Диагностика на основе эффекторной системы crispr - RU2020115264A

1. Латеральное проточное устройство, содержащее подложку, содержащую первый конец, причем первый конец содержит часть для загрузки образцов и первую область, в которую загружают обнаруживаемый лиганд, эффекторную систему CRISPR, конструкцию для обнаружения, первую область захвата, содержащую первый связывающий агент, и вторую область захвата, содержащую второй связывающий агент, причем эффекторная система CRISPR содержит эффекторный белок CRISPR и одну или более направляющих последовательностей, при этом каждая направляющая последовательность сконструирована для связывания одной или более целевых молекул.

2. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что конструкция для обнаружения содержит

олигонуклеотид РНК или ДНК, содержащий первую молекулу на первом конце и вторую молекулу на втором конце.

3. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что часть для загрузки образцов дополнительно содержит один или более амплификационных реагентов для амплификации одной или более целевых молекул.

4. Латеральное проточное устройство по п. 3, отличающееся тем, что реагенты для амплификации одной или более целевых молекул РНК включают амплификацию на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA), петлеопосредованную изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с замещением цепей (SDA), геликазо-зависимую амплификацию (HDA), реакцию амплификации с ферментом, создающим одноцепочечный разрыв (NEAR), ПЦР, амплификацию со множественным замещением (MDA), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), лигазную цепную реакцию (LCR) или рамификационный метод амплификации (RAM).

5. Латеральное проточное устройство по п. 2, отличающееся тем, что первая молекула представляет собой ФИТЦ, а вторая молекула представляет собой биотин, или наоборот.

6. Латеральное проточное устройство по п. 5, отличающееся тем, что первая область захвата расположена вблизи и в том же конце латеральной проточной подложки, что и часть для загрузки образцов.

7. Латеральное проточное устройство по п. 5, отличающееся тем, что первая область захвата содержит первый связывающий агент, который специфически связывает первую молекулу репортерной конструкции.

8. Латеральное проточное устройство по п. 7, отличающееся тем, что первый связывающий агент представляет собой антитело, которое зафиксировано или иным образом иммобилизовано в первой области захвата.

9. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что вторая область захвата расположена в направлении противоположного конца латеральной проточной подложки относительно первой области связывания.

10. Латеральное проточное устройство по п. 9, отличающееся тем, что вторая область захвата содержит второй связывающий агент, который специфически связывает вторую молекулу репортерной конструкции или обнаруживаемый лиганд.

11. Латеральное проточное устройство по п. 10, отличающееся тем, что второй связывающий агент представляет собой антитело или антитело-связывающий белок, которые зафиксированы или иным образом иммобилизованы во второй области захвата.

12. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что обнаруживаемый лиганд представляет собой наночастицу золота.

13. Латеральное проточное устройство по п. 12, отличающееся тем, что наночастица золота модифицирована связывающим агентом, который специфически связывает вторую молекулу конструкции для обнаружения.

14. Латеральное проточное устройство по п. 13, отличающееся тем, что первое антитело представляет собой анти-ФИТЦ антитело.

15. Латеральное проточное устройство по п. 8, отличающееся тем, что антитело представляет собой анти-ФИТЦ антитело.

16. Латеральное проточное устройство по п. 8, отличающееся тем, что антитело представляет собой антитело к биотину.

17. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что подложка представляет собой подложку из гибких материалов.

18. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что подложка из гибких материалов представляет собой бумажную подложку или подложку на основе гибкого полимера.

19. Латеральное проточное устройство по п. 18, отличающееся тем, что эффекторный белок CRISPR представляет собой РНК-нацеленный эффекторный белок, ДНК-нацеленный белок или их комбинацию.

20. Латеральное проточное устройство по п. 19, отличающееся тем, что РНК-нацеленный эффекторный белок представляет собой Cas13.

21. Латеральное проточное устройство по п. 20, отличающееся тем, что эффекторный белок Cas13 получен из организма рода, выбранного из группы, состоящей из: Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter и Lachnospira.

22. Латеральное проточное устройство по п. 21, отличающееся тем, что эффекторный белок Cas13 получен из организма, выбранного из группы, состоящей из: Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; Lachnospiraceae bacterium MA2020; Lachnospiraceae bacterium NK4A179; [Clostridium] aminophilum DSM 10710; Carnobacterium gallinarum DSM 4847; Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (локусы второго CRISPR); Paludibacter propionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317; Listeriaceae bacterium FSL M6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus SB 1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; Eubacteriaceae bacterium CHKCI004; вида Blautia Marseille-P2398 и вида Leptotrichia, перорального таксона, шт. 879. F0557. Двенадцатью (12) дополнительными неограничивающими примерами являются: Lachnospiraceae bacterium NK4A144; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; вида Thalassospira TSL5-1; вида Pseudobutyrivibrio OR37; вид Butyrivibrio YAB3001; вид Blautia Marseille-P2398; вид Leptotrichia Marseille-P3007; Bacteroides ihuae; Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA; Listeria riparia и Insolitispirillum peregrinum.

23. Латеральное проточное устройство по п. 22, отличающееся тем, что эффекторный белок Ca13 представляет собой эффекторный белок C2c2 L. wadei F0279 или L. wadei F0279 (Lw2).

24. Латеральное проточное устройство по п. 19, отличающееся тем, что ДНК-нацеленный эффекторный белок представляет собой Cas12.

25. Латеральное проточное устройство по п. 24, отличающееся тем, что Cas12 представляет собой Cpf1, C2c1 или их комбинацию.

26. Латеральное проточное устройство по любому из пп. 1–25, отличающееся тем, что одна или более направляющих последовательностей являются диагностическими в отношении болезненного состояния.

27. Латеральное проточное устройство по п. 26, отличающееся тем, что болезненное состояние представляет собой рак.

28. Латеральное проточное устройство по п. 26, отличающееся тем, что болезненное состояние представляет собой аутоиммунное заболевание.

29. Латеральное проточное устройство по п. 26, отличающееся тем, что болезненное состояние представляет собой инфекцию.

30. Латеральное проточное устройство по п. 29, отличающееся тем, что инфекция вызвана вирусом, бактерией, грибком, простейшим или паразитом.

31. Латеральное проточное устройство по п. 30, отличающееся тем, что инфекция является вирусной инфекцией.

32. Латеральное проточное устройство по п. 31, отличающееся тем, что вирусная инфекция вызвана ДНК-вирусом.

33. Латеральное проточное устройство по п. 32, отличающееся тем, что ДНК-вирус представляет собой Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (включая вирус герпеса человека и вирус ветряной оспы), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (включая вирус африканской чумы свиней), Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polydnaviruses, Polyomaviridae (включая вирус обезьян 40, вирус JC, вирус BK), Poxviridae (включая коровью оспу и черную оспу), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus, Rhizidovirus.

34. Латеральное проточное устройство по п. 31, отличающееся тем, что вирусная инфекция вызвана вирусом, содержащим двухцепочечную РНК, вирусом, содержащим положительно-полярную РНК, вирусом, содержащим отрицательно-полярную РНК, ретровирусом или их комбинацией.

35. Латеральное проточное устройство по п. 34, отличающееся тем, что вирусная инфекция вызвана коронавирусом, пикорнавирусом, калицивирусом, флавивирусом, тогавирусом, борнавирусом, филовирусом, парамиксовирусом, пневмовирусом, рабдовирусом, аренавирусом, буньявирусом, ортомиксовирусом или дельтавирусом.

36. Латеральное проточное устройство по п. 35, отличающееся тем, что вирусная инфекция вызвана коронавирусом, SARS, полиовирусом, риновирусом, вирусом гепатита A, вирусом Норуолк, вирусом желтой лихорадки, вирусом Западного Нила, вирусом гепатита C, вирусом лихорадки Денге, вирусом Зика, вирусом краснухи, вирусом Росс-ривер, вирусом Синдбис, вирусом Чикунгунья, вирусом болезни Борна, вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом кори, вирусом свинки, вирусом Нипах, вирусом Хендра, вирусом ньюкаслской болезни, респираторным синцитиальным вирусом человека, вирусом бешенства, вирусом Ласса, хантавирусом, вирусом конго-крымской геморрагической лихорадки, вирусом гриппа или вирусом гепатита D.

37. Латеральное проточное устройство по п. 30, отличающееся тем, что инфекция является бактериальной инфекцией.

38. Латеральное проточное устройство по п. 37, отличающееся тем, что бактерия, вызывающая бактериальную инфекцию, представляет вид Acinetobacter, вид Actinobacillus, вид Actinomycetes, вид Actinomyces, Aerococcus species вид Aeromonas, вид Anaplasma, вид Alcaligenes, вид Bacillus, вид Bacteriodes, вид Bartonella, вид Bifidobacterium, вид Bordetella, вид Borrelia, вид Brucella, вид Burkholderia, вид Campylobacter, вид Capnocytophaga, вид Chlamydia, вид Citrobacter, вид Coxiella, вид Corynbacterium speces, вид Clostridium, вид Eikenella, вид Enterobacter, вид Escherichia, вид Enterococcus, вид Ehlichia, вид Epidermophyton, вид Erysipelothrix, вид Eubacterium, вид Francisella, вид Fusobacterium, вид Gardnerella, вид Gemella, вид Haemophilus, вид Helicobacter, вид Kingella, вид Klebsiella, вид Lactobacillus, вид Lactococcus, вид Listeria, вид Leptospira, вид Legionella, вид Leptospira, Leuconostoc, вид Mannheimia, вид Microsporum, вид Micrococcus, вид Moraxella, вид Morganell, вид Mobiluncus, вид Micrococcus, Mycobacterium, вид Mycoplasm, вид Nocardia, вид Neisseria, вид Pasteurelaa, вид Pediococcus, вид Peptostreptococcus, вид Pityrosporum, вид Plesiomonas, вид Prevotella, вид Porphyromonas, вид Proteus, вид Providencia, вид Pseudomonas, вид Propionibacteriums, вид Rhodococcus, вид Rickettsia, вид Rhodococcus, вид Serratia, вид Stenotrophomonas, вид Salmonella, вид Serratia, вид Shigella, вид Staphylococcus, вид Streptococcus, вид Spirillum, вид Streptobacillus, вид Treponema, вид Tropheryma, вид Trichophyton, вид Ureaplasma, вид Veillonella, вид Vibrio, вид Yersinia, вид Xanthomonas или их комбинацию.

39. Латеральное проточное устройство по п. 30, отличающееся тем, что инфекция вызвана грибком.

40. Латеральное проточное устройство по п. 39, отличающееся тем, что грибок представляет собой Aspergillus, Blastomyces, Candidiasis, Coccidiodomycosis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, вид Histoplasma (такой как Histoplasma capsulatum), вид Pneumocystis (такой как Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (такой как Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, глазные грибковые инфекции, трихофитию, Exserohilum, Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, вид Hansenula, вид Candida, вид Kluyveromyces, вид Debaryomyces, вид Pichia, вид Penicillium, вид Cladosporium, вид Byssochlamys или их комбинацию.

41. Латеральное проточное устройство по п. 30, отличающееся тем, что инфекция вызвана простейшим.

42. Латеральное проточное устройство по п. 41, отличающееся тем, что простейшее представляет собой Euglenozoa, Heterolobosea, Diplomonadida, Amoebozoa, Blastocystic, Apicomplexa или их комбинацию.

43. Латеральное проточное устройство по п. 30, отличающееся тем, что инфекция вызвана паразитом.

44. Латеральное проточное устройство по п. 43, отличающееся тем, что паразит представляет собой Trypanosoma cruzi (болезнь Шагаса), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae и Toxoplasma gondii или их комбинацию.

45. Латеральное проточное устройство по п. 1, отличающееся тем, что образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.

46. Латеральное проточное устройство по п. 45, отличающееся тем, что биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, кал, мокроту, слизь, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асциты, плевральный выпот, серому, слюну, цереброспинальную жидкость, внутриглазную жидкость или стекловидное тело или любые выделения организма, транссудат, экссудат (например, жидкость, полученную из абсцесса или любого другого участка инфекции или воспаления) или жидкость, полученную из сустава (например, нормального сустава или сустава, пораженного заболеванием, таким как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит), или мазок с поверхности кожи или слизистой оболочки.

47. Латеральное проточное устройство по п. 45, отличающееся тем, что образец окружающей среды получен из пробы пищи, бумажной поверхности, ткани, металлической поверхности, деревянной поверхности, пластиковой поверхности, пробы почвы, пробы свежей воды, пробы сточной воды, пробы соленой воды, или их комбинации.

48. Латеральное проточное устройство по п. 31, отличающееся тем, что болезненное состояние представляет собой инфекцию, заболевание органа, заболевание крови, заболевание иммунной системы, рак, заболевание головного мозга и нервной системы, эндокринное заболевание, беременность или связанное с рождением ребенка заболевание, наследственное заболевание или приобретенное вследствие влияния окружающей среды заболевание.

49. Латеральное проточное устройство по п. 26, отличающееся тем, что указанное болезненное состояние характеризуется наличием или отсутствием гена, или транскрипта, или полипептида резистентности или восприимчивости к антибиотику или лекарственному препарату, предпочтительно в патогене или клетке.

50. Латеральное проточное устройство по п. 49, отличающееся тем, что одна или более направляющих молекул идентифицируют биологический материал.

51. Латеральное проточное устройство по п. 50, отличающееся тем, что биологический материал представляет собой генетически модифицированный материал.

52. Латеральное проточное устройство по п. 51, отличающееся тем, что генетически модифицированный материал представляет собой генетически модифицированное растение.

53. Латеральное проточное устройство по п. 2, отличающееся тем, что первая молекула представляет собой ФИТЦ, а вторая молекула представляет собой ФАМ.

54. Латеральное проточное устройство по п. 35, отличающееся тем, что вирусная инфекция вызвана вирусом лихорадки Денге.

55. Латеральное проточное устройство, содержащее подложку, содержащую первый конец, причем первый конец содержит часть для загрузки образцов и первую область, в которую загружают обнаруживаемый лиганд, две или более эффекторных систем CRISPR, две или более конструкций для обнаружения, одну или более первых областей захвата, каждая из которых содержит первый связывающий агент, две или более вторых областей захвата, каждая из которых содержит второй связывающий агент, причем каждая из двух или более эффекторных систем CRISPR содержит эффекторный белок CRISPR и одну или более направляющих последовательностей, при этом каждая направляющая последовательность сконструирована для связывания одной или более целевых молекул.

56. Латеральное проточное устройство по п. 55, отличающееся тем, что каждая из двух или более конструкций для обнаружения содержит РНК- или ДНК-олигонуклеотид, содержащий первую молекулу на первом конце и вторую молекулу на втором конце.

57. Латеральное проточное устройство по п. 56, содержащее две эффекторные системы CRISPR и две конструкции для обнаружения.

58. Латеральное проточное устройство по п. 56, содержащее четыре эффекторные системы CRISPR и четыре конструкции для обнаружения.

59. Латеральное проточное устройство по п. 55, отличающееся тем, что часть для загрузки образцов дополнительно содержит один или более амплификационных реагентов для амплификации одной или более целевых молекул.

60. Латеральное проточное устройство по п. 57, отличающееся тем, что первая конструкция для обнаружения содержит ФАМ в качестве первой молекулы и биотин в качестве второй молекулы, или наоборот, а вторая конструкция для обнаружения содержит ФАМ в качестве первой молекулы и дигоксигенин (ДИГ) в качестве второй молекулы, или наоборот.

61. Латеральное проточное устройство по п. 60, отличающееся тем, что эффекторный белок CRISPR представляет собой РНК-нацеленный эффекторный белок.

62. Латеральное проточное устройство по п. 61, отличающееся тем, что РНК-нацеленный эффекторный белок представляет собой C2c2.

63. Латеральное проточное устройство по п. 19, отличающееся тем, что РНК-нацеленный эффекторный белок представляет собой Cas13b.

64. Латеральное проточное устройство по п. 58, отличающееся тем, что первая конструкция для обнаружения содержит Tye665 в качестве первой молекулы и Alexa-fluor-488 в качестве второй молекулы, или наоборот; вторая конструкция для обнаружения содержит Tye665 в качестве первой молекулы и ФАМ в качестве второй молекулы, или наоборот; третья конструкция для обнаружения содержит Tye665 в качестве первой молекулы и биотин в качестве второй молекулы, или наоборот; а четвертая конструкция для обнаружения содержит Tye665 в качестве первой молекулы и ДИГ в качестве второй молекулы, или наоборот.

65. Латеральное проточное устройство по п. 64, отличающееся тем, что эффекторный белок CRISPR представляет собой РНК-нацеленный или ДНК-нацеленный эффекторный белок.

66. Латеральное проточное устройство по п. 65, отличающееся тем, что РНК-нацеленный эффектор представляет собой C2c2.

67. Латеральное проточное устройство по п. 65, отличающееся тем, что РНК-нацеленный эффектор представляет собой Cas13b.

68. Латеральное проточное устройство по п. 65, отличающееся тем, что ДНК-нацеленный эффекторный белок представляет собой Cas12a.

69. Способ обнаружения целевой нуклеиновой кислоты в образце, включающий приведение образца в контакт с первым концом латерального проточного устройства по любому из пп. 1–53, содержащим часть для загрузки образцов; причем образец протекает от части для загрузки образцов подложки в направлении первой и второй областей захвата и генерирует обнаруживаемый сигнал.

70. Способ по п. 54, отличающийся тем, что образец представляет собой жидкий образец или образец растворен в водном растворителе.

71. Способ по п. 54, отличающийся тем, что образец не содержит целевую нуклеиновую кислоту.

72. Способ по п. 56, отличающийся тем, что обнаруживаемый сигнал появляется в первой области захвата.

73. Способ по п. 54, отличающийся тем, что образец содержит целевую нуклеиновую кислоту.

74. Способ по п. 58, отличающийся тем, что обнаруживаемый сигнал появляется во второй области захвата.

75. Способ по пп. 58 или 59, отличающийся тем, что наличие целевой нуклеиновой кислоты является показательным для болезненного состояния.