Уреогидролазы в качестве доминантных селективных маркеров у дрожжей - RU2016144154A

1. Способ культивирования микроорганизма рода Saccharomycetaceae в присутствие гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота, включающий:

(a) встраивание молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую гуанидинобутиразу, в микроорганизм, при этом нуклеотидная последовательность функционально связана с последовательностями промотора и терминатора;

(b) культивирование микроорганизма таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гуанидинобутиразу, экспрессируется в микроорганизме; и

(c) культивирование микроорганизма в присутствие гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.

2. Способ по п. 1, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая гуанидинобутиразу, кодирует гипотетический белокNRRL Y-1140 Kluyveromyces lactis.

3. Способ по п. 1 или 2, где последовательности промотора и/или терминатора выбраны из гликолитического гена.

4. Способ по п. 3, где гликолитический ген выбран из PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1, TDH3, PGK1, GPM1, PYK1, ENO1 и/или ENO2.

5. Микроорганизм рода Saccharomycetaceae, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую гуанидинобутиразу.

6. Микроорганизм рода Saccharomycetaceae по п. 5, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая гуанидинобутиразу, кодирует гипотетический белокNRRL Y-1140 Kluyveromyces lactis.

7. Набор конструкций, содержащий первую конструкцию, содержащую первую часть нуклеотидной последовательности, кодирующей гуанидинобутиразу, и вторую конструкцию, содержащую вторую часть нуклеотидной последовательности, кодирующей гуанидинобутиразу, при этом фрагмент первой части нуклеотидной последовательности перекрывается с фрагментом, присутствующим во второй части нуклеотидной последовательности, делая возможной рекомбинацию между первой и второй частью нуклеотидной последовательности.

8. Набор конструкций по п. 7, где первая конструкция дополнительно содержит участок распознавания эндонуклеазы и первую область гомологии с геномом-мишенью микроорганизма, и вторая конструкция дополнительно содержит вторую область гомологии с геномом-мишенью микроорганизма и копию участка распознавания эндонуклеазы, при этом

кодирующая последовательность, кодирующая эндонуклеазу и соединенная с индуцибельным промотором, присутствует в первой или второй конструкции; и

часть первой области гомологии с геномом-мишенью в первой конструкции является дуплицированной между копией участка распознавания эндонуклеазы и второй областью гомологии с геномом-мишенью во второй конструкции; или часть второй области гомологии с геномом-мишенью во второй конструкции является дуплицированной между первой областью гомологии с геномом-мишенью и участком распознавания эндонуклеазы в первой конструкции.

9. Набор конструкций по п. 7 или 8, где перекрывающийся фрагмент нуклеотидной последовательности, кодирующей селективный маркер, составляет приблизительно 200 пар оснований.

10. Набор конструкций по любому из пп. 7-9, где дуплицированная область гомологии с геномом-мишенью в первой и второй конструкции предпочтительно составляет от 20 п.н. до 200 п.н.

11. Способ изменения генома, предпочтительно - гена-мишени, в микроорганизме рода Saccharomycetaceae, включающий снабжение набором конструкций по любому из пп. 7-10 указанного микроорганизма и селекцию микроорганизма, в котором изменяют геном, предпочтительно - посредством селекции микроорганизма, функционально экспрессирующего указанную гуанидинобутиразу.

12. Способ по п. 11, где микроорганизм подвергают селекции посредством культивирования микроорганизма в присутствие гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.

13. Набор, содержащий набор конструкций по любому из пп. 7-10.

14. Способ изменения генома микроорганизма рода Saccharomycetaceae, включающий снабжение набором конструкций по любому из пп. 7-10 указанного микроорганизма и селекцию микроорганизма, в котором изменяют геном посредством инсерции функционального, рекомбинированного селективного маркера.

15. Способ по п. 14, где микроорганизм подвергают селекции посредством культивирования микроорганизма в присутствие гуанидинобутирата в качестве единственного источника азота.