Улучшенный способ дифференцировки - RU2018145539A
Код документа: RU2018145539A
Формула
1. Способ дифференцировки клеток-предшественников, включающий
культивирование клеток в дифференцировочной среде, содержащей минимальную среду и дополнительно содержащей один или несколько ингибиторов пути EGFR, ингибитор Notch и один или несколько ингибиторов Wnt.
2. Способ по п. 1, где один или несколько ингибиторов пути EGFR выбраны из: (1) ингибитора EGFR, (2) ингибитора EGFR и ErbB2, (3) ингибитора пути RAS-RAF-MAPK, (4) ингибитора пути PI3K/AKT и (5) ингибитора пути JAK/STAT.
3. Способ по п. 2, где один или несколько ингибиторов пути EGFR включают ингибитор EGFR, такой как гефитиниб.
4. Способ по п. 2 или 3, где один или несколько ингибиторов пути EGFR включают ингибитор EGFR и ErbB-2, такой как афатиниб.
5. Способ по любому из пп. 2-4, где один или несколько ингибиторов пути EGFR включают ингибитор пути RAS-RAF-MAPK, например, ингибитор MEK, такой как PD0325901, и/или ингибитор ERK, такой как SCH772984.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где ингибитор Notch является ингибитором гамма-секретазы, необязательно, DAPT или дибензодиазепином (DBZ), или бензодиазепином (BZ), или LY-411575.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где один или несколько ингибиторов Wnt выбраны из: (1) ингибитора секреции Wnt, (2) конкурентного или неконкурентного ингибитора взаимодействия между Wnt или R-спондином и рецепторным комплексом Wnt, (3) ингибитора, стимулирующего деградацию компонентов рецепторного комплекса Wnt, (4) ингибитора белков семейства Dishevelled, (5) активатора, стимулирующего активность деструктивного комплекса, (6) ингибитора деолигомеризации деструктивного комплекса и/или (7) ингибитора экспрессии гена-мишени β-катенина.
8. Способ по п. 7, где один или несколько ингибиторов Wnt включают ингибитор секреции Wnt, например, ингибитор Porc, выбранный из IWP 2, LGK974 и IWP 1.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где дифференцировочная среда содержит менее 1 мМ EGF.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где дифференцировочная среда дополнительно содержит
один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из: ингибитора p38, ингибитора TGF-бета, гастрина, глюкокортикоида, лиганда рецепторных тирозинкиназ, активатора пути BMP, активатора пути цАМФ, активатора Hedgehog, ингибитора Hedgehog, модулятора передачи сигнала mTOR, B27 и N2; или
один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из: ингибитора p38, ингибитора TGF-бета, гастрина, глюкокортикоида, лиганда рецепторных тирозинкиназ, ингибитора BMP, активатора пути цАМФ, активатора Hedgehog, ингибитора Hedgehog, модулятора передачи сигнала mTOR, B27 и N2; или
активатор BMP, такой как BMP7, BMP4 или BMP2; или
ингибитор BMP, такой как Noggin, склеростин, хордин, CTGF, фоллистатин, гремлин, tsg, sog, LDN193189 или дорсоморфин.
11. Дифференцировочная среда, описанная в любом из пп. 1-10.
12. Способ дифференцировки клеток-предшественников кишечника для получения популяции клеток кишечника, обогащенной аргентофильными клетками, включающий:
культивирование клеток-предшественников кишечника в дифференцировочной среде по п. 11.
13. Способ культивирования эпителиальных стволовых клеток, включающий:
культивирование эпителиальных стволовых клеток в присутствие среды для выращивания эпителиальных стволовых клеток для получения выращенных эпителиальных стволовых клеток; а затем
культивирование одной или нескольких выращенных клеток в дифференцировочной среде по п. 11.
14. Способ по любому из пп. 1-10, 12 и 13, где клетки культивируют в контакте с внеклеточным матриксом.
15. Способ по любому из пп. 1-10 и 12-14, где способ дополнительно включает получение и/или выделение популяции дифференцированных клеток или дифференцированного органоида.
16. Способ по любому из пп. 1-10 и 13-15, где клетки-предшественники являются эпителиальными клетками, например, из кишечника, желудка, поджелудочной железы, печени, предстательной железы, легких, молочной железы, яичника, слюнной железы, волосяного фолликула, кожи, пищевода, мочевого пузыря, уха или щитовидной железы.
17. Способ по п. 16, где клетки-предшественники получают из кишечника, желудка, поджелудочной железы или легких.
18. Способ по любому из пп. 1-10 и 12-17, где клетки-предшественники являются клетками-предшественниками млекопитающих, например, клетками-предшественниками человека.
19. Способ культивирования эпителиальных стволовых клеток кишечника, предпочтительно, для получения дифференцированного органоида кишечника, включающий:
культивирование одной или нескольких эпителиальных стволовых клеток кишечника, приведенных в контакт с внеклеточным матриксом, в присутствие среды для выращивания; предпочтительно, где среда для выращивания содержит минимальную среду и дополнительно содержит: лиганд рецепторных тирозинкиназ, ингибитор BMP и агонист Wnt и, необязательно, вальпроевую кислоту и ингибитор GSK-3 (например, CHIR99021); а затем
культивирование одной или нескольких выращенных эпителиальных стволовых клеток кишечника, приведенных в контакт с внеклеточным матриксом, в присутствие дифференцировочной среды по п. 11.
20. Органоид, получаемый или полученный способом по любому из пп. 1-10 и 12-19.
21. Органоид по п. 20, где органоид получают из печени, поджелудочной железы, кишечника, желудка, предстательной железы, легких, молочной железы, яичника, слюнной железы, волосяного фолликула, кожи, пищевода, мочевого пузыря, уха или щитовидной железы, предпочтительно, из кишечника, желудка, поджелудочной железы или легкого.
22. Органоид по п. 20 или 21, где органоид получают из человека, и в котором по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 99% клеток экспрессируют маркеры аргентофильных клеток.
23. Органоид по п. 20 или 21, где органоид получают из мыши, и в котором по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 99% клеток экспрессируют маркеры аргентофильных клеток.
24. Органоид по п. 22 или 23, где маркеры аргентофильных клеток выбраны из Chga, Chgb, Tac1, Tph1, Gip, Fabp5, Ghrl, Pyy, Nts, Neurod1, Sst, Sct, холецистокинина, глюкагона и/или проглюкагона.
25. Композиция, содержащая органоид, например, по любому из пп. 20-24, и дифференцировочную среду по п. 11.
26. Применение органоида по любому из пп. 20-24 или клетки, полученной из указанного органоида, в скрининге для обнаружения лекарственных средств; анализе токсичности; диагностике; исследованиях эмбриологии ткани, линий клеток и путей дифференцировки; исследованиях для идентификации химических и/или нейронных сигналов, приводящих к высвобождению соответствующих гормонов; исследованиях экспрессии генов, включая экспрессию рекомбинантных генов; исследованиях механизмов, участвующих в повреждении и репарации ткани; исследованиях воспалительных и инфекционных заболеваний; исследованиях патогенетических механизмов или исследованиях механизмов трансформации клеток и этиологии злокачественных новообразований.
27. Органоид по любому из пп. 20-24 или клетка, полученная из указанного органоида для применения в медицине, например, лечении нарушения, состояния или заболевания.
28. Органоид или клетка, полученная из указанного органоида, для применения по п. 27, где медицина является регенеративной медициной, например, где применение включает трансплантацию органоида или клетки пациенту.
29. Фармацевтический состав, содержащий один или несколько ингибиторов пути EGFR, ингибитор Notch и один или несколько ингибиторов Wnt.
30. Способ скрининга терапевтического или профилактического фармацевтического лекарственного средства или косметического средства, включающий:
приведение дифференцированного органоида по любому из пп. 20-24 в контакт с молекулой-кандидатом (или библиотекой молекул-кандидатов),
оценку указанного органоида на любые эффекты (например, любое изменение в клетке, такое как снижение или утрата пролиферации, морфологическое изменение и/или гибель клеток) или изменение в органоиде (например, размера или подвижности органоида);
идентификацию молекулы-кандидата, вызывающей указанные эффекты, в качестве потенциального лекарственного средства или косметического средства; и, необязательно,
получение указанной молекулы-кандидата в качестве фармацевтического или косметического средства.
31. Способ индукции состояния покоя Lgr5+ стволовых клеток, включающий
обработку клеток одним или несколькими ингибиторами пути EGFR.
32. Способ по п. 31, где клетки имеют непрерывную экспрессию Lgr5, например, по результатам FACS, и/или передачу сигнала Wnt, например, по результатам анализа с использованием репортерных конструкций люциферазы pTOPFLASH и pFOPFLASHTcf.
33. Способ по п. 31 или 32, где о состоянии покоя свидетельствует утрата экспрессии KI67.
34. Способ по любому из пп. 31-33, где клетки обрабатывают одним или несколькими ингибиторами пути EGFR в течение по меньшей мере одной недели.
35. Популяция покоящихся стволовых клеток, полученная способом по любому из пп. 31-34, где клетки экспрессируют Lgr5 и Lef1 и не экспрессируют KI367 и маркер M-фазы фосфогистон H3.
36. Способ получения популяции клеток, обогащенной EEC, включающий культивирование популяции клеток в дифференцировочной среде по п. 11.
37. Способ получения популяции клеток, обогащенной GLP1-секретирующими EEC, включающий культивирование популяции клеток в дифференцировочной среде по п. 11, где дифференцировочная среда содержит ингибитор BMP.
38. Способ получения популяции клеток, обогащенной секретин-секретирующими EEC, включающий культивирование популяции клеток в дифференцировочной среде по п. 11, где дифференцировочная среда содержит активатор пути BMP.
39. Ингибитор BMP для применения в способе лечения или профилактики сахарного диабета или ассоциированного с ним заболевания или нарушения, где способ включает введение терапевтически эффективного количества ингибитора BMP нуждающемуся в этом индивидууму.
40. Активатор BMP для применения в способе лечения гиперхлоргидрии или ожирения, где способ включает введение терапевтически эффективного количества активатора BMP нуждающемуся в этом индивидууму.
