Устройство, способ и прибор для количественного анализа по меньшей мере одного конкретного компонента в пробе продукта - RU2200945C2

Чертежи

Описание

Изобретение относится к устройству для количественного или качественного анализа по меньшей мере одного компонента в пробе продукта, позволяющему осуществлять иммунологический анализ, а также к способу и прибору с использованием указанного устройства.

Были разработаны различные способы идентификации, обнаружения или определения количества анализируемых веществ в химических или биологических пробах.

Большинство этих способов основано на формировании комплексов, полученных в результате сродства между членами одной пары специфической связи.

Эти реакции типа лиганд/рецептор, являются, в частности, результатом взаимодействия между антигеном и специфическим антителом, или результатом гибридизации между двумя последовательностями комплементарных нуклеиновых кислот или феномена распознавания между сайтом связывания протеина, например фермента, гормона или другой биологической частицы, и ее лигандом, субстратом или рецептором.

Образование комплекса в результате сродства позволяет выявить присутствие искомого анализируемого вещества в пробе. Это анализируемое вещество при необходимости может быть определено количественно в случае, если возможно отделить комплексные формы от форм, оставшихся в свободном виде, или измерить степень занятости специфических лигандов анализируемого вещества.

Такой метод обнаружения и определения количества анализируемого вещества, присутствующего в пробе, находящегося иногда в виде следов, представляет большой интерес для исследовательских или аналитических лабораторий, в частности, для лабораторий клинического или биологического анализа.

Однако для использования их в повседневной практике необходимо, чтобы такие методы могли применяться одновременно на большом количестве проб. Кроме того, часто бывает необходимо выполнить несколько тестов на одном и том же образце.

Поэтому в большинстве случаев протоколы обычных анализов, проводимых вручную, включают в себя несколько последовательных реакций и этапов. Эти многочисленные тесты выполняются на серийных образцах в очень крупных центрах, где за один день приходится тестировать несколько десятков тысяч образцов. Для выполнения многочисленных тестов требуется довольно много времени. Кроме того, необходимость выполнения последовательных операций может привести к ошибкам в результатах.

Таким образом, довольно быстро возникла проблема автоматизации проведения тестов такого типа, и для ее решения были разработаны различные устройства для автоматизации или, по крайней мере, для упрощения вышеназванных последовательных этапов.

Большинство этих устройств остаются относительно сложными или приспособленными к обнаружению одного типа анализируемого вещества (клетки или молекулы) или же позволяют выполнять только качественные анализы. Такие устройства, в частности, описаны в документах ЕР 0339277 и ЕР 0426729.

В частности, в патенте ЕР 0339277 описывается устройство для проведения последовательных аналитических реакций при определении количества анализируемого вещества в жидком исследуемом образце с использованием аналитических реакций между анализируемым веществом и аналитическими реактивами, которые взаимодействуют с анализируемым веществом для получения ответа, получаемого в зависимости от анализируемого вещества.

Это устройство содержит закрытый резервуар, имеющий горизонтальную ось вращения. Закрытый резервуар ограничен снаружи цилиндрической стенкой и содержит внутри две концентрические стенки в виде ложки, которые определяют между собой зону впуска пробы. Между стенками в форме ложки и цилиндрической периферической стенкой находится несколько реакционных зон, в которые помещены специальные аналитические реактивы.

Согласно этому патенту образец вводят через входной канал в камеру впуска, образованную между стенками в форме ложки и выходящую к реакционным зонам. При вращении названного резервуара в соответствии с движением "маятника" вокруг его горизонтальной оси, жидкий образец под действием силы тяжести перетекает в реакционные зоны, где он вступает во взаимодействие с реактивами, затем он перемещается в зону для исследования, расположенную в центре резервуара.

Такое устройство было разработано, главным образом, для того, чтобы избежать центрифугирование продукта во время количественного анализа.

Также, из патента JP HEI-5215750 известно устройство для обнаружения и анализа клеточных популяций, которое содержит горизонтальный кругообразный металлический диск, вращающийся вокруг вертикальной оси. Этот открытый диск покрыт антителами.

Диск приводят во вращение вокруг вертикальной оси таким образом, чтобы проба, введенная в его центр, равномерно распределялась под действием центробежной силы на диске.

Последующие этапы промывания выполняются таким же образом путем введения в центр диска промывающей жидкости, которая при вращении диска выводится к периферии, промывая поверхность, на которой зафиксирован определяемый компонент. Для рекуперации моющей жидкости предусмотрен резервуар, который помещен под диском.

Наконец, из документа WO 9425159 известно устройство для осуществления качественного и/или количественного анализа конкретного компонента в пробе продуктов, которое содержит практически кругообразный контейнер, установленный с возможностью вращения на пусковом валу в его центре, в котором устроены камеры для тестирования, располагающиеся по радиусам контейнера и имеющие градиент плотности. В центральной части контейнера предусмотрена кольцевая камера для центрифугирования, которая соединена с каждой тестирующей камерой.

Кольцевая камера для центрифугирования может быть разделена на две части, которые сообщаются между собой через верхнее отверстие.

Ограничительная стенка первой части камеры для центрифугирования наклонена таким образом, что перемещение вещества из первой части во вторую часть осуществляется переливанием за ограничительную стенку, через соединительное отверстие. Точно так же и ограничительная стенка второй части камеры центрифугирования наклонена таким образом, что перемещение смеси в каждую камеру для тестирования осуществляется путем переливания через соединительное отверстие между второй частью камеры центрифугирования и названными камерами для тестирования.

Угол наклона ограничительной стенки второй части камеры центрифугирования больше угла наклона ограничительной стенки первой части, поэтому при центрифугировании вещество перемещается сначала от первой части камеры центрифугирования, расположенной рядом с осью вращения контейнера, во вторую часть камеры центрифугирования, а затем перемещается в камеры для тестирования.

В основу изобретения поставлена задача создания нового анализирующего устройства, простого по конструкции и в использовании, которое может работать индивидуально с минимальным числом операций и позволяет производить анализ в непосредственной близости от места взятия пробы продукта, содержащего определенный анализируемый компонент, оптимизированной конструкции и, кроме того, которое позволяло бы проводить серийные исследования на небольших количествах проб.

В частности, согласно изобретению предлагается устройство для выполнения качественного и/или количественного анализа по меньшей мере одного определенного компонента в пробе продукта, путем мечения и фиксации, которое содержит контейнер и крышку, соединенные между собой, для образования закрытого резервуара.

Устройство характеризуется тем, что закрытый резервуар имеет вертикальную ось, контейнер и крышка имеют коаксиальные цилиндрические стенки, которые при монтаже устанавливаются парами одна против другой, образуя по меньшей мере три концентрические кольцевые камеры внутри резервуара, а именно, одну камеру впуска около оси, предназначенную для ввода пробы и, в случае необходимости, метки компонента, камеру фиксации и считывания названного меченого компонента, и камеру вывода, при этом цилиндрические коаксиальные стенки, образующие перегородки между последовательными кольцевыми камерами, содержат каждая по меньшей мере одно отверстие, а соединенные между собой крышка и контейнер установлены с возможностью вращения относительно друг друга вокруг вертикальной оси, а отверстия цилиндрических коаксиальных стенок контейнера и крышки размещены в определенных угловых положениях, таким образом, что при перемещении цилиндрических стенок каждой пары одной относительно другой, отверстия каждой пары стенок способны занимать положение одна против другой или под углом, чтобы соединять или изолировать друг от друга последовательные кольцевые камеры.

В соответствии с предпочтительным вариантом воплощения устройства отверстия, предусмотренные в цилиндрических коаксиальных стенках контейнера и крышки, расположены таким образом, чтобы отверстия одной пары цилиндрических стенок находились напротив друг друга для соединения двух последовательных кольцевых камер, а отверстия других пар цилиндрических стенок располагались сдвинутыми под углом таким образом, чтобы другие кольцевые камеры оставались изолированными.

В соответствии с другими вариантами воплощения устройства согласно изобретению на крышке и на контейнере имеются средства для установления их в заданном положении. Крышка имеет выступ на внешней поверхности одной из коаксиальных цилиндрических стенок, расположенных снаружи других цилиндрических стенок с образованием наружного периферического борта резервуара, причем этот выступ образует захват или опору, обеспечивающие вращение крышки вокруг вертикальной оси по отношению к контейнеру. Устройство согласно изобретению имеет поперечное центральное отверстие, изолированное от непосредственно примыкающей кольцевой камеры, и предназначенное для введения в него вертикального вращающегося приводного вала, который приводит во вращение названный резервуар.

В основании крышки или в основании контейнера может быть предусмотрено входное отверстие в камеру впуска.

В соответствии с одним из вариантов устройства предусмотрено, чтобы резервуар содержал между камерой впуска и камерой вывода несколько концентрических камер фиксации и считывания.

Устройство согласно изобретению имеет оптимизированную эргономичную форму. В частности, резервуар имеет форму диска.

Преимущественно, контейнер устройства выполнен из прозрачного материала, позволяющего считывать меченые фиксированные компоненты в камере фиксации и считывания через стенки резервуара. Крышка может быть непрозрачной или обработанной таким образом, чтобы устранить вредные излучения, причем считывание можно производить с помощью камеры CCD.

Устройство согласно изобретению предпочтительно содержит в камере фиксации по меньшей мере один рецептор анализируемого компонента, причем рецептор фиксируется в камере. Следует отметить, что под рецептором и лигандом в целом понимают два элемента, которые соединены прочными взаимодействиями, например, речь может идти как о паре антигены/антитела, так и о паре нуклеиновая кислота/ комплементарная нуклеиновая кислота или же истинный лиганд и рецептор или о других прочных взаимодействиях.

Специалисту в этой области техники хорошо известны способы, позволяющие фиксировать протеины (например, антигены, антитела) или нуклеиновые кислоты на поверхностях из пластика или даже из стекла. Речь идет об используемых в настоящее время методиках фиксации компонентов этого типа на стандартных чашеобразных пластинах, которые используются, например, в тесте ELISA, или которые могут быть адаптированы в зависимости от типа используемого полимерного материала.

Предпочтительно рецептор закрепляют на дне контейнера в виде монослоя таким образом, чтобы сделать считывание более легким и удобным. Действительно, если средством считывания является камера CCD, то излучение будет проходить через дно контейнера и будет или не будет модифицировано в результате присутствия меченого компонента, затем будет рекуперировано после второго прохода через дно контейнера.

Используемая методика во многом похожа на способы иммунологического анализа, называемого "сэндвич", когда обнаруживаемый элемент вступает в реакцию с рецептором, например с антителом, и сам метится другим элементом, его распознающим, который имеет либо физическую метку, т.е. частицы, либо химическую метку, например, с помощью флуоресцирующих элементов или тех, которые можно сделать флуоресцирующими.

В этой связи согласно предпочтительной характеристике изобретения, частицы, предназначенные для мечения, имеют определенный диаметр, преимущественно больше или равный 100 диаметрам анализируемого компонента или компонентов, и имеют оптические свойства, позволяющие их обнаруживать путем подсчета.

Под выражением "имеют оптические свойства" понимается тот факт, что названные частицы способны все световое излучение, испускаемое системой обнаружения, или часть его, направлять в свою сторону.

Хотя компонент можно метить перед его вводом в устройство, предпочтительно, чтобы предназначенный для мечения элемент, способный метить анализируемый компонент, помещался в камеру впуска, например, в сухой, нефиксированной форме. Речь может идти, например, о меченых антителах, распознающих один из эпитопов анализируемого антигена, причем другое антитело фиксируется в камере фиксации и мечения.

В устройстве согласно изобретению фиксированный рецептор выбран из группы, состоящей из
антител, антигенов, последовательностей комплементарных нуклеиновых кислот,
истинных рецепторов для анализа специфических компонентов, которыми являются антигены, антитела, последовательности нуклеиновых кислот, лиганды названных рецепторов.

При иммунологических анализах предпочитают использовать антиген или меченое антитело, чтобы определить дополнительный элемент и фиксировать другой дополнительный элемент в камере фиксации и считывания.

Возможно также осуществлять множественный анализ, позволяющий, при необходимости, определять количественное содержание нескольких антигенов или нескольких антител. Для этого достаточно, чтобы камера фиксации и считывания была разделена на множество угловых секторов, в которых фиксируются отличающиеся друг от друга рецепторы, каждый из которых предназначен для фиксации и для считывания другого меченого компонента. Для этого нужно, и это является особенно предпочтительным вариантом изобретения, чтобы один из угловых секторов камеры фиксации оставался без рецепторов и представлял собой контрольный сектор, который бы при инициализирующем считывании названного устройства выставлял ноль.

Считывание согласно изобретению может выполняться с помощью камеры CCD, которая может быть объединена в систему с информационным устройством, которое позволит воспроизвести результаты анализа каждого из элементов в зависимости от считываний, сделанных в разных секторах.

В соответствии с особенно предпочтительной характеристикой устройства согласно изобретению камера CCD способна подсчитывать произвольным образом, путем эмиссии приема светового сигнала, количество меченых фиксированных компонентов в каждой камере фиксации и считывания, чтобы получить цифровой сигнал обнаружения.

Это происходит при использовании частиц или микросфер для мечения одного или нескольких анализируемых компонентов в пробе, причем эти частицы имеют, преимущественно, размер, равный 100-кратному размеру искомых молекул, и способны отражать все или часть светового излучения, направляемого на частицы, причем отраженное излучение соответствует количеству явлений отражения на частицах, которое способна зарегистрировать камера CCD с последующей передачей на информационное устройство, которое выдает результат в абсолютных значениях и в реальном времени регистрируемых явлений.

Согласно изобретению предложен также способ количественного и/или качественного анализа по меньшей мере одного компонента в пробе продукта путем мечения и фиксации.

Этот способ отличается тем, что используют по меньшей мере одно устройство, которое содержит специфические рецепторы анализируемого компонента, фиксированные в каждой камере фиксации и считывания, в котором:
а) пробу продукта, содержащую меченый компонент, помещают в камеру впуска, изолированную от других кольцевых камер,
б) поворачивают крышку относительно контейнера таким образом, чтобы камера впуска соединилась с каждой камерой фиксации и считывания, а камера вывода осталась изолированной от других кольцевых камер,
в) устройство приводят во вращение вокруг его вертикальной оси таким образом, чтобы распределить путем центрифугирования в каждой камере фиксации и считывания пробу продукта, содержащую меченый компонент, при этом названный компонент соединяется путем прочного взаимодействия со специфическими рецепторами, фиксированными в каждой камере фиксации и считывания,
г) поворачивают крышку относительно контейнера таким образом, чтобы соединить камеру фиксации и считывания с камерой вывода,
д) устройство приводят во вращение вокруг оси таким образом, чтобы направить путем центрифугирования излишек пробы в камеру вывода,
е) устройство промывают изнутри с помощью моющей жидкости, которая направляется благодаря центрифугированию в разные кольцевые камеры устройства с осуществлением предыдущих стадий б), в), г) и д) таким образом, чтобы в каждой камере фиксации и считывания сохранялся только меченый компонент, связанный путем прочного взаимодействия с фиксированными рецепторами,
ж) меченый компонент обнаруживают и анализируют через стенку или стенки устройства.

Способ согласно изобретению является автоматизированным способом широкого спектра; он может применяться при обнаружении и подсчете веществ-мишеней, как в виде молекул, так и в виде частиц везикул или клеток.

Согласно изобретению предложен также прибор для реализации указанного способа, характеризующийся тем, что содержит вертикальный приводной вал для приведения во вращение, на который насажены устройства согласно изобретению, средства для поддержания названных устройств на расстоянии друг от друга, средства для приведения во вращение в двух направлениях названного вертикального приводного вала, средства инжектирования проб продукта и моющей жидкости в камеры впуска названных устройств, насаженных на приводной вал, и средства для поворота крышек устройств относительно контейнеров таким образом, чтобы соединять или изолировать последовательные кольцевые камеры, и средство считывания меченых фиксированных агентов (веществ).

Предлагаемый прибор позволяет автоматически при использовании устройства анализировать различные компоненты одной и той же пробы, или один и тот же конкретный компонент в нескольких пробах разных продуктов.

В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения изобретения со ссылками на сопровождающие чертежи, на которых:
фиг.1 изображает крышку устройства (вид сверху) согласно изобретению;
фиг.2 - разрез по линии 11-11 на фиг.1 согласно изобретению;
фиг.3 - контейнер (вид сверху) согласно изобретению;
фиг.4 - разрез по линии IV-IV на фиг.3 согласно изобретению;
фиг. 5 - две диаграммы обнаружения компонента в сыворотке с помощью флуоресценции и подсчета меченых микросфер согласно изобретению;
фиг. 6 - диаграммы обнаружения компонента в сыворотке методом ELISA и с помощью подсчета микросфер согласно изобретению.

Устройство для выполнения качественного и/или количественного анализа по меньшей мере одного компонента в пробе продукта путем мечения и фиксации показано на фиг.1-4.

Такое устройство используют предпочтительно для выполнения иммунологического анализа, обнаружения микроорганизмов, анализа загрязняющих веществ, а также для выявления отдельной последовательности нуклеиновой кислоты.

Устройство содержит контейнер 110 и крышку 120, которые монтируются друг с другом с образованием закрытого резервуара.

Контейнер 110 и крышка 120 имеют круглую форму с центральной осью симметрии 101, поэтому, когда они соединены, образованный таким образом закрытый резервуар имеет форму диска с вертикальной осью 101.

Контейнер 110 и крышка 120 имеют основание соответственно 110а и 120а, на которых расположены коаксиальные цилиндрические стенки 111, 112, 113; 121, 122, 123 (в описываемом варианте их число 3). При соединении контейнера 110 с крышкой 120 эти коаксиальные цилиндрические стенки располагаются парами одна против другой, образуя внутри закрытого резервуара три концентрические кольцеобразные камеры 102, 103, 104.

По направлению от оси цилиндрические стенки образуют сначала камеру 102 впуска, предназначенную для введения пробы продукта и в случае необходимости для мечения анализируемого компонента, например антитела, меченого частицей в сухом виде; затем камеру фиксации и считывания меченого компонента 103, содержащую, например, фиксированное антитело в основании контейнера, и затем выводящую камеру 104.

В описываемом варианте крышка имеет диаметр, немного превышающий диаметр контейнера, чтобы она могла устанавливаться на контейнере. Цилиндрическая стенка 123 крышки 120, расположенная снаружи по отношению к другим коаксиальным цилиндрическим стенкам 121, 122, образует внешний периферический край названного резервуара. Коаксиальные цилиндрические стенки 111, 112, 113 контейнера 110 размещены напротив внутренних сторон коаксиальных цилиндрических стенок 121, 122, 123 крышки 120.

Внутренние коаксиальные цилиндрические стенки 111, 112 и 121, 122 контейнера 110 и крышки 120, которые образуют перегородки между последовательными кольцеобразными камерами 102, 103, 104, имеют каждая по меньшей мере одно отверстие 111a, 112a и 121а, 122а.

Каждая из коаксиальных цилиндрических стенок 111, 112, 121, 122 имеет три отверстия 111a, 111b, 111c, 112a, 112b, 112с; 121а, 121b, 121с, 122а, 122b, 122с, равномерно распределенные по периметру каждой стенки и сдвинутые попарно под углом приблизительно 120^o угловых.

В представленном варианте выполнения отверстия коаксиальных цилиндрических стенок контейнера 110 и крышки 120 образованы путем вырезания материала.

Отверстия коаксиальных цилиндрических стенок контейнера 110 и крышки 120 размещены в определенных угловых положениях и соединенные крышка 120 и контейнер 110 установлены с возможностью поворачиваться по отношению друг к другу вокруг вертикальной оси 101, причем при перемещении одной по отношению к другой цилиндрических стенок каждой пары, образующей перегородку последовательных кольцеобразных камер, отверстия каждой пары стенок располагаются напротив друг друга или сдвинуты под углом для соединения последовательных кольцеобразных камер или изолирования их друг от друга.

В этом случае отверстия 111a, 111b, 111с, выполненные в цилиндрической стенке 111 контейнера 110, располагаются соответственно напротив отверстий 112а, 112b, 112с, выполненных в цилиндрической стенке 112 контейнера 110. Другими словами, каждое отверстие 111a, 111b, 111c, выполненное в цилиндрической внутренней стенке 111 контейнера 110, располагается напротив соответствующего отверстия 112а, 112b, 112с, выполненного в коаксиальной цилиндрической стенке 112, снаружи названной стенки 111.

Наоборот, отверстия 121а, 121b, 121с, образованные в цилиндрической стенке 121 крышки 120, сдвинуты по отношению к отверстиям 122а, 122b, 122с, выполненным в коаксиальной цилиндрической стенке 122 крышки 120, расположенной снаружи цилиндрической стенки 121 под углом, равным приблизительно 60 градусов, чтобы отверстия, выполненные в стенке, не находились напротив отверстий, образованных в другой следующей за ней коаксиальной стенке.

При такой компоновке, когда крышка 120 соединена с контейнером 110, она размещается по отношению к контейнеру таким образом, что отверстия одной пары цилиндрических стенок находятся напротив друг друга и позволяют последовательным кольцеобразным камерам сообщаться друг с другом, причем отверстия другой пары цилиндрических стенок сдвинуты под углом, чтобы две другие последующие кольцеобразные камеры были изолированы одна от другой.

Кроме того, крышка 120 и контейнер 110 снабжены средствами для установления их в заданное положение.

Согласно описанному варианту средства для установления в заданное положение крышки 120 и контейнера 110 состоят из отверстия 123а, размер которого соответствует длине дуги углового сектора цилиндрической стенки 123 крышки 120, расположенной снаружи от других коаксиальных цилиндрических стенок и образующей внешний периферический край резервуара, и из выступа 113а, радиально выступающего на цилиндрической стенке 113 контейнера 110, предназначенной для размещения против внешней цилиндрической стенки 123 крышки 120, причем выступ 113а может входить в отверстие 123а внешней стенки 123 крышки 120 и перемещаться в этом отверстии 123а при повороте крышки 120 относительно контейнера 110 до положения упора о два боковых конца 123'а, 123"а отверстия 123а.

Отверстие 123а, выполненное во внешней стенке 123 крышки 120, выполнено в виде выемки, длина которой приблизительно соответствует 70 угловым градусам.

Оба положения упора, которые занимает выступ 113а в отверстии 123а, соответствуют двум определенным относительным положениям крышки 120 и контейнера 110.

Первое положение упора выступа 113а о край 123'а отверстия 123а соответствует положению, при котором камера впуска 102 пробы продукта сообщается с камерой 103 фиксации и считывания меченого компонента, причем камера 104 вывода остается изолированной от других камер.

Второе положение упора выступа 113а о другой край 123"а отверстия 123 соответствует положению, при котором камера 103 фиксации и считывания сообщается с камерой 104 вывода и изоляции камеры 102 впуска от других камер.

Чтобы вращение крышки 120 относительно контейнера 110 было более легким, крышка 120 содержит выступ 123b, радиально выступающий от наружной стороны цилиндрической стенки 123, расположенной снаружи от других цилиндрических стенок, причем выступ 123b образует сцепление или опору для поворота крышки 120 вокруг вертикальной оси 101 по отношению к контейнеру 110.

Контейнер 110 и крышка 120 снабжены центральным поперечным отверстием 105, изолированным от непосредственно прилегающей кольцевой камеры 102 впуска с помощью коаксиальных цилиндрических стенок 105а и 105b. Когда крышка соединена с контейнером, стенки 105а и 105b контейнера 110 и крышки 120 располагаются одна против другой, и закрытый таким образом резервуар имеет центральное поперечное отверстие, изолированное двумя цилиндрическими расположенными одна против другой стенками 105а и 105b, от непосредственно примыкающей кольцевой камеры 102.

Это центральное поперечное отверстие 105 предназначено для размещения в нем вертикального вращаемого приводного вала, который приводит во вращение резервуар. Отверстие 105 имеет диаметр приблизительно 4 мм.

Отверстия, выполненные в коаксиальных цилиндрических стенках контейнера 110 и крышки 105 для соединения кольцевых камер резервуара, имеют ширину, равную приблизительно 5 мм.

Крышка 120 (фиг.1) имеет на основании 120а отверстие 102а, выходящее в камеру впуска 102. Оно примыкает к поперечному отверстию 105, т.к. камера впуска непосредственно примыкает к поперечному отверстию 105.

Естественно, можно предусмотреть, чтобы это отверстие, входящее в камеру впуска, было выполнено в основании 110а контейнера 110 (не показано).

Контейнер 110 выполнен из прозрачного материала, позволяющего считывать меченые фиксированные компоненты в каждой камере фиксации и считывания через стенку основания контейнера, например, с помощью камеры CCD, путем трансмиссии и отражения излучения.

Крышка тогда может быть непрозрачной, либо обработана так, чтобы избежать вредного излучения.

Предпочтительно, чтобы контейнер и крышка были выполнены путем формования из пластмассового материала, коаксиальные цилиндрические стенки формуются вместе с крышкой.

Для выполнения устройства согласно изобретению может быть использован любой классический пластмассовый материал, применяемый для покрытия молекул. Можно использовать, например, полистирол или, предпочтительно, пластик ZYLAR (зарегистрированный товарный знак), такой пластик обладает очень сильной адгезией в качестве покрытия.

Согласно одному из вариантов выполнения анализирующего устройства предпочтительно, чтобы камера 103 фиксации и считывания была разделена на множество угловых секторов, в которых фиксируются рецепторы, отличающиеся друг от друга, и предназначенные каждый для фиксации и для считывания меченого компонента. Согласно этому варианту особенно предпочтительно предусмотреть, чтобы один угловой сектор камеры фиксации был свободен от фиксированных рецепторов и образовывал сектор с холостым сайтом, который при начале считывания дает нулевое значение.

Можно также предусмотреть согласно другому варианту изобретения, чтобы резервуар содержал между камерой впуска и камерой вывода несколько других концентрических и последовательных камер фиксации и считывания для фиксирования разных меченых компонентов.

Анализирующее устройство, образуемое при соединении контейнера 110 и крышки 120, позволяет осуществить способ количественного и/или качественного анализа по меньшей мере одного компонента в пробе продукта путем фиксирующего мечения.

Согласно этому способу используют по меньшей мере одно устройство вышеописанного типа, содержащее два элемента, контейнер и крышку, представленное на фиг.1 и 3, и соединенное с образованием закрытого резервуара, содержащего специфические рецепторы анализируемого компонента, фиксированные в камере фиксации и считывания.

На первой стадии а) в камере впуска, изолированной от других кольцевых камер резервуара, помещают пробу продукта, содержащую меченый анализируемый компонент.

Затем на стадии б) поворачивают крышку по отношению к контейнеру таким образом, чтобы соединились камера впуска и камера фиксации и считывания, при этом камера впуска изолирована от других кольцевых камер.

Затем на стадии с) приводят во вращение устройство вокруг вертикальной оси таким образом, чтобы путем центрифугирования разместить в камере фиксации и считывания пробу продукта, содержащую меченый анализируемый компонент, причем этот компонент за счет сильного взаимодействия соединяется со специфическими рецепторами, фиксированными в камере фиксации и считывания.

Следует подчеркнуть, что при вращении устройства осуществляется переход пробы продукта из камеры впуска в камеру фиксации и считывания, а также проба перемешивается внутри этой камеры, чтобы меченый компонент связался с фиксированными рецепторами.

На следующей стадии д) поворачивают крышку по отношению к контейнеру так, чтобы соединить камеру фиксации и считывания с камерой вывода, затем на стадии е) приводят во вращение устройство вокруг его оси, чтобы путем центрифугирования направить излишек пробы в камеру вывода.

С этой целью, как показано на фиг.3 и 4, в основании 110а контейнера 110 предусмотрен кругообразный выступ 114 вблизи от внутренней цилиндрической стенки 112, образующей перегородку между камерой фиксации и считывания и камерой вывода. Этот кругообразный выступ 114 образует барьер против возврата излишка пробы, направляемого при центрифугировании в камеру вывода, или моющей жидкости, рекуперируемой в этой камере, как будет описано ниже.

На стадии е) осуществляют несколько промываний внутренней части устройства с помощью моющей жидкости, которую направляют путем центрифугирования в разные кольцевые камеры устройства, повторяя предшествующие стадии б), в), г) и д) для удаления других компонентов продукта, которые могут закрепиться в результате адсорбции на внутренних стенках устройства или могут оказаться связанными в результате слабого взаимодействия (такого как адсорбция) со специфическими фиксированными рецепторами в камере фиксации и считывания.

Таким образом, в камере фиксации и считывания после промывания сохраняют только меченый компонент, связанный путем прочного взаимодействия с рецепторами, фиксированными в данной камере.

Тогда на стадии ж) через стенку(и) устройства обнаруживают меченый компонент, связанный с фиксированными рецепторами, и осуществляют качественный и/или количественный анализ меченого компонента.

Это обнаружение может быть осуществлено согласно предложенному способу с помощью камеры CCD. Для этого нужно, чтобы мечение анализируемого компонента осуществлялось физическим или химическим путем с помощью, например, флуоресцентных микросфер или микросфер, которые могут стать флуоресцентными. Считывание фиксированных меченых агентов может производиться по радиусам камеры фиксации и считывания.

В частности, согласно способу с помощью камеры CCD подсчитывают число фиксированных меченых компонентов в каждой камере фиксации и считывания. Это возможно при использовании в качестве элементов, маркирующих анализируемый компонент, частиц или микросфер, которые приблизительно в 100 раз крупнее, чем искомые молекулы, и соединены с антителом или антигеном, который требуется обнаружить. Для эффективного использования камеры CCD предпочитают частицы, диаметр которых равен 2 мкм.

Эти микросферы таковы, что они отражают все или часть излучения, которое на них направлено. Они могут представлять собой латекс или любое другое вещество, которое поддается обнаружению и может быть количественно определено путем подсчета.

Таким образом, камера CCD способна регистрировать определенное число явлений отражения и выдавать соответствующий результат в абсолютном числе фиксированных анализируемых компонентов.

Камера CCD соединяется с системой программного обеспечения, которая на выходе дает цифровой сигнал обнаружения. Такая визуальная система осуществляет подсчет в реальном времени от нескольких единиц до 100 000 микросфер на 1 мм² с вычитанием фонового шума с помощью эталонной поверхности и соответствующих алгоритмов. Эта система обладает избирательной способностью, поскольку может распознавать и устранять гетерогенные изображения, способные искажать анализ данных.

На фиг.5 и 6 показаны диаграммы, полученные способом обнаружения с помощью указанного выше подсчета и наиболее классических способов обнаружения, типа флуоресценции или метода ELISA для данного анализируемого компонента в данной сыворотке.

Диаграммы этих фигур позволяют проверить, с одной стороны, имеется ли корректировка между подсчетом микросфер и концентрацией анализируемого компонента, и с другой стороны, является ли метод подсчета микросфер согласно изобретению более точным, чем методы обнаружения, называемые классическими. В частности, анализ путем подсчета микросфер показывает динамику больше 4 лог против 2 лог по методу ELISA. Это является большим преимуществом, потому что значительно увеличиваются пределы обнаружения. Результаты, полученные при сильном разведении пробы, показывают, таким образом, что способ имеет чувствительность на 2 лог выше чем метод ELISA. Результаты, полученные при слабом разведении пробы, также показывают, что способ позволяет осуществлять анализы при концентрациях анализируемого вещества, соответствующих порогу насыщения в способе ELISA. Это позволяет устранить или уменьшить возможное влияние разведения на некоторые тестируемые компоненты пробы.

Согласно способу мечение каждого отдельного компонента пробы может быть осуществлено вне устройства перед введением пробы в камеру впуска устройства.

В одном из вариантов мечение каждого отдельного анализируемого компонента пробы может быть выполнено непосредственно в камере впуска и маркировки при введении на первой стадии специфического меченого рецептора каждого анализируемого компонента в сухом нефиксированном виде, затем, на второй стадии, вводят в изолированную камеру впуска пробу продукта для того, чтобы меченый рецептор в результате прочного взаимодействия связался с соответствующим компонентом, содержащимся в пробе продукта.

Заявленный способ может быть осуществлен с помощью другого устройства такого же типа, чтобы одновременно анализировать один и тот же компонент во множестве разных проб или анализировать разные компоненты в одной и той же пробе продукта.

С этой целью предложен прибор, использующий множество указанных выше устройств (фиг.1-4), который содержит вертикальный приводной вал, способный вращаться, на который установлены анализирующие устройства, средства для поддержания этих устройств на расстоянии друг от друга, средства для приведения во вращение в двух направлениях названный вертикальный приводной вал, чтобы осуществить центрифугирование путем вращения названных устройств, средства для впрыскивания проб и моющей жидкости в камеры впуска устройств, и средства для поворота крышек относительно контейнеров, чтобы соединить или изолировать разные последовательные кольцевые камеры названных устройств, и средство для считывания меченых фиксированных агентов.

Реферат

Устройство для анализа по меньшей мере одного компонента в пробе продукта содержит контейнер (110) и крышку (120), которые соединены с образованием закрытого резервуара. Согласно изобретению резервуар имеет вертикальную ось, контейнер и крышка имеют коаксиальные цилиндрические стенки (111, 112, 113), которые разграничивают концентрические кольцеобразные камеры (102, 103, 104) внутри резервуара. Стенки, разделяющие камеры, содержат каждая одно отверстие (111а, 112а). Крышка и контейнер вращаются по отношению друг к другу вокруг вертикальной оси, а отверстия располагаются таким образом, чтобы в результате относительного перемещения стенок они были размещены напротив друг друга или сдвинуты под углом для соединения последовательных камер или их изолирования. Техническим результатом является создание устройства, простого по конструкции и в использовании, которое может работать индивидуально с минимальным числом операций, проводить серийные исследования и в непосредственной близости от места взятия пробы. 3 с. и 30 з.п.ф-лы, 6 ил.

Формула