) рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции, включающей рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, один раз или более одного раза (как в протоколе первичная иммунизация-усиливающая иммунизация) в качестве серии инъекций.

В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции, включающей наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, один раз или более одного раза (как в протоколе первичная иммунизация-усиливающая иммунизация) в качестве серии инъекций.

В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции, включающей вектор, кодирующий рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и вектор, кодирующий рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, один раз или более одного раза (как в протоколе первичная иммунизация-усиливающая иммунизация) в качестве серии инъекций. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать введение композиции, включающей рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации и рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и/или композиции, включающей наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, один раз или более одного раза (как в протоколе первичная иммунизация-усиливающая иммунизация) в качестве серии инъекций. В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать введение композиции, включающей рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и/или композиции, включающей наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и наночастицу ферритина, включающую рекомбинантный белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления каждая из композиций для первичной и усиливающей иммунизации, вводимых индивидууму, включает (или кодирует) первый рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и второй рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации. В нескольких вариантах осуществления каждая из композиций для первичной иммунизации и усиливающей иммунизации, вводимых индивидууму, включает (или кодирует) смесь (такую как смесь приблизительно 1:1, 1:2, 2:1, 2:3, 3:2, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 3:5, 5:3, 1:5, 5:1, 5:7, 7:5), первого рекомбинантного белка F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, и второго рекомбинантного белка F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации.

В некоторых вариантах осуществления каждая из композиций для первичной иммунизации и усиливающей иммунизации, вводимых индивидууму, включает рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и второй рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В некоторых вариантах осуществления каждая из композиций для первичной иммунизации и усиливающей иммунизации, вводимых индивидууму, включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В некоторых вариантах осуществления каждая из композиций для первичной иммунизации и усиливающей иммунизации, вводимых индивидууму, включает первую белковую наночастицу (такую как наночастица ферритина), включающую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и вторую белковую наночастицу (такую как наночастица ферритина), включающую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В некоторых вариантах осуществления каждая из композиций для первичной иммунизации и усиливающей иммунизации, вводимых индивидууму, включает вектор, включающий или кодирующий рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и вектор, включающий или кодирующий рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

В некоторых вариантах осуществления композиция для первичной иммунизации, вводимая индивидууму, включает первую молекулу нуклеиновой кислоты (такую как плазмидный вектор, экспрессирующий ДНК), кодирующую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и вторую молекулу нуклеиновой кислоты (такую как экспрессирующий вектор), включающую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и композиция для усиливающей иммунизации, вводимая индивидууму, включает первую белковую наночастицу (такую как наночастица ферритина), включающую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа A, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L), и вторую белковую наночастицу (такую как наночастица ферритина), включающую рекомбинантный белок F RSV, который представляет собой белок F RSV подтипа B, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации посредством любой из замен, описанных в настоящем описании (таких как замены S155C, S290C и S190F или замены S155C, S290C, S190F и V207L).

Протоколы иммунизации с использованием первичной иммунизации ДНК-плазмидой и усиливающей иммунизации наночастицами ферритина известны специалисту в данной области (см., например, Wei et al., Science, 329(5995):1060-4, 2010, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

Фактическая дозировка иммуногенной композиции варьирует в соответствии с факторами, такими как заболевание и конкретный статус индивидуума (например, возраст индивидуума, размер, физическая форма, выраженность симптомов, факторы чувствительности и т.п.), время и путь введения, введение других лекарственных средств или способы лечения, проводимые одновременно, а также конкретная фармакология иммуногенной композиции для индукции желаемой активности или биологического ответа у индивидуума. Режимы дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального профилактического или терапевтического ответа. Как описано выше в представленном выше перечне терминов, эффективное количество также представляет собой количество, в котором токсические или вредоносные побочные эффекты описанного антигена и/или другого биологически активного агента перевешиваются с клинической точки зрения терапевтически благоприятными эффектами.

Неограничивающий диапазон для терапевтически эффективного количества описанных антигенов PreF в способах и иммуногенных композициях по изобретению, составляет от приблизительно 0,0001 мг/кг массы тела до приблизительно 10 мг/кг массы тела, как например, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,02 мг/кг, приблизительно 0,03 мг/кг, приблизительно 0,04 мг/кг, приблизительно 0,05 мг/кг, приблизительно 0,06 мг/кг, приблизительно 0,07 мг/кг, приблизительно 0,08 мг/кг, приблизительно 0,09 мг/кг, приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,2 мг/кг, приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 0,4 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 0,6 мг/кг, приблизительно 0,7 мг/кг, приблизительно 0,8 мг/кг, приблизительно 0,9 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, или приблизительно 10 мг/кг, например от 0,01 мг/кг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,2 мг/кг до приблизительно 2 мг/кг массы тела, или от приблизительно 1,0 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг массы тела.

В некоторых вариантах осуществления дозировка с заданным количеством описанного антигена PreF, или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген PreF, включает дозировку для детей, взрослых пожилых и т.д., такую как приблизительно 1-300 мкг, например, дозировка приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или приблизительно 300 мкг антигена PreF, или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспрессирущих или включающих антиген PreF. Дозировка и количество доз будут зависеть от ситуации, например, у взрослого или какого-либо индивидуума после первичной иммунизации посредством предшествующей инфекции RSV или иммунизации, однократная доза может представлять собой достаточную усиливающую иммунизацию. У наивных детей младшего возраста в некоторых примерах вводят по меньшей мере две дозы, например, по меньшей мере три дозы. В некоторых вариантах осуществления у пожилых индивидуумов проводят ежегодную усиливающую иммунизацию (например, у людей в возрасте старше 60) один раз в год, например, вместе с ежегодной вакцинацией против гриппа. Способы получения вводимых композиций известны и очевидны специалистам в данной области и более подробно описаны в таких публикациях, как Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19^th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995.

Дозировку может варьировать лечащий врач для поддержания желаемой концентрации в заданной области (например, в системном кровотоке). Более высокие или более низкие концентрации можно выбирать, исходя из пути доставки, например, трансэпидермальной, ректальной, пероральной, легочной или интраназальной доставки относительно внутривенной или подкожной доставки. Дозировку также можно корректировать, исходя из скорости высвобождения вводимого состава, например, внутрилегочного спрея относительно порошка, перорального состава с замедленным высвобождением относительно инъецируемого состава в форме частиц или состава для трансдермальной доставки и т.д. Для достижения того же уровня концентрации в сыворотке, например, частицы с замедленным высвобождением с константой скорости высвобождения, составляющей 5 нмоль/л (в стандартных условиях), можно вводить приблизительно в двукратной дозировке относительно частиц с константой скорости высвобождения 10 нмоль/л.

При введении иммуногенной композиции по настоящему изобретению иммунная система индивидуума, как правило, отвечает на иммуногенную композицию путем продуцирования антител, специфичных к предшествующей слиянию конформации белка F RSV. Такой ответ означает, что доставили эффективную дозу иммуногенной композиции.

В нескольких вариантах осуществления может быть преимущественным вводить иммуногенные композиции, описанные в настоящем описании, с другими средствами, такими как белки, пептиды, антитела и другие противовирусные средства, такие как средства против RSV. Неограничивающие примеры средств против RSV включают моноклональное антитело паливизумаб (SYNAGIS®; Medimmune, Inc.) и низкомолекулярное противовирусное средство рибавирин (изготавливаемое многими источниками, например, Warrick Pharmaceuticals, Inc.). В определенных вариантах осуществления иммуногенные композиции вводят одновременно с другими средствами против RSV. В определенных вариантах осуществления иммуногенные композиции вводят последовательно с другими лекарственными средствами против RSV, как например, до или после другого средства. Специалисту в данной области будет известно, что последовательное введение может означать введение сразу друг за другом или введение после периода времени, такого как часы, сутки, недели, месяца или даже годы.

В дополнительных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество фармацевтической композиции, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный антиген PreF, вводят индивидууму для индукции иммунного ответа. В одном конкретном неограничивающем примере терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей описанный антиген, вводят индивидууму для лечения, или предупреждения, или ингибирования инфекции RSV.

Одним подходом для введения нуклеиновых кислот является прямая иммунизация посредством плазмидной ДНК, такой как экспрессирующая плазмида млекопитающих. Как описано выше, нуклеотидную последовательность, кодирующую описанный антиген, можно помещать под контроль промотора для увеличения экспрессии молекулы. В другом подходе используется РНК (такая как невирусная доставка самоамплифицирующихся РНК-вакцин, см. например, Geall et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 109:14604-9, 2012.

Иммунизация конструкциями нуклеиновой кислоты хорошо известна в данной области и описана, например, в патенте США № 5643578 (в котором описаны способы иммунизации позвоночных животных путем введения ДНК, кодирующей желаемый антиген, для индукции клеточно-опосредуемого или гуморального ответа) и в патенте США № 5593972 и патенте США № 5817637 (в котором описано функциональное связывание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, с регуляторной последовательностью, обеспечивающей экспрессию). В патенте США № 5880103 описано несколько способов доставки нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногенные пептиды или другие антигены, в организм. Способы включают липосомальную доставку нуклеиновых кислот (или самих синтетических пептидов) и иммуностимулирующих конструкций, или ISCOMS^TM - отрицательно заряженных подобных решетчатой сфере структур размером 30-40 нм, образующихся спонтанно при смешении холестерина и Quil A^TM (сапонин). Защитный иммунитет был достигнут в различных экспериментальных моделях инфекции, включая токсоплазмоз и индуцируемые вирусом Эпштейна-Барр опухоли, с использованием ISCOMS^TM в качестве носителя для доставки антигенов (Mowat and Donachie, Immunol. Today 12:383, 1991). Было обнаружено, что дозы антигена только 1 мкг, инкапсулированные в ISCOMS^TM, вызывают ответ CTL, опосредуемый классом I (Takahashi et al., Nature 344:873, 1990).

В другом подходе для использования нуклеиновых кислот для иммунизации, описанный антиген также может экспрессироваться ослабленными вирусными хозяевами, или векторами, или бактериальными векторами. Для экспрессии пептида или белка, и, тем самым, для индукции ответа CTL, можно использовать рекомбинантный вирус коровьей оспы, аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV), вирус герпеса, ретровирус, цитомегаловирус или другие вирусные векторы. Например, векторы на основе вируса коровьей оспы и способы, пригодные в протоколах иммунизации, описаны в патенте США № 4722848. BCG (бацилла Кальмета-Герена) обеспечивает другой вектор для экспрессии пептидов (см. Stover, Nature 351:456-460, 1991).

В одном варианте осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую описанный антиген PreF, вводят прямо в клетки. Например, нуклеиновую кислоту можно наносить на золотые микросферы стандартными способами и вводить в кожу посредством устройства, такого как генная пушка Helios™ Bio-Rad. Нуклеиновые кислоты могут быть "простыми", состоящими из плазмид под контролем мощного промотора. Как правило, ДНК инъецируют в мышцу, хотя также ее можно инъецировать прямо в другие области, включая ткани вблизи метастазов. Дозировки для инъекции обычно составляют от приблизительно 0,5 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг, и как правило, составляют от приблизительно 0,005 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг (см., например, патент США № 5589466).

В дополнение к терапевтическим способам, описанным выше, любой из описанных антигенов PreF можно использовать для получения антигенспецифических иммунодиагностических реагентов, например, для эпидемиологического надзора. Иммунодиагностические реагенты можно конструировать из любых антигенов, описанных в настоящем описании. Например, в случае описанных антигенов мониторинг присутствия сывороточных антител к RSV проводят с использованием выделенных антигенов, описанных в настоящем описании, как например, для обнаружения инфекции RSV и/или присутствия антител, которые специфически связываются с предшествующей слиянию конформацией белка F RSV.

Как правило, способ включает контактирование образца от индивидуума, такого как, но не ограничиваясь ими, образец крови, сыворотки, плазмы, мочи или мокроты от индивидуума, с одним или несколькими антигенами белка F RSV, стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, описанными в настоящем описании, и обнаружение связывания антител в образце с описанными иммуногенами. Связывание можно обнаруживать любыми способами, известными специалисту в данной области, включая использованием меченых вторичных антител, которые специфически связывают антитела из образца. Метки включают радиоактивные метки, ферментные метки и флуоресцентные метки.

Кроме того, обнаружение антитела, связывающего предшествующего слиянию F RSV, также позволяет мониторинг ответа индивидуума на иммунизацию описанным антигеном. В других вариантах осуществления определяют титр антител, связывающихся с предшествующим слиянию F RSV. Связывание можно обнаруживать любыми способами, известными специалисту в данной области, включая использование меченых вторичных антител, которые специфически связывают антитела из образца. Метки включают радиоактивные метки, ферментные метки и флуоресцентные метки. В других вариантах осуществления описанный иммуноген используют для выделения антител, присутствующих у индивидуума или в биологическом образце, полученном от индивидуума.

G. Наборы

Также предусматриваются наборы. Например, предусматриваются наборы для лечения или предупреждения инфекции RSV у индивидуума, или для обнаружения присутствия антител, специфичных к белку F RSV в предшествующей слиянию конформации, в сыворотке индивидуума. Наборы, как правило, включают один или несколько из антигенов PreF, или нуклеиновых кислот или вирусных векторов, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген.

Набор может включать контейнер или ярлык или вкладыш в упаковку на контейнере или прилагаемые к контейнеру. Пригодные контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть образованы из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер, как правило, содержит композицию, включающую один или несколько из описанных антигенов PreF, или нуклеиновых кислот или вирусных векторов, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген, которые являются эффективными для лечения или предупреждения инфекции RSV. В нескольких вариантах осуществления контейнер может иметь стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, проницаемую для иглы для подкожной инъекции). На ярлыке или вкладыше в упаковку указано, что композицию используют для лечения конкретного состояния.

Ярлыку или вкладыш в упаковку, как правило, дополнительно включает инструкции по применению антигена PreF или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующего, экспрессирующего или включающего антиген, например, в способе лечения или предупреждения инфекции RSV. Вкладыш в упаковку, как правило, включает инструкции, обычно включаемые в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях, и/или предупреждения, касающиеся применения таких терапевтических продуктов. Инструкции могут быть письменными, могут быть в электронной форме (такой как компьютерная дискета или компакт-диск) или могут быть визуальными (как например, в форме видеофайлов). Наборы также могут включать дополнительные компоненты для облегчения конкретного применения, для которого набор предназначен. Кроме того, наборы могут включать буферы и другие реагенты, обычно используемые для применения конкретного способа на практике. Такие наборы и соответствующее содержимое хорошо известны специалистам в данной области.

H. Определенные варианты осуществления

Дополнительные варианты осуществления описаны в разделе H на страницах 135-158 приоритетной временной заявке США № 61/863909, поданной 8 августа 2013 года, которая конкретно включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Позиция 1. Выделенный иммуноген, содержащий:

рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с нативным белком F RSV, которая стабилизирует рекомбинантный белок F RSV в предшествующей слиянию конформации, которая специфически связывается с антителом, специфичным к F RSV в предшествующей слиянию конформации, и где антитело не связывается специфически с белком F RSV в образующейся после слияния конформации.

Позиция 2. Иммуноген, который специфически связывается с антителом после инкубации при 20°C в фосфатно-солевом буфере при физиологических значениях pH в течение по меньшей мере 24 часов в отсутствие антитела.

Позиция 3. Иммуноген согласно позиции 1 или позиции 2, где предшествующая слиянию конформация рекомбинантного белка F RSV или его фрагмента включает антигенный участок ∅, который специфически связывается с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, и где антигенный участок ∅ включает остатки 62-69 и 196-209 нативной последовательности белка F RSV, указанной в качестве одной из SEQ ID NO: 1-184.

Позиция 4. Иммуноген согласно любой из позиций 1-3, где иммуноген специфически связывается с антителом D25, AM22, 5C4 или MPE8, специфичным к предшествующей слиянию конформации.

Позиция 5. Иммуноген согласно любой из позиций 1-4, где нативный белок F RSV представляет собой белок F RSV подтипа A человека, подтипа B человека или бычий белок F RSV.

Позиция 6. Иммуноген согласно любой из позиций 1-5, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержит полипептид F₁ и полипептид F₂ и необязательно не содержит полипептида pep27 или его части.

Позиция 7. Иммуноген согласно позиции 6, где полипептиды F₂ и F₁ включают положения 62-69 и 196-209 F RSV, соответственно, и где:

полипептид F₂ содержит или состоит из 8-84 остатков в положениях 26-109 F RSV; и

полипептид F₁ содержит или состоит из остатков 14-393 в положениях 137-529 F RSV,

где положения F RSV соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанного в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 8. Иммуноген согласно позиции 7, где C-концевой остаток полипептида F₂ и N-концевой остаток полипептида F₁, соответственно, содержит положения 97 и 137; 97 и 145; 97 и 150; 102 и 144; 102 и 145; 102 и 146; 102 и 147; 103 и 144; 103 и 145; 103 и 146; 103 и 147; 104 и 144; 104 и 145; 104 и 146; 104 и 147; 105 и 144; 105 и 145; 105 и 146; 105 и 147; или 105 и 150 F RSV.

Позиция 9. Иммуноген согласно позиции 7, где полипептиды F₂и F₁, соответственно, содержат или состоят из положений F RSV: 26-109 и 137-513; 26-107 и 137-513; 26-107 и 145-513; 26-105 и 137-513; 26-105 и 145-513; 26-103 и 145-513; 26-109 и 137-529; 26-107 и 137-529; 26-107 и 145-529; 26-105 и 137-529; 26-105 и 145-529; 26-103 и 145-529; 46-103 и 147-310; 46-104 и 146-310; 50-96 и 149-306; 51-103 и 146-307; 51-103 и 139-307; 50-105 и 146-306; или 53-97 и от 148 до одного из 305-320.

Позиция 10. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащих аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные аминокислотам 26-103 и 145-310, соответственно, нативной последовательности белка F RSV, указанной в качестве любой из SEQ ID NO: 1-184.

Позиция 11. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащих аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные аминокислотам 26-103 и 145-310, соответственно, SEQ ID NO: 124.

Позиция 12. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащих аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные аминокислотам 26-103 и 145-513, соответственно, SEQ ID NO: 124.

Позиция 13. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащих аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные аминокислотам 26-103 и 145-529, соответственно, SEQ ID NO: 124.

Позиция 14. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из полипептида F₂ и полипептида F₁, содержащих аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80% идентичные аминокислотам 26-103 и 145-551, соответственно, SEQ ID NO: 124.

Позиция 15. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV представляет собой одноцепочечный белок F RSV и полипептиды F₂ и F₁ связаны гетерологичным пептидным линкером или связаны прямо.

Позиция 16. Иммуноген согласно позиции 15, где

положение 105 полипептида F₂ связано с положением 145 полипептида F₁ линкером Gly-Ser; или

положение 103 полипептида F₂ прямо связано с положением 145 полипептида F₁.

Позиция 17. Иммуноген согласно позиции 16 или позиции 16, где гетерологичный пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность, указанную в качестве одной из SEQ ID NO: 356-365 или 1443-1453, или представляет собой линкер G, S, GG, GS, SG, GGG или GSG.

Позиция 18. Выделенный иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV является стабилизированным в предшествующей слиянию конформации белка F RSV посредством:

(a) первой дисульфидной связи между парой остатков цистеина;

(b) заполняющей полость замены;

(c) переупаковывающей аминокислотной замены;

(d) участка N-связанного гликозилирования;

(e) комбинации двух или более из (a)-(d); или

(f) комбинации (a) и (b).

Позиция 19. Выделенный иммуноген согласно позиции 18, где пара остатков цистеина содержит первый остаток цистеина и второй остаток цистеина, и где

первый остаток цистеина и второй остаток цистеина находятся в положениях 137-216 полипептида F₁;

первый остаток цистеина и второй остаток цистеина находятся в положениях 461-513 полипептида F₁; или

первый остаток цистеина и второй остаток цистеина находятся в положениях 137-216 и 461-513, соответственно, полипептида F₁; и

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 20. Иммуноген согласно позиции 18, где первый остаток цистеина вносят посредством аминокислотной замены одного из положений 137-216 F RSV, и второй остаток цистеина вносят посредством аминокислотной замены одного из положений 271-460 F RSV.

Позиция 21. Иммуноген согласно позиции 19 или позиции 20, где пара остатков цистеина содержит первый остаток цистеина и второй остаток цистеина, каждый из которых содержит атом углерода Cα и атом углерода Cβ, и где:

(a) первый остаток цистеина вносят посредством аминокислотной замены одного из положений 137-216 или 461-513 F RSV, и второй остаток цистеина вносят посредством аминокислотной замены одного из положений 26-61, 77-97 или 271-460 F RSV; и

(b) атом углерода Cα положения первого остатка цистеина находится на расстоянии 2,0-8,0 ангстрем от атома углерода Cα положений второго остатка цистеина, и/или атом углерода Cβ положения первого остатка цистеина находится на расстоянии 2,0-5,5 от атома углерода Cβ положения второго остатка цистеина с использованием оптимального ротомера для каждого атома углерода Cβ, в трехмерной структуре, показанной с помощью структурных координат, представленных в таблице 1.

Позиция 22. Иммуноген согласно позиции 19 или позиции 20, где пара остатков цистеина содержит первый остаток цистеина и второй остаток цистеина, каждый из которых содержит атом углерода Cα и атом углерода Cβ, и где:

(a) первый остаток цистеина и второй остаток цистеина внесены посредством аминокислотной замены в положениях 137-216 F RSV или положениях 461-513 F RSV; или первый остаток цистеина внесен посредством аминокислотной замены в положениях 137-216 F RSV, и второй остаток цистеина внесен посредством аминокислотной замены в положениях 461-513 F RSV; и

(b) атом углерода Cα положения первого остатка цистеина находится на расстоянии 2,0-8,0 ангстрем от атома углерода Cα положения второго остатка цистеина, и/или атом углерода Cβ положения первого остатка цистеина находится на расстоянии 2,0-5,5 от атома углерода Cβ положения второго остатка цистеина с использованием оптимального ротомера для каждого атома углерода Cβ, в трехмерной структуре, показанной с помощью структурных координат, представленных в таблице 1.

Позиция 23. Иммуноген согласно позиции 18, где дисульфидная связь включает дисульфидную связь внутри протомера или между протомерами.

Позиция 24. Иммуноген согласно позиции 23, где неприродная дисульфидная связь включает

дисульфидную связь внутри протомера между положениями 155 и 290; 151 и 288; 137 и 337; 397 и 487; 138 и 353; 341 и 352; 403 и 420; 319 и 413; 401 и 417; 381 и 388; 320 и 415; 319 и 415; 331 и 401; 320 и 335; 406 и 413; 381 и 391; 357 и 371; 403 и 417; 321 и 334; 338 и 394; 288 и 300; 60 и 194; 33 и 469; 54 и 154; 59 и 192; 46 и 311; 48 и 308; или 30 и 410 F RSV;

дисульфидную связь между протомерами между положениями 400 и 489; 144 и 406; 153 и 461; 149 и 458; 143 и 404; 346 и 454; 399 и 494; 146 и 407; 374 и 454; 369 и 455; 402 и 141; 74 и 218; 183 и 428 F RSV, и рекомбинантный белок F RSV содержит инсерцию G между положениями 182/183; 183 и 428, и рекомбинантный белок F RSV содержит инсерцию C между положениями 427/428; 145 и 460, и рекомбинантный белок F RSV содержит инсерцию AA между положениями 146/147; 183 и 423, и рекомбинантный белок F RSV содержит инсерцию AAA между положениями 182/183; или 330 и 430, и рекомбинантный белок F RSV содержит инсерцию CAA между положениями 329/330;

дисульфидную связь внутри протомера между положениями 155 и 290 F RSV, и где рекомбинантный белок F RSV дополнительно содержит неприродную дисульфидную связь между положениями 74 и 218; 141 и 402; 146 и 460 F RSV, и инсерцию G между положениями 460/461; 345 и 454, и инсерцию C между положениями 453/454; 374 и 454, и инсерцию C между положениями 453/454; 239 и 279, и инсерцию C между положениями 238/239; 330 и 493, и инсерцию C между положениями 329/330; 183 и 428, и инсерцию G между положениями 182/183; или 183 и 428, и инсерцию C между положениями 427/428.

Позиция 25. Иммуноген согласно позиции 23, где рекомбинантный белок F RSV содержит:

дисульфидную связь внутри протомера и один или несколько из следующих наборов замен: S155C и S290C; G151C и I288C; F137C и T337C; T397C и E487C; L138C и P353C; W341C и F352C; S403C и T420C; S319C и I413C; D401C и Y417C; L381C и N388C; P320C и S415C; S319C и S415C; N331C и D401C; P320C и T335C; V406C и I413C; L381C и Y391C; T357C и N371C; S403C и Y417C; L321C и L334C; D338C и K394C; I288C и V300C; E60C и D194C; Y33C и V469C; T54C и V154C; I59C и V192C; S46C и T311C; L48C и V308C; E30C и L410C; или

дисульфидную связь между протомерами и один или несколько из следующих наборов замен: T400C и D489C; V144C и V406C; A153C и K461C; A149C и Y458C; G143C и S404C; S346C и N454C; K399C и Q494C; S146C и I407C; T374C и N454C; T369C и T455C; или V402C и L141C; A74C и E218C; S155C, S290C, L141C, и V402C; S155C, S290C, A74C, и E218C; N183C и N428C, и инсерцию G между положениями 182/183; N183C и N427G, и инсерцию C между положениями 427/428; S145C и 460C; и инсерцию AA между положениями 146/147; N183C и K423C, и инсерцию AAA между положениями 182/183; A329C и S430C, и инсерцию CAA между положениями 329/330; или

дисульфидную связь внутри протомера между положениями 155 и 290 F RSV и дополнительную неприродную дисульфидную связь, замены S155C и S290C, и один или несколько из следующих наборов аминокислотных замен: S146C, и N460C, и инсерцию G между положениями 460/461; N345C и N454G, и инсерцию C между положениями 453/454; T374C, и N454G, и инсерцию C между положениями 453/454; S238G и Q279C, и инсерцию C между положениями 238/239; и S493C, и инсерцию C между положениями 329/330; N183C и N428C; и инсерцию G между положениями 182/183; или N183C и N427G; и инсерцию C между положениями 427/428.

Позиция 26. Иммуноген согласно позиции 23, где рекомбинантный белок F RSV содержит

полипептид F₁, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в качестве остатков 137-513 одной из SEQ ID NO: 185, 189, 201, 202, 205, 207, 209, 213, 244, 245, 247, 257-262, 264-275, 277-282, 284, 296-299, 302, 303, 338-340; или

полипептид F₂и полипептид F₁, содержащий аминокислотные последовательности, указанные в качестве остатков 26-109 и 137-513, соответственно, одной из SEQ ID NO: 190, 211, 212, 243, 246, 263, 276, 283, 285.

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 27. Иммуноген согласно позиции 23, где неприродная дисульфидная связь включает дисульфидную связь внутри протомера между положениями 155 и 290 F RSV.

Позиция 28. Иммуноген согласно позиции 23, где рекомбинантный белок F RSV содержит замены S155C и S290C.

Позиция 29. Иммуноген согласно позиции 23, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с остатками 26-109 и 137-513, остатками 26-103 и 145-513, или остатками 26-105 и 145-513, SEQ ID NO: 185.

Позиция 30. Иммуноген согласно любой из позиций 18-29, содержащий заполняющую полость замену, включающую замену на F, L, W, Y, H или M в положении 190, положении 207 или положениях 190 и 207.

Позиция 31. Иммуноген согласно любой из позиций 18-29, содержащий заполняющую полость замену, включающую одну из 190F; 190L; 190W; 190Y; 190H; 190M; 190F и 207L; 190F и 207F; 190F и 207W; 190L и 207L; 190L и 207F; 190L и 207W; 190W и 207L; 190W и 207F; 190W и 207W; 190Y и 207L; 190Y и 207F; 190Y и 207W; 190H и 207L; 190H и 207F; 190H и 207W; 190M и 207L; 190M и 207F; 190M и 207W; 207L и 220L; 296F и 190F; 220L и 153W; 203W; 83W и 260W; 58W и 298L; или 87F и 90L.

Позиция 32. Иммуноген согласно позиции 31, где рекомбинантный белок F RSV содержит положения 137-513 одной из SEQ ID NO: 191, 193, 196-197 или 248, или 371-376, или положения 26-109 и 137-513 одной из SEQ ID NO: 192, 195 или 194.

Позиция 33. Иммуноген согласно позиции 30, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с остатками 26-109 и 137-513, остатками 26-103 и 145-513 или остатками 26-105 и 145-513 SEQ ID NO: 191.

Позиция 34. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV содержит неприродную дисульфидную связь между заменами на цистеин в положении 155 и 290, и заполняющие полость замены на F, L, W, Y, H или M в положении 190, положении 207 или положениях 190 и 207.

Позиция 35. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV содержит замены S155C, S290C и S190F, или замены S155C, S290C, S190F и V207L.

Позиция 36. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV содержит или состоит из аминокислотной последовательности, обладающей по меньшей мере 80% идентичностью с остатками 26-109 и 137-513, соответственно, или 26-103 и 145-513, соответственно, или 26-105 и 145-513, соответственно, одной из SEQ ID NO: 185 (DS, подтип A), 371 (DS-Cav1, подтип A), 372 (DSCav1, подтип B), 373 (DSCav1, бычий), 374 (DS S190F, подтип A), 375 (DS, S190F, подтип B) или 376 (DS, S190F, бычий).

Позиция 37. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации белка F RSV посредством переупаковывающей замены, где полипептид F₁содержит аминокислотные замены, указанные в одной из следующих: замены 64L, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L и 214L; 64L, 79L, 86W, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F и 214L; 64W, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L и 214L; 79V, 86F, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L и 214L; 64V, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199Y, 203F, 207L и 214L; 64F, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L и 214L; 64L, 79V, 86W, 193V, 195F, 199F, 203F, 207L и 214L; 56I, 58I, 164I, 171I, 179L, 181F, 187I, 291V, 296I и 298I; 56I, 58I, 164I, 179L, 189F, 291V, 296I и 298I; 56L, 58I, 158W, 164L, 167V, 171I, 179L, 181F, 187I, 291V и 296L; 56L, 58I, 158Y, 164L, 167V, 187I, 189F, 291V и 296L; 56I, 58W, 164I, 167F, 171I, 179L, 181V, 187I, 291V и 296I; 56I, 58I, 64L, 79V, 86W, 164I, 179L, 189F, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L, 214L, 291V, 296I и 298I; 56I, 58I, 79V, 86F, 164I, 179L, 189F, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L, 214L, 291V, 296I и 298I; 56I, 58W, 64L, 79V, 86W, 164I, 167F, 171I, 179L, 181V, 187I, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L, 214L, 291V и 296I; 56I, 58W, 79V, 86F, 164I, 167F, 171I, 179L, 181V, 187I, 193V, 195F, 198F, 199F, 203F, 207L, 214L, 291V и 296I; 486N, 487Q, 489N и 491A; 486H, 487Q и 489H; 400V, 486L, 487L и 489L; 400V, 486I, 487L и 489I; 400V, 485I, 486L, 487L, 489L, 494L и 498L; 400V, 485I, 486I, 487L, 489I, 494L и 498L; 399I, 400V, 485I, 486L, 487L, 489L, 494L, 497L и 498L; 399I, 400V, 485I, 486I, 487L, 489I, 494L, 497L и 498L; 375W, 391F и 394M; 375W, 391F и 394W; 375W, 391F, 394M, 486N, 487Q, 489N и 491A; 375W, 391F, 394M, 486H, 487Q и 489H; 375W, 391F, 394W, 486N, 487Q, 489N и 491A; 375W, 391F, 394W, 486H, 487Q и 489H; 375W, 391F, 394M, 400V, 486L, 487L, 489L, 494L и 498M; 375W, 391F, 394M, 400V, 486I, 487L, 489I, 494L и 498M; 375W, 391F, 394W, 400V, 486L, 487L, 489L, 494L и 498M; 375W, 391F, 394W, 400V, 486I, 487L, 489I, 494L и 498M; 137W и 339M; 137W и 140W; 137W, 140W и 488W; 486N, 487Q, 489N, 491A и 488W; 486H, 487Q, 489H и 488W; 400V, 486L, 487L, 489L и 488W; 400V, 486I, 487L, 489I и 488W; 486N, 487Q, 489N, 491A, 137W и 140W; 486H, 487Q, 489H, 137W и 140W; 400V, 486L, 487L, 489L, 137W и 140W; 375W, 391F, 394M, 137W и 140W; или 375W, 391F, 394M, 137W, 140W и 339M; и где положения аминокислот соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 38. Иммуноген согласно позиции 37, где рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации белка F RSV посредством переупаковывающей замены, где полипептид F₁содержит аминокислотные замены, указанные в одной из следующих: I64L, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L и I214L; I64L, I79L, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F и I214L; I64W, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L и I214L; I79V, Y86F, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L и I214L; I64V, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199Y, L203F, V207L и I214L; I64F, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L и I214L; I64L, I79V, Y86W, L193V, L195F, I199F, L203F, V207L и I214L; V56I, T58I, V164I, L171I, V179L, L181F, V187I, I291V, V296I и A298I; V56I, T58I, V164I, V179L, T189F, I291V, V296I и A298I; V56L, T58I, L158W, V164L, I167V, L171I, V179L, L181F, V187I, I291V и V296L; V56L, T58I, L158Y, V164L, I167V, V187I, T189F, I291V и V296L; V56I, T58W, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, I291V и V296I; V56I, T58I, I64L, I79V, Y86W, V164I, V179L, T189F, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I и A298I; V56I, T58I, I79V, Y86F, V164I, V179L, T189F, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I и A298I; V56I, T58W, I64L, I79V, Y86W, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V и V296I; V56I, T58W, I79V, Y86F, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V и V296I; D486N, E487Q, D489N и S491A; D486H, E487Q и D489H; T400V, D486L, E487L и D489L; T400V, D486I, E487L и D489I; T400V, S485I, D486L, E487L, D489L, Q494L и K498L; T400V, S485I, D486I, E487L, D489I, Q494L и K498L; K399I, T400V, S485I, D486L, E487L, D489L, Q494L, E497L и K498L; K399I, T400V, S485I, D486I, E487L, D489I, Q494L, E497L и K498L; L375W, Y391F и K394M; L375W, Y391F и K394W; L375W, Y391F, K394M, D486N, E487Q, D489N и S491A; L375W, Y391F, K394M, D486H, E487Q и D489H; L375W, Y391F, K394W, D486N, E487Q, D489N и S491A; L375W, Y391F, K394W, D486H, E487Q и D489H; L375W, Y391F, K394M, T400V, D486L, E487L, D489L, Q494L и K498M; L375W, Y391F, K394M, T400V, D486I, E487L, D489I, Q494L и K498M; L375W, Y391F, K394W, T400V, D486L, E487L, D489L, Q494L и K498M; L375W, Y391F, K394W, T400V, D486I, E487L, D489I, Q494L и K498M; F137W и R339M; F137W и F140W; F137W, F140W и F488W; D486N, E487Q, D489N, S491A и F488W; D486H, E487Q, D489H и F488W; T400V, D486L, E487L, D489L и F488W; T400V, D486I, E487L, D489I и F488W; D486N, E487Q, D489N, S491A, F137W и F140W; D486H, E487Q, D489H, F137W и F140W; T400V, D486L, E487L, D489L, F137W и F140W; L375W, Y391F, K394M, F137W и F140W; или L375W, Y391F, K394M, F137W, F140W и R339M; и где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 39. Иммуноген согласно позиции 38, где рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации белка F RSV посредством переупаковывающей аминокислотной замены, где полипептид F₁включает положения 137-513 одной из SEQ ID NO: 227-242, 249-256, 286-295 или 326-337.

Позиция 40. Иммуноген согласно любой из позиций 18-39, где рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации белка F RSV посредством участка N-связанного гликозилирования, где участок N-связанного гликозилирования находится в одном из следующих положений полипептида F₁: 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503, 157, или комбинации двух или более из них, где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 41. Иммуноген согласно позиции 40, где рекомбинантный белок F RSV содержит одну из (a) I506N и K508T; (b) A177S; (c) V178N; (d) V278T; (e) Y478T; (f) V185N и V187T; (g) L160N и G162S; (h) L503N и F505S; (i) V157N; (j) или комбинацию двух или более из (a)-(j); и где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 42. Иммуноген согласно позиции 41, где рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации белка F RSV посредством участка N-связанного гликозилирования и где полипептид F₁включает положения 137-513 одной из SEQ ID NO: 198-200, 203-204, 214-217.

Позиция 43. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации белка F RSV, содержит аминокислотные замены, как указано в качестве одной из следующих: S238C и E92C; L193C и I59C; I59C и L297C; L297C и I292C; K176C и S190C; T189C и A177C; T58C и K191C; A424C и V450C; L171C и K191C; K176C и S190C; K77C и I217C; K427C и D448C; G151C и N302C; G151C и V300C; T189C и V56C; L171C и K191C; L230F; L158F; L230F и L158F; L203F; V187F; Y198F; Y198W; L204F; Y53F и L188F; V187F и L203F; Y198F и L203F; L141W; L142F; L142W; V144F; V144W; V90F; L83F; V185F и T54A; I395F; V90F, V185F и T54A; L83F и V90F; L83F, V185F и T54A; L230F, V90F и I395F; I395F, V185F и T54A; L203F, V90F, L230F, L158F, S509F, I395F, V185F и T54A; I221Y; F140W; F137W; S190L и V192L; V187F, S190L и V192L; V187L, S190L и V192L; V185F, V187L, S190L и V192L; V154L, V157L, V185L и V187L; V154L, V185L и V187L; V187F; T58L A298L; T58L, V154L, V185L, V187L и A298L; Y458W; L158F и I167A; L158W и I167A; L158F; L158W; V56L, I167L и A298L; V56L, I167L и A298M; V56L и A167L; I167F; I167M; V154F; V56L, I167L, A298L и V154F; I199L, L203F; I199L, L203F, P205Q и I206T; I199L, L203F, P205E и I206K; I199L, L203F и V207F; I199L, L203F, P205Q, I206T и V207F; I199L, L203F, P205E, I206K и V207F; I199L, L203F и L83F; I199L, L203F, P205Q, I206T и L83F; I199L, L203F, P205E, I206K и L83F; I199L, L203F, S190L и V192L; I199L, L203F, P205Q, I206T, V187F и S190L, V192L; S55A, S190M, L203F, V207I и V296I; Y53F, S55A, K176I, S190L, V207I, S259L, D263L и V296I; L158F, V207M и V296I; V56L, V207M и V296I; V56L, V207I и V296I; V56I, V207M ,и V296I; V154L, V207M и V296I; Y198F, V207I, T219W и V296I; Y198F, V207I, T219I и V296I; Y198F, V207M, T219W и V296I; 198F, V207M, T219I и V296I; Y198F, V207M, T219L и V296I; S190Y; S190W; I206F, V207M, T219V и V296I; Y198F, V207M, T219L и K226M; Y198F, V207M, T219L и K226W; Y198F, V207M, T219L и K226L; L158F, L203F, V207I и V296I; F488W; F488R; V207L; S190F; S190M; L503E, I506K и S509F; L503E, I506K, S509F и F505W; L503E, I506K, S509F, L230F и L158F; Q279C и S238C; Q501F; E82V, V207M, N227L и V296I; E82V, V207I, N227L и V296I; L158F, Y198F, V207M, S215G, N216P и T219L; L158F, Y198F, V207M, S213G, S215G и T219L; V56L, E82V, L203F, V207M, N227L, L230F и V296I; E82V, L158F, L203F, V207M, N227L, L230F и V296I; E82V, L203F, V207M, K226M, N227L, L230F и V296I; или L203F, V207I, S180C, S186C и V296I;

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 44. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV содержит замены S155C и S290C и дополнительно содержит один из следующих наборов замен: замены L513C, 514E и 515C; L513C, 514E, 515E и 516C; L512C, 513E и 514C; или замены L512C, 513E, 514E и 515C; S155C, S290C и S190F, и дополнительно содержит один из следующих наборов замен: замены F488W, L513C, A514E и I515C; F488W, L513C, A514E, G515E и 516C; F488W, L512C, L513E и A514C; F488W, L512C, L513E, A514E и G515C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, A514E и I515C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, A514E, G515E и 516C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E и A514C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E, A514E и G515C; K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, L514E и A515C; K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, L514E и A515E; K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E и A514C; или K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E, A514E и G515C; S155C, S290, S190F и V207L, и дополнительно содержит один из следующих наборов замен: L503E и I506K; L503E, I506K и F505W; L503E, I506K, L230F и L158F; L503E, I506K, S509F, F505W, L230F и L158F; L160K, V178T, L258K, V384T, I431S и L467Q; F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; L160K, V178T, L258K, V384T, I431S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; L512C и L513C; L512C, L513C, L160K, V178T, L258K, V384T, I431S и L467Q; L512C, L513C, F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; L512C, L513C, L160K, V178T, L258K, V384T, I431S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; F505W; F505W L160K, V178T, L258K, V384T, I431S и L467Q; F505W F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; F505W L160K, V178T, L258K, V384T, I431S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; L512C, L513C и F505W; L512C, L513C F505W L160K, V178T, L258K, V384T, I431S и L467Q; L512C, L513C F505W F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; L512C, L513C F505W L160K, V178T, L258K, V384T, I431S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q и I506K; I506K, S509F, L83F и V90F; I506K, S509F, L83F, V90F, L230F и L158F; I506K, S509F, F505W, L83F, V90F, L230F, V185F и T54A; L83F, V90F, L230F и I395F; I506K, S509F, F505W, L83F, V90F, L230F, L158F, I395F, V185F и T54A; L512C и L513C; или 486DEF на CPC, где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 45. Иммуноген согласно позиции 18, где рекомбинантный белок F RSV стабилизирован в предшествующей слиянию конформации белка F RSV и содержит полипептиды F₂и F₁, содержащие аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-513, соответственно, одной из SEQ ID NO: 338-433, 434-544, 672-682.

Позиция 46. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV содержит аминокислотные замены, указанные в одном из

рядов 1-16 таблицы 5b (новые межцепочечные дисульфиды);

рядов 1-84 таблицы 6b (новые заполняющие полость мутации);

рядов 1-54 таблицы 8b (новые комбинации с DSCav-1); или

рядов 1-13 таблицы 8c ((новые заполняющие полость мутации +замена экспонированных гидрофобных остатков); и

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 47. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV представляет собой одноцепочечный белок и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную любой из SEQ ID NO: 698-828 или 1474-1478.

Позиция 48. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV представляет собой одноцепочечный белок и содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную любой из SEQ ID NO: 698-828 или 1474-1478, необязательно без белковых меток или лидерных последовательностей, приведенных в соответствующих SEQ ID NO.

Позиция 49. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV содержит домен тримеризации, дополнительно содержащий участок расщепления протеазой между доменом Foldon и рекомбинантным белком F RSV.

Позиция 50. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV содержит аминокислотные замены, приведенные в ряду таблицы 23, соответствующем одной из SEQ ID NO: 829-1025.

Позиция 51. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV содержит аминокислотные замены, приведенные в ряду таблицы 23, соответствующем одной из SEQ ID NO: 969-1025.

Позиция 52. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где иммуноген содержит одну или несколько из следующих аминокислотных замен: DSCav1-F137C, и R339C; DSCav1- F137C и T337C; DSCav1-G139C и Q354C; F137C, R339C; F137C, T337C; G139C, Q354C; L260F; L260W; L260Y; L260R; L188F; L188W; L188Y; L188R; I57F; I57W; I57R; L252F; L252W; L252R; V192F; V192W; V192R; S150C и Y458C; A149C и N460C; S146C, и N460C; A149C и Y458C; V220F; V220W; V220M; T219F; T219M; T219W; T219R; I221F; I221Y; I221W; Q224D и , L78K; V278F Q279F N277D и , S99K; Q361F; V402F; T400F; T400W; H486F; H486W; I217F; I217Y; I217W; F190V; K226L; T58I, и A298M; F190V и K226L; F190V, и T58I, A298M; K226L, T58I, и A298M; T58I, A298M, F190V и K226L, и необязательно дополнительно содержит замены S155C и S290C, или замену S155C, S290C, S190F и V207L.

Позиция 53. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где иммуноген содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 829-1025, необязательно без белковых меток или лидерных последовательностей, приведенных в соответствующей SEQ ID NO.

Позиция 54. Иммуноген согласно любой из позиций 53, где рекомбинантный белок F RSV содержит домен тримеризации, дополнительно содержащий участок расщепления протеазой между доменом Foldon и рекомбинантным белком F RSV.

Позиция 55. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где рекомбинантный белок F RSV содержит аминокислотные замены, приведенные в ряду таблицы 24, соответствующем одной из SEQ ID NO: 901-968.

Позиция 56. Иммуноген согласно любой из позиций 1-18, где иммуноген содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 901-968, необязательно без белковых меток или лидерных последовательностей, приведенных в соответствующих SEQ ID NO.

Позиция 57. Иммуноген согласно позиции 7, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержат или состоят из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной следующим положениями F₂ и F₁RSV, как указано в любой из SEQ ID NO: 1-184:

(a) 56-97 и 189-211, соответственно; (b) 58-97 и 192-242, соответственно; (c) 59-97 и 194-240, соответственно; (d) 60-75 и 193-218, соответственно; (e) 60-94 и 192-229, соответственно; (f) 60-94 и 192-232, соответственно; (g) 60-94 и 193-237, соответственно; (h) 60-95 и 192-240, соответственно; (i) 60-96 и 192-239, соответственно; (j) 60-97 и 192-242, соответственно; (k) 60-97 и 194-239, соответственно; (l) 61-96 и 192-235, соответственно; (m) 61-96 и 192-240, соответственно;(n) 62-69 и 196-209, соответственно; или (o) круговая перестановка положений F₂ и F₁, приведенных в любой из (a)-(m), где положений F₂ и F₁RSV связаны через гетерологичный линкер.

Позиция 58. Иммуноген согласно позиции 7, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержат или состоят аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной следующим положениями F₂ и F₁RSV, как указано в любой из SEQ ID NO: 1-184:

(a) 46-103 и 147-310, соответственно; (b) 46-104 и 146-310, соответственно; (c) 50-96 и 149-306, соответственно; (d) 51-103 и 146-307, соответственно; (e) 51-103 и 139-307, соответственно; (f) 50-105 и 146-306, соответственно; (g) 53-97 и от 148 до одной из 305-320; (h) круговая перестановка положений F₂ и F₁, приведенных в любом из (a) - (g), где положения F₂ и F₁RSV связаны гетерологичным линкером или связаны прямо.

Позиция 59. Иммуноген согласно позиции 57 или 58, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержат аминокислотную последовательность согласно любому из минимальных иммуногенов с участком ∅, приведенных в таблице 20.

Позиция 60. Иммуноген согласно позиции 57 или 58, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 1027-1218.

Позиция 61. Иммуноген согласно позиции 57 или 58, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 1027-1218, необязательно без белковых меток или лидерных последовательностей, приведенных в соответствующих SEQ ID NO.

Позиция 62. Иммуноген согласно любой из позиций 58-61, где рекомбинантный белок F RSV содержит

замены на цистеин в положениях 155 и 290, и замены на F, L, W, Y, H или M в положении 190, положении 207 или положениях 190 и 207.

Позиция 63. Иммуноген согласно любой из позиций 58-61, где рекомбинантный белок F RSV содержит замены S155C и S290C; замены S155C, S290C и S190F, или замены S155C, S290C, S190F и V207L.

Позиция 64. Иммуноген согласно любой из позиций 58-61, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент содержат или состоят из последовательности F₁-линкер- F₂ или последовательности F₂-линкер-F₁согласно любой из SEQ ID NO: 1027-1218.

Позиция 65. Иммуноген согласно любой из позиций 57-64, где гетерологичный линкер содержит или состоит из аминокислотной последовательности, указанной в качестве любой из SEQ ID NO: 1443-1455, или линкера G, S, GG, GS, SG, GGG или GSG.

Позиция 66. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, содержащий мультимер рекомбинантного белка F RSV или его фрагмента.

Позиция 67. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV связан с каркасным белком.

Позиция 68. Иммуноген согласно любой из позиций 1-56, где полипептид F1 содержит спираль α10 RSV, содержащую от положений 492 до одного из положений 510-529 RSV, и где полипептид F1 содержит по меньшей мере две замены на цистеин, которые образуют неприродную дисульфидную связь между протомерами.

Позиция 69. Иммуноген согласно 68, где положения 512-524 полипептида F1 содержат аминокислотную последовательность, указанную как CCHNVNAGKSTTN (остатки 512-524 SEQ ID NO: 844) или CCHNVNACCSTTN (остатки X-Y SEQ ID NO: 849); или где положения 512-529 полипептида F1 содержат аминокислотную последовательность, указанную как CCHNVNACCSTTNICCTT (остатки 512-529 SEQ ID NO: 853).

Позиция 70. Выделенный иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV дополнительно содержит дополнительную дисульфидную связь, содержащую пару сшитых остатков цистеина в положениях F₁:

(a) 486 и 487;

(b) 512 и 513;

(c) 519 и 520;

(d) 526 и 527;

(e) 486 и 487, где полипептид F₁дополнительно содержит P, встроенный между положениями 486 и 487;

(f) 330 и 493; где полипептид F₁дополнительно содержит C, встроенный между положениями 329 и 330; или

(g) 330 и 493; где полипептид F₁дополнительно содержит C, встроенный между 329 и 330, и G, встроенный между положениями 492 и 493;

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 71. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент или белок эпитоп-каркас связан с доменом тримеризации.

Позиция 72. Иммуноген согласно позиции 71, где C-конец полипептида F₁рекомбинантного белка F RSV связан с доменом тримеризации.

Позиция 73. Иммуноген согласно позиции 71 или положению 72, где домен тримеризации представляет собой домен Foldon.

Позиция 74. Иммуноген согласно любой из позиций 71-73, дополнительно содержащий участок расщепления протеазой между полипептидом F₁и доменом тримеризации.

Позиция 75. Иммуноген согласно позиции 74, дополнительно содержащий трансмембранный домен между участком расщепления протеазой и доменом тримеризации.

Позиция 76. Выделенный иммуноген согласно позиции 75, где белок F RSV является стабилизированным в предшествующей слиянию конформации белка F посредством

(a) дисульфидной связи, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, содержат аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 185, 189, 190, 201, 202, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 244, 245, 247, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 284, 302, 303, 243, 246, 276, 283, 285, 296, 297, 298 или 299;

(b) заполняющей полость замены, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, содержат аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 191, 193, 196, 197, 248, 192, 195 или 194;

(c) переупаковывающей аминокислотной замены, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, содержат аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO: 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 или 337; или

(d) участка N-связанного гликозилирования, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанный с доменом Foldon, содержат аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 198, 199, 200, 203, 204, 214, 215, 216 или 217;

(e) дисульфидной связи и заполняющей полость замены, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, содержат аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-544, соответственно, любой из SEQ ID NO, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 371, 372, 373, 374, 375, 376; и

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 77. Выделенный иммуноген согласно позиции 75, где полипептид F₂и полипептид F₁, связанные с доменом Foldon, содержат аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 26-109 и 137-548, соответственно, любой из SEQ ID NO: 552; 553; 554; 555; 556; 557; 558; 559; 560; 561; 562; 563; 564; 565; 566; 567; 568; 569; 570; 571; 572; 573; 574; 575; 576; 577; 578; 579; 580; 581; 582; 583; 584; 585; 586; 587; 588; 589; 590; 591; 592; 593; и 601; 683; 684; 685; 686; 687; 688; 689; 690; 691; 692 или 693.

где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанного в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 78. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV, или его фрагмент, или белок эпитоп-каркас связаны с субъединицей белковой наночастицы.

Позиция 79. Иммуноген согласно позиции 78, где C-конец рекомбинантного белка F RSV, или его фрагмента, или белка эпитоп-каркас связан с субъединицей белковой наночастицы.

Позиция 80. Иммуноген согласно позиции 78 или позиции 79, где субъединица белковой наночастицы представляет собой ферритин, инкапсулин, оксиганезу/редуктазу серы (SOR), синтазу лумазина или субъединицу наночастицы пируватдегидрогеназы.

Позиция 81. Иммуноген согласно позиции 78, где:

субъединица наночастицы ферритина содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с остатками 517-679 SEQ ID NO: 350, и необязательно включает замену C31S, C31A или C31V в полипептиде ферритина;

субъединица SOR содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с остатками 516-825 SEQ ID NO: 344 или SEQ ID NO: 345;

субъединица синтазы лумазина содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с остатками 517-670 SEQ ID NO: 346 или SEQ ID NO: 348, или остатками 517-669 SEQ ID NO: 347; или

субъединица пируватдегидрогеназы содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с остатками 516-757 SEQ ID NO: 349.

Позиция 82. Иммуноген согласно позиции 78, содержащий одноцепочечный белок F RSV, связанный с субъединицей ферритина, содержащей аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную одной из SEQ ID NO: 827-828 или 1429-1442.

Позиция 83. Иммуноген согласно позиции 78, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент связаны с субъединицей наночастицы и содержат аминокислотную последовательность любого из иммуногенов минимального участка ∅, связанных с белковой наночастицей, как указано в таблице 21.

Позиция 84. Иммуноген согласно позиции 78, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент, связанные с субъединицей наночастицы, содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 1219-1428.

Позиция 85. Иммуноген согласно позиции 78, где рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент связаны с субъединицей наночастицы и содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности одной из SEQ ID NO: 1219-1428, необязательно без белковых меток или лидерных последовательностей, приведенных в соответствующих SEQ ID NO.

Позиция 86. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где рекомбинантный белок F RSV образует тример в фосфатно-солевом буфере при физиологических значениях pH при комнатной температуре.

Позиция 87. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где иммуноген образует гомогенную популяцию иммуногенов при инкубации в водном растворе, где по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, и/или по меньшей мере 95% иммуногенов, инкубированных в растворе, специфически связываются с антителом, специфичным к предшествующей слиянию конформации, после:

(a) инкубации в течение одного часа в 350 мМ NaCl, pH 7,0, при 50°C;

(b) инкубации в течение одного часа в 350 мМ NaCl, pH 3,5, при 25°C;

(c) инкубации в течение одного часа в 350 мМ NaCl, pH 10, при 25°C;

(d) инкубации в течение одного часа при осмолярности 10 мМ, pH 7,0, при 25°C;

(e) инкубации в течение одного часа при осмолярности 3000 мМ, pH 7,0, при 25°C; или

(f) десяти циклов замораживания-размораживания в 350 мМ NaCl, pH 7,0; или

(g) комбинации двух или более из (a)-(f); где

иммуноген инкубируют в растворе в отсутствие антитела, специфичного к предшествующей слиянию конформации.

Позиция 88. Иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где:

(a) рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент не включают дисульфидную связь между положениями 481 и 489 F RSV, или между положениями 509 и 510 F RSV;

(b) рекомбинантный белок F RSV или его фрагмент не включают остаток цистеина в положениях 481, 489, 509, 510 F RSV или их комбинации;

(c) комбинация (a) и (b).

Позиция 89. Выделенный иммуноген согласно любой из позиций 1-70, где C-конец полипептида F₁связан с трансмембранным доменом.

Позиция 90. Выделенный иммуноген согласно позиции 89, где трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен F RSV.

Позиция 91. Выделенный иммуноген согласно позиции 89 или 90, где C-конец трансмембранного домена связан с цитозольным доменом F RSV.

Позиция 92. Выделенный иммуноген согласно любой из предшествующих позиций, где иммуноген не является стабилизированным в предшествующей слиянию конформации посредством неспецифического сшивания.

Позиция 93. Вирусоподобная частица, содержащая иммуноген согласно любой из позиций 1-70.

Позиция 94. Белковая наночастица, содержащая иммуноген согласно любой из позиций 1-85.

Позиция 95. Белковая наночастица согласно позиции 94, где белковая наночастица представляет собой наночастицу ферритина, наночастицу инкапсулина, наночастицу оксигеназы/редуктазы серы (SOR), наночастицу синтазы лумазина или наночастицу пируватдегидрогеназы.

Позиция 96. Иммуноген согласно любой из позиций 1-92, где Fab моноклонального антитела D25 или AM22 специфически связывается с иммуногеном, вирусоподобной частицей или белковой наночастицей с K_d 1 мкМ или менее.

Позиция 97. Выделенный иммуноген согласно любой из позиций 1-85, где иммуноген содержит эпитоп D25, содержащий трехмерную структуру, которая в отсутствие моноклонального антитела D25 может быть структурно совмещена с трехмерной структурой эпитопа D25, содержащего остатки 62-69 и 196-209 SEQ ID NO: 370 в комплексе с моноклональным антителом D25, как определяется атомными координатами, указанными в таблице 1, со среднеквадратическим отклонением (RMSD) их координат менее чем 2,0 Å/остаток, где RMSD измеряют на атомах полипептидного остова N, Cα, C, O, для по меньшей мере трех последовательно расположенных аминокислот.

Позиция 98. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая выделенный иммуноген согласно любой из позиций 1-92.

Позиция 99. Молекула нуклеиновой кислоты согласно позиции 98, где молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок-предшественник иммуногена.

Позиция 100. Молекула нуклеиновой кислоты согласно позиции 99, где белок-предшественник содержит от N-конца к C-концу сигнальный пептид, полипептид F₂, полипептид Pep27 и полипептид F₁.

Позиция 101. Молекула нуклеиновой кислоты согласно позиции 100, где полипептид Pep27 содержит аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 110-136 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 102. Молекула нуклеиновой кислоты согласно позиции 101, где сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность, указанную в качестве положений 1-25 любой из SEQ ID NO: 1-184 или 370, где аминокислотные положения соответствуют аминокислотной последовательности эталонного полипептида F₀, указанной в качестве SEQ ID NO: 124.

Позиция 103. Молекула нуклеиновой кислоты согласно любой из позиций 99-102, кодон-оптимизированная для экспрессии в клетке человека или животного семейства бычьих.

Позиция 104. Молекула нуклеиновой кислоты согласно любой из позиций 99-103, функционально связанная с промотором.

Позиция 105. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно позиции 104.

Позиция 106. Вектор согласно позиции 105, где вектор представляет собой вирусный вектор.

Позиция 107. Вирусный вектор согласно позиции 106, где вирусный вектор представляет собой вектор на основе бычьего парагриппа, вектор на основе вируса парагриппа человека, вектор на основе вируса болезни Ньюкасла, вектор на основе вируса Сендай, вектор на основе вируса кори, ослабленный вектор RSV, вектор на основе парамиксовируса, вектор на основе аденовируса, вектор на основе альфавируса, вектор на основе вируса венесуэльского энцифалита лошадей, вектор на основе вируса леса Семлики, вектор на основе вируса Синдбис, вектор на основе аденоассоциированного вируса, вектор на основе поксвируса, вектор на основе рабдовируса, вектор на основе вируса везикулярного стоматита, вектор на основе пикорнавируса или вектор на основе вируса герпеса.

Позиция 108. Вектор согласно позиции 106, где вектор представляет собой бактериальный вектор.

Позиция 109. Бактериальный вектор согласно позиции 108, где бактериальный вектор представляет собой вектор микобактерий, вектор сальмонелл, вектор шигелл, ввектор Listeria monocytogenes или вектор молочнокислых бактерий.

Позиция 110. Молекула нуклеиновой кислоты или вектор согласно любой из позиций 98-109, содержащие нуклеотидную последовательность, указанную в качестве SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 или SEQ ID NO: 386.

Позиция 111. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор согласно любой из позиций 105-110.

Позиция 112. Иммуногенная композиция, содержащая эффективное количество иммуногена, вирусоподобной частицы, белковой наночастицы, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора согласно любой из позиций 1-110; и фармацевтически приемлемый носитель.

Позиция 113. Иммуногенная композиция согласно позиции 112, дополнительно содержащая адъювант.

Позиция 114. Иммуногенная композиция согласно позиции 113, где адъювант представляет собой квасцы, композицию типа "масло в воде", MF59, AS01, AS03, AS04, MPL, QS21, CpG-олигонуклеотид, агонист TLR7, агонист TLR4 или комбинацию двух или более из них.

Позиция 115. Иммуногенная композиция согласно позиции 113, где адъювант стимулирует иммунный ответ Th1.

Позиция 116. Иммуногенная композиция согласно любой из позиций 112, дополнительно содержащая антитело, специфичное к предшествующей слиянию конформации F RSV, которое специфически связывает иммуноген.

Позиция 117. Иммуногенная композиция согласно любой из позиций 112, содержащая смесь рекомбинантных белков F RSV или их фрагментов на основе белка F RSV подтипа A и B.

Позиция 118. Иммуногенная композиция согласно позиции 117, где

белок F RSV подтипа A человека содержит замены S155C, S290C и S190F, и белок F RSV подтипа B человека содержит замены S155C, S290C и S190F; или

белок F RSV подтипа A человека содержит замены S155C, S290C, S190F и V207L, и белок F RSV подтипа B человека содержит замены S155C, S290C, S190F и V207L.

Позиция 119. Способ индукции иммунного ответа на RSV F у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества иммуногенной композиции согласно любой из позиций 112-118 для индукции иммунного ответа.

Позиция 120. Способ согласно позиции 119, где иммунный ответ включает иммунный ответ Th1.

Позиция 121. Способ лечения или предупреждения инфекции RSV у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции согласно любой из позиций 112-120, тем самым осуществляя лечение или предупреждение инфекции RSV у индивидуума.

Позиция 122. Способ согласно одной из позиций 119-121, включающий введение иммуногенной композиции по типу первичной иммунизации-усиливающей иммунизации.

Позиция 123. Способ согласно позиции 122, где первичная имммунизация и усиливающая иммунизация включают введение смеси рекомбинантных белков F RSV, или их фрагментов, или молекул нуклеиновых кислот, или белковых наночастиц на основе белка F RSV подтипа A и B.

Позиция 124. Способ обнаружения или выделения антитела, связывающего F RSV у индивидуума, включающий:

предоставление эффективного количества иммуногена, вирусоподобной частиц, белковой наночастицы, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора согласно одному из положений 1-110;

контактирование биологического образца от индивидуума с рекомбинантным белком F RSV или белковой наночастицей в условиях, достаточных для образования иммунного комплекса между рекомбинантным белком F RSV или белковой наночастицей и антителом, связывающим F RSV; и

обнаружение иммунного комплекса, тем самым обнаруживая или выделяя антитело, связывающее F RSV, у индивидуума.

Позиция 125. Способ согласно любой из позиций 119-124, где индивидуум имеет риск инфекции RSV или имеет инфекцию RSV.

Позиция 126. Способ согласно позиции 125, где инфекция RSV представляет собой инфекцию RSV подтипа A человека, RSV подтипа B человека или бычьим RSV.

Позиция 127. Способ согласно любой из позиций 119-126, где индивидуум представляет собой человека и ветеринарного индивидуума.

Позиция 129. Набор, содержащий иммуноген, вирусоподобную частицу, белковую наночастицу, молекулу нуклеиновой кислоты или вектор согласно любой из позиций 1-110; и инструкции по применению набора.

Как используют в рамках изобретения, указание на:

"любую из SEQ ID NO: 1-184" относится к "SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 или SEQ ID NO: 184"

"SEQ ID NO: 698-828" относится к "любой из "SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 773, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 775, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 781, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 783, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 785, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 791, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 793, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 795, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 799, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 801, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 805, SEQ ID NO: 806, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 821, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 823, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 827, или SEQ ID NO: 828".

"SEQ ID NO: 1474-1478" относится к "любой из SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1477 или SEQ ID NO: 1478".

"SEQ ID NO: 829-1025" относится к "любой из SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 845, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024 или SEQ ID NO: 1025".

"SEQ ID NO: 969-1025" относится к "любой из SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024 или SEQ ID NO: 1025".

"SEQ ID NO: 901-968" относится к "любой из SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 или SEQ ID NO: 968".

"SEQ ID NO: 1027-1218" относится к "любой из SEQ ID NO: 1027, SEQ ID NO: 1028, SEQ ID NO: 1029, SEQ ID NO: 1030, SEQ ID NO: 1031, SEQ ID NO: 1032, SEQ ID NO: 1033, SEQ ID NO: 1034, SEQ ID NO: 1035, SEQ ID NO: 1036, SEQ ID NO: 1037, SEQ ID NO: 1038, SEQ ID NO: 1039, SEQ ID NO: 1040, SEQ ID NO: 1041, SEQ ID NO: 1042, SEQ ID NO: 1043, SEQ ID NO: 1044, SEQ ID NO: 1045, SEQ ID NO: 1046, SEQ ID NO: 1047, SEQ ID NO: 1048, SEQ ID NO: 1049, SEQ ID NO: 1050, SEQ ID NO: 1051, SEQ ID NO: 1052, SEQ ID NO: 1053, SEQ ID NO: 1054, SEQ ID NO: 1055, SEQ ID NO: 1056, SEQ ID NO: 1057, SEQ ID NO: 1058, SEQ ID NO: 1059, SEQ ID NO: 1060, SEQ ID NO: 1061, SEQ ID NO: 1062, SEQ ID NO: 1063, SEQ ID NO: 1064, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1066, SEQ ID NO: 1067, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1069, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1074, SEQ ID NO: 1075, SEQ ID NO: 1076, SEQ ID NO: 1077, SEQ ID NO: 1078, SEQ ID NO: 1079, SEQ ID NO: 1080, SEQ ID NO: 1081, SEQ ID NO: 1082, SEQ ID NO: 1083, SEQ ID NO: 1084, SEQ ID NO: 1085, SEQ ID NO: 1086, SEQ ID NO: 1087, SEQ ID NO: 1088, SEQ ID NO: 1099, SEQ ID NO: 1100, SEQ ID NO: 1101, SEQ ID NO: 1102, SEQ ID NO: 1103, SEQ ID NO: 1104, SEQ ID NO: 1105, SEQ ID NO: 1106, SEQ ID NO: 1107, SEQ ID NO: 1108, SEQ ID NO: 1109, SEQ ID NO: 1110, SEQ ID NO: 1111, SEQ ID NO: 1112, SEQ ID NO: 1113, SEQ ID NO: 1114, SEQ ID NO: 1115, SEQ ID NO: 1116, SEQ ID NO: 1117, SEQ ID NO: 1118, SEQ ID NO: 1119, SEQ ID NO: 1120, SEQ ID NO: 1121, SEQ ID NO: 1122, SEQ ID NO: 1123, SEQ ID NO: 1124, SEQ ID NO: 1125, SEQ ID NO: 1126, SEQ ID NO: 1127, SEQ ID NO: 1128, SEQ ID NO: 1129, SEQ ID NO: 1130, SEQ ID NO: 1131, SEQ ID NO: 1132, SEQ ID NO: 1133, SEQ ID NO: 1134, SEQ ID NO: 1135, SEQ ID NO: 1136, SEQ ID NO: 1137, SEQ ID NO: 1138, SEQ ID NO: 1139, SEQ ID NO: 1140, SEQ ID NO: 1141, SEQ ID NO: 1142, SEQ ID NO: 1143, SEQ ID NO: 1144, SEQ ID NO: 1145, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1147, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1149, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1152, SEQ ID NO: 1153, SEQ ID NO: 1154, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1156, SEQ ID NO: 1157, SEQ ID NO: 1158, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1160, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1162, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1165, SEQ ID NO: 1166, SEQ ID NO: 1167, SEQ ID NO: 1168, SEQ ID NO: 1169, SEQ ID NO: 1170, SEQ ID NO: 1171, SEQ ID NO: 1172, SEQ ID NO: 1173, SEQ ID NO: 1174, SEQ ID NO: 1175, SEQ ID NO: 1176, SEQ ID NO: 1177, SEQ ID NO: 1178, SEQ ID NO: 1179, SEQ ID NO: 1180, SEQ ID NO: 1181, SEQ ID NO: 1182, SEQ ID NO: 1183, SEQ ID NO: 1184, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1186, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1188, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1191, SEQ ID NO: 1192, SEQ ID NO: 1193, SEQ ID NO: 1194, SEQ ID NO: 1195, SEQ ID NO: 1196, SEQ ID NO: 1197, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1199, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1201, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1204, SEQ ID NO: 1205, SEQ ID NO: 1206, SEQ ID NO: 1207, SEQ ID NO: 1208, SEQ ID NO: 1209, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1214, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1217, или SEQ ID NO: 1218".

"SEQ ID NO: 1429-1442" относится к "любой из SEQ ID NO: 1429, SEQ ID NO: 1430, SEQ ID NO: 1431, SEQ ID NO: 1432, SEQ ID NO: 1433, SEQ ID NO: 1434, SEQ ID NO: 1435, SEQ ID NO: 1436, SEQ ID NO: 1437, SEQ ID NO: 1438, SEQ ID NO: 1439, SEQ ID NO: 1440, SEQ ID NO: 1441, или SEQ ID NO: 1442".

"SEQ ID NO: 1219-1428" относится к любой из SEQ ID NO: 1219, SEQ ID NO: 1220, SEQ ID NO: 1221, SEQ ID NO: 1222, SEQ ID NO: 1223, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1225, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1227, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1230, SEQ ID NO: 1231, SEQ ID NO: 1232, SEQ ID NO: 1233, SEQ ID NO: 1234, SEQ ID NO: 1235, SEQ ID NO: 1236, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1238, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1240, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1243, SEQ ID NO: 1244, SEQ ID NO: 1245, SEQ ID NO: 1246, SEQ ID NO: 1247, SEQ ID NO: 1248, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1250, SEQ ID NO: 1251, SEQ ID NO: 1252, SEQ ID NO: 1253, SEQ ID NO: 1254, SEQ ID NO: 1255, SEQ ID NO: 1256, SEQ ID NO: 1257, SEQ ID NO: 1258, SEQ ID NO: 1259, SEQ ID NO: 1260, SEQ ID NO: 1261, SEQ ID NO: 1262, SEQ ID NO: 1263, SEQ ID NO: 1264, SEQ ID NO: 1265, SEQ ID NO: 1266, SEQ ID NO: 1267, SEQ ID NO: 1268, SEQ ID NO: 1269, SEQ ID NO: 1270, SEQ ID NO: 1271, SEQ ID NO: 1272, SEQ ID NO: 1273, SEQ ID NO: 1274, SEQ ID NO: 1275, SEQ ID NO: 1276, SEQ ID NO: 1277, SEQ ID NO: 1278, SEQ ID NO: 1279, SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1281, SEQ ID NO: 1282, SEQ ID NO: 1283, SEQ ID NO: 1284, SEQ ID NO: 1285, SEQ ID NO: 1286, SEQ ID NO: 1287, SEQ ID NO: 1288, SEQ ID NO: 1289, SEQ ID NO: 1290, SEQ ID NO: 1291, SEQ ID NO: 1292, SEQ ID NO: 1293, SEQ ID NO: 1294, SEQ ID NO: 1295, SEQ ID NO: 1296, SEQ ID NO: 1297, SEQ ID NO: 1298, SEQ ID NO: 1299, SEQ ID NO: 1300, SEQ ID NO: 1301, SEQ ID NO: 1302, SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1318, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1321, SEQ ID NO: 1322, SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1329, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1331, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1334, SEQ ID NO: 1335, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1344, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1346, SEQ ID NO: 1347, SEQ ID NO: 1348, SEQ ID NO: 1349, SEQ ID NO: 1350, SEQ ID NO: 1351, SEQ ID NO: 1352, SEQ ID NO: 1353, SEQ ID NO: 1354, SEQ ID NO: 1355, SEQ ID NO: 1356, SEQ ID NO: 1357, SEQ ID NO: 1358, SEQ ID NO: 1359, SEQ ID NO: 1360, SEQ ID NO: 1361, SEQ ID NO: 1362, SEQ ID NO: 1363, SEQ ID NO: 1364, SEQ ID NO: 1365, SEQ ID NO: 1366, SEQ ID NO: 1367, SEQ ID NO: 1368, SEQ ID NO: 1369, SEQ ID NO: 1370, SEQ ID NO: 1371, SEQ ID NO: 1372, SEQ ID NO: 1373, SEQ ID NO: 1374, SEQ ID NO: 1375, SEQ ID NO: 1376, SEQ ID NO: 1377, SEQ ID NO: 1378, SEQ ID NO: 1379, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1381, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1383, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1386, SEQ ID NO: 1387, SEQ ID NO: 1388, SEQ ID NO: 1389, SEQ ID NO: 1390, SEQ ID NO: 1391, SEQ ID NO: 1392, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1394, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1396, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1399, SEQ ID NO: 1400, SEQ ID NO: 1401, SEQ ID NO: 1402, SEQ ID NO: 1403, SEQ ID NO: 1404, SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1415, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1420, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1425, SEQ ID NO: 1426, SEQ ID NO: 1427 или SEQ ID NO: 1428".

В некоторых вариантах осуществления описанный рекомбинантный белок F RSV может включать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% (как например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 98%, или 100%) идентичную любой из SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO: 644, SEQ ID NO: 645, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 663, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 773, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 775, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 781, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 783, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 785, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 791, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 793, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 795, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 799, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 801, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 805, SEQ ID NO: 806, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 821, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 823, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 845, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024, SEQ ID NO: 1025, SEQ ID NO: 1026, SEQ ID NO: 1027, SEQ ID NO: 1028, SEQ ID NO: 1029, SEQ ID NO: 1030, SEQ ID NO: 1031, SEQ ID NO: 1032, SEQ ID NO: 1033, SEQ ID NO: 1034, SEQ ID NO: 1035, SEQ ID NO: 1036, SEQ ID NO: 1037, SEQ ID NO: 1038, SEQ ID NO: 1039, SEQ ID NO: 1040, SEQ ID NO: 1041, SEQ ID NO: 1042, SEQ ID NO: 1043, SEQ ID NO: 1044, SEQ ID NO: 1045, SEQ ID NO: 1046, SEQ ID NO: 1047, SEQ ID NO: 1048, SEQ ID NO: 1049, SEQ ID NO: 1050, SEQ ID NO: 1051, SEQ ID NO: 1052, SEQ ID NO: 1053, SEQ ID NO: 1054, SEQ ID NO: 1055, SEQ ID NO: 1056, SEQ ID NO: 1057, SEQ ID NO: 1058, SEQ ID NO: 1059, SEQ ID NO: 1060, SEQ ID NO: 1061, SEQ ID NO: 1062, SEQ ID NO: 1063, SEQ ID NO: 1064, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1066, SEQ ID NO: 1067, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1069, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1074, SEQ ID NO: 1075, SEQ ID NO: 1076, SEQ ID NO: 1077, SEQ ID NO: 1078, SEQ ID NO: 1079, SEQ ID NO: 1080, SEQ ID NO: 1081, SEQ ID NO: 1082, SEQ ID NO: 1083, SEQ ID NO: 1084, SEQ ID NO: 1085, SEQ ID NO: 1086, SEQ ID NO: 1087, SEQ ID NO: 1088, SEQ ID NO: 1099, SEQ ID NO: 1100, SEQ ID NO: 1101, SEQ ID NO: 1102, SEQ ID NO: 1103, SEQ ID NO: 1104, SEQ ID NO: 1105, SEQ ID NO: 1106, SEQ ID NO: 1107, SEQ ID NO: 1108, SEQ ID NO: 1109, SEQ ID NO: 1110, SEQ ID NO: 1111, SEQ ID NO: 1112, SEQ ID NO: 1113, SEQ ID NO: 1114, SEQ ID NO: 1115, SEQ ID NO: 1116, SEQ ID NO: 1117, SEQ ID NO: 1118, SEQ ID NO: 1119, SEQ ID NO: 1120, SEQ ID NO: 1121, SEQ ID NO: 1122, SEQ ID NO: 1123, SEQ ID NO: 1124, SEQ ID NO: 1125, SEQ ID NO: 1126, SEQ ID NO: 1127, SEQ ID NO: 1128, SEQ ID NO: 1129, SEQ ID NO: 1130, SEQ ID NO: 1131, SEQ ID NO: 1132, SEQ ID NO: 1133, SEQ ID NO: 1134, SEQ ID NO: 1135, SEQ ID NO: 1136, SEQ ID NO: 1137, SEQ ID NO: 1138, SEQ ID NO: 1139, SEQ ID NO: 1140, SEQ ID NO: 1141, SEQ ID NO: 1142, SEQ ID NO: 1143, SEQ ID NO: 1144, SEQ ID NO: 1145, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1147, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1149, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1152, SEQ ID NO: 1153, SEQ ID NO: 1154, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1156, SEQ ID NO: 1157, SEQ ID NO: 1158, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1160, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1162, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1165, SEQ ID NO: 1166, SEQ ID NO: 1167, SEQ ID NO: 1168, SEQ ID NO: 1169, SEQ ID NO: 1170, SEQ ID NO: 1171, SEQ ID NO: 1172, SEQ ID NO: 1173, SEQ ID NO: 1174, SEQ ID NO: 1175, SEQ ID NO: 1176, SEQ ID NO: 1177, SEQ ID NO: 1178, SEQ ID NO: 1179, SEQ ID NO: 1180, SEQ ID NO: 1181, SEQ ID NO: 1182, SEQ ID NO: 1183, SEQ ID NO: 1184, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1186, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1188, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1191, SEQ ID NO: 1192, SEQ ID NO: 1193, SEQ ID NO: 1194, SEQ ID NO: 1195, SEQ ID NO: 1196, SEQ ID NO: 1197, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1199, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1201, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1204, SEQ ID NO: 1205, SEQ ID NO: 1206, SEQ ID NO: 1207, SEQ ID NO: 1208, SEQ ID NO: 1209, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1214, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1217, SEQ ID NO: 1218, SEQ ID NO: 1219, SEQ ID NO: 1220, SEQ ID NO: 1221, SEQ ID NO: 1222, SEQ ID NO: 1223, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1225, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1227, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1230, SEQ ID NO: 1231, SEQ ID NO: 1232, SEQ ID NO: 1233, SEQ ID NO: 1234, SEQ ID NO: 1235, SEQ ID NO: 1236, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1238, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1240, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1243, SEQ ID NO: 1244, SEQ ID NO: 1245, SEQ ID NO: 1246, SEQ ID NO: 1247, SEQ ID NO: 1248, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1250, SEQ ID NO: 1251, SEQ ID NO: 1252, SEQ ID NO: 1253, SEQ ID NO: 1254, SEQ ID NO: 1255, SEQ ID NO: 1256, SEQ ID NO: 1257, SEQ ID NO: 1258, SEQ ID NO: 1259, SEQ ID NO: 1260, SEQ ID NO: 1261, SEQ ID NO: 1262, SEQ ID NO: 1263, SEQ ID NO: 1264, SEQ ID NO: 1265, SEQ ID NO: 1266, SEQ ID NO: 1267, SEQ ID NO: 1268, SEQ ID NO: 1269, SEQ ID NO: 1270, SEQ ID NO: 1271, SEQ ID NO: 1272, SEQ ID NO: 1273, SEQ ID NO: 1274, SEQ ID NO: 1275, SEQ ID NO: 1276, SEQ ID NO: 1277, SEQ ID NO: 1278, SEQ ID NO: 1279, SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1281, SEQ ID NO: 1282, SEQ ID NO: 1283, SEQ ID NO: 1284, SEQ ID NO: 1285, SEQ ID NO: 1286, SEQ ID NO: 1287, SEQ ID NO: 1288, SEQ ID NO: 1289, SEQ ID NO: 1290, SEQ ID NO: 1291, SEQ ID NO: 1292, SEQ ID NO: 1293, SEQ ID NO: 1294, SEQ ID NO: 1295, SEQ ID NO: 1296, SEQ ID NO: 1297, SEQ ID NO: 1298, SEQ ID NO: 1299, SEQ ID NO: 1300, SEQ ID NO: 1301, SEQ ID NO: 1302, SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1318, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1321, SEQ ID NO: 1322, SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1329, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1331, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1334, SEQ ID NO: 1335, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1344, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1346, SEQ ID NO: 1347, SEQ ID NO: 1348, SEQ ID NO: 1349, SEQ ID NO: 1350, SEQ ID NO: 1351, SEQ ID NO: 1352, SEQ ID NO: 1353, SEQ ID NO: 1354, SEQ ID NO: 1355, SEQ ID NO: 1356, SEQ ID NO: 1357, SEQ ID NO: 1358, SEQ ID NO: 1359, SEQ ID NO: 1360, SEQ ID NO: 1361, SEQ ID NO: 1362, SEQ ID NO: 1363, SEQ ID NO: 1364, SEQ ID NO: 1365, SEQ ID NO: 1366, SEQ ID NO: 1367, SEQ ID NO: 1368, SEQ ID NO: 1369, SEQ ID NO: 1370, SEQ ID NO: 1371, SEQ ID NO: 1372, SEQ ID NO: 1373, SEQ ID NO: 1374, SEQ ID NO: 1375, SEQ ID NO: 1376, SEQ ID NO: 1377, SEQ ID NO: 1378, SEQ ID NO: 1379, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1381, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1383, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1386, SEQ ID NO: 1387, SEQ ID NO: 1388, SEQ ID NO: 1389, SEQ ID NO: 1390, SEQ ID NO: 1391, SEQ ID NO: 1392, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1394, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1396, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1399, SEQ ID NO: 1400, SEQ ID NO: 1401, SEQ ID NO: 1402, SEQ ID NO: 1403, SEQ ID NO: 1404, SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1415, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1420, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1425, SEQ ID NO: 1426, SEQ ID NO: 1427, SEQ ID NO: 1428, SEQ ID NO: 1429, SEQ ID NO: 1430, SEQ ID NO: 1431, SEQ ID NO: 1432, SEQ ID NO: 1433, SEQ ID NO: 1434, SEQ ID NO: 1435, SEQ ID NO: 1436, SEQ ID NO: 1437, SEQ ID NO: 1438, SEQ ID NO: 1439, SEQ ID NO: 1440, SEQ ID NO: 1441, SEQ ID NO: 1442, SEQ ID NO: 1456, SEQ ID NO: 1457, SEQ ID NO: 1458, SEQ ID NO: 1459, SEQ ID NO: 1460, SEQ ID NO: 1461, SEQ ID NO: 1462, SEQ ID NO: 1463, SEQ ID NO: 1464, SEQ ID NO: 1465, SEQ ID NO: 1466, SEQ ID NO: 1467, SEQ ID NO: 1468, SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1477 или SEQ ID NO: 1478 ("набор последовательностей F"), где рекомбинантный полипептид F RSV специфически связывается с антителом, специфичным к RSV F в предшествующей слиянию конформации (таким как D25), и/или включает специфический антигенный участок F RSV в предшествующей слиянию конформации (как например, антигенный участок ∅). В нескольких вариантах осуществления иммуноген специфически связывается с антителом и включает антигенный участок после инкубации в PBS при pH 7,4 при 20°C в течение 24 часов. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид F RSV включает одну из последовательностей из набора последовательностей F, и дополнительно включает вплоть до 20 (как например, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19) аминокислотных замен (таких как консервативные аминокислотные замены, где рекомбинантный полипептид F RSV специфически связывается с антителом, специфичным к F RSV в предшествующей слиянию конформации (таким как D25), и/или включает антигенный участок, специфичный к RSV F в предшествующей слиянию конформации (как например, антигенный участок ∅). Специалисту в данной области будет понятно, что последовательности, приведенные выше, могут включать лидерные последовательности, метки для очистки, участки расщепления протеазой для удаления меток для очистки, домены тримеризации, домены субъединиц белковой наночастицы или другие последовательности, которые являются неродственными рекомбинантному белку F RSV. В нескольких вариантах осуществления иммуноген, описанный в настоящем описании, включает рекомбинантный белок F RSV одной из описанных выше последовательностей, но не включает лидерные последовательности, метки для очистки, участки расщепления протеазой для удаления меток для очистки, домены тримеризации, домены субъединиц белковой наночастицы или другие последовательности, которые являются неродственными рекомбинантному белку F RSV. Также предусматриваются молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эти белковые последовательности, также как и способы применения рекомбинантных белков F RSV для индукции иммунного ответа на RSV у индивидуума или для предупреждения или лечения инфекции RSV у индивидуума.

III. ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предоставлены для иллюстрации конкретных признаков определенных вариантов осуществления, однако объем формулы изобретения не ограничивается проиллюстрированными признаками.

Пример 1

Структура тримера F респираторно-синцитиального вируса в предшествующей слиянию конформации, связанного с антителом человека

Предшествующая слиянию конформация гликопротеина слияния (F) респираторно-синцитиального вируса (RSV) является мишенью большинства нейтрализующих антител против RSV в сыворотке человека, однако ее метастабильность препятствует охарактеризации. Для преодоления этого препятствия были идентифицированы антитела, которые не связываются с образующейся после слияния конформацией F и являются в >10 раз более эффективными, чем профилактическое антитело паливизумаб (Synagis®). Структура сокристалла одного из этих антител, D25, в комплексе с гликопротеином F демонстрирует, что D25 фиксирует F в его предшествующем слиянию состоянии. Сравнение предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформаций F позволяет определить перестройки, требуемые для опосредования вхождения RSV. Структура гликопротеина D25-F демонстрирует новый участок уязвимости, антигенный участок ∅, в верхней части гликопротеина F, который является специфическим для предшествующей слиянию конформации и четвертичным по своему характеру. Структура тримера F RSV в предшествующей слиянию конформации вместе с определением антигенного участка ∅, должны обеспечить конструкцию усовершенствованных вакцинных антигенов и привести к новым подходам для пассивного предупреждения индуцируемого RSV заболевания.

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является повсеместным, инфицируя практически всех детей к возрасту 3 лет (Glezen et al., Am. J. Dis. Child., 140, 543 (1986)). В США обусловленный RSV бронхиолит является ведущей причиной госпитализации у детей младшего возраста и основной причиной астмы и свистящего дыхания в детском возрасте (Shay et al., JAMA, 282, 1440 (1999); Hall et al., N. Engl. J. Med., 360, 588 (2009)). По всему миру RSV ответственен за 66000-199000 смертей каждый год у детей младше пяти лет (Nair et al., Lancet, 375, 1545 (2010)), и он обуславливает 7% смертей среди младенцев в возрасте от 1 месяца до 1 года - больше чем любой другой отдельно взятый патоген, за исключением малярии (Lozano et al., Lancet, 380, 2095 (2013)). Единственным доступным вмешательством является пассивное введение лицензированного моноклонального антитела паливизумаба (Synagis®), которое распознает гликопротеин слияния (F) RSV (Johnson et al., J. Infect. Dis., 176, 1215 (1997); Beeler and van Wyke Coelingh, J. Virol., 63, 2941 (1989)) и снижает встречаемость тяжелого заболевания (The IMpact-RSV Study Group, Pediatrics, 102, 531 (1998)). Клинические данные о том, что антитела, специфичные к F RSV, могут защищать от заболевания, привели к поиску лучших антител (Collarini et al., J. Immunol., 183, 6338 (2009); Wu et al., J. Mol. Biol., 368, 652 (2007); Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16, 123 (2010)) и скоординированным усилиям по разработке эффективной вакцины (Graham, Immunol. Rev., 239, 149 (2011)).

Гликопротеин F RSV способствует слиянию вирусных и клеточных мембран (Walsh and Hruska, J. Virol., 47, 171 (1983)); он представляет собой белок слияния типа I с метастабильной предшествующей слиянию конформацией, которая аккумулирует энергию сворачивания, высвобождаемую в процессе структурной перестройки в высокостабильную образующуюся после слияния конформацию. Было обнаружено, что три антигенных участка (I, II и IV) индуцируют нейтрализующую активность (Arbiza et al., J. Gen. Virol., 73, 2225 (1992); Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998); López et al., J. Virol., 64, 927 (1990)), и все из них существуют на образующейся после слияния форме F при определении с использованием структурных и биофизических исследований (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)). Однако поглощение из сыворотки человека образующегося после слияния F RSV не устраняет основную часть F-специфической активности нейтрализации, что указывает на то, что предшествующая слиянию форма F RSV содержит новые нейтрализующие антигенные участки (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 3089 (2012)). Несмотря на широкомасштабные усилия, гомогенный препарат растворимого F RSV в предшествующей слиянию конформации не был получен. Таким образом, определение предшествующей слиянию структуры F и идентификация новых специфических антигенных участков F стали пересекающимися приоритетами для разработки новых профилактических и терапевтических антител и вакцин. Наряду с этими задачами были идентифицированы антитела, специфичные к F, которые могли нейтрализовывать RSV, но не связываться с образующимся после слияния F, и была определена структура F RSV, распознаваемая этими антителами. Результаты выявили предшествующую слиянию конформацию F RSV, механизм нейтрализации категории высокоэффективных антител и детали на атомном уровне для специфического антигенного участка предшествующей слиянию конформации, который должен служить в качестве мишени для усовершенствованных способов терапии на основе антител, и обеспечили основу для разработки эффективных вакцинных антигенов.

Было определено, что два антитела человека - D25 и AM22 - являются в ~ 50 раз более эффективными, чем паливизумаб (фиг.1A) в отношении нейтрализации F RSV, и они также не связываются с растворимой формой F RSV, стабилизированной в образующейся после слияния конформации (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011)) (фиг.1B). D25 и AM22 были описаны ранее (Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16, 123 (2010); публикация патента США № 2010/0239593; публикация патента США № 2012/0070446). Отсутствие связывания D25 и AM22 с образующейся после слияния формой F RSV показало, что эти антитела могут распознавать метастабильную предшествующую слиянию конформацию.

Усилия по изучению структуры были сфокусированы на антителах человека AM22 и D25. Формат экспрессии в 96-луночном микропланшете для титрования (Pancera et al., PLoS One. 2013;8(2):e55701, 2013, включенная в настоящее описание в качестве ссылки) использовали для скрининга связывания этих антител с панелью вариантов гликопротеина F RSV, которые были уловлены из клеточных супернатантах на планшеты Ni²⁺-NTA ELISA. Исследовали связывание антитела с конструкцией гликопротеина F (RSV F(+) Fd), содержащей остатки 1-513 F RSV, слитые с C-концевым доменом тримеризации фибритина (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)). Однако при смешении очищенного RSV F(+) Fd с очищенным антителом D25 или AM22 комплексы не образовывались. Было определено, что очистка растворимого гликопротеина F запускала метастабильное предшествующей слиянию состояние (Chaiwatpongsakorn et al., J. Virol., 85, 3968 (2011)); для преодоления этой нестабильности клетки, экспрессирущие RSV F(+) Fd, инкубировали с антигенсвязывающими фрагментами (Fab) или иммуноглобулинами (последние из них с участком расщепления протеазой HRV3C в шарнирной области (McLellan et al., Nature 480, 336, (2011)) для улавливания F в предшествующем слиянию состоянии. Альтернативно клетки, экспрессирующие RSV F(+) Fd, совместно трансфицировали с отдельными ДНК-экспрессирующими кассетами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела (фиг.5). Оптимальной экспрессии комплекса D25-гликопротеина F достигали при совместной трансфекции ДНК, кодирующей Fab D25, с ДНК, кодирующей RSV F(+) Fd; приемлемые выходы комплекса также наблюдали при добавлении растворимого Fab.

Скрининг кристаллизации проводили для Fab D25 и AM22, отдельно или в комплексе с RSV F(+) Fd. Данные рентгенодиффракции до разрешения 1,6 Å получали для шестиугольных кристаллов Fab D25 отдельно, и структуру решали путем молекулярного замещения и уточняли до R_cryst/R_free 24,5/25,7% (таблица 9). Данные до разрешения 3,6 Å получали на кубических кристаллах Fab D25 в комплексе с RSV F (+) Fd, и эту структуру решали путем молекулярного замещения с использованием несвязанной структуры D25 и частей ранее определенной образующейся после слияния структуры F RSV (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)) в качестве моделей для поиска, вместе с данными для производного золота. Структуру комплекса уточняли до R_cryst/R_free 21,3/26,7% (фиг.1C) (таблица 9).

Комплекс одного Fab D25, связанного с одной молекулой гликопротеина F RSV, присутствовал в асимметричном элементе кубической решетки. Тройная симметрия решетки вмещала два других комплекса D25-RSV F для формирования обширной тримерной поверхности контакта F RSV, составляющей 2,098 Ų. Непрерывную электронную плотность наблюдали для остатков с 26 по 513, за исключением остатков 98-136, которые включали фрагмент из 27 аминокислот, удаленный путем протеолитического расщепления предшественника F₀ для формирования субъединиц F₂ и F₁ (соответствующих N- и C-концевым фрагментам, соответственно) зрелого гликопротеина F. В электронной плотности было обнаружено три участка N-связанного гликозилирования в остатках аспарагина 27, 70 и 500 (фиг.2A).

В целом связанная с D25 структура F RSV состоит из двух долей, упакованных либо на конце незамкнутого антипараллельного бочонка из 7 цепей, две цепи которого (β2 и β7) располагаются между двумя долями, образующими водородную связь свыше 70 Å и образующими интегральные участки обеих долей и центрального бочонка. Проксимальная относительно мембраны доля, которая содержит N-конец F₂ и C-конец F₁, состоит из трехслойного β-сэндвича и трех спиралей (α8, α9 и α10). Спираль α10 образует часть спирали, которая, как оказалось, проходит в вирусную мембрану и к которой присоединен домен тримеризации. Дистальная относительно мембраны доля, находящаяся на расстоянии приблизительно 90 Å от вирусной мембраны, состоит из семи спиралей, упакованных вокруг трехцепочечного антипараллельного слоя, и β-шпильки (β3+β4). Обширные контакты между протомерами, как оказалось, стабилизируют тримерную структуру, в частности, гидрофобный N-конец субъединицы F₁ (также известный как пептид слияния), который поддерживается тройным β-сэндвичем из проксимальной относительно мембраны доли соседнего протомера. Слитый пептид, содержащийся в остальных случаях в полой полости тримера, соединен с экспонированными на поверхности спиралями α2 и α3 через цилиндрическое отверстие между протомерами, которое имеет диаметр приблизительно 10 Å; это отверстие может использоваться в качестве пути выхода для пептида слияния в процессе запуска.

Структура связанного с D25 гликопротеина F напоминала предшествующую слиянию структуру родственного гликопротеина F вируса парагриппа 5 (PIV5) (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 16672 (2012); Yin et al., Nature, 439, 38 (2006)) (фиг.6 и 7). Связанная с D25 форма F RSV, таким образом, оказалась находящейся в предшествующей слиянию конформации (фиг.2). Для определения структурных перестроек между F в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации, связанную с D25 форму F RSV сравнивали с образующейся после слияния конформацией, которая была определена недавно (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011).

Предшествующая слиянию и образующаяся после слияния конформации F RSV выявили значительные изменения общей формы из относительно компактной структуры овальной формы с высотой 110 Å в вытянутый конус, приблизительно на 50% более длинный (170 Å) (фиг.2A). Несмотря на это значительное изменение конформации, большая часть вторичной и третичной структуры гликопротеина F сохранялась как в предшествующем слиянию, так и в образующемся после слияния состояниях, причем 215 остатков демонстрировали отклонение Cα менее 2 Å между двумя структурами (фиг.2A,B). Встречаются две области поразительного изменения конформации. В дистальной относительно мембраны доле пептид слияния и пять элементов вторичной структуры (α2, α3, β3, β4 и α4) связаны с α5-спиралью с образованием одноцепочечной образующейся после слияния спирали (α5_post) длиной более 100 Å, накрытой на ее N-конце пептидом слияния (для ясности, элементы вторичной структуры образующейся после слияния структуры обозначены с использованием подстрочного индекса "post"). В проксимальной относительно мембраны доле единственная параллельная цепь (β22) тройного β-сэндвича - которая в предшествующей слиянию структуре образует водородные связи с β1 - разворачивается, позволяя предшествующей слиянию α10-спирали связываться со спиралью α5_post. Вместе спирали α5_post и α10_post помещают рядом N- и C-концы F₁ с образованием двухспиральной структуры, характерной для белков слияния типа I в их образующейся после слияния конформации (Colman and Lawrence, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 309 (2003)). В целом, участки спирали α10 смещаются более чем на 170 Å между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями.

По сравнению с ранее описанными расщепленными протеазой структурами типа I в предшествующей слиянию конформации для гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., Nature, 289, 366 (1981)), GP вируса Эбола (Lee et al., Nature, 454, 177 (2008)) и F PIV5 (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 16672 (2012)), положение пептида слияния RSV является наиболее сходным с положением пептида слияния гемагглютинина (фиг.7), что является неожиданным, учитывая, что оба из PIV5 и RSV являются парамиксовирусами. Пептид слияния F RSV погружен в центр полой полости тримера и расположен на расстоянии более 40 Å от последнего видимого остатка F₂. Это указывает на то, что происходит значительная структурная перестройка пептида слияния после расщепления F₀ фурин-подобной протеазой хозяина с образованием F₁/F₂. Кроме того, значительные структурные перестройки происходят между конформациями до слияния и после слияния как в проксимальной относительно мембраны, так и в дистальной относительно мембраны долях, что обеспечивает понимание трудности стабилизации предшествующей слиянию конформации F RSV. В отличие от F PIV5 и F метапневмовируса человека, которые могут быть стабилизированы в предшествующем слиянию состоянии только путем присоединения мотива тримеризации GCN4 к C-концу (Yin et al., Nature, 439, 38 (2006); Wen et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 19, 461 (2012)), предшествующая слиянию конформация F RSV требует стабилизации как проксимальной относительно мембраны доли (которая осуществляется путем присоединения домена тримеризации фибритина (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)), так и дистальной относительно мембран доли (которая происходит при связывании антителом D25).

Антитело D25 распознает дистальную относительно мембраны вершину гликопротеина F RSV (фиг.1C). Оно связывается с четвертичным эпитопом, причем тяжелая цепь D25 взаимодействует с одним протомером (вовлекающим 638 Ų погруженной взаимодействующей площади поверхности на RSV), и легкая цепь D25 связывается как с тем же протомером (373 Ų), так и с соседним протомером (112 Ų) (фиг.3A). Контакты с F RSV осуществляются посредством 5 из 6 определяющих комплементарность петель D25, причем 3-я CDR тяжелой цепи (CDR H3) взаимодействует с α4-спиралью (остатки 196-210 F₁) и образует межмолекулярные водородные связи с остатками 63, 65, 66 и 68 F₂ в петле между цепью β2 и спиралью α1. В то время как вторичные структурные элементы эпитопа D25 остаются по большей части неизмененными, их относительная ориентация существенно изменяется, причем α4-спираль вращается на ~180° относительно цепи β2 в предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациях (фиг.3B). Эта структурная перестройка поясняет отсутствие связывания D25 с молекулой F в образующейся после слияния конформации и указывает на то, что D25 ингибирует слияние мембран путем стабилизации предшествующей слиянию конформации тримерного комплекса гликопротеина F. Хотя белки F из RSV подтипов A и B являются высокородственными по последовательности (447/472 или 94,7% аминокислот, составляющих зрелый эктодомен F₂/F₁, являются идентичными между известными подтипами), шесть наблюдаемых в природе положений варьирования последовательности RSV (остатки 67 и 74 в F₂, и остатки 200, 201, 209 и 213 в F₁) располагаются в области, связываемой D25 (фиг.3C). Аналогично, из 56 аминокислот в F бычьего RSV, которые не являются идентичными зрелому эктодомену F RSV подтипа A человека, 13 находятся именно в этой области (фиг.3C). Таким образом, эпитоп D25 на вершине предшествующей слиянию структуры F RSV может находиться под иммунным давлением и может служить в качестве детерминанты специфического для подтипа иммунитета (Chambers et al., J. Gen. Virol., 73, 1717 (1992)). Например, исходя из анализа последовательностей, было предположено, что в семействе Paramyxoviridae существует область петли в гликопротеинах F, которая может находиться под иммунным давлением (Chambers et al., J. Gen. Virol., 73, 1717 (1992)). Было продемонстрировано, что связывание специфических для подгруппы RSV моноклональных антител может нарушаться сайт-направленными мутациями между остатками 200 и 216 F1 (Connor et al., J. Med. Virol., 63, 168 (2001)), и что пептид, содержащий остатки 205-225 F1, может индуцировать нейтрализующую активность у кроликов, хотя конкретный эпитоп не был определен (Corvaisier et al., Arch. Virol., 142, 1073 (1997)).

Для понимания взаимосвязи эпитопа D25 и эпитопов, распознаваемых другими нейтрализующими антителами против RSV, была исследована конкуренция за связывание D25 с инфицированными RSV клетками (фиг.4A). Примечательно, что AM22 конкурировало с за связывание F RSV, что указывает на то, что они распознавали тот же антигенный участок. Для дальнейшего определения участка, распознаваемого этими антителами, проводили EM с отрицательным окрашиванием для комплексов Fab-F RSV. Изображения EM для комплексов Fab D25-F RSV напоминали кристаллическую структуру Fab D25-F RSV, а также изображения EM для Fab AM22-RSV F (фиг.4B). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что антитела D25 и AM22 распознают один и тот же или высокородственный антигенный участок, который был назван "антигенным участком ∅".

Для охарактеризации антител, которые распознают антигенный участок ∅, исследовали их функциональные свойства. В дополнение к их необычайной эффективности и специфичности к предшествующей слиянию конформации (фиг.1A), все три антитела строго ингибировали слияние при добавлении после присоединения (фиг.4C), и все три из них были неспособны блокировать прикрепление к клеточной поверхности (фиг.4D), что указывает на то, что рецептор F RSV связывался с областью на F, которая не блокировалась этим тремя антителами. Связывающий рецептор домен на родственном белке F метапневмовируса человека представляет собой мотив RGD (Cseke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 1566 (2009)), который соответствует остаткам 361-363F RSV, которые находятся на вершине петли центрального бочонка, на стороне предшествующего слиянию тримера F RSV, не блокированной связыванием D25. Хотя эти антитела не предотвращают присоединения, известно, что области как F₂, так F₁, содержащие антигенный участок ∅, вносят вклад в связывание гепарина (Feldman et al., J. Virol., 74, 6442 (2000); Crim et al., J. Virol., 81, 261 (2007)), и является возможным, что эта область может участвовать в неспецифическом связывании с частями гепаринсульфата на гликозаминогликанах совместно с гликопротеином G и другими областями F. Наконец, антитела AM22 и D25 имели сходную нейтрализацию как в контексте Fab, так и в контексте иммуноглобулина (фиг.8), что указывает на то, что авидность не играла доминирующую роль, как в случае некоторых антител против вируса гриппа (Ekiert et al., Nature, 489, 526 (2012)). В целом, общая специфичность связывания и фенотипы нейтрализации у D25 и AM22 указывают на то, что эти свойства могут быть характеристиками антител, которые распознают антигенный участок ∅. Напротив, ни одно из антител, которые распознают другие антигенные участки на F RSV, ассоциированные с нейтрализующей активностью (участки I, II и IV) не обладает общими свойствами эффективности нейтрализации и специфичности к F в предшествующей слиянию конформации (фиг.9A-9B).

Несмотря на то, что антигенный участок ∅ частично экранирован от иммунного распознавания множеством механизмов, включающих конформационную маскировку (он присутствует только в метастабильном предшествующем слиянию состоянии), четвертичную сборку (участок является общим для протомеров RSV), антигенную вариацию (он является одной из наиболее вариабельных областей F RSV) и экранирование гликаном (N-связанный гликан, присоединенный к Asn70, находится сверху предшествующего слиянию тримера F), все три антитела, специфичных к предшествующей слиянию конформации, по-видимому, нацелены на сходные эпитопы. Положение антигенного участка ∅ на вершине предшествующего слиянию тримера F должно быть хорошо доступным даже на скученной поверхности вириона, что может пояснить наблюдение, что основная нейтрализующая активность в сыворотке человека, индуцированная природной инфекцией RSV, направлена против предшествующей слиянию формы RSV F (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 3089 (2012), хотя другие предшествующие слиянию-специфические антигенные участки не могут быть исключены. Высокая эффективность антител против антигенного участка ∅ указывает на то, что они могут быть разработаны для пассивной профилактики индуцируемого RSV заболевания у новорожденных. Также индукции вакциной антител, специфичных к предшествующей слиянию конформации, может способствовать стабилизация предшествующий слиянию формы F RSV, возможно облегчаемая связыванием подвижной и неподвижной частей структуры F посредством конструирования на основе структуры вариантов F RSV с дисульфидными связями. Следует отметить, что F, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации, содержит все из ранее охарактеризованных нейтрализующих эпитопов, а также антигенный участок ∅. Определение структуры F D25-RSV, таким образом, обеспечивает основу для множества новых подходов для предупреждения индуцируемого RSV заболевания.

Материалы и способы

Вирусы и клетки. Исходныекультуры вируса получали и поддерживали, как описано ранее (Graham et al., J. Med. Virol., 26, 153 (1988)). RSV, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), RSV-GFP, конструировали, как описано ранее (Hallak et al., Virology. 271, 264 (2000)). Титр исходной культуры RSV-GFP, использованных для нейтрализации на основе проточной цитометрии и анализов слияния, составил 2,5×10⁷ б.о.е./мл. Титр исходной культуры RSV A2, использованной для анализа связывания, составил 1,02×10⁸ б.о.е./мл. Клетки HEp-2 поддерживали в минимальной поддерживающей среде Игла, содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (10% EMEM), и их дополняли глутамином, пенициллином и стрептомицином.

Получение плазмид, экспрессирующих антитела. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител, подвергали кодон-оптимизации для экспрессии у человека и синтезировали. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей AM22 и D25 субклонировали в экспрессирующие плазмиды pVRC8400, содержавшие константные домены в рамке считывания (IgG1 для тяжелой цепи и каппа для легкой цепи). Варианты экспрессирующих плазмид для тяжелой цепи AM22 и D25 получали путем встраивания либо участка расщепления протеазой HRV3C (GLEVLFQGP; SEQ ID NO: 355), либо стоп-кодона в шарнирную область.

Экспрессия и очистка антител и Fab-фрагментов. Антитела экспрессировали посредством временной совместной трансфекции плазмид тяжелой и легкой цепей в клетки HEK293F в суспензии при 37°C в течение 4-5 суток. Клеточные супернатанты пропускали над агарозой с белком A и связанные антитела промывали PBS и элюировали буфером для элюирования IgG в 1/10 объема 1 M Tris-HCl pH 8,0. Fab AM22 и D25 получали путем расщепления IgG посредством Lys-C. Расщепление ингибировали добавлением таблеток коктейля полных ингибиторов протеаз, и смеси Fab и Fc пропускали над агарозой с белком A для удаления Fc-фрагментов. Fab, который проходил через колонку, далее очищали эксклюзионной хроматографией.

Анализы нейтрализации RSV. Опосредуемую антителом нейтрализацию измеряли с использованием проточно-цитометрического анализа нейтрализации (Chen et al., J. Immunol. Methods, 362, 180 (2010). В кратком изложении, клетки HEp-2 инфицировали посредством RSV-GFP и мониторинг инфекции проточной цитометрией проводили в качестве функции экспрессии GFP через 18 часов после инфицирования. Данные анализировали посредством аппроксимации кривой и нелинейной регрессии (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego CA).

Анализ связывания образующегося после слияния F RSV. Очищенный растворимый белок F RSVв образующейся после слияния конформации получали, как описано в (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011). Для исследования связывания моноклональных антител с образующимся после слияния F RSV использовали кинетический ELISA, как описано ранее (McLellan et al., J. Mol. Biol., 409, 853 (2011). В кратком изложении, 96-луночные покрытые Ni²⁺-NTA планшеты (ThermoFisher Scientific) покрывали 100 мкл образующегося после слияния F RSV (1 мкг/мл) в течение одного часа при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного антитела и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Связанные антитела обнаруживали путем инкубации планшетов с 100 мкл конъюгированного с HRP антитела козы против IgG мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) или конъюгированного с HRP антитела против IgG человека (Santa Cruz Biolotechnology, Inc, Santa Cruz, CA) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата Super AquaBlue ELISA (eBioscience, San Diego CA) и планшеты сразу считывали с использованием устройства для считывания микропланшетов Dynex Technologies при 405 нм (Chantilly, VA). Между стадиями планшеты промывали PBS-T.

Сбор данных кристаллизации и рентгеноструктурных данных для несвязанного Fab D25. Скрининг условий кристаллизации проводили с использованием робота для кристаллизации Cartesian Honeybee, и первоначальные кристаллы выращивали способом диффузии пара в сидячих каплях при 20°C путем смешения 0,2 мкл Fab D25 с 0,2 мкл резервуарного раствора (22% (масс./об.) PEG 4000, 0,1 M ацетат натрия pH 4,6). Кристаллы вручную воспроизводили в висячих каплях путем комбинирования белка и резервуарного раствора в соотношении 2:1. Кристаллы быстро замораживали в жидком азоте в 27,5% (масс./об.) PEG 4000, 0,1 M ацетате натрия pH 4,5, и 15% (об./об.) 2R,3R-бутандиоле. Данные рентгенодиффракции до 1,6 Å получали при длине волны 1,00 Å на линии пучка SER-CAT beamline ID-22 (Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory).

Определение и уточнение структуры несвязанного Fab D25. Данные рентгенодиффракции интегрировали и масштабировали с помощью пакета программ HKL2000 (Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. (Academic Press, vol. 276, pp. 307-326, 1997)), и решение для молекулярного замещения с использованием доменов Ig из PDB ID: 3GBM (Ekiert et al., Science, 324, 246 (2009)) и 3IDX (Chen et al., Science, 326, 1123 (2009)) в качестве моделей для поиска получали с использованием PHASER (McCoy et al., J. Appl. Crystallogr., 40, 658 (2007)). Ручное построение модели проводили с использованием COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486 (2010)) и уточнения индивидуальных участков, параметров TLS и индивидуальных B-факторов проводили в PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213 (2010)). Электронная плотность для вариабельных доменов D25 была превосходной, однако электронная плотность для константных доменов была недостаточной, возможно в результате подвижности угла изгиба. Получение конечных данных и статистика уточнения представлены в таблице 8.

Экспрессия и очистка RSV F(+) Fd в комплексе с Fab D25. Конструкция белка RSV F (+) Fd происходила из штамма A2 (номер доступа P03420) с тремя встречающимися в природе заменами (P102A, I379V и M447V) для усиления экспрессии. Кодон-оптимизированный ген млекопитающих, кодирующий остатки 1-513 F RSV с C-концевым доменом тримеризации фибритина T4 (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)), участком расщепления тромбином, 6x His-меткой и StreptagII синтезировали и субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, происходящий из pLEXm (Aricescu et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62, 1243 (2006)). Плазмиды, экспрессирующие RSV F(+) Fd, легкую цепь D25 и тяжелую цепь D25 (со стоп-кодоном в шарнирой области или без него) одноверменно трансфицировали в клетки HEK293 GnTI^-/- (Reeves et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 13419 (2002)) в суспензии. Альтернативно можно было трансфицировать только плазмиду RSV F(+) Fd с добавлением очищенного Fab D25 к клеткам GnTI^-/- через 3 часа после трансфекции. Через 4-5 суток клеточный супернатант собирали, центрифугировали, фильтровали и концентрировали. Комплекс первоначально очищали с помощью смолы Ni²⁺-NTA (Qiagen, Valencia, CA) с использованием буфера для элюирования, состоящего из 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 250 мМ имидазола pH 8,0. Затем комплекс концентрировали и далее очищали на смоле StrepTactin в соответствии с инструкциями изготовителя (Novagen, Darmstadt, Germany). После инкубации в течение ночи с протеазой тромбином (Novagen) для удаления His-меток и Strep-меток, к комплексу добавляли избыток Fab D25, а затем его очищали на колонке для гель-фильтрации Superose6 (GE Healthcare) с подвижным буфером 2 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 350 мМ NaCl и 0,02% NaN₃. Элюированный комплекс разбавляли равным объемом воды и концентрировали до ~5 мг/мл. Сходные методики использовали для экспрессии и очистки комплексов Fab AM22.

Кристаллизация и получение данных рентгеноструктурного анализа для RSV F(+) Fd в комплексе с Fab D25. Исходные кристаллы выращивали способом диффузии пара в сидячих каплях при 20°C путем смешения 0,1 мкл RSV F(+) Fd, связанного с Fab D25, с 0,1 мкл резервуарного раствора (40% (масс./об.) PEG 400, 5% (масс./об.) PEG 3350 и 0,1 M ацетат натрия, pH 5,5) (Majeed et al., Structure, 11, 1061 (2003)). Кристаллы воспроизводили вручную в висячих каплях и кристалл, который дифрагировал до 3,6 Å, выращивали с использованием резервуарного раствора, содержавшего 30% (масс./об.) PEG 400, 3,75% (масс./об.) PEG 3350, 0,1 M HEPES pH 7,5, и 1% (об./об.) 1,2-бутандиол. Кристалл сразу переносили из капли в Cryostream, и данные рентгенодиффракции получали удаленно при длине волны 1,00 Å на линии пучка SER-CAT beamline ID-22.

Определение и уточнение структуры RSV F(+)Fd в комплексе с Fab D25. Данныерентгенодиффракции интегрировали и масштабировали с использованием пакета программ HKL2000 (Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. (Academic Press, vol. 276, pp. 307-326, 1997)), и решение для молекулярного замещения получали с помощью PHASER (McCoy et al., J. Appl. Crystallogr., 40, 658 (2007)) с использованием несвязанной структуры Fab D25 и остатков 29-42, 49-60, 78-98, 219-306, 313-322, 333-343 и 376-459 из образующейся после слияния структуры F RSV (PDB ID: 3RRR, McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011)) в качестве моделей для поиска. Шесть участков из производного NaAuCl₄ картировались на известных реактивных боковых цепях (остатки F Met97/His159, Met264/Met274, His317 и Met396; остатки тяжелой цепи D25 Met19/His82 и His 59). Ручное построение модели проводили с использованием COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486 (2010)), причем сначала проводили построение вторичных структурных элементов. Уточнение индивидуальных участков, параметров TLS и индивидуальных B-факторов проводили в PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213 (2010)) с использованием структуры несвязанного Fab D25 и структуры участков образующейся после слияния F RSV в качестве эталонных моделей в процессе уточнения. Проводили построение всех остатков F RSV в зрелом белке за исключением остатков в F₂, являющихся C-концевыми для Met97. Получение конечных данных и статистика уточнения представлены в таблице 9.

Конкурентный анализ связывания F RSV. Конкурентное связывание антител проводили на клетках HEp-2, инфицированных RSV. Клетки HEp-2 инфицировали посредством 3 MOI (множественность инфицирования) RSV в течение 18-20 часов. После инфицирования клетки разделяли с использованием раствора для диссоциации клеток (Cellstripper, Mediatech Inc., Herndon, VA), и промывали посредством PBS. Клетки высевали в количестве 5×10⁴/лунка в 96-луночных планшетах с U-образным дном в PBS. Моноклональные антитела AM22, D25 и 101F разбавляли, начиная с концентрации 100 мкг/мл, и добавляли к клеткам HEp-2. Через 30 минут добавляли 100 мкл D25, конъюгированного с Alexa 488, в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали при 4°C в течение одного часа. Клетки промывали один раз PBS, а затем фиксировали 0,5% параформальдегидом. Связывание D25-Alexa 488 на клетках измеряли с использованием проточной цитометрии (LSR II instrument, Becton Dickinson, San Jose, CA). Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo версии 8.5 (Tree Star, San Carlos, CA).

Анализ с использованием электронной микроскопии с негативным окрашиванием. Образцы адсорбировали на свежие покрытые углем решетки после тлеющего разряда, промывали кратковременно водой и окрашивали свежеприготовленным 0,75% уранилформиатом. Изображения регистрировали на микроскопе FEI T20 с камерой Eagle CCD. Анализ изображений и 2D-усреднение проводили с использованием Bsoft (Heymann and Belnap, J. Struct. Biol., 157, 3 (2007) и EMAN (Ludtke et al., J. Struct. Biol., 128, 82 (1999)).

Анализ ингибирования слияния вируса RSV с клеткой. Способность антител ингибировать слияние вируса RSV с клеткой измеряли, как описано ранее (McLellan et al., J. Virol., 84, 12236 (2010)). В кратком изложении, клетки HEp-2 высевали в 96-луночные планшеты, культивировали в течение 24 часов при 37°C, а затем охлаждали при 4°C в течение одного часа перед анализом. К предварительно охлажденным клеткам добавляли RSV-GFP при 4°C, а затем клетки промывали холодным PBS для удаления несвязанного вируса. К охлажденным клеткам добавляли серийно разбавленные антитела и инкубировали в течение 1 часа при 4°C перед переносом в условия 37°C на 18 часов. После инкубации клетки трипсинизировали, фиксировали в 0,5% параформальдегиде и анализировали проточной цитометрией для определения частоты экспрессирующих GFP клеток.

Анализ ингибирования прикрепления RSV. Способность антител ингибировать прикрепление RSV к клеткам измеряли, как описано ранее (McLellan et al., J. Virol., 84, 12236 (2010)). В кратком изложении, клетки HEp-2 диспергировали в среде, промывали холодным PBS, высевали в 96-луночные планшеты с v-образным дном и охлаждали в течение 1 часа при 4°C перед применением. Антитела и гепарин, известный ингибитор прикрепления RSV, распределяли в серийных разведениях, затем смешивали с вирусом RSV штамма A2 в течение одного часа при 37°C. Среду охлажденных клеток удаляли после центрифугирования и к охлажденным клеткам добавляли вирус или смеси вирусов и реагенты и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. После инкубации клетки промывали холодным PBS для удаления несвязанного вируса и фиксировали 0,5% параформальдегидом. Вирус, связанный с клетками, выявляли с использованием конъюгированного с FITC антитела козы против RSV. Клетки промывали холодным PBS и оценивали проточной цитометрией. Среднюю интенсивность флуоресценции связанного вируса анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo версии 8.5 (Tree Star, San Carlos, CA).

Пример 2

Стабилизация белков F RSV

Этот пример демонстрирует конструкцию иллюстративных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации. Кристаллическая структура белка F RSV в комплексе с Fab D25 (т.е. в предшествующей слиянию конформации) по сравнению со структурой образующегося после слияния белка F RSV (описанного, например, в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, с координатами, депонированными в качестве номера доступа PDB № 3RRR) демонстрирует структурные перестройки между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями как в проксимальной относительно мембраны доле, так и в дистальной относительно мембраны доле, что обеспечивает руководство по стабилизации предшествующей слиянию конформации F RSV. Исходя из сравнения структур F RSV в предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациях существует две области, которые претерпевают крупные конформационные изменения, расположенные на N- и C-концах субъединицы F₁. Например, как проиллюстрировано на фиг.2, положения 137-216 и 461-513 полипептида F₁претерпевают структурную перестройку между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями белка F, в то время как положения 271-460 полипептида F₁остаются относительно неизмененными. Этот пример иллюстрирует несколько стратегий стабилизации белка F RSV в его предшествующей слиянию конформации.

Для стабилизации N-концевой области F₁, которая является компонентом антигенного участка ∅ и вовлечена в связывание антитела D25, были разработаны различные стратегии, включая внесение дисульфидных связей внутри протомера, дисульфидных связей между протомерами, заполняющих полость аминокислотных замен, переупаковывающих замен, внесение участков N-связанного гликозилирования и их комбинации.

Дисульфидные связи внутри протомера

Внесение двух остатков цистеина, которые находятся на достаточно близком расстоянии для формирования дисульфидной связи внутри протомера в предшествующей слиянию, но не в образующиеся после слияния, конформации может фиксировать белок F в предшествующей слиянию конформации. Дисульфидная связь между протомерами может образовываться в одном протомере F₂/F₁ в тримере, и, таким образом, она не сшивает три протомера вместе. В частности, дисульфидная связь, образовавшаяся между областью, которая изменяет конформацию, и областью, которая не изменяет конформацию в предшествующей слиянию и образующейся после слияния структурах, должна фиксировать белок в предшествующей слиянию конформации. Одним примером является мутант S155C/S290C, где Ser155 расположен в области, которая изменяет конформацию, в то время как Ser290 расположен в области, которая не изменяет конформацию. Кроме того, образование дисульфидной связи между двумя областями, обе из которых изменяют конформацию, такой как между двумя остатками, расположенными в положениях 137-216 F₁, или между двумя остатками, расположенными в положениях 461-513 F₁, или между одним остатком в положениях 137-216 F₁и вторым остатком в положениях 461-513 F₁, также может быть достаточным для фиксации белка в предшествующей слиянию конформации.

С использованием способов, описанных выше, было определено несколько пар остатков белка F RSV, находящихся достаточно близко в предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации, для формирования дисульфидной связи внутри протомера, если остатки цистеина внесены в соответствующие положения пар остатков. Эти пары остатков, а также соответствующие аминокислотные замены SEQ ID NO: 1, необходимые для внесения остатков цистеина в эти положения, указаны в таблице 10. В таблице 10 также приведена SEQ ID NO, содержащая указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид F₀, включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Межмолекулярные дисульфидные связи

Внесение двух остатков цистеина, которые находятся на достаточно близком расстоянии для формирования дисульфидной связи между протомерами в предшествующей слиянию, но не в образующейся после слияния, конформации может фиксировать белок F в предшествующей слиянию конформации. Дисульфидная связь между протомерами образуется между соседними протомерами в тримере, и, таким образом, сшивает три протомера вместе. В частности, дисульфид связь, образовавшаяся между областью, которая изменяет конформацию, и областью, которая не изменяет конформацию в предшествующей слиянию и образующейся после слияния структурах должна замыкать белок в предшествующей слиянию конформации. Одним примером является мутант A153C/K461C, где Ala153 расположен в области, которая изменяет конформацию, в то время как Lys461 расположен в области, которая не изменяет конформацию. Кроме того, образование дисульфидной связи между двумя областями, обе из которых изменяют конформацию, такой как между двумя остатками, расположенными в положениях 137-216 F₁, или между двумя остатками, расположенными в положениях 461-513 F₁, или одним остатком в положениях 137-216 F₁и вторым остатком в положениях 461-513 F₁, также может быть достаточным для фиксации белка в предшествующей слиянию конформации.

С использованием способов, описанных выше, было определено, что несколько пар остатков белка F RSV находятся достаточно близко в предшествующей слиянию конформации, но не в образующейся после слияния конформации, для формирования дисульфидной связи между протомерами, если остатки цистеина внесены в соответствующие положения пар остатков. Эти пары остатков, а также соответствующие аминокислотные замены, необходимые для внесения остатков цистеина в эти положения, представлены в таблице 11. В таблице 11 также приведена SEQ ID NO, содержащая указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Кроме того, множество стабилизирующих мутаций, описанных в настоящем описании, можно комбинировать для получения антигена PreF, содержащего более одной стабилизирующей мутации. Примеры таких конструкций, содержащих первую и вторую пары остатков, которые образуют дисульфидную связь внутри протомера или между протомерами, представлены в таблице 12. В таблице 12 также приведена SEQ ID NO, содержащая указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Кроме того, аминокислоты могут быть встроены (или удалены) в последовательности белка F для корректирования размещения остатков в структуре белка F, так чтобы конкретная пара остатков была на достаточно близком расстоянии для формирования дисульфидной связи внутри протомера или между протомерами в предшествующей слиянию, но не в образующейся после слияния, конфомрации, которая, как рассмотрено выше, будет стабилизировать белок F в предшествующей слиянию конформации. Примеры таких конструкций, содержащих первую и вторую пары остатков, которые образуют дисульфидную связь внутри протомера или между протомерами, представлены в таблице 13. В таблице 13 также приведена SEQ ID NO, содержащая указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Заполняющие полость замены

Сравнение кристаллической структуры белка F RSV в комплексе с Fab D25 (т.е. в предшествующей слиянию конформации) по сравнению со структурой образующегося после слияния белка F RSV (описанной, например, в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011; структурные координаты белка F RSV в его образующейся после слияния конформации депонированы в Protein Data Bank (PDB) в качестве номера доступа PDB № 3RRR) идентифицирует несколько внутренних полостей или карманов в предшествующей слиянию конформации, которые должны сокращаться в F для перехода в образующуюся после слияния конформацию. Эти полости приведены в таблице 14. Таким образом, заполнение этих внутренних полостей F стабилизирует предшествующее слиянию состояние путем препятствования переходу в образующуюся после слияния конформацию. Полости заполнят путем замены аминокислотами с более крупными боковыми цепями аминокислот с небольшими боковыми цепями. Полости могут представлять собой полости внутри протомера или полости между протомерами. Одним примером заполняющей полость модификации F RSV для стабилизации белка RSV в его предшествующей слиянию конформации является мутант S190F/V207L.

С использованием этой стратегии было идентифицировано несколько заполняющих полость модификаций для стабилизации белка F RSV в его предшествующей слиянию конформации. Эти модификации указаны в таблице 14. В таблице 14 также приведены SEQ ID NO, содержащие указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Указанные полости обозначают посредством небольшого остатка, находящегося в полости, которые могут быть подвергнуты мутации на более крупный остаток для заполнения полости. Будет понятно, что в другие остатки (помимо остатков, по которым названа полость) также можно вносить мутацию для заполнения указанной полости.

Переупаковывающие замены

Кроме того, предшествующую слиянию конформацию белка F RSV можно стабилизировать путем усиления взаимодействий соседних остатков, например, путем усиления гидрофобных взаимодействий или образования водородных связей. Кроме того, предшествующая слиянию конформация белка F RSV может быть стабилизирована путем уменьшения неблагоприятных или отталкивающих взаимодействий соседних остатков, которые приводят к метастабильности предшествующей слиянию конформации. Это можно осуществлять путем устранения кластеров сходным образом заряженных остатков. Примеры таких модификаций указаны в таблице 15. В таблице 15 также приведены SEQ ID NO, содержащие указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Мутации гликозилирования

Кроме того, внесение участков N-связанного гликозилирования, которые являются доступными для растворителя в предшествующей слиянию конформации F RSV, но недоступными для растворителя в образующейся после слияния конформации F RSV, может стабилизировать F RSV в предшествующем слиянию состоянии путем предотвращения принятия образующегося после слияния состояния. Для создания участка N-связанного гликозилирования можно вносить последовательность Asn-X-Ser/Thr (где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением Pro). Это можно осуществлять путем замены аминокислотами Ser/Thr двух остатков, находящихся с C-концевой стороны от нативного остатка Asn, или путем замены аминокислотой Asn двух остатков, находящихся с N-концевой стороны от нативного остатка Ser/Thr, или путем замены как остатком Asn, так и Ser/Thr, остатков, разделенных одной не являющейся пролином аминокислотой.

С использованием этой стратегии было идентифицировано несколько положений для участков N-связанного гликозилирования, которые являются доступными для растворителя в предшествующей слиянию конформации F RSV, но недоступными для растворителя в образующейся после слияния конформации F RSV. Эти модификации указаны в таблице 16. В таблице 16 также приведены SEQ ID NO, содержащие указанные замены, и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), домен тримеризации (домен Foldon) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))).

Пример 3

Стабилизация проксимальной относительно мембраны доли антигенов PreF

Как рассмотрено выше, кристаллическая структура белка F RSV в комплексе с Fab D25 (т.е. в предшествующей слиянию конформации) по сравнению со структурой образующегося после слияния белка F RSV ((описанного, например, в McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, с координатами, депонированными в качестве номера доступа PDB № 3RRR)) демонстрирует значительные структурные перестройки между предшествующей слиянию конформацией и образующейся после слияния конформацией в дистальной относительно мембраны доле. Исходя из сравнения структур F RSV в предшествующей слиянию конформации и образующейся после слияния конформации, существует две области, которые претерпевают крупные конформационные изменения, расположенные на N- и C-концах субъединицы F₁. Например, как проиллюстрировано на фиг.2, положения 137-216 и 461-513 полипептида F₁претерпевают структурную перестройку между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями белка F, где положения 271-460 полипептида F₁остаются относительно неизмененными. В этом примере иллюстрируется несколько стратегий стабилизации C-концевой области F₁, которая включает проксимальную относительно мембраны долю белка F RSV. Были идентифицированы различные стратегии, включая внесение домена тримеризации (как рассмотрено выше), внесение пар остатков цистеина, которые могут образовывать дисульфидную связь, которая стабилизирует C-концевую область F1, и внесение трансмембранного домена (например, для применений, включающих мембраносвязанный антиген PreF).

Дисульфидные связи

Одной стратегией для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F является внесение одной или нескольких замен на цистеин, которые вносят дисульфидную связь, которая стабилизирует C-концевую часть F₁(например, для применения, включающего растворимый антиген PreF). Такую стратегию можно комбинировать с любой из стабилизирующих модификаций, описанных в настоящем описании, например, с модификациями, описанными в примере 2, как например, белок F₁с заменами на цистеин S155C/S290C. Одна из стратегий включает внесение двух остатков цистеина, которые находятся на достаточно близком расстоянии для формирования дисульфидной связи между протомерами, которая связывает C-концевую область белка F₁в предшествующей слиянию конформации. Между соседними протомерами в тримере образуется дисульфидная связь, и, таким образом, она сшивает три протомера вместе. С использованием способов, описанных выше, было определено, что несколько пар остатков белка F RSV находятся достаточно близко в предшествующей слиянию конформации для формирования дисульфидной связи между протомерами, если остатки цистеина внести в соответствующие положения пар остатков.

Примеры замен на цистеин, которые можно вносить для образования дисульфидной связи, которая стабилизирует проксимальную относительно мембраны долю, включают замены на цистеин в парах остатков:

(a) 486 и 487

(b) 486 и 487; со вставкой P между положениями 486/487

(c) 512 и 513

(d) 493; вставка C между положениями 329/330

(e) 493; вставка C между 329/330, и вставка G между 492/493

Кроме того, длина полипептида F₁может варьировать в зависимости от положения пары C-концевых остатков цистеина. Например, полипептид F₁может включать положения 137-481, которые устраняют спираль α10 из полипептида F₁.

Примеры конструкций, содержащих модификации, включающие остатки цистеина в этих парах остатков, а также дополнительное описание приведены в таблице 17. В таблице 17 также приведена SEQ ID NO, содержащая указанные замены и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(с различными положениями).

Трансмембранные домены

Другой стратегией для стабилизации проксимальной относительно мембраны доли белка F является включение трансмембранного домена белка F₁, например, для применения, включающего заякоренный на мембране антиген PreF. Например, присутствие трансмембранных последовательностей является пригодным для экспрессии в качестве трансмембранного белка для получения мембранной везикулы. Трансмембранный домен может быть связан с белком F₁, содержащим любую из стабилизирующих мутаций, описанных в настоящем описании, например, мутации, описанные в примере 2, как например, белок F₁с заменой на цистеин S155C/S290C. Кроме того, трансмембранный домен может быть связан с цитозольным хвостом F₁RSV. Примеры конструкций предшественника F₀, включающих сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(положения 137-513), трансмембранный домен RSV представлены в качестве SEQ ID NO: 323 (без цитозольного домена) и 324 (с цитозольным доменом).

Пример 4

Одноцепочечные антигены PreF

В этом примере проиллюстрированы рекомбинантные белки F RSV, которые лишены нативных участков расщепления фурином, так что протомер белка F образуется в качестве одной полипептидной цепи вместо гетеродимера F₂/F₁.

В таблице 18 приведены несколько одноцепочечных антигенов PreF, которые включают делецию положений 98-149 F, которая удаляет два участка расщепления фурином, полипептид pep27 и пептид слияния. Остальные участки полипептидов F₁и F₂связаны линкером. Кроме того, несколько стратегий можно использовать для стабилизации одноцепочечных конструкций в предшествующей слиянию конформации, включая применение стратегий, описанных в примерах 2 и 3, выше. В таблице 18 также приведена SEQ ID NO, содержащая указанные замены и соответствие конструкции предшественника F₀, также включающей сигнальный пептид, полипептид F₂(положения 26-109), полипептид pep27 (положения 110-136), полипептид F₁(с варьирующими положениями).

Пример 5

Белок F RSV, стабилизированный дисульфидной связью и доменом тримеризации

В данном примере проиллюстрировано получение белка F RSV, стабилизированного дисульфидной связью и доменом тримеризации. Как проиллюстрировано на фиг.10, остатки серина в положениях 155 и 290 (указанные стрелками и выделением красным цветом на ленточных диаграммах) являются соседними в предшествующей слиянию конформации белок F RSV, но не в образующейся после слияния конформации белка F RSV. Кроме того, боковые цепи этих остатков ориентированы в направлении друг к другу. Однако боковые цепи остатков, соседних с серином 155, валином 154 и лизином 156, ориентированы в направлении от боковой цепи серина 290. Ввиду этих данных конструировали рекомбинантный белок F RSV с заменами S155C и S290C. Ожидалось, что остатки цистеина в этой конструкции 155/290 могут образовывать дисульфидную связь, которая фиксирует рекомбинантный белок F RSV в предшествующей слиянию конформации, но что включение остатков цистеина в положений 154 или 156 (вместо положения 155) не приводит к образованию стабилизирующей дисульфидной связи.

В молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую нативный полипептид F₀RSV, вносили мутацию с использованием стандартных способов молекулярной биологии для кодирования белка F RSV, называемого RSVF(+)FdTHS S155C, S290C, и он указан в качестве SEQ ID NO: 185:

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMCIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 185).

RSVF(+)FdTHS S155C, S290C включает сигнальный пептид (остатки 1-25), полипептид F₂(остатки 26-109), полипептид Pep27 (остатки (110-136), полипептид F₁(остатки 137-513), домен Foldon (остатки 514-544) и участок расщепления тромбином (LVPRGS (положения 547-552 SEQ ID NO: 185)) и метки для очистки (his-метка (HHHHHH (положения 553-558 SEQ ID NO: 185)) и Strep Tag II (SAWSHPQFEK (положения 559-568 SEQ ID NO: 185))). Также получали контрольные конструкции с заменами V154C или K156C вместо замены S155C. При экспрессии в клетках, RSVF(+)FdTHS S155C, S290C процессировался и экспрессировался в качестве стабильного и растворимого белка F RSV; однако контрольные конструкции с заменами 154/290 или 156/290 не экспрессировались (вероятно, они не сворачивались в растворимой конформации) (см. фиг.10).

Конструкцию RSVF(+)FdTHS S155C, S290C очищали и исследовали в отношении связывания антител, специфичных к предшествующей слиянию конформации, AM22 и D25, а также антитела 131-2a (которое связывает антигенный участок I, присутствующий в предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациях F RSV), мотавизумаба и паливизумаба (которые связывают антигенный участок II, присутствующий в предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациях F RSV) и антитела 101F (которое связывает антигенный участок IV, присутствующий в предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациях F RSV). Как показано на фиг. 11 (левый график), все из этих антител специфически связывались с очищенной конструкцией RSVF(+)FdTHS S155C, S290C, что указывает на то, что RSVF(+)FdTHS S155C, S290C сохраняет предшествующую слиянию конформацию. Кроме того, результаты указывают на то, что эта конструкция сохраняет антигенные участки I, II и IV, являющиеся общими как для предшествующей слиянию, так и для образующейся после слияния конформаций F RSV.

Чтобы продемонстрировать, что очищенный RSVF(+)FdTHS S155C, S290C имеет тримерную конформацию, эту конструкцию пропускали через эксклюзионную хроматографическую колонку. Как показано на фиг.11 (правые графики) препарат очищенного RSVF(+)FdTHS S155C, S290C элюировался в качестве единственного пика, соответствующего молекулярной массе тримерного белка F. Напротив, препарат контрольной конструкции, лишенной замен S155C и S290C, для которых ожидалось, что они не являются стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, элюировался во множестве пиков, что указывает на присутствие розеток и агрегатов инициированного белка F, что указывает на то, что эта контрольная конструкция не является стабильной в гомогенной предшествующей слиянию конформации.

Чтобы далее подтвердить, что конструкция RSVF(+)FdTHS S155C, S290C представляет собой стабилизированную в предшествующей слиянию конформацию, проводили исследования с использованием электронной микроскопии (фиг.12), и они демонстрируют, что RSVF(+)FdTHS S155C, S290C образует гомогенную совокупность структур с формой, сходной с формой предшествующей слиянию конформации F RSV, и значительно отличается от формы образующегося после слияния белка F (правое изображение, от Martin et al., J. Gen. Virol., 2006).

Проводили кристаллографические исследования, чтобы продемонстрировать, что очищенный RSVF(+)FdTHS S155C, S290C является гомогенным в растворе. Образование кристаллов в водном растворе является строгим критерием гомогенности белка в растворе. На фиг.15 представлены изображения кристаллов, образованных очищенным RSVF(+)FdTHS S155C, S290C в водном буфере, содержащем 0,2 M сульфат лития, 1,64 M тартрат Na/K и 0,1 M CHES, при pH 9,5. Образование кристаллов RSVF(+)FdTHS S155C, S290C в водном буфере демонстрирует, что этот белок является по существу гомогенным в растворе.

Пример 6

Индукция нейтрализующего иммунного ответа с использованием антигена PreF

Этот пример иллюстрирует применение антигена PreF для индукции нейтрализующего RSV иммунного ответа у индивидуума.

Свободных от патогена мышей CB6F1/J в возрасте восьми недель (Jackson Labs) разделяли на 5 групп по 10 в каждой, и иммунизировали с использованием следующих режимов:

1) живой RSV A2 (RSV) в количестве 5×10⁶ б.о.е. интраназально;

2) инактивированный формалином преципитированный на квасцах RSV(FI-RSV) внутримышечно (в/м);

3) стабилизированный предшествующий слиянию F RSV (RSVF(+)FdTHS S155C, S290C; предшествующий слиянию F) 20 мкг в поли-I:C 50 мкг, в/м;

4) образующийся после слияния тример F RSV ((образующийся после слияния RSV) 20 мкг в поли-I:C 50 мкг, в/м; и

Группу 1 (живой RSV) инфицировали один раз в момент времени 0, и все другие группы иммунизировали на 0 и 3 неделях. Сыворотку получали на 5 недели, через две недели после 2-ой в/м инъекции или через пять недель после инфицирования RSV. Нейтрализующую активность определяли следующим способом: сыворотки распределяли в качестве четырехкратных разведений от 1:10 до 1:40960, смешивали с равным объемом рекомбинантного mKate-RSV, экспрессирующего прототипные гены F либо из штамма A2 (подтип A) либо из штамма 18537 (подтип B) и флуоресцентный белок Katushka, и инкубировали при 37°C в течение одного часа. Далее, 50 мкл смеси каждого разведения сыворотки/вируса добавляли к клеткам HEp-2, которые были посеяны с плотностью 1,5×10⁴ в 30 мкл MEM (минимальная поддерживающая среда) в каждую лунку 384-луночных черных планшетов с оптическим дном, и инкубировали в течение 20-22 часов перед спектрофотометрическим анализом при Ex 588 нм и Em 635 нм (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089). IC50 для каждого образца вычисляли посредством аппроксимации кривой и нелинейной регрессии с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA). Величины P определяли с использованием T-критерия Стьюдента. Описанный выше способ измерения нейтрализации RSV проводили, по существу как описано ранее (см., например, Chen et al. J. Immunol. Methods., 362:180-184, 2010, включенную в настоящее описание в качестве ссылки), за исключением того, что считывание данных проводили с использованием флуоресцентного устройства для считывания планшетов вместо проточной цитометрии.

При использовании этого анализа, как правило, ответы антител свыше ~100 EC₅₀ считались защитными. Как показано на фиг.13 и 14, у мышей, которым вводили белок F RSV, стабилизированный в предшествующей слиянию конформации (RSV F (RSVF(+)FdTHS S155C, S290C) индуцировался нейтрализующий иммунный ответ на RSV A, в ~15 раз превышающий ответ, индуцируемый у мышей, которым вводили белок F RSV в образующейся после слияния конформации, и ответ на RSV B, в ~5 раз превышающий ответ, индуцируемый у мышей, которым вводили белок F RSV в образующейся после слияния конформации. На фиг.13 представлены результаты через 5 недель после первоначальной иммунизации, и на фиг.14 представлены результаты через 7 недель после иммунизации. Средние индуцируемые величины IC50 также представлены на фиг.13 и 14. Различие в нейтрализации между подгруппами A и B RSV не является неожиданным, поскольку конструкция RSVF(+)FdTHS S155C, S290C происходит из белка F из подгруппы A RSV. Ожидается, что иммунизация соответствующей конструкцией, происходящей из штамма B RSV, обеспечит нейтрализующие сыворотки, более специфичные к RSV B (см. фиг.41).

Кроме того, было показано, что стабилизированный предшествующий слиянию F может быть составлен в квасцах, а также в поли I:C и может сохранять иммуногенность, сообщаемую антительными ответами на антигенный участок ∅. Мышей BALB/c иммунизировали посредством 20 мкг версии DS S155C/S290C стабилизированного предшествующего слиянию F, происходящего из подтипа A, и составляли с квасцами (гель на основе гидроксида алюминия 10 мг/мл, Brenntag, Frederikssund, Denmark) или поли I:C. Мышам проводили инокуляцию на 0 и 3 неделях, и в момент времени 5 недель (через 2 недели после второй инъекции), получали сыворотку для анализов нейтрализации (см. фиг.42). Результаты показывают, что иммунизация белком F RSV, стабилизированным в предшествующей слиянию конформации, индуцирует защитный иммунный ответ на RSV.

Пример 7

Лечение индивидуумов описанными антигенами

В этом примере описаны способы, которые можно использовать для лечения индивидуума, или которые имеют инфекцию RSV или имеют риск наличия инфекции RSV, путем введения одного или нескольких из описанных антигенов PreF, или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген PreF. В конкретных примерах способ включает скрининг индивидуума, предположительно имеющего инфекцию RSV или имеющего риск наличия инфекции RSV (например, вследствие нарушенного иммунитета, физиологического статуса или воздействия RSV). Индивидуумов с неизвестным статусом инфекции можно исследовать для определения того, имеют ли они инфекцию, например, с использованием серологических тестов, физикального обследования, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиологического скрининга или другого диагностического способа, известного средним специалистам в данной области. В некоторых примерах выбирают индивидуума, который имеет инфекцию RSV или имеет риск приобретения инфекции RSV.Индивидуумов, для которых обнаружено (или известно), что они имеют инфекцию RSV и, тем самым, поддаются лечению путем введения описанных антигенов PreF или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген PreF, выбирают для введения антигенов PreF или нуклеиновой кислоты или вирусного вектора, кодирующих, экспрессирующих или включающих антиген PreF. Также можно отбирать индивидуумов, которые имеют риск развития инфекции RSV например, пожилых индивидуумов, индивидуумов с иммунодефицитом и очень молодых индивидуумов, таких как младенцы.

Индивидуумам, выбранным для лечения, можно вводить терапевтическое количество описанных антигенов PreF. Иммуногенную композицию, включающую антиген PreF, можно вводить в дозах от 0,1 мкг/кг массы тела до приблизительно 1 мг/кг массы тела на дозу, таких как от 0,1 мкг/кг массы тела до приблизительно 1 мкг/кг массы тела, от 0,1 мкг/кг массы тела до приблизительно 10 мкг/кг массы тела на дозу, 1 мкг/кг массы тела - 100 мкг/кг массы тела на дозу, 100 мкг/кг массы тела - 500 мкг/кг массы тела на дозу, или 500 мкг/кг массы тела - 1000 мкг/кг массы тела на дозу или даже более. В некоторых вариантах осуществления приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно 100 мкг антигена PreF включают иммуногенную композицию, которую вводят индивидууму в однократной дозе. Иммуногенную композицию можно вводить несколькими дозами, например, непрерывно, ежесуточно, еженедельно или ежемесячно. Можно использовать любой путь введения, используемый в данной области, такой как назальное введение. Количество средства, вводимого индивидууму, может определять врач, и оно может зависеть от конкретного подвергаемого лечению индивидуума. Конкретные иллюстративные количества представлены в настоящем описании (однако изобретение не ограничивается такими дозами).

Пример 8

Белок F RSV, стабилизированный дисульфидной связью, заполняющими полость заменами и доменом тримеризации

В этом примере иллюстрируется получение белка F RSV, стабилизированного дисульфидной связью и доменом тримеризации.

На фиг16 представлена конструкция рекомбинантного белка F RSV, стабилизированного посредством внесенных способами инженерии мутаций дисульфидной связи S155C и S290C (называемых "DS"), заполняющих полость мутаций S190F и V207L (называемых "Cav1") и гетерологичного домена тримеризации, присоединенного к C-концу полипептида F1 белка F. Представленная трехмерная структура представляет собой структуру F RSV, связанного с D25, и она показана с двумя из протомеров, представленных в качестве молекулярной поверхности, окрашенной розовым и желто-коричневым цветом, и третьим протомером, представленным в ленточном представлении. Показаны N- и C-концевые остатки F₁, которые смещаются более чем на 5Å между предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформациями. На вставках показана внесенная способами инженерии дисульфидная связь между остатками S155C и S290C, а также заполняющие полость мутации S190F и V207L. Модель домена тримеризации фибритина фага T4 представлена у основания предшествующего слиянию тримера.

Белок F RSV, включающий замены S155C, S290C, S190F и V207L (Cav1) в RSV подтипа A человека и присоединенный к нему C-концевой гетерологичный домен foldon, экспрессировали и очищали с использованием способов, описанных в примере 1 и 5, и его назвали RSV_A F(+)FdTHS DSCav1.

Антигенная охарактеризация RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 представлена на фиг.17. Константы ассоциации и диссоциации для растворимого Fab D25, AM22, 5C4, 101F, мотавизумаба и паливизумаба с иммобилизованным RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 измеряли с использованием устройства OctetRED 384™ (ForteBio, Melno Park, CA). Представлены равновесные константы диссоциации для каждого антитела.

Чистота RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 была проиллюстрирована эксклюзионной хроматографией (фиг.18). Очищенный белок после расщепления тромбином для удаления меток пропускали над эксклюзионной колонкой 16/70 Superose 6. Объем элюирования согласуется с гликозилированным тримером.

Антигенные и физические характеристики, включая выход из временно экспрессируемых плазмид, антигенность против различных антигенных участков и сохранение связывания D25 (представленное в качестве относительного количества) после инкубации в течение 1 часа при различных температурах (350 мМ NaCl, pH 7,0, при 50°C, 70°C или 90°C), pH (350 мМ NaCl pH 3,5 или pH 10, при 25°C) и осмолярности (осмолярность 10 мМ или 3000 мМ, pH 7,0, при 25°C), или после 10 циклов замораживания-размораживания (в 350 мМ NaCl, pH 7,0) вариантов RSV_A F(+)FdTHS, стабилизированных посредством мутаций DS, Cav1 или DSCav1, представлены на фиг.19. Вариант DSCav1 сохраняет распознавание антигенного участка ∅ с улучшенной физической стабильностью, исходя из более высокого сохранения реактивности D25 после воздействия чрезмерной температуры, значения pH, осмолярности и замораживания-оттаивания, чем любой из вариантов DS или Cav1.

Для исследования структурных свойств мутанта DSCav1 трехмерную структуру RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 определяли с использованием рентгеновской кристаллографии. На фиг.20 показано ленточное представление кристаллической структуры RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 при 3,1 Å. Более теплые цвета и утолщенные ленты соответствуют увеличению B-факторов. Несмотря на стабилизирующие мутации, антигенный участок ∅ на вершине тримера сохраняет значительную подвижность. На фиг.21 показано сравнение структуры RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 со структурой F RSV, связанного с D25. На фиг.22 показаны стабилизирующие мутации в структуре RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Наблюдаемая электронная плотность, соответствующая дисульфидной связи между остатками цистеина 155 и 290 (слева), а также заполняющему полностью остатку Phe190 (справа), указывает на то, что эти модификации присутствуют в кристалле.

Для определения иммуногенности конструкции RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 мышам и не являющимся человеком приматам инокулировали эту конструкцию и сыворотки, полученные от инокулированных животных, исследовали в отношении нейтрализации RSV (фиг.23 и 24). Мышей иммунизировали и активность нейтрализации полученных сывороток исследовали, как описано в примере 6, выше. В кратком изложении десять мышей CB6 на группу иммунизировали посредством 10 мкг указанного белка F RSV, смешанных с 50 мкг адъюванта поли I:C. Иммунизации проводили на 0 и 3 неделях, и сыворотки на 5 неделе и 7 неделе исследовали в отношении нейтрализации RSV подтипа A (RSV_A) и B (RSV_B). Средние значения указаны с помощью горизонтальных красных линий. Животным Macaca mulatta индийского происхождения, имеющим вес 8,76-14,68 кг, внутримышечно инъецировали иммуногены на 0 неделе и 4 недели. Взятие крови проводили раз в две недели в течение вплоть до 6 недель. Четыре наивных по RSV макака-резус на группу иммунизировали посредством 50 мкг белка указанного белка F RSV, смешанных с 500 мкг адъюванта поли I:C. Иммунизации проводили на 0 и 4 неделях, и сыворотки на 6 неделе исследовали в отношении нейтрализации RSV подтипа A (слева) и B (справа). Средние значения указаны горизонтальными красными линиями. Взятые вместе, эти результаты показывают, что конструкция RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 успешно индуцировала нейтрализующий ответ у мышей и не являющихся человеком приматов.

Пример 9

Моделирование на структурной основе вакцины с гликопротеином слияния от респираторно-синцитиального вируса

Реферат. Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является ведущей причиной госпитализации детей до возраста пяти лет. Для индукции защитных гуморальных ответов против RSV, усилия были направлены на антигенный участок ∅ - метастабильный участок, специфический для предшествующего слиянию состояния гликопротеина слияния (F), поскольку этот участок является основной мишенью высокоэффективных RSV-нейтрализующих антител, индуцируемых естественной инфекцией. Использовали моделирование на структурной основе для конструирования способами инженерии стабилизированных версий F, который сохраняли антигенный участок ∅ при чрезмерных значениях pH и температуре. Шесть кристаллических структур стабилизированного F обеспечили детали на атомном уровне для внесенных остатков цистеина и заполненных гидрофобных полостей и выявили немного различающиеся "предшествующие слиянию" конформации F. Иммунизация вариантами F RSV со стабилизированным участком ∅ индуцировала как у мышей, так и у не являющихся человеком приматов, RSV-специфическую нейтрализующую активность, которая в 3-15 раз превышающую нейтрализующую активность, индуцируемую F RSV в его образующемся после слияния состоянии. Таким образом, моделирование на атомном уровне для получения суперучастка вирусной уязвимости может оказывать существенный эффект на разработку вакцины.

Введение. Согласно оценкам, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) ответственен за 6,7% смертей у детей в возрасте от 1 месяца до 1 года и он вызывает чрезмерную смертность у пожилых людей на уровнях, сравнимых с уровнями, вызываемыми инфекцией вирусом гриппа. Хотя инфекция RSV не индуцирует полностью защитного иммунитета, антитела против гликопротеина слияния (F) RSV могут предотвратить тяжелое заболевание у человека, что демонстрируется пассивной профилактикой направленным против F антителом паливизумабом (Synagis®).

Доказанный успех паливизумаба побудил к попыткам создания вакцины, нацеленной на индукцию защитных антител, направленных против F RSV. Эти попытки были осложнены структурным разнообразием F RSV, белка слияния типа I, который принимает по меньшей мере две конформации: метастабильное предшествующее слиянию состояние и стабильное образующееся после слияния состояния. Оба состояния имеют общие эпитопы, на которые нацелены нейтрализующие антитела, включая эпитопы паливизумаба, и образующийся после слияния F RSV находится на стадии разработки в качестве кандидата для вакцины. Как описано в настоящем описании, было обнаружено, что преобладающая мишень RSV-нейтрализующих антител, индуцируемых природной инфекции, находится в основном на предшествующей слиянию конформации F RSV, и антитела, такие как AM22 и D25 (см., например, U.S. 12/600950 и U.S. 12/898325) - существенно более мощные, чем паливизумаб - нацелены на антигенный участок ∅, который является метастабильным участком, специфическим для предшествующего слиянию F, который расположен на дистальной относительно мембраны вершине предшествующего слиянию тримера F RSV.

Для усиления индукции этих мощных антител были сконструированы получаемые способами инженерии растворимые варианты F RSV для стабильного экспонирования антигенного участка ∅. Эти варианты были охарактеризованы как с антигенной точки зрения, так и кристаллографически, и они были исследованы в отношении иммуногенности у мышей и не являющихся человеком приматов. Результаты обеспечивают понимание взаимодействий между конструкцией, антигенностью, структурой и иммуногенностью, и демонстрируют как инженерия на основе структуры для сохранения и презентации соответствующей антигенной мишени может иметь преобразующий эффект на индукцию защитных гуморальных ответов.

Стратегия вакцины на структурной основе, описанная в настоящем описании, включала стратегию из четырех стадий: (1) идентифицировать суперучасток вирусной уязвимости, на которой нацелены антитела с высокой нейтрализующей активностью, (2) определить структуру суперучастка в комплексе с репрезентативным антителом, (3) обеспечить способам инженерии стабильную презентацию суперучастка в отсутствие распознающего антитела, и (4) индуцировать защитные ответы с высокими титрами посредством иммунизации сконструированными антигенами, которые презентируют суперучасток (фиг.26).

Конструирование антигенов F RSV

Вследствие распознавания чрезвычайно мощными RSV-нейтрализующими антителами, антигенный участок ∅ был выбран в качестве суперучастка-мишени; его структура в комплексе с антителом D25 описана в настоящем описании (фиг.26B). Для конструирования вариантов F RSV, которые стабильно презентировали участок ∅, анализировали структуру F RSV, связанную с D25. Механистически, существует ряд путей стабилизации конформации белка. Механизмы стабилизации участка ∅ без нарушения его распознавания исследовали в комбинации с доменом тримеризации фибритина фага T4 ("foldon") (Efimov et al., J Mol Biol 242, 470 (1994); Boudko et al., European journal of biochemistry/FEBS 269, 833 (2002)) присоединенным к C-концу эктодомена F RSV (McLellan et al., J. Virol. 85, 7788 (2011)).

Внесение пар остатков цистеина, для которых спрогнозировано, что они образуют дисульфидную связь в конформации мишени, но широко разделены в альтернативных конформациях, является одним из подходов для стабилизации выбранной структуры. β-атомы углерода остатков серина 155 и 290 находятся на расстоянии 4,4 Å в связанной с D25 структуре F RSV (см. пример 1) и на расстоянии 124,2 Å в образующейся после слияния структуре (McLellan et al., J. Virol. 85, 7788 (2011; описано выше и см. фиг.27 и 32). Двойной мутант S155C-S290C, называемый "DS", образовывал стабильные тримеры F RSV, экспрессировался на уровне 1,4 мг/л, сохранял антигенный участок ∅ и был гомогенным, исходя из EM с негативным окрашиванием (описано выше; также см. фиг.31, фиг.33). Другие модификации цистеином, такие как модификации между областями F RSV, которые совместимы как с предшествующим слиянию так и с образующимся после слияния состояниями (например, S403C и T420C), не стабилизировали антигенный участок ∅ (фиг.31). Также исследовали ряд потенциальных двойных модификаций на цистеин между субъединицами; однако ни одна из исследованных двойных замен на цистеин между субъединицами не экспрессировалась на уровне более 0,1 мг/л.

Заполняющие полость гидрофобные замены обеспечивают другое средство для стабилизации выбранной конформации. Структуру F RSV, связанного с D25, анализировали в отношении гидрофобных полостей, уникальных для связанной с D25 конформацией F RSV, которые примыкали к областям, которые различались в предшествующем слиянию и образующемся после слияния состояниях F. Ряд таких полостей был идентифицирован в дистальной относительно мембраны "головке" предшествующей слиянию структуры, вблизи участка связывания D25, и были смоделированы гидрофобные изменения для заполнения этих полостей. Изменения S190F и V207L принимали преобладающие конформации боковых цепей с минимальными столкновениями, в то время как изменения K87F, V90L, V220L и V296F продемонстрировали меньшую пространственную совместимость. Оценивали заполнение этих полостей парами изменений. Пара S190F-V207L, которая была названа "Cav1" (фиг.27), образовывала стабильные тримеры F RSV, экспрессируемые на уровне 2,2 мг/л, и сохраняла антигенный участок ∅ (фиг.31). Между тем, варианты K87F-V90L, S190F-V296F и V207L-V220L продемонстрировали усиленное сохранение распознавания D25, но выход тримера F RSV менее 0,1 мг/л (фиг.31).

Другие полости в направлении центра предшествующего слиянию F RSV были близки к пептиду слияния, оси тримера и кислотному участку, содержащему остатки Asp486, Glu487 и Asp489. Был смоделирован ряд заполняющих полость изменений, включающих F137W, F140W и F488W, и эти изменения были проанализированы в комбинации с D486H, E487Q и D489H (фиг.31). Из шести исследованных комбинаций только две (F488W и D486H-E487Q-F488W-D489H) экспрессировали уровни очищенного тримера F RSV, превышающие 0,1 мг/л и сохраняли распознавание D25. Вариант D486H-E487Q-F488W-D489H, обозначаемый как "TriC", образовывал стабильные тримеры F RSV, экспрессировался на уровне 0,8 мг/л и сохранял антигенный участок ∅ (фиг.31, фиг.27).

Также исследовали влияние дестабилизации образующейся после слияния конформации на сохранение антигенного участка ∅. V178N, спрогнозированный для внесения N-связанного гликана, совместимого с предшествующей слиянию, но не с образующейся после слияния, конформацией F, как оказалось, не стабилизировал антигенный участок ∅, также как и V185E или I506K, которые помещают глутаминовую кислоту или a лизин внутрь образующегося после слияния пучка из шести спиралей (фиг.31). Эти мутации, вероятно, приводят к некоторой промежуточной конформации F RSV, которая является "инициированной", но неспособна принимать образующуюся после слияния конформацию. В целом, более 100 вариантов F RSV было сконструировано, экспрессировано в 96-луночном формате трансфекции (Pancera et al., PLoS ONE 8, e55701 (2013)) и исследовано с использованием ELISA в отношении связывания с D25 и мотавизумабом. Пятнадцать конструкций было совместимо со связыванием D25, шесть из которых сохраняли распознавание D25 в течение по меньшей мере 7 суток при 4°C, и три из них можно было очистить для гомогенных тримеров, которые сохраняли антигенный участок ∅ (фиг.31). В целом, наблюдали высокую корреляцию между сохранение связывания D25 в течение по меньшей мере 7 суток при 4°C в 96-луночных супернатантах и выходом очищенных тримеров после крупномасштабной экспрессии и очистки (фиг.34).

Комбинаторная оптимизация стабильности участка ∅

Варианты DS, Cav1 и TriC проявляли различные физические и антигенные свойства. Вариант DS был наименее стабильным к чрезвычайным pH и температурам, но был более постоянно стабилизированным в трехмерном состоянии, в то время как для Cav1 и TriC наблюдали постоянное взаимное преобразование из тримера в агрегат. Для оценки того, может ли быть получен более оптимальный вариант F RSV путем комбинирования DS, Cav1 и TriC, осуществляли все комбинации.

Комбинации, как правило, улучшали сохранение реактивности D25 при физических чрезмерных воздействиях. Таким образом, например, все комбинации продемонстрировали увеличенную стабильность при инкубации при 50°C или pH 10,0. Однако также наблюдали низкую толерантность к замораживанию-размораживанию, проявляемую TriC как в Cav1-TriC, так и в DS-Cav1-TriC. В целом, комбинация DS-Cav1 оказалась оптимальной с точки зрения выхода тримера и физической стабильности при чрезмерных температурах, pH, осмолярности и замораживании-размораживании (фиг.31, фиг.35) и гомогенности, исходя из EM с негативным окрашиванием (фиг.33).

Кристаллографические анализы

Для обеспечения обратной связи на атомном уровне определяли кристаллические структуры вариантов F RSV со стабилизированным участком ∅ (фиг.28). Все из вариантов DS, Cav1, DS-Cav1 и DS-Cav1-TriC кристаллизовали в сходных условиях 1,5 M тартрата, pH 9,5, и эти кубические кристаллы дифрагировали рентгеновские лучи до разрешений 3,1 Å, 3,1 Å, 3,8 Å и 2,8 Å, соответственно (фиг.40). Решения для молекулярного замещения получали с использованием структуры F RSV, связанного с D25, в качестве поисковой модели, и они выявили один протомер F RSV в асимметричном элементе с осью тримера F, располагающейся вдоль кристаллографической тройной оси. Четырехугольные кристаллы Cav1 и кубические кристаллы DS-Cav1 также получали в условиях с 1,7 M сульфатом аммония, pH 5,5, и они дифрагировали до разрешений 2,4 Å и 3,0 Å, соответственно (фиг.40). Молекулярное замещение выявило четырехугольную решетку, имеющую полный тример F RSV в асимметричном элементе и являющуюся высокосходной с кубической решеткой тартрата. В целом, эти структуры выявили сконструированные варианты F RSV, находящиеся по существу в связанной с D25 конформации (сконструированные варианты F RSV имели C-среднеквадратические отклонения от связанной с D25 конформации между 0,68-1,5 Å и от образующейся после слияния конформации приблизительно 30 Å).

Хотя структура варианта DS (фиг.28, самая левая колонка) была стабильной в качестве растворимого тримера с замененными на цистеин остатками в 155 и 290, действительно формирующими дисульфидную связь, которая по большей части предотвращала инициацию в образующееся после слияния состояние, значительная часть дистальной относительно мембраны части тримера F RSV, включая антигенный участок ∅, была либо разупорядоченной (остатки 63-72 и 169-216), либо находилась в отличающейся конформации. Таким образом, например, остатки 160-168 в структуре DS выходят за пределы α2-спирали вместо образования изгиба и инициации α3-спирали, как в структуре F, связанной с D25 (фиг.28B, самая левая панель). Одним неограничивающим объяснением различий между структурой DS и структурой F RSV, связанной с D25, является то, что кристаллизованный DS находится в конформации, которая не связывает D25. В целом, вариант DS сохранял многие из признаков предшествующего слиянию состояния F RSV, включая пептид слияния внутри тримерной полости.

По сравнению с DS, структура Cav1 (фиг.28, 2-ой и 3-ий столбцы) была более упорядоченной в дистальной относительно мембраны вершине, с четко определенными α3-спиралью, β3/β4 шпилькой и α4-спиралью. Остатки 137-202, которые содержат замену S190F, имели Cα-rmsd 0,6 Å по сравнению со структурой F, связанной с D25. Более высокая степень структурного порядка, вероятно, была следствием мутации S190F, которая заполняла полость, наблюдаемую в структуре F, связанной с D25, и увеличивала ван-дер-ваальсовы контакты с остатками Ile57, Lys176, Val192, Glu256, Ser259 и Leu260. Другая заполняющая полость мутация в Cav1, V207L была сдвинута на 5,5Å по сравнению со структурой F, связанной с D25, причем C-концевая часть α4-спирали образовала петлю вблизи Pro205 и принимала отчетливые конформации при двух условиях кристаллизации (фиг.28B, 2-ая и 3-я панели слева).

Удивительным признаком структуры Cav1 в четырехугольной кристаллической решетке является C-конец F₂, который является разупорядоченным в структуре F, связанной с D25, но в Cav1 образует тоннель в тримерную полость вдоль пептида слияния. Интересно, что C-конец оканчивается Ala107, но не Arg109, как ожидалось после расщепления участка фурина (Arg106-Ala107-Arg108-Arg109). В структуре Cav1 положительный заряд Arg106 скомпенсирован за счет упорядоченного сульфатного иона (фиг.28C). Биологически внутреннее положение C-конца F₂ может играть роль в инициации предшествующей слиянию конформации F.

Сравнение структур DS-Cav1 из двух четырехугольных кристаллических форм (фиг.28, 2-ой и 3-ий столбцы справа) со структурами Cav1 выявило только небольшие отличия (Cα rmsd 0,86 Å для остатков между Cav1 и DS-Cav1, выращенных в условиях сульфата аммония; Cα rmsd 0,47 Å для остатков 447 в кубической решетке). Наибольшие отличия происходили на вершине F RSV, включая антигенный участок ∅, и, в частности, в остатках 64-73 и 203-216. Примечательно, что атомная подвижность (B-фактор) была наиболее высокой в этой области вершины для всех из вариантов со стабилизированным участком ∅, что, возможно, указывает на имманентную подвижность участка ∅. Однако интересно, что участок ∅ имеет низкую атомную подвижность, когда он связан с D25, демонстрируя способность D25 стабилизировать как общую, так и локальную конформации F RSV.

Структура тройной комбинации DS-Cav1-TriC (фиг.28, дальний правый столбец) также была высоко сходной с другими содержащими Cav1 структурами варианта F RSV. Однако одно отличие электронной плотности соответствовало расширению слабой плотности в проксимальной относительно мембраны области, которая соответствовала размерам домена тримеризации фибрина T4 (Stetefeld et al., Structure 11, 339 (2003)), которая не видна в других структурах кристаллизованного F RSV, которые содержали этот домен, включая структуру, связанную с D25. Небольшие структурные отличия в упаковке, вероятно, позволяют частичное упорядочивание этого домена (и также могут объяснять его увеличенный придел дифракции для кристаллов DS-Cav1-TriC относительно других кубических вариантов), а не отличия во взаимодействии между F RSV, стабилизированным посредством DS-Cav1-TriC, и этим доменом тримеризации.

С точки зрения изменений остатков 486-489 TriC, критическая замена F488W упаковывалась непосредственно напротив замен F488W в соседних протомерах тримера F RSV. Боковая цепь индола Trp488 была направлена в сторону вершины тримера и также образовывала стэкинг-взаимодействия колец с боковой цепью 140Phe пептида слияния (фиг.28C, дальняя правая панель). Это взаимодействие пептида слияния, которое не наблюдается в какой-либо из Phe488-содержащих структур, вероятно, ингибирует извлечение пептида слияния из полости предшествующего слиянию тримера, обеспечивая структурное обоснование для способности изменения F488W стабилизировать предшествующей слиянию состояние F RSV (фиг.31).

Иммуногенность F RSV со стабилизированным антигенным участком ∅

Для оценки эффекта стабилизации участка ∅ на индукцию защищающих от RSV гуморальных ответов мышей CB6 иммунизировали различными формами F RSV, инъецируя каждой мыши 10 мкг F RSV в комбинации с 50 мкг адъюванта поли I:C на 0 и 3 неделях, и измеряли способность сывороток на 5 неделе препятствовать инфицированию RSV клеток HEp-2. Каждый из DS, Cav1 и TriC индуцировал высокие титры нейтрализующей активности (геометрическое среднее значение 50% эффективных концентраций (EC₅₀) 1826-2422). Этот уровень был в ~3- раза более высоким, чем индуцируется образующимся после слияния F (504 EC₅₀), и в ~20 раз более высоким, чем защитный порог. Для сравнения, DS-Cav1 индуцировал нейтрализующую активность с EC₅₀3937, приблизительно в 7 раз более высокую, чем образующийся после слияния F и в 40 раз более высокую, чем защитный порог (фиг.29A). (Когда паливизумаб (Synagis®) дозируют в концентрации 15 мг/кг остаточные сывороточные уровни составляют ~40 мкг/мл, что обеспечивает защиту младенцев от тяжелого заболевания. В анализе нейтрализации, 40 мкг/мл паливизумаба в сыворотке обеспечивает EC50 100. Этот титр также ассоциирован с полной защитой от инфекции нижних дыхательных путей у мышей и хлопковых хомячков, зараженных RSV.)

Для количественного определения индукции антител между различными участками на предшествующем слиянию F RSV, использовали формы F RSV с закрытым антигенным участком ∅. У мышей CB6, которых иммунизировали посредством 20 мкг F RSV, связываемого антителами, направленными против антигенного участка ∅ (содержащими ~10 мкг RSV F и ~10 мкг антигенсвязывающего фрагмента антитела) развивались нейтрализующие титры на 5 неделе с геометрическим средним значением EC₅₀ 911 и 1274 для комплексов AM22 и D25, соответственно, что приблизительно в два раза больше, чем в случае образующегося после слияния белка в количестве 10 мкг/мл и сравнимо с титрами, индуцируемыми образующимся после слияния белком в количестве 20 мкг/мл (фиг.29A). Эти данные указывают на то, что очень высокие титры, индуцируемые посредством иммунизации вариантов F RSV, стабилизированных в предшествующем слиянию состоянии - особенно DS-Cav1 - были следствием антител, нацеленных на антигенный участок ∅.

Для исследования универсальности индукции участка ∅, макак-резусов иммунизировали посредством DS-Cav1, DS и образующихся после слияния форм F RSV, инъецируя каждому макаку 50 мкг F RSV, смешанного с 500 мкг адъюванта поли I:C на 0 и 4 неделях, и измеряя способность сывороток на 6 неделе ингибировать инфекцию RSV. Составленные белки сохраняли ожидаемые антигенные профили при измерении по связыванию D25 (фиг.38). DS и DS-Cav1 индуцировали геометрические средние титры EC₅₀1222 и 2578, соответственно, что приблизительно в 5 и 10 раз выше, чем в случае образующегося после слияния F (287 EC₅₀) (фиг.29B), тем самым, демонстрируя сохранение относительной иммуногенности для различных форм иммуногена F RSV между мышами и приматами и способность DS-Cav1 генерировать высокие защитные титры против RSV в иммунной системе приматов.

Оптимизация защитных ответов на F RSV

Матрица информации (фиг.26C) полученной при взаимодействии между конструкцией, физическими и антигенными свойствами, структурой на атомном уровне и иммуногенностью, обеспечивает основу для дальнейшей оптимизации (Nabel, Science 326, 53 (2009)). Например, для понимания взаимосвязи между различными антигенными и физическими свойствами сконструированных F RSV и индукцией защитных ответов против RSV, можно сопоставить свойства (фиг.31) с иммуногенностью (фиг.29). Такое сопоставление указывает на то, что увеличение стабильности участка ∅ при чрезмерных физических воздействиях (но не выход тримера и не аффинность к D25), должно увеличивать защитные титры, индуцируемые при иммунизации (фиг.30A), тем самым обеспечивая понимание дальнейшей оптимизации конструкции. Аналогично, корреляция между различными конформационными состояниями или областями F RSV (фиг.28) и иммуногенность (фиг.29) обеспечивает понимание конструкции конформации F RSV, которая обеспечивает наиболее защитные ответы. В этом случае, результаты указывают на то, что усиление структурной мимикрии антигенного участка ∅ в его связанной с D25 конформации должно приводить к улучшенным защитным титрам (фиг.30B).

В дополнение к обеспечению указаний для улучшения, матрица информации также может обеспечить оценку степени, в которой такое улучшение может произойти. Таким образом, после установления корреляции, например, между физической стабильностью или структурной мимикрией и защитными ответами, можно максимизировать физическую стабильность (например, до 100% сохранения связывания D25) или структурную мимикрию (например, до точной мимикрии связанной с D25 конформации) для осуществления идеи о максимальном улучшении индуцируемого защитного ответа в отношении этого конкретного параметра. Эти результаты (фиг.30A,B) указывают на то, что дополнительная структурная мимикрия, вероятно, не имеет значительного эффекта на иммуногенность, но дополнительная физическая стабилизация антигенного участка ∅ может существенно улучшить антигенное качество защитных титров. Независимые параметры, такие как адъювант, мультимеризация или режимы иммунизации, вероятно позволят улучшение индуцируемого ответа и такие параметры можно независимо анализировать и оптимизировать (подвижность антигенного участка может увеличить его иммуногенность посредством позволения участку соответствовать более широкому разнообразию антител. В этом контексте, авторы настоящего изобретения отмечают, что факторы атомной подвижности антигенного участка ∅ были среди наиболее высоких в эктодомене F RSV).

Экспериментальноесмешение параметров также может обеспечить понимание. Например, для определения направленности индуцируемых F RSV сывороток, иммуногенность можно проверять с помощью антигенов (фиг.30C). Для измерения антигенности сывороток, индуцируемых различными формами F RSV, различные формы F RSV связывали с наконечником биосенсора Octet и измеряли реактивность индуцированных сывороток, а также сывороток после "предварительного поглощения", в которые добавляли различные формы F RSV (фиг.30C). С DS-Cav1 на сенсоре ответ биосенсора для макаков, иммунизированных образующимся после слияния F, DS и DS-Cav1, продемонстрировали увеличение ответов (фиг.30C, левая панель); с образующимся после слияния F на сенсоре, ответы биосенсоров на те же сыворотки продемонстрировали снижение ответов (фиг.30C, правая панель); и в случае сывороток, которые подвергали предварительному поглощению, с образующимся после слияния F и с DS-Cav1 на сенсоре, ответы для макаков, иммунизированных образующимся после слияния F, DS и DS-Cav1 имели тенденцию к индукции защитных тиров (фиг.30C, левая панель). В целом, индуцированные титры EC₅₀ не имели тенденции к антигенным ответам, измеряемым против либо предшествующих слиянию, либо образующихся после слияния форм F RSV, но коррелировали с уровнем специфичных к предшествующей слиянию конформации ответов, измеренных либо в качестве разности, либо в качестве соотношения (p=0,005) между ответами F RSV, направленными против предшествующей слиянию и образующейся после слияния конформаций (фиг. 30D) (для "предшествующий слиянию" формы RSV F, использовали стабилизированный вариант DS-Cav1 F RSV). Эти результаты указывают на то, что качество иммунного ответа является существенно лучшим для иммуногенов F RSV в предшествующей слиянию против образующейся после слияния конформации, что является открытием, которое может быть связано с лучшей эффективностью нейтрализации, наблюдаемой для антител, специфичных к предшествующей слиянию конформации, которые нацелены на антигенный участок ∅ (должно быть возможным устранение индуцируемого ответа с использованием структурно определенных зондов, как показано для F RSV, связанного D25 и мотавизумабом, на фиг.39).

Без связи с теорией, антигенные участки, которые содержат множество эпитопов, на которые нацелены антитела, которые происходят из множества генов эмбрионального типа, могут быть идеальными мишенями для вакцин, поскольку эти "суперучастки" имеют высокую вероятность индукции множественных линий нейтрализующих антител. Антигенный участок ∅ на F RSV является примером антигенного суперучастка, который также является участком уязвимости вируса. Многие из извлеченных уроков из попыток, направленных на RSV, описанных в настоящем описании, такие как важность исследования естественного иммунного ответа у человека и выбора подходящего участка-мишени, вероятно, являются общеприменимыми. В целом, путем фокусирования моделирования на структурной основе на суперучастках уязвимости, структурная вакцинология может находиться на грани достижения изменяющего парадигму сдвига в разработке вакцин против вирусных патогенов.

Материалы и способы

Вирусы и клетки. Исходные культуры вируса получали и поддерживали, как описано ранее (Graham et al., J. Med. Virol., 26, 153 (1988)). RSV, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), RSV-GFP, конструировали, как описано ранее (Hallak et al., Virology. 271, 264 (2000)). Титр исходной культуры RSV-GFP, использованных для нейтрализации на основе проточной цитометрии и анализов слияния составлял 2,5×10⁷ б.о.е./мл. Титр исходной культуры RSV A2, использованной для анализа связывания, составил 1,02×10⁸ б.о.е./мл. Клетки HEp-2 поддерживали в минимальной поддерживающей среде Игла, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (10% EMEM) и их дополняли глутамином, пенициллином и стрептомицином.

Экспрессия и очистка антител и Fab-фрагментов. Антитела экспрессировали посредством временной совместной трансфекции плазмид тяжелой и легкой цепей в клетки HEK293F в суспензии при 37°C в течение 4-5 суток (см. выше, а также McLellan et al., Nat Struct Mol Biol 17, 248 (2010); McLellan et al., J Virol 84, 12236 (2010)). Клеточные супернатанты пропускали над агарозой с белком A и связанные антитела промывали PBS и элюировали буфером для элюирования IgG в 1/10 объема 1 M Tris-HCl pH 8,0. Fab получали путем расщепления IgG посредством Lys-C или протеазы HRV3C (McLellan et al., Nature 480, 336 (2011)) и смеси Fab и Fc пропускали над агарозой с белком A для удаления Fc-фрагментов. Fab, которые проходили через колонку, далее очищали эксклюзионной хроматографией.

Скрининг конструкций F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации. Варианты предшествующего слиянию F RSV происходили из конструкции RSV F (+) Fd (см. пример 1), которая состоит из остатков 1-513 F RSV с C-концевым мотивом тримеризации фибритина T4 (McLellan et al., Nature 480, 336 (2011)), участком расщепления тромбином, 6x His-метки и StreptagII. Подход для экспрессии генов в формате 96-луночных микропланшетах использовали для достижения высокопроизводительной экспрессии различных белков F RSV, как описано ранее (Pancera et al., PLoS ONE 8, e55701 (2013)). В кратком изложении, за 24 часа до трансфекции клетки HEK 293T высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета при плотности 2,5x10⁵ клеток/мл в среде для экспрессии (DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненная 10% эмбриональной телячьей сывороткой со сверхнизким содержанием IgG и 1x заменимыми аминокислотами), и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 20 ч. Плазмидную ДНК и TrueFect-Max (United BioSystems, MD) смешивали и добавляли к растущим клеткам и 96-луночный планшет инкубировали при 37°C, 5% CO₂. Через одни сутки после трансфекции в каждую лунку добавляли обогащенную среду (DMEM с высоким содержанием глюкозы плюс 25% эмбриональная телячья сыворотка со сверхнизким содержанием IgG, 2x заменимыми аминокислотами, 1x глутамином) и возвращали в инкубатор для непрерывной культуры. На пятые сутки после трансфекции экспрессированный белок F RSV в супернатанте собирали и исследовали с помощью ELISA в отношении связывания с антителами D25 и мотавизумабом с использованием микропланшетов с Ni²⁺-NTA. После инкубации собранных супернатантов при 4°C в течение одной недели ELISA повторяли.

Крупномасштабная экспрессия и очистка конструкций F RSV. Растворимый образующийся после слияния RSV F экспрессировали и очищали, как описано ранее (McLellan, J Virol 85, 7788 (2011)). Предшествующие слиянию варианты экспрессировали посредством временной трансфекции в клетках Expi293F с использованием TrueFect-Max (United BioSystems, MD). Культуральные супернатанты собирали через 5 суток после трансфекции и центрифугировали при 10000 g для удаления клеточного дебриса. Культуральные супернатаны подвергали стерилизации фильтрованием перед заменой буфера и концентрировали с использованием проточной фильтрации вдоль потока (van Reis, J Membrane Sci 159, 133 (1999)). Гликопротеины F RSV очищали посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным никелем и стрептацином, и соответствующие фракции, содержащие варианты F RSV, объединяли, концентрировали и подвергали эксклюзионной хроматографии (см. пример 1). Аффинные метки удаляли посредством расщепления тромбином, а затем эксклюзионной хроматографии. Гликопротеины, использованные в иммунизациях не являющихся человеком приматов, исследовали в отношении эндотоксинов с использованием анализа лизат амебоцитов Limulus и при необходимости белки пропускали над колонкой EndoTrap Red (BioVendor) для удаления эндотоксина перед иммунизациями. Уровень эндотоксина составлял <5 МЕ/кг массы тела/ч при измерении с использованием тест-набора Endpoint Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test kit (Lonza, Basel, Switzerland).

Антигенная охарактеризация стабилизированного F RSV. Устройство fortéBio Octet Red384 использовали для измерения кинетики связывания F RSV с антителами, которые нацелены на антигенный участок ∅ (D25, AM22), участок I (131-2a), участок II (павилизумаб, мотавизумаб) и участок IV (101F). Все анализы проводили при встряхивании при 1000 об./мин. в фосфатно-солевом буфере (PBS), дополненном 1% бычьим сывороточным альбуминум (BSA) для минимизации неспецифических взаимодействий. Конечный объем для всех растворов составлял 100 мкл/лунка. Анализы проводили при 30°C в сплошных черных 96-луночных планшетах (Geiger Bio-One). StrepMAB-Immo (35 мкг/мл) в буфере PBS использовали для нанесения зондов против Fc мыши в течение 300 с, а затем их использовали для улавливания соответствующих вариантов белков F RSV, которые содержали C-концевую Strep-метку. Типичные уровни улавливания для каждой стадии нагрузки составляли от 0,7 до 1 нм, и вариабельность в ряду из восьми наконечников не превышала 0,1 нм для каждой из этих стадий. Затем наконечники биосенсора уравновешивали в течение 300 с в PBS + 1% BSA перед измерением ассоциации с антигенсвязывающими фрагментами (Fab) в растворе (от 0,002 мкм до 1 мкм) в течение 300 с; Затем Fab позволяли диссоциировать в течение 400 с-1200 с в зависимости от наблюдаемой скорости диссоциации. Лунки для диссоциации использовали только один раз для предупреждения контаминации. Параллельную поправку для вычитания систематического сдвига от исходного уровня проводили путем вычитания результатов измерений, зарегистрированных для нагруженного сенсора, инкубированного в PBS + 1% BSA. Для устранения ответов в виде неспецифического связывания молекулу gp120 ВИЧ-1 с C-концевой Strep-меткой наносили на зонды против Fc мыши и инкубировали с Fab RSV, и неспецифические ответы вычитали из данных ответа для варианта F RSV. Анализ данных и аппроксимацию кривой проводили с использованием программного обеспечения Octet, версия 7.0. Экспериментальные данные аппроксимировали к уравнениям связывания, описывающим взаимодействие 1:1. Глобальный анализ полных наборов данных, допускающий обратимое связывание (полная диссоциация) проводили с использованием нелинейной среднеквадратической аппроксимации, допускающей получение одного набора параметров связывания одновременно для всех концентраций, использованных в каждом эксперименте.

Физическая стабильность вариантов F RSV. Для оценки физической стабильности сконструированных белков F RSV в условиях различной нагрузки белки обрабатывали с использованием различных имеющих фармацевтическое значение воздействий, таких как чрезмерные значения pH, высокая температура, низкая и высокая осмолярность, а также повторяющиеся циклы замораживания/оттаивания. Физическую стабильность обработанных белков F RSV оценивали по их степени сохранения антигенного участка ∅ после обработки, что является критическим параметром, оцениваемым по связыванию антитела, специфичного к участку ∅ D25.

При pH-обработке белок F RSV разбавляли до первоначальной концентрации 50 мкг/мл, доводили до pH 3,5 и pH 10 с помощью соответствующих буферов и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут, а затем нейтрализовывали обратно до pH7,5 и доводили до 40 мкг/мл. При термической обработке белок RSV в концентрации 40 мкг/мл инкубировали при 50°C, 70°C и 90°C в течение 60 минут в ПЦР-циклерах с нагреванием крышек для предотвращения испарения. При осмомолярной обработке, 100 мкл растворов белка F RSV (40 мкг/мл), первоначально содержавших 350 мМ NaCl, разбавляли либо 2,5 мМ Tris-буфером (pH 7,5) до осмолярности 10 мМ NaCl, либо доводили посредством 4,5 M MgCl2 до конечной концентрации 3,0 M. Растворы белков инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре, а затем доводили обратно до 350 мМ NaCl посредством добавления 5M NaCl или разбавления 2,5 мМ Tris-буфером, соответственно, перед снижением концентрации до 100 мкл. Обработку посредством замораживания/оттаивания проводили 10 раз посредством повторяющегося замораживания в жидком азоте и оттаивания при 37°C. Связывание антитела D25 с обработанными белками F RSV измеряли с использованием устройства Octet по протоколам, описанным выше. Степени физической стабильности были показаны в качестве соотношения уровня стационарного связывания D25 до и после стрессового воздействия.

Данные кристаллизации и получение данных рентгенографического анализа для белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации. Кристаллы F DS, Cav1, DSCav1, и DSCav1TriC RSV выращивали способом диффузии пара в висячих каплях при 20°C посредством смешения 1 мкл F RSV с 1 мкл резервуарного раствора (1,4 M тартрат K/Na, 0,1 M CHES, pH 9,5, 0,2 M LiSO₄). Кристаллы сразу замораживали в жидком азоте. Кристаллы F Cav1 и DSCav1 RSV также выращивали способом диффузии пара в висячих каплях при 20°C путем смешения 1 мкл F RSV с 0,5 мкл резервуарного раствора (1,7 M сульфат аммония, 0,1 M цитрат, pH 5,5). Кристаллы переносили в раствор 3,2 M сульфата аммония, 0,1 M цитрат pH 5,5 и быстро замораживали в жидком азоте. Все данные рентгенодиффракции получали при длине волны 1,00 Å на линии пучка SER-CAT beamline ID-22.

Определение, уточнение и анализ структуры F RSV, стабилизированного в предшествующей слиянию конформации

Данные рентгенодиффракции интегрировали и масштабировали с использованием пакета программ HKL2000 (Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. (Academic Press, 1997), vol. 276, pp. 307-326)) и решения для молекулярного замещения получали с помощью PHASER (McCoy et al., Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658 (2007)) с использованием структуры F RSV, связанной с D25 (PDB ID: 4JHW, (см. пример 1)) в качестве поисковой модели. Построение модели вручную проводили с использованием COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486 (2010)) и уточнение проводили в PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213 (2010)). Конечный сбор данных и статистика уточнения представлены на фиг.40. Совмещение структур F RSV проводили с использованием остатков 225-455, которые продемонстрировали высокие уровни структурного сходства. Вычисления rmsd для антигенного участка ∅ были основаны на остатках 61-71 и 194-219, которые находились в пределах 10 Å от антитела D25 в структуре комплекса F RSV-D25.

Анализ с использованием электронной микроскопии с негативным окрашиванием. Образцы адсорбировали на свежие покрытые углем решетки после тлеющего разряда, промывали кратковременно водой и окрашивали свежеприготовленным 0,75% уранилформиатом. Изображения регистрировали на микроскопе FEI T20 с камерой 2k × 2k Eagle CCD с размером пикселя 1,5 Å. Анализ изображений и 2D-усреднение проводили с использованием Bsoft (Heymann and Belnap, J. Struct. Biol., 157, 3 (2007) и EMAN (Ludtke et al., J. Struct. Biol., 128, 82 (1999)).

Иммунизации NHP. Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Animal Care and Use Committee Vaccine Research Center, NIAID, NIH, и всех животных содержали и осуществляли за ними уход в соответствии с местными правилами, правилами штата, федеральными правилами и правилами учреждения в помещении, аккредитованном American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) в NIH. Животным Macaca mulatta массой 8,76-14,68 кг внутримышечно инъецировали иммуногены на 0 неделе и 4 неделе. Взятие крови проводили раз в две недели в течение вплоть до 6 недель.

Анализы нейтрализации RSV. Сыворотки распределяли в качестве четырехкратных разведений от 1:10 до 1:40960, смешивали с равным объемом экспрессирующих рекомбинантный mKate-RSV прототипных генов F из штамма A2 и флуоресцентный белок Katushka, и инкубировали при 37°C в течение одного часа. Далее 50 мкл смеси каждого разведения сыворотки/вируса добавляли к клеткам HEp-2, которые были посеяны при плотности 1,5×10⁴ в 30 мкл MEM (минимальная поддерживающая среда) в каждую лунку 384-луночных черных планшетов с оптическим дном и инкубировали в течение 20-22 часов перед спектрофотометрическим анализом при Ex 588 нм и Em 635 нм (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089). IC₅₀ для каждого образца вычисляли посредством аппроксимации кривой и нелинейной регрессии с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA). Величины P определяли с использованием T-критерия Стьюдента.

Анализ антигенности сывороток. Устройство fortéBio Octet Red384 использовали для измерения реактивности сыворотки в отношении белков-вариантов F RSV при встряхивании, температуре, в 96-лунчоных планшетах, буфере и объемах, идентичных тем, которые использовали для измерений кинетики. RSV F DSCav1 и образующийся после слияния F иммобилизовывали на зондах для улавливания аминов посредством активации зонда в смеси для активации EDC/NHS в течение 300 с в 10 мМ ацетате, pH 5. Реактивность зонда гасили с использованием 10 мМ этаноламина, pH 8,5. Типичные уровни улавливания находились между 0,7 и 1 нм, и вариабельность в пределах ряда из восьми наконечников не превышала 0,1 нм для каждой из этих стадий. Затем наконечники биосенсора уравновешивали в течение 300 с в буфере PBS + 1% BSA перед измерением связывания. Сыворотки разбавляли до разведения 1/50 и 1/100 в PBS + 1% BSA и связывание оценивали в течение 300 с. Истощения сыворотки достигали с использованием 1 мкг DSCav1 или образующегося после слияния белка F на 1 мкл сыворотки животного. Параллельную поправку для вычитания неспецифического связывания сыворотки проводили путем вычитания уровней связывания ненагруженного зонда, инкубированного с сывороткой. Сайт-специфическую антигенность оценивали путем инкубации зондов, нагруженных вариантом F RSV, с 1 или 2 мкм Fab D25 для оценки участка ∅ и Fab мотавизумаба для оценки участка II или обоих антител для оценки остаточной реактивности не в отношении участков ∅/II.

Пример 10

Одноцепочечные белки F RSV, стабилизированные в предшествующей слиянию конформации

Этот пример иллюстрирует дополнительные рекомбинантные белки F RSV, которые лишены нативных участков расщепления фурином, так что протомер белка F образуется в качестве единой полипептидной цепи вместо гетеродимера F₂/F₁. Схематические диаграммы, иллюстрирующие конструкцию дополнительных одноцепочечных белков F RSV, стабилизированных в предшествующей слиянию конформации, представлены на фиг.43 и 44.

На фиг.43-45 иллюстрируется модель серии одноцепочечных конструкций, включая одноцепочечную конструкцию F RSV № 9 (scF№ 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669). Переменные для одноцепочечных конструкций включают размер линкера, концевые точки F1 и F2 и механизм, используемый для индукции тримеризации одноцепочечной конструкции. Кроме того, несколько стратегий можно использовать для стабилизации одноцепочечных конструкций в предшествующей слиянию конформации, включая использование стратегий, описанных в настоящем описании. Указанные одноцепочечные конструкции экспрессировали в клетках и охарактеризовывали с использованием эксклюзионной хроматографии (фиг.46) и по связыванию с антителами, специфичными к F RSV (фиг.47).

Для дальнейшей охарактеризации конструкции F RSV № 9 (scF № 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669), трехмерную структуру этого белка решали с использованием рентгеновской кристаллографии (см. фиг.48-51). Кубические кристаллы выращивали с использованием способа диффузии пара в резервуарном растворе 1,19 M Li₂SO₄, 3,33% PEG 400, 0,12 M MgSO₄, 0,1 M NaOAc pH 5,5. Кристаллы выращивали до ~120 мкм, а затем их быстро замораживали в резервуарном растворе, содержавшем 2 M сульфат лития. Данные дифракции получали до разрешения 3,2 Å с погрешностью интенсивности 2,84. Кристаллическую структуру, которая проиллюстрировала положение линкера GS в конструкции № 9 (фиг.49 и 50), использовали для прогнозирования положение других размеров линкеров (фиг.51), и в качестве основы для конструирования дополнительных одноцепочечных конструкций с BZGJ9-1 по 9-10 (см. фиг.55). Кодон-оптимизированные гены одноцепочечных конструкций с C-концевым мотивом тримеризации фибритина T4, 6x His-меткой и StreptagII синтезировали и субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, происходящий из pLEXm. Плазмиды, экспрессирующие RSV F(+) Fd, трансфицировали в HEK293 GnTI-/-.

Клетки в суспензии. Через 4-5 суток клеточный супернатант собирали, центрифугировали, фильтровали и концентрировали. Белок первоначально очищали с помощью смолы Ni2+-NTA (Qiagen, Valencia, CA) с использованием буфера для элюирования, состоящего из 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl, и 250 мМ имидазол pH 8,0. Затем комплекс концентрировали и далее очищали над смолой StrepTactin в соответствии с инструкциями изготовителя (Novagen, Darmstadt, Germany). После инкубации в течение ночи с протеазой тромбином (Novagen) для удаления меток His и Strep, к комплексу добавляли избыток Fab D25, который затем очищали на колонке для гель-фильтрации Superdex-200 (GE Healthcare) с подвижным буфером 2 мМ Tris-HCl pH 7,5, 350 мМ NaCl, и 0,02% NaN3 или фосфатно-солевым буфером (PBS) pH7,4. Продукты единого гена одноцепочечная конструкция-ферритин экспрессировали и очищали аналогичным образом.

Несколько одноцепочечных конструкций отбирали для исследования иммуногенности в моделях на животных (фиг.53). Все из BZGJ9 DS-Cav1, BZGJ9, BZGJ11 DS-Cav1 (мономер), BZGJ10 (фракции мономеров и тримеров), BZGJ8 (мономер), BZGJ4 DS-Cav1 и BZGJ11 DS-Cav1-синтаза лумазина (60-мерный олигомер) также исследовали в отношении иммуногенности в группах из 10 мышей CB6F1/J посредством инъекции 10 мкг белка в присутствии 50 мкг поли I:C на 0 неделе и 3 неделе. Сыворотки, полученные на 5 неделе, исследовали в отношении иммуногенности. Контрольные группы F RSV подтипа A DS-Cav1 и белка в образующейся после слияния конформации также исследовали и иммунизировали аналогичным образом.

Для оценки нейтрализации против RSV подтипа A и подтипа B, сыворотки от иммунизированных животных распределяли в качестве четырехкратных разведений от 1:10 до 1:40960, смешивали с равным объемом рекомбинантного mKate-RSV, экспрессирующего прототипные гены F подтипа A (штамм A2) или подтипа B (штамм 18537) и флуоресцентный белок Katushka, и инкубировали при 37°C в течение 1 ч. Далее, 50 смеси каждого разведения сыворотки/вируса добавляли к клеткам HEp-2, которые были посеяны при плотности 1,5x10⁴ в 30 мкл MEM (минимальная поддерживающая среда) в каждой лунке 384-луночных черных планшетов с оптическим дном и инкубировали в течение 20-22 ч, а затем проводили спектрофотометрический анализ при возбуждении 588 нм и испускании 635 нм (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, CA). IC50 для каждого образца вычисляли посредством аппроксимации кривой и нелинейной регрессии с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA). Величины P-определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты нейтрализации демонстрируют, что все исследованные одноцепочечные конструкции являются иммуногенными.

Одноцепочечные конструкции связывали с ферритином для получения наночастиц ферритина, включающих антигены scF (фиг.56). В кратком изложении, C-конец полипептида F1, включенного в белок scF, связывали с ферритином, и рекомбинантный белок экспрессировали в клетках для продуцирования наночастиц scF-ферритин. Одним примером является белок "BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin" (SEQ ID NO: 1429), который включает рекомбинантный одноцепочечный белок F RSV, включающий линкер GS между положениями 105 и 145 F RSV и субъединицу ферритина, связанную с положением 513 белка F RSV через гетерологичный пептидный линкер, полученный путем связывания C-конца полипептида F1 в scF № 9 с субъединицей ферритина. Наночастицы scF-ферритин экспрессировали, очищали и охарактеризовывали в отношении стабильности при различных температурах, pH и осмолярности (фиг.57). Кроме того, наночастицы ферритина вводили животным для демонстрации того, что они являются иммуногенными (фиг.58). Три исследованных конструкции представляли собой RSV F DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin (SEQ ID NO: 1429) и scF № 9 (также называемую BZGJ9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). Они имеют одинаковую иммуногенность/нейтрализацию, как описано выше.

Несколько одноцепочечных последовательностей представлено в SEQ ID NO, приведенных в таблице 19, также как и указание на подход для конструирования.

Выход белка вычисляли для нескольких рекомбинантных белков F, и он показан ниже в таблице 27.

Пример 11

Структура белка F RSV из штамма B18537 с мутациями DSCav1

В этом примере проиллюстрировано сходство белков RSV со стабилизирующими заменами DSCav1 среди подтипов RSV. Замены DSCav1 вносили в белок F RSV из штамма B18537. Трехмерную структуру полученного рекомбинантного белка, включая C-концевой домен Foldon, решали с использованием способов, сходных со способами, описанными выше. Как показано на фиг.59-62, замены DSCav1 можно было последовательно вносить в гликопротеин F RSV подтипа B для стабилизации антигенного участка ∅ для получения мутанта DSCav1 на фоне подтипа B, который специфически связывается с антителами, специфичными к предшествующей слиянию конформации. В таблице 25 ниже представлено обобщение кристаллографических данных для DSCav1 на F RSV подтипа B.

Пример 12

Конструирование и продуцирование рекомбинантных белков F RSV без домена тримеризации.

В этом примере иллюстрируется конструирование и продуцирование рекомбинантных белков F RSV, которые являются стабилизированными в предшествующей слиянию конформации, но которые не включают C-концевой домен тримеризации для поддержания стабильности проксимальной относительно мембраны доли белка F RSV.

В кратком изложении, вместо C-концевого домена тримеризации, кольцо из дисульфидных связей вносят на C-конец полипептида F1 путем замены остатков цистеина аминокислотами спирали α10. Три спирали α10 эктодомена F RSV образовывали двойную спираль, которая стабилизировала проксимальную относительно мембраны часть белка. При экспрессии в клетках между остатками цистеина, внесенными в спираль α10, образуются дисульфидные связи между протомерами, тем самым "фиксируя" три спирали α10 близко вблизи друг от друга и препятствуя передвижению проксимального относительно мембраны домена из предшествующей слиянию в образующуюся после слияния конформацию. Спираль α10 белка F RSV включает остатки от 492 до трансмембранного домена (остаток 529).

В этом примере рекомбинантный белок F RSV со стабилизирующим цистеиновым кольцом первоначально экспрессируют в качестве рекомбинантного белка, который включает домен тримеризации. Домен тримеризации можно протеолитически удалять после первоначальной экспрессии. Расщепление можно проводить до, после или в процессе очистки белка F RSV. В настоящее время авторы настоящего изобретения очищают белок F RSV с использованием тандемной Ni2+ IMAC и стадий иммобилизации на стрептацине через C-концевую метку His6 и StrepII, с последующим расщеплением тромбином при комнатной температуре в течение 12 часов, а затем отделением foldon от белка F RSV эксклюзионной хроматографией. Также является возможным очистка расщепленного белка F RSV ионообменной хроматографией.

На фиг.63-68 представлены результаты гель-фильтрации и окрашивания кумасси синим при восстанавливающем и невосстанавливающем анализе PAGE нескольких из рекомбинантных белков F без домена тримеризации, конструкции которых приведены ниже. В таблице 22 представлены антигенные и физические характеристики указанных конструкций, которые включают замены DSCav1 и замены на цистеин в спирали α10 в положениях 525 и 526 (CCTail4xFd), 512 и 513 (CCTail5xFd), 519 и 520 (CCTail6xFd), и 512 и 512 (CCLongxFd). Соответствующая SEQ ID NO для каждой конструкции представлена на фиг.66.

Несколько последовательностей белка F RSV без доменов тримеризации или с отщепляемым доменом тримеризации представлены в SEQ ID NO, приведенных в таблице 23, также как и указание на подход для конструирования. Указаны название, α10 цистеиновое кольцо, присутствие или отсутствие C-концевого Foldon или отщепляемого Foldon, фоновая последовательность (например, "DSCAV1" указывает на то, что конструкция включает замены DSCav1), концепция конструирования и соответствующий SEQ ID NO. В таблице 23 используют следующие сокращенные обозначения: DSCAV1: замены S155C, S290C, S190F, V207L; Op - оптимизированная двойная спираль; OpCC - оптимизированная двойная спираль с дисульфидами; InterC - дисульфид между протомерами на C-концевой спирали; Multi-InterC - стабилизация посредством множественных дисульфидов между протомерами; ECC: увеличенная стабильность двойной спирали; FP-CC: Cys-мостик пептида слияния; 190P: 190 альтернативная аминокислота кармана; Fd (неотщепляемый Foldon), xFd (отщепляемый foldon), N (нет Foldon); CFM: заполняющая полость мутация; ICFM: заполняющие полость мутации поверхности контакта.

Рекомбинантные белки F RSV с отщепляемым доменом тримеризации или без него, приведенные в таблице 23, экспрессировали в клетках в условиях, при которых белки секретируются из клеток в клеточную среду, как описано выше в примере 9. Каждая конструкция содержит лидерную последовательность, которая приводит к тому, что белок попадает в секреторную систему и секретируется. Затем среду центрифугировали и супернатант использовали для исследования антигенности по связыванию с антителом D25, специфичным к участку ∅, и антителом мотавизумабом, специфичным к участку II ("Mota", фиг.69A-69E). Исследованные условия включают связывание D25 и Mota на 0 сутки (условия 1 и 2), связывание D25 и Mota на 0 сутки после инкубации при 70°C в течение одного часа (условия 3 и 4), и связывание D25 и Mota после 1 недели при 4°C (условия 5 и 6). Контроль представляет собой конструкцию DSCav1 с доменом Foldon. Конкретные данные об антигенности для каждой конструкции представлены на фиг.69A-69E (исследованные условиях указаны в строках заголовков).