Стабильность силосных инокулятов и способы повышения аэробной стабильности силоса - RU2708448C2

Описание

Настоящее описание относится к силосу, в частности к силосным инокулятам и способу применения силосных инокулятов для повышения аэробной стабильности силоса.

Силос представляет собой ферментированный корм с высоким содержанием влаги для скармливания жвачным животным, таким как жующие жвачку животные типа рогатый скот и овцы. Силос ферментируют и хранят в силосохранилище, процесс называется силосованием. Силос чаще всего получают из травы или злаковых культур, включающих плевел, овсяницу, люцерну, кукурузу (маис) или сорго. Силос получают из цельного растения или его части. Силос также можно получить из многих других полевых культур, включающих сахарный тростник, и иногда, когда он получен, используют другие названия, такие как, например, овсяный силос для овса, сенаж для люцерны. Иногда используют смесь, такую как овес и горох.

В последние годы производство силоса и связанное с ним растениеводство развилось до такой степени, что можно выделить целый ряд различных процессов. Такими процессами являются: (i) силосование молодой травы с особо низким содержанием сухого вещества, например, менее 25%; (ii) силосование более зрелых трав с более высоким содержанием сухого вещества, или силосования молодой травы с высоким содержанием сухого вещества, но полученной провяливанием; и (iii) силосование цельного маиса, включающего стебли и початки, обычно с содержанием сухого вещества около 35%, и целых зерновых культур, например, пшеницы, с содержанием сухого вещества 45-50%.

В то время как эти процессы в целом дают хороший выход, они не обходятся без проблем. Особенно в случаях (ii) и (iii) постоянно возникает одна из основных проблем. Это явление известное как аэробная порча. Процесс аэробной порчи происходит при открытии силосохранилища, когда материал подвергается воздействию воздуха. Его можно разделить на отдельные фазы. Сначала начальная фаза, на которой дрожжи и иногда уксуснокислые бактерии размножаются с потреблением консервирующих органических кислот, повышением рН силоса, и температура начинает возрастать. После первоначального повышения рН происходит вторая фаза, на которой наблюдается активность бактерий и связанное с ней увеличение температуры. Дальнейшая фаза включает активность различных микроорганизмов, в том числе грибов.

В таких силосах, которые имеют значительное содержание сухого вещества, то есть более 30%, проблема порчи является особенно острой. Порча наблюдается в большей или меньшей степени, как только силосный бурт открывается и подвергается воздействию воздуха.

Биологические добавки, такие как бактериальные инокуляты, широко используются для улучшения процесса силосования, преимущественно для увеличения объема и скорости производства молочной кислоты и предотвращения аэробной порчи. В патенте США № 6326037, выданном Mann и др., обеспечиваются способы и композиции для улучшения данной ситуации. В частности, приведенное там описание основано, по меньшей мере, частично на определении процесса аэробной порчи, как тесно связанного с нагреванием в бурте под воздействием поступления воздуха. Последующее исследование такого силоса показало высокую концентрацию термофильных грамположительных бактерий, включающих бациллы, дрожжей и плесеней. Это очевидно свидетельствует о начале вторичного брожения, похожего на то, которое происходит при компостировании (главного брожения, являющегося процессом силосования). На этой стадии брожения преобладают дрожжи и плесени. Выяснено, что для предотвращения порчи тремя основными группами микроорганизмов, которые необходимо убить или подавить их развитие, являются спорообразующие бактерии, дрожжи и грибы. Устранение только одной группы может привести к росту остальных групп, следовательно, порча не предотвращается.

Таким образом, Mann предлагает для предотвращения порчи использовать обработку микроорганизмами, которые, по меньшей мере, в первую очередь подавляют микроорганизмы, которые вызывают аэробную порчу, в частности дрожжи, и на поверхности силоса грибы. Микроорганизм, способный к этому, также может подавлять развитие других микроорганизмов, вызывающих порчу, и может быть определен скринингом. Микроорганизм видов Lactobacillus buchneri, который отвечает этому требованию, депонирован в Национальных коллекциях промышленных и морских бактерий 13 февраля 1996. Ему присвоен инвентарный номер 40788.

Несмотря на то, что обработки с использованием Lactobacillus buchneri снижают порчу силоса, они делают это только в ограниченной степени. Соответственно, остается потребность в усовершенствованной обработке силоса, в частности для повышения аэробной стабильности силоса с одновременным увеличением количества полученного сухого вещества.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте предлагается способ обработки силоса. Способ включает добавление в силос силосного инокулята, содержащего эффективное количество Lactobacillus hilgardii для консервирования силоса. Силосный инокулят является эффективным для предотвращения или снижения аэробной порчи.

В другом аспекте предлагается силосный инокулят, содержащий эффективное количество Lactobacillus hilgardii для консервирования силоса.

В одном аспекте силосного инокулята силосный инокулят дополнительно содержит носитель.

В дополнительном аспекте предлагается силос, содержащий эффективное количество Lactobacillus hilgardii для консервирования силоса.

В одном аспекте способа в силосном инокуляте и силосе Lactobacillus hilgardii является, по меньшей мере, одним из штамма Lactobacillus hilgardii SIL51, имеющего инвентарный номер CNCM I-4784, зарегистрированного 26 июня 2013, и штамма Lactobacillus hilgardii SIL52, имеющего инвентарный номер CNCM I-4785, зарегистрированного 26 июня 2013, или их генетических эквивалентов. Указанные штаммы были депонированы Lallemand SAS 19 rue des Briquetiers, 31702 Blagnac Cedex, Франция.

В одном аспекте способа силосный инокулят дополнительно содержит носитель.

В еще одном аспекте предлагается выделенный штамм Lactobacillus hilgardii, штамм SIL51, имеющий инвентарный номер CNCM I-4784, зарегистрированный 26 июня 2013, или его генетические эквиваленты.

В другом аспекте предлагается выделенный штамм Lactobacillus hilgardii, штамм SIL52, имеющий инвентарный номер CNCM I-4785, зарегистрированный 26 июня 2013, или его генетические эквиваленты.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Согласно настоящему описанию были выделены и очищены молочнокислые бактерии, которые улучшают аэробную стабильность силосованного корма. В частности, Lactobacillus hilgardii, как установлено, повышают аэробную стабильность силоса. Кроме того, при инокуляции силоса штаммы Lactobacillus hilgardii приводят к получению силоса, который является хорошо консервированным, и в котором начало вторичного брожения, связанного с аэробной порчей и нагреванием, снижено или предотвращено.

Штаммы по настоящему описанию были выделены из силоса из сахарного тростника (Saccharum spp.). После очистки и выделения штаммов были проведены таксономические исследования для идентификации штаммов. Два из них были идентифицированы как Lactobacillus hilgardii, и им присвоены номера с учетом прототипа SIL51 и SIL52.

Таким образом, настоящее описание относится к силосным инокулятам и способу применения силосных инокулятов для повышения аэробной стабильности силоса.

Термин «эффективное количество для консервирования силоса», в используемом здесь значении, следует понимать как относящийся к количеству, которое является, по меньшей мере, достаточным для консервирования силоса. Таким образом, количество является, по меньшей мере, достаточным для улучшения стабильности силоса, но предпочтительно является количеством, достаточным для улучшения стабильности силоса с одновременным увеличением количества полученного сухого вещества.

Термин «аэробная стабильность», в используемом здесь значении, следует понимать как относящийся к количеству часов, в течение которых температура силоса остается стабильной до повышения более чем на 2°C по сравнению с температурой окружающей среды.

Теперь будет сделана ссылка на варианты осуществления, описанные здесь. Понятно, что таким образом не предполагается ограничение объема раскрытия. Кроме того, понятно, что настоящее раскрытие включает любые изменения и модификации в проиллюстрированных вариантах осуществления и включает дальнейшие применения принципов раскрытия, которые обычно приходят в голову специалистам в той области, к которой относится данное раскрытие.

В одном варианте осуществления предлагается способ обработки силоса. Способ включает стадию добавления в силос силосного инокулята, содержащего эффективное количество Lactobacillus hilgardii для консервирования силоса. Силосный инокулят является эффективным для предотвращения или снижения аэробной порчи.

Также предлагается силосный инокулят, содержащий, по меньшей мере, штамм Lactobacillus hilgardii. В частности, силосный инокулят содержит эффективное количество видов Lactobacillus hilgardii для консервирования силоса.

В одном варианте осуществления способа и силосных инокулятов, описанных выше, штамм Lactobacillus hilgardii может быть выделенным штаммом Lactobacillus hilgardii CNCM I-4784, зарегистрированным 26 июня 2013 (SIL51), CNCM I-4785, зарегистрированным 26 июня 2013 (SIL52), или их генетическими эквивалентами. Понятно, что также предполагаются мутанты или генетические эквиваленты штаммов CNCM I-4784, зарегистрированного 26 июня 2013 (SIL51), и CNCM I-4785, зарегистрированного 26 июня 2013 (SIL52), которые сохраняют функциональную активность относительно повышения аэробной стабильности корма, как описано в настоящем описании.

Независимо от способа, которым вызваны мутации или генетические эквиваленты, критическим вопросом является то, что они выполняют функции в отношении повышения аэробной стабильности силоса, как описано для родительских видов и/или штамма. Другими словами, настоящее описание включает мутации, приводящие к таким незначительным изменениям, как, например, незначительные таксономические изменения.

Силосные инокуляты согласно настоящему описанию могут находиться или жидкой или твердой форме и могут содержать дополнительные штаммы бактерий. Силосные инокуляты согласно настоящему описанию могут содержать подходящий носитель или могут быть использованы как получены. В твердой форме силосный инокулят может содержать твердый носитель. Подходящий носитель может быть в водной или неводной жидкой форме или в твердой форме. Примеры носителя в водной или неводной жидкой форме включают воду, масла и парафины. Примеры носителя в твердой форме включают органический или неорганический носитель, такой как, например, мальтодекстрин, крахмал, карбонат кальция, целлюлоза, сыворотка, измельченные кукурузные початки и диоксид кремния. Твердую композицию можно наносить непосредственно на корм в виде легкого порошкового напыления, или, если она выделена на жидком носителе, ее можно успешно распылять на корм. Понятно, что можно использовать любой другой подходящий носитель для целей настоящего описания.

Выяснено, что ингибирующее вещество может быть вторичным метаболитом. Таким образом, его полный эффект не может быть замечен, если, при использовании в силосе, силос открывают слишком рано. Силос предпочтительно сохраняют закрытым, по меньшей мере, 30 суток, и более предпочтительно, по меньшей мере, 45 суток. Оптимальные периоды могут зависеть, в частности, от объема силосной массы, а также от природы силосуемого материала.

Материалы, которые подходит для силосования согласно настоящему описанию, подвержены аэробной порче. Материалы обычно содержат, по меньшей мере, 20% по весу сухого вещества. Такие материалы включают, например, рожь или обычные травы, маис, в том числе высоковлажную кукурузу, цельное растение кукурузы, люцерну, провяленные травы, пшеницу, бобовые растения, сорго, подсолнечник, ячмень, другую цельную крупяную культуру и другую полевую культуру, такую как сахарный тростник. Силос может находиться в тюках (форма особенно подверженная аэробной порче), мешках с ограниченным количеством кислорода, бункерах, силосных башнях, силосохранилищах с ограниченным количеством кислорода, мешках, пакетах или любой другой подходящей форме для хранения, которая может быть подвержена аэробной порче. В одном варианте осуществления силосный инокулят по настоящему описанию можно использовать с любым подходящим кормом для животных, или твердым или жидким, для скармливания животным, таким как, например, свиньи, домашняя птица или жвачные животные.

Следующие примеры служат для дальнейшего описания и определения изобретения и не предназначены для ограничения изобретения каким-либо образом.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Силос получали с использованием свежесобранного сахарного тростника из растений, которым было приблизительно 12 месяцев. Сахарный тростник собирали вручную и нарезали с использованием лабораторного измельчителя (Pinheiro, модель: PP-47) до приближенной длины 30 мм. 3 кг измельченного материала смешивали с инокулятами и выдерживали в пластиковых ведрах из ПВХ (мини-силосохранилищах, 10 см в диаметре и 60 см в длину), которые закрывали герметическими крышками, содержащими клапаны BUNSEN для выпуска газа. Материал в силосохранилище прессовали до плотности приблизительно 630±19,9 кг/м³. Мини-силосохранилища выдерживали при комнатной температуре и анализировали через 61 сутки хранения, и готовили три повторности для каждого силосохранилища.

Силос получали с использованием Lactobacillus plantarum SIL34 (L. plantarum обычно используют в качестве силосного инокулята) и штаммов Lactobacillus hilgardii SIL51 (CNCM I-4784, зарегистрированного 26 июня 2013) и SIL52 (CNCM I-4785, зарегистрированного 26 июня 2013) в качестве инокулятов. Штаммы Lactobacillus plantarum и Lactobacillus hilgardii выделяли из силоса из сахарного тростника и идентифицировали с идентичностью последовательности 98%. Силос без инокулятов использовали в качестве контроля. Инокуляты культивировали по методу Avila и др. (Влияние местного и промышленного штамма Lactobacillus buchneri на качество силоса из сахарного тростника, Grass Forage Sci 6:384-394, 2009). Затем в конечной культуре подсчитывали количество клеток на агаре De Man Rogosa Sharpe (Oxoid CM361, Бейзингсток, Гэмпшир, Англия), и концентрацию культуры доводили до log 9 КОЕ/мл. Культуру смешивали с 80 мл стерильной дистиллированной воды и распыляли на измельченный сахарный тростник до конечной концентрации log 6 КОЕ/г травы. Контроль получали с таким же количеством воды без бактерий. Для каждой обработки использовали индивидуальный распылитель для предотвращения перекрестного загрязнения.

Регистрировали вес полных и пустых силосохранилищ. После герметизации силосохранилища выдерживали при комнатной температуре (в среднем 25°C) и защищали от солнечных лучей и дождя. Через 61 сутки силосования полные силосохранилища взвешивали до открытия. Потери сухого вещества (СВ) рассчитывали с использованием веса и содержания СВ в свежем корме и силосе.

Инокуляция с использованием Lactobacillus plantarum (SIL34) привела к получению силоса с низким содержанием СВ, более высокими потерями СВ и более высоким содержанием НДК по сравнению с другими штаммами и контролем. В силосе, инокулированном штаммами Lactobacillus hilgardii SIL5l и SIL52, обнаружили более низкие потери СВ по сравнению с SIL34 и контролем (Таблица 1). Инокуляция этими же штаммами также привела к получению силоса с более высоким содержанием СВ и более низким содержанием НДК. Инокуляты не влияют на значение рН и содержание растворимых углеводов в силосе.

b – содержание сухого вещества; c – свежий материал; d – нейтрально-детергентная клетчатка; e – водорастворимые углеводы; f - молочнокислые бактерии.

Средние значения с разными буквами в колонке значительно отличаются (р<0,05).

АНАЛИТИЧЕСКИЙ МЕТОД

В сутки открытия отбирали два образца из каждого мини- силосохранилища, и все содержимое мини-силосохранилища гомогенизировали. Один из образцов взвешивали и высушивали в вентилируемой печи при 55°С в течение 96 ч; другой образец использовали для приготовления водного экстракта для определения значения рН, оценивали микробиологическую обсемененность и определяли конечные продукты брожения.

Высушенные образцы измельчали на мельнице типа Willey с использованием сита 30 меш и хранили в маркированных пластиковых банках. Образцы анализировали на содержание СВ (АОАС (1990) Официальные методы анализа. 15-е издание. Вашингтон, округ Колумбия, США: Ассоциация официальных химиков-аналитиков), водорастворимых углеводов (ВРУ) фенольным методом (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F (1956) Колориметрический метод определения сахаров и родственных соединений Anal Chem 28: 350-356) и нейтрально-детергентной клетчатки (NDF), как описано Holden (Сравнение методов определения переваримости сухого вещества in vitro для десяти кормов. J Dairy Sci 82:1791-1794; 1999) с использованием анализатора клетчатки Ankom (ANKOM Technology Corporation, 20 Fairport, Нью-Йорк, USA) и выражали на основе СВ.

Концентрации этанола, 1,2-пропандиола и молочной, уксусной, пропионовой и масляной кислот измеряли методом ВЭЖХ по Carvalho и др. (Влияние добавления пропионовой кислоты и Lactobacillus buchneri (SIL72) на ферментативные и микробиологические свойства силоса из сахарного тростника с или без обработки оксидом кальция. Grass Forage Sci doi:. 10.1111/j.1365-2494.2012.00863.x). Кислоты, этанол и 1,2-пропандиол идентифицировали сравнением их времени удерживания со временем удерживания известных стандартных образцов. Концентрации идентифицированных соединений определяли методом внешней калибровки. Оборудование для ВЭЖХ (Shimadzu модель LC-10Ai; Shimadzu Corp., Токио, Япония) было оснащено двойной системой обнаружения, состоящей из ультрафиолетового детектора (UV-VisSPD-10Ai) и детектора показателя преломления (RID 10A). Для хроматографического разделения использовали ионоисключающую колонку производства Shimadzu (Shim-Pack SCR-101H, 7,9 мм×30 см), работающую при 50°С. Подвижная фаза включала 100 мМ раствор хлорной кислоты при скорости потока 0,6 мл/мин. Кислоты обнаруживали УФ-поглощением (210 нм). Этанол и 1,2-пропандиол идентифицировали с использованием детектора показателя преломления. Значения рН измеряли потенциометром (Expandomatic Beckman SS-2).

Как показано в таблице 2, силос, инокулированный штаммами SIL51 и SIL52, с самой низкой потерей СВ имел более низкую концентрацию этанола, чем SIL34 и контроль. Штамм SIL34, который привел к получению силоса с наибольшей потерей СВ, производил самое большее количество молочной кислоты. В силосе, инокулированном штаммами SIL51 и SIL52, также отмечали более высокие концентрации уксусной кислоты и 1,2-пропандиола по сравнению с SIL34 и контролем. Концентрации пропионовой кислоты были так же низкими, сопоставимыми с силосом, инокулированным SIL34, и контрольным силосом.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Образцы (70 г) свежего корма и силоса из сахарного тростника через 61 сутки инкубации смешивали с 630 мл 0,1% стерильной пептонной воды и перемешивали в орбитальном шейкере при 120 об/мин в течение 20 мин. Затем получали 10-кратные разведения для количественного определения различных групп микроорганизмов. Молочнокислые бактерии (МКБ) подсчитывали с использованием агара MRS (De Man Rogosa Sharpe, Difco, Детройт, Мичиган, США), содержащего 0,1% цистеин НСl (Merck, Дармштадт, Германия) и 0,4% циклогексимид (0,4%) (Sigma), после анаэробной инкубации (AnaeroGen; Oxoid, Бейзингсток, Великобритания). Планшеты инкубировали при 30°С в течение 48 ч. Дрожжи и мицелиальные грибы подсчитывали на среде Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC, Difco; Becton Dickinson, Спаркс, Мэриленд, США) после инкубации планшетов при 28°С в течение 72 ч. Для всех микроорганизмов подсчитывали только планшеты, содержащие от 30 до 300 КОЕ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЭРОБНОЙ СТАБИЛЬНОСТИ СИЛОСА

Через 90 суток силосования открывали мини-силосохранилища, и отбирали образцы в трех повторностях приблизительно 3 кг из каждого мини-бункера и помещали в пластиковые ведра по 5 кг для определения их аэробной стабильности. Термометр помещали в силосную массу на глубину 10 см на 7 суток. Контейнеры выдерживали в помещении с контролируемой температурой 26°С (±1,5°С). Температуру силоса регистрировали каждые 8 ч. Температуру окружающей среды измеряли с использованием термометра, расположенного рядом с ведрами. Аэробную стабильность определяли как количество часов, в течение которого температура силоса оставалась стабильным до повышения более чем на 2°C по сравнению с температурой окружающей среды.

Как показано в таблице 3, температура контрольного силоса была стабильной приблизительно в течение 21,3 ч, в то время как силос, инокулированный штаммами SIL51 и SIL52, утратил стабильность температуры через 26,7 и 21,3 ч соответственно после открытия силоса. Время достижения максимальной температуры было больше для обоих штаммов SIL51 и SIL52. Таким образом, штаммы SIL51 и SIL52 привели к получению силоса с превосходной стабильностью температуры по отношению к силосу, инокулированному SIL34, и контрольному силосу.

Силос, инокулированный штаммом Lactobacillus plantarum SIL34, производящий молочную кислоту, утратил стабильность температуры через 24 ч. Однако, штамм SIL34 привел к получению силоса с более высоким содержанием этанола, более высоким содержанием дрожжей и более высокими потерями СВ. Штаммы SIL51 и SIL52 обеспечивают более хорошие свойства силосу, такие как меньшая популяция дрожжей, более низкое содержание этанола и меньшие потери СВ.

ПРИМЕР 2. АЭРОБНАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КУКУРУЗНОГО СИЛОСА

Кукурузный силос получали в мини-силосохранилищах, как описано в примере 1, с использованием Lactobacillus buchneri NCIMB 40788 (патент США № 6326037, выданный Mann и др.), Lactobacillus plantarum SIL34 и штаммов Lactobacillus hilgardii SIL51 (CNCM I-4784, зарегистрированный 26 июня 2013) и SIL52 (CNCM I-4785, зарегистрированный 26 июня 2013) в качестве инокулятов. Силос без инокулятов использовали в качестве контроля. Инокуляты культивировали, как описано в примере 1.

Через 90 суток силосования мини-силосохранилища открывали, и отбирали образцы приблизительно 3 кг из каждого мини-силосохранилища и помещали в пластиковые ведра по 5 кг для определения аэробной стабильности. Регистрирующее устройство помещали в силосную массу на глубину 10 см на 7 суток. Температуру окружающей среды измеряли с использованием регистрирующего устройства, расположенного рядом с ведрами. Данные по аэробной стабильности силосов приведены в таблице 4.

Доза 1=10⁵ КОЕ/г; 2=10⁶ КОЕ/г

Как показано в таблице 4, температура контрольного силоса была стабильной приблизительно в течение 42,7 ч, в то время как силос, инокулированный штаммами SIL51 и SIL52, утратил стабильность температуры через 73,05 и 53,35 ч соответственно после открытия силоса. Силос, инокулированный SIL34, был стабильным в течение 17,4 ч. Силос, инокулированный Lactobacillus buchneri NCIMB 40788, был стабильным в течение 60,5 ч. Штаммы SIL51 и SIL52 привели к получению силоса с превосходной стабильностью температуры по отношению к силосу, инокулированному SIL 34, и контрольному силосу. Штаммы SIL51 и SIL52 также привели к получению силосу с превосходной стабильностью температуры по отношению к силосу, инокулированному NCIMB 40788.

В то время как изобретение было описано применительно к конкретным вариантам осуществления, должно быть понятно, что возможны дальнейшие модификации, и это описание предназначено для охвата любых вариантов, применений или адаптаций изобретения, следуя в целом принципам изобретения и включая такие отклонения от настоящего раскрытия, которые подпадают под известную или обычную практику в данной области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, сформулированным выше, и следующим в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Реферат

Предлагается способ обработки силоса, который включает добавление в силос силосного инокулята, содержащего эффективное количество Lactobacillus hilgardii для консервирования силоса. Силосный инокулят является эффективным для предотвращения или снижения аэробной порчи. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл.

Формула