Анализ плюрипотентных стволовых клеток - RU2019116152A
Код документа: RU2019116152A
Формула
1. Способ выявления остаточных, недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в культуре клеток, дифференцировавшихся из PSC, включающий
культивирование указанных клеток на субстрате, покрытом ламинином-521 и Е-кадгерином, в среде, содержащей ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы, содержащей суперспираль (ROCK);
количественное измерение в культивируемых клетках экспрессии маркера остаточных, недифференцированных PSC; и
сравнение экспрессии маркера в культивируемых клетках с экспрессией маркера в контрольной культуре клеток, содержащей известную долю PSC,
где более низкая экспрессия маркера в культуре клеток, чем экспрессия маркера в контрольной культуре клеток, указывает на отсутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках или на присутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках в меньшей доле, чем известная доля PSC в контрольной культуре клеток.
2. Способ по п. 1, где экспрессия маркера представляет собой экспрессию LIN28, ОСТ4, SOX2, FOXD3, NANOG, PODXL, REX1, SSEA1, SSEA4, DPPA2 или DPPA3.
3. Способ по п. 1 или 2, где ингибитор ROCK представляет собой Y27632.
4. Способ по п. 3, где клетки культивируют в примерно 10 мкМ Y27632.
5. Способ по любому из пп. 1-4, включающий культивирование клеток в среде, содержащей ингибитор ROCK, в течение примерно 3 суток.
6. Способ по п. 5, дополнительно включающий культивирование клеток в среде, не содержащей ингибитор ROCK, в течение примерно 2 суток после культивирования в среде, содержащей ингибитор ROCK.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где экспрессию маркера количественно измеряют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
8. Способ по п. 7, где ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР-РВ).
9. Способ по п. 8, где кПЦР-РВ включает зонд, состоящий из 5'→3' последовательности CGCATGGGGTTCG GCTTCCTGTCC (SEQ ID NO: 14), праймер, состоящий из 5'→3' последовательности CACGGTGCGGGCATCTG (SEQ ID NO: 15), и праймер, состоящий из 5'→3' последовательности CCTTCCATGTGCAGCTTACTC (SEQ ID NO: 16).
10. Способ по любому из пп. 1-9, где экспрессия маркера нормализована.
11. Способ по п. 10, где экспрессия маркера нормализована по отношению к экспрессии GAPDH.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где известная доля составляет 0,001%.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где PSC представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
14. Способ по любому из пп. 1-13, где клетки представляют собой мезенхимные стволовые клетки (MSC).
15. Способ по п. 14, где MSC культивируют в полной среде Е8.
16. Способ по любому из пп. 1-15, дополнительно включающий приготовление в виде терапевтической композиции культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля.
17. Способ по любому из пп. 1-16, дополнительно включающий введение субъекту культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтической композиции.
18. Способ изготовления терапевтической композиции, включающий приготовление в виде композиции для терапевтического введения субъекту культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, при выявлении способом по любому из пп. 1-15.
19. Способ лечения или предупреждения состояния у субъекта, включающий введение указанному субъекту:
культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, при выявлении способом по любому из пп. 1-15; или терапевтической композиции, изготовленной способом по п. 18.
20. Применение культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния у субъекта, где остаточные, недифференцированные PSC в культуре клеток, дифференцировавшихся из PSC, выявляют способом по любому из пп. 1-15.
21. Способ по п. 19 или применение по п. 20, где состояние выбрано из кист кости, новообразований кости, переломов, дефектов хряща, остеоартрита, повреждения связки, незавершенного остеогенеза, остеонекроза, остеопороза, апластической анемии, реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD), миелодиспластического синдрома, диабета типа 1, диабета типа 2, аутоиммунного гепатита, цирроза печени, печеночной недостаточности, дилатационной кардиомиопатии, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, ишемии миокарда, болезни Крона, язвенного колита, ожогов, буллезного эпидермолиза, красной волчанки, ревматоидного артрита, болезни Шегрена, системного склероза, бронхолегочной дисплазии, хронического обструктивного заболевания дыхательных путей, эмфиземы, легочного фиброза, бокового амиотрофического склероза (ALS), болезни Альцгеймера, травмы головного мозга, атаксии, остеохондроза, множественной системной атрофии, рассеянного склероза, болезни Паркинсона, пигментной дистрофии сетчатки, болезни Ромберга, травмы спинного мозга, инсульта, мышечной дистрофии, ишемии конечности, повреждения почки, волчаночного нефрита, эндометриоза и осложнений трансплантации костного мозга или солидных органов.
22. Набор для выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, дифференцировавшихся из PSC, содержащий ламинин-521; и Е-кадгерин; и ингибитор ROCK.
23. Набор по п. 22, дополнительно содержащий праймеры ПЦР и, возможно, зонд ПЦР для количественного измерения в культивируемых клетках экспрессии маркера остаточных, недифференцированных PSC.
24. Набор по п. 22 или п. 23, дополнительно содержащий среду, возможно содержащую ингибитор ROCK.
25. Набор по любому из пп. 22-24, дополнительно содержащий субстрат, возможно покрытый ламинином-521 и Е-кадгерином.
