Протеаза streptomyces - RU2486244C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по патентной заявке США с серийным № 11/929817 под названием "Протеаза Streptomyces", поданной 30 октября 2007 года.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к сериновым протеазам Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична протеазе 1AG3 Streptomyces дикого типа. Настоящее изобретение также относится к последовательностям выделенных нуклеиновых кислот, также предусматриваются рекомбинантные нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева, содержащие рекомбинантные нуклеиновые кислоты. Кроме того, настоящее изобретение относится к моющим и другим композициям, содержащим сериновую протеазу Streptomyces.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сериновые протеазы представляют собой подгруппу класса разнообразных ферментов, имеющих широкий диапазон специфичности и биологических функций. Несмотря на функциональное разнообразие, каталитический аппарат сериновых протеаз был изучен по меньшей мере в двух генетически отличающихся семействах ферментов, а именно в субтилизинах и в химотрипсин-связанных сериновых протеазах млекопитающих и гомологичных бактериальных сериновых протеазах (например, трипсин и трипсин S. griseus). Эти два семейства сериновых протеаз демонстрируют в значительной степени сходные механизмы катализа (смотрите, например, Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46:331-358 [1977]).

Более того, несмотря на несходные первичные структуры, третичные структуры этих двух семейств ферментов сводят вместе консервативные каталитические триады аминокислот. Как субтилизины, так и химотрипсин-связанные сериновые протеазы имеют каталитическую триаду, содержащую аспартат, гистидин и серин. В субтилизин-связанных протеазах относительный порядок этих аминокислот, при считывании от N- к С-концу, представляет собой аспартат-гистидин-серин. Однако в химотрипсин-связанных протеазах, относительный порядок представляет собой гистидин-аспартат-серин. Много исследований было проведено на субтилизинах, главным образом, вследствие их применимости в связанных с очисткой и питанием применений. Дополнительная работа была сфокусирована на неблагоприятных окружающих условиях (например, воздействие окислителей, хелатирующих агентов и/или предельных температур и/или pH), которые могут оказывать неблагоприятное действие на функциональность этих ферментов при различных применениях. Тем не менее, в данной области остается необходимость в ферментных системах, которые могут выдерживать эти условия и сохранять или иметь повышенную активность относительно ферментных систем, известных в настоящее время в данной области.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предусматривается выделенная сериновая протеаза, а также моющие композиции, содержащие ее. В некоторых вариантах осуществления протеаза идентична протеазе 1AG3 Streptomyces дикого типа (SEQ ID NO:9), а в других вариантах осуществления протеаза является вариантом. В некоторых вариантах осуществления протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична протеазе 1AG3 Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления выделенная сериновая протеаза имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену относительно протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. В некоторых из этих вариантов осуществления выделенная сериновая протеаза имеет измененную субстратную специфичность относительно протеазы 1AG3 Streptomyces и имеет измененную pI, повышенную активность, такую как повышенная устойчивость к кислотам, термостабильность, гидролиз казеином, гидролиз кератином, эффективность очистки и/или стабильность LAS, относительно протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа.

Также предусматривается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая выделенную сериновую протеазу. В этих вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность, которая: a) гибридизуется с SEQ ID NO:8 в строгих условиях гибридизации; и/или b) по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:8.

Также предусматривается рекомбинантный полинуклеотид, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полинуклеотид содержит функционально связанные промотор и выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления промотор является гетерологичным для выделенной нуклеиновой кислоты, поскольку он не является промотором протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота обеспечивает секрецию выделенной сериновой протеазы из клетки-хозяина (т.е. она содержит участок, кодирующий сигнальную последовательность, который направляет выделенную сериновую протеазу на секрецию). Также предусматривается экспрессирующий вектор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин выбрана из Bacillus sp., Streptomyces sp., Aspergillus sp. и Trichoderma sp. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полинуклеотид находится в экспрессирующем векторе в клетке, а в других вариантах осуществления он находится в геноме клетки (т.е. он встроен в геном клетки-хозяина). В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина используют в способах получения выделенной сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления способы включают: культивирование клетки-хозяина в условиях, пригодных для продуцирования выделенной сериновой протеазы. В некоторых альтернативных вариантах осуществления способы дополнительно включают извлечение выделенной сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления протеаза секретируется в культуральную среду. В некоторых дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают выделение протеазы из культуральной среды.

Также предусматривается моющая композиция, содержащая выделенную сериновую протеазу. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой алкилсульфат натрия, содержащий группу оксида этилена. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция содержит от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% по массе выделенной сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция содержит достаточное количество модификатора pH для обеспечения композиции с pH в чистом виде от приблизительно 3 до приблизительно 5, где моющая композиция по существу не содержит материалов, которые гидролизуются при pH от приблизительно 3 до приблизительно 5. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления моющая композиция изготовлена в качестве детергента для стирки, и/или детергента для мытья посуды и/или моющей композиции для твердых поверхностей. В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к рассматриваемой протеазе, моющая композиция также содержит по меньшей мере один дополнительный фермент, выбранный из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и/или целлюлаз. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один стабилизатор. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стабилизатором является боракс, глицерин и/или конкурентный ингибитор. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор стабилизирует выделенную сериновую протеазу от действия анионных поверхностно-активных веществ. Моющая композиция предусматривается в любой пригодной форме, включая, но не ограничиваясь ими, твердую, жидкую формы, форму аэрозоля и/или геля.

Моющие композиции по настоящему изобретению применимы в способах очистки. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование объекта с моющей композицией для очистки объекта. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает промывание и/или ополаскивание объекта. В иллюстративных вариантах осуществления объектом является ткань (например, одежда) или предмет столовой посуды (например, блюдо или тарелка).

Также настоящее изобретение относится к корму для животных, содержащему выделенную сериновую протеазу.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 схематично представлена диаграмма, на которой показана организация гена 1AG3.

На фиг.2 представлено выравнивание полипептидных последовательностей 1AG3 (SEQ ID NO:2) и стрептогрисина C (SEQ ID NO:12).

На фиг.3 представлено выравнивание зрелой (т.е. каталитических доменов) протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:13) и стрептогрисина C (SEQ ID NO:14). На этой фигуре активный центр аминокислот (his-asp-ser) показан полужирным шрифтом и характерные три дисульфидных мостика указаны соединительными линиями.

На фиг.4 представлено выравнивание протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:2) и ASP (SEQ ID NO:15).

На фиг.5 представлено выравнивание зрелой (т.е. каталитических доменов) протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:13) и ASP (SEQ ID NO:16).

На фиг.6 представлена карта экспресирующей конструкции pSEA4CT-1AG3.

На фиг.7 представлена кривая "доза-эффект" для протеазы 1AG3, тестированной в жидком детергенте при 20ºС и pH 8,2.

На фиг.8 представлена кривая "доза-эффект" для протеазы 1AG3, тестированной в жидком детергенте при 30ºС и pH 6,0.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе представлены новые протеазы, новый генетический материал, кодирующий эти ферменты, и протеолитические белки, полученные из видов Streptomyces, включая варианты белков, полученные из них. В некоторых вариантах осуществления предусматриваются композиции протеаз, полученные из вновь описанных видов Streptomyces, ДНК, кодирующая протеазу, векторы, содержащие ДНК, кодирующую протеазу, клетки-хозяева, трансформированные векторной ДНК, и фермент, продуцируемый клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также предусматриваются моющие композиции (например, детергентные композиции), композиции кормов для животных и композиции для обработки тканей и кожи, содержащие протеазу(ы), полученную из Streptomyces sp. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутантным (т.е. являющимся вариантами) протеазам, происходящим из протеаз дикого типа, описанных в настоящем документе. Эти мутантные протеазы также применимы во множестве применений.

Streptomyces представляют собой грамположительные бактерии, классифицируемые как члены семейства Streptomycetaceae, подотряд Streptomycineae, отряд Actinomycetales, класс Actinobacteria. Streptomyces растут в качестве широко ветвящегося первичного или субстратного мицелия и многочисленного воздушного мицелия, который при созревании имеет характерные споры. Стрептогрисины представляют собой сериновые протеазы, секретируемые в больших количествах широким множеством видов Streptomyces. Аминокислотные последовательности протеаз Streptomyces были определены по меньшей мере для 9 различных видов Streptomyces, включая стрептогрисин C Streptomyces griseus (регистрационный № P52320); щелочную протеазу (EC 3.4.21.-) из Streptomyces sp. (регистрационный № PC2053); щелочную сериновую протеазу I из Streptomyces sp. (регистрационный № S34672), сериновую протеазу из Streptomyces lividans (регистрационный № CAD4208); предполагаемую сериновую протеазу из Streptomyces coelicolor A3(2) (регистрационный № NP_625129); предполагаемую сериновую протеазу из Streptomyces avermitilis MA-4680 (регистрационный № NP_822175); сериновую протеазу из Streptomyces lividans (регистрационный № CAD42809); предполагаемый предшественник сериновой протеазы из Streptomyces coelicolor A3(2) (регистрационный № NP_628830)). Были описаны очищенная нативная щелочная протеаза, имеющая кажущуюся молекулярную массу 19000 дальтон и выделенная из Streptomyces griseus var. alkaliphilus, и моющие композиции, содержащие ее (смотрите, например, патент США № 5646028, включенный в настоящий документ в качестве ссылки). Дополнительный штамм был выделен из образца воды и осадка озерной воды; этот штамм обозначен в настоящем документе как "штамм 1AG3". Температура толщи воды и осадка составляла 19-23ºС, pH 10,5, и проводимость воды составляла 26,1 мС см^-1.

Некоторые из протеазных ферментов, описанных в настоящем документе, обладают высокой стабильностью и протеолитической активностью. Эти ферменты применимы в различных применениях, включая, но не ограничиваясь ими, моющие композиции, корма для животных, композиции для обработки тканей и кожи, и т.д. Настоящее изобретение также относится к способам получения этих ферментов. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению находятся в чистой или относительно чистой форме.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые пригодны для получения протеаз по настоящему изобретению в рекомбинантных организмах. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантное продуцирование обеспечивает способ получения протеаз в количествах, которые являются рентабельными.

Если нет иных указаний, практика этого изобретения вовлекает общепринятые способы, широко используемые в молекулярной биологии, микробиологии и способах рекомбинантных ДНК, которые относятся к данной области. Такие способы известны специалистам в данной области и описаны в ряде книг и справочных изданий. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, упомянутые в настоящем документе, как выше, так и ниже, включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

Если в настоящем документе не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой это изобретение относится. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, применимы для практики этого изобретения, иллюстративные способы и материалы описаны. Таким образом, термины, определенные непосредственно ниже, более полно описаны, исходя из описания в целом. Также, как используют в настоящем документе, форма единственного числа включает форму множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Числовые диапазоны являются включающими числа, определяющие диапазон. Если нет иных указаний, последовательности нуклеиновых кислот представлены слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности представлены слева направо в ориентации от N- к С-, соответственно. Следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными описанными способами, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьировать, в зависимости от условий, в которых их используют специалисты в данной области.

Для практики этого изобретения используются, если нет иных указаний, общепринятые способы очистки белков, молекулярной биологии, микробиологии, способы рекомбинантных ДНК и секвенирования белков, все из которых находятся в пределах квалификации в данной области.

Более того, заголовки, представленные в настоящем документе, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые могут существовать, исходя из описания в целом. Таким образом, термины, определенные непосредственно ниже, более подробно определены, исходя из описания в целом. Тем не менее, для облегчения понимания изобретения, ряд терминов определен ниже.

I. Определения

Как используют в настоящем документе, термины "протеаза" и "протеолитическая активность" относятся к белку или пептиду, проявляющему способность гидролизовывать пептиды или субстраты, имеющие пептидные связи. Для измерения протеолитической активности известно множество общепринятых способов, и они знакомы специалистам в данной области. Например, протеолитическую активность, как правило, устанавливают с помощью сравнительных анализов, в которых анализируется способность соответствующих протеаз гидролизовывать коммерческий субстрат. Иллюстративные субстраты, пригодные для анализа протеаз и/или протеолитической активности, включают, но не ограничиваются ими, диметилказеин (Sigma C-9801), бычий коллаген (Sigma C-9879), бычий эластин (Sigma E-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием этих субстратов хорошо известны в данной области (смотрите, например, WO 99/34011; и патент США № 6376450, оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок). Также применим анализ pNA (смотрите, например, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) для определения концентрации активного фермента для фракций, собранных в ходе градиентного элюирования. В этом анализе измеряется скорость, с которой п-нитроанилин высвобождается по мере гидролиза ферментом растворимого синтетического субстрата, сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-п-нитроанилида (sAAPF-pNA). Скорость образования желтого цвета при реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, для определения общей концентрации белка можно использовать измерение поглощения при 280 нм. Отношение активный фермент/общий белок определяет чистоту фермента.

Как используют в настоящем документе, термины штаммовая "протеаза 1AG3" относится к протеазе одного из вариантов осуществления настоящего изобретения. Протеаза дикого типа была выделена из штамма 1AG3 Streptomyces, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится активной форме протеазы, содержащей полипептид из 256 аминокислот. В дополнительных вариантах осуществления протеаза 1AG3 представляет собой вариант или гомолог ASP-протеазы 1AG3.

Термин "гомологи протеазы Streptomyces" относится к встречающимся в природе протеазам, имеющим аминокислотные последовательности, по существу идентичные зрелой протеазе, происходящей из штамма 1AG3 Streptomyces, и/или полинуклеотидные последовательности, которые кодируют такие встречающиеся в природе протеазы, и эти протеазы сохраняют функциональные характеристики сериновой протеазы, кодируемой такими нуклеиновыми кислотами.

"ASP-протеаза", "Asp-протеаза" и "Asp" относятся к сериновым протеазам, описанным в настоящем документе и в PCT с серийными №№ US04/39006 и US04/39066, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления протеаза Asp представляет собой протеазу, обозначаемую в настоящем документе как протеаза 69B4, получаемая из штамма 69B4 Cellulomonas. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления термин "протеаза 69B4" относится к встречающейся в природе зрелой протеазе из штамма 69B4 Cellulomonas (DSM 16035), имеющей по существу идентичные аминокислотные последовательности, как указано в SEQ ID NO:25. В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к частям ASP-протеазы.

Термин "гомологи протеазы Cellulomonas" относится к встречающимся в природе протеазам, имеющим аминокислотные последовательности, по существу идентичные зрелой протеазе из штамма 69B4 Cellulomonas, или полинуклеотидные последовательности, которые кодируют такие встречающиеся в природе протеазы, и имеющим функциональные характеристики сериновой протеазы, кодируемой такими нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления эти гомологи протеаз обозначают как "целлюломонадины".

Как используют в настоящем документе, термины "вариант 1AG3 Streptomyces", "вариант протеазы Streptomyces" и "вариант протеазы 1AG3" используют для указания на протеазы, которые сходны с протеазой 1AG3 Streptomyces дикого типа, в частности, их функцией, однако имеют мутации в их аминокислотной последовательности, которые делают их отличающимися по последовательности от протеазы дикого типа.

Как используют в настоящем документе, термины "вариант ASP", "вариант протеазы ASP" и "вариант протеазы 69B" используют для указания на протеазы, которые сходны с ASP дикого типа, в частности, их функцией, но имеют мутации в их аминокислотной последовательности, которые делают их отличающимися по последовательности от протеазы дикого типа.

Как используют в настоящем документе, термин "виды Cellulomonas" относится ко всем видам рода "Cellulomonas", которые представляют собой грамположительные бактерии, классифицируемые как члены семейства Cellulomonadaceae, подотряд Micrococcineae, отряд Actinomycetales, класс Actinobacteria. Является признанным, что род Cellulomonas продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые будут переклассифицированы.

Как используют в настоящем документе, термин "виды Streptomyces" относится ко всем видам рода "Streptomyces", которые являются грамположительными бактериями, классифицируемыми как члены семейства Streptomycetaceae, подотряд Streptomycineae, отряд Actinomycetales, класс Actinobacteria. Является признанным, что род Streptomyces продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые будут переклассифицированы.

Как используют в настоящем документе, "род Bacillus" включает все виды рода "Bacillus", как известно специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus и B. thuringiensis. Является общепризнанным, что род Bacillus продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые будут переклассифицированы, включая, но не ограничиваясь ими, такие организмы, как B. stearothermophilus, которые в настоящее время называют "Geobacillus stearothermophilus". Получение устойчивых эндоспор в присутствии кислорода считают определяющим признаком рода Bacillus, хотя эта характеристика также применима к недавно получившим название Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus, а также к дополнительным организмам.

Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота", используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо из рибонуклеотидов, либо из дезоксирибонуклеотидов. Эти термины включают, но не ограничиваются ими, одно-, двух- или трехцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, гибрид ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные нуклеотидные основания или производные нуклеотидных оснований. Ниже представлены неограничивающие примеры полинуклеотидов: гены, фрагменты генов, хромосомные фрагменты, EST, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды содержат модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и линкерные группы, такие как фторрибоза и тиоат, и нуклеотидные ответвления. В альтернативных вариантах осуществления последовательность нуклеотидов прерывается ненуклеотидными компонентами.

Как используют в настоящем документе, термины "конструкция ДНК" и "трансформирующая ДНК" используют взаимозаменяемо, и они относятся к ДНК, используемой для введения последовательностей в клетку-хозяина или организм хозяина. ДНК можно создавать in vitro посредством ПЦР или любого другого пригодного способа(ов), известного специалисту в данной области. В конкретных вариантах осуществления конструкция ДНК содержит представляющую интерес последовательность (например, в качестве вводимой последовательности). В некоторых вариантах осуществления последовательность функционально связана с дополнительными элементами, такими как элементы контроля (например, промоторы и т.д.). Кроме того, конструкция ДНК может содержать селективный маркер. Кроме того, она может содержать вводимую последовательность, фланкируемую гомологичными боксами. В следующем варианте осуществления трансформирующая ДНК содержит другие негомологичные последовательности, добавляемые на концы (например, спейсерные или фланкирующие последовательности). В некоторых вариантах осуществления концы вводимой последовательности являются замкнутыми, так что трансформирующая ДНК образует замкнутую окружность. Трансформирующие последовательности могут представлять собой последовательности дикого типа, мутантные или модифицированные последовательности. В некоторых вариантах осуществления конструкция ДНК содержит последовательности, гомологичные хромосоме клетки-хозяина. В других вариантах осуществления конструкция ДНК содержит негомологичные последовательности. После сборки конструкции ДНК in vitro, ее можно использовать для: 1) встраивания гетерологичных последовательностей в требуемую последовательность-мишень или клетку-хозяина и/или 2) осуществления мутагенеза участка хромосомы клетки-хозяина (т.е. замены эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью), 3) удаления генов-мишеней; и/или введения заменяющей плазмиды в хозяина.

Как используют в настоящем документе, термины "экспрессирующая кассета" и "экспрессирующий вектор" относятся к конструкциям нуклеиновых кислот, созданным рекомбинантно или синтетически, с серией определенных элементов нуклеиновых кислот, которые позволяют транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную экспрессирующую кассету можно включать в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, часть экспрессирующего вектора, представляющая собой рекомбинантную экспрессирующую кассету, включает, помимо других последовательностей, последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащую транскрипции, и промотор. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы обладают способностью включать в себя и экспресировать гетерологичные фрагменты ДНК в клетке-хозяине. Множество прокариотических и эукариотических экспрессирующих векторов являются коммерчески доступными. Выбор соответствующих экспрессирующих векторов относится к знаниям специалистов в данной области. Термин "экспрессирующая кассета" используют в настоящем документе взаимозаменяемо с термином "конструкция ДНК" и его грамматическими эквивалентами. Выбор соответствующих экспрессирующих векторов относится к знанию специалистов в данной области.

Как используют в настоящем документе, термин "вектор" относится к полинуклеотидной конструкции, предназначенной для введения нуклеиновых кислот в один или несколько типов клеток. Векторы включают клонирующие векторы, экспрессирующие векторы, челночные векторы, плазмиды, кассеты и т.п. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция содержит последовательность ДНК, кодирующую протеазу (например, предшественника протеазы или зрелую протеазу), которая функционально связана с пригодной пропоследовательностью (например, секреторной последовательностью, и т.д.), способной осуществлять экспрессию ДНК в пригодном хозяине.

Как используют в настоящем документе, термин "плазмида" относится к замкнутой двухцепочечной (ds) конструкции ДНК, используемой в качестве клонирующего вектора, и которая образует внехромосомный саморпелицирующийся генетический элемент у некоторых эукариот или прокариот, или встраивается в хромосому хозяина.

Как используют в настоящем документе в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, термин "введенный" относится к любому способу, пригодному для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но не ограничиваются ими, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, конъюгацию и трансдукцию (смотрите, например, Ferrari et al., "Genetics", Hardwood et al., (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp, pp. 57-72, [1989]).

Как используют в настоящем документе, термины "трансформированный" и "стабильно трансформированный" относится к клетке, которая имеет ненативную (гетерологичную) полинуклеотидную последовательность, встроенную в ее геном или в качестве эписомальной плазмиды, которая сохраняется в течение по меньшей мере двух поколений.

Как используют в настоящем документе, термин "кодирующая селективный маркер нуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая способна экспрессироваться в клетках-хозяевах, и где экспрессия селективного маркера придает клеткам, содержащим экспрессируемый ген, способность расти в присутствии соответствующего селективного агента или в отсутствие необходимых питательных веществ.

Как используют в настоящем документе, термины "селектируемый маркер" и "селективный маркер" относятся к нуклеиновой кислоте (например, гену), способной экспрессироваться в клетке-хозяине, которая обеспечивает простоту селекции этих хозяев, содержащих вектор. Примеры таких селективных маркеров включают, но не ограничиваются ими, противомикробные средства. Таким образом, термин "селективный маркер" относится к генам, которые обеспечивают указание на то, что клетка-хозяин захватила представляющую интерес вводимую ДНК или что произошла какая-либо другая реакция. Как правило, селективные маркеры представляют собой гены, которые придают противомикробную устойчивость или метаболическое преимущество клетке-хозяину, позволяя отличить клетки, содержащие экзогенную ДНК, от клеток, в которые не была введена какая-либо экзогенная последовательность в процессе трансформации. "Собственный селективный маркер" представляет собой маркер, который расположен на хромосоме микроорганизма, подлежащего трансформации. Собственный селективный маркер кодирует ген, который отличается от селективного маркера на трансформирующей конструкции ДНК. Селективные маркеры хорошо известны специалистам в данной области. Как указано выше, маркер может представлять собой маркер устойчивости к антибиотикам (например, amp^R; phleo^R; spec^R; kan^R; ery^R; tet^R; cmp^R; и neo^R; сморите, например, Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995]; Palmeros et al., Gene 247:255-264 [2000]; и Tnieu-Cuot et al., Gene, 23:331-341 [1983]). Другие маркеры включают, но не ограничиваются ими, ауксотрофные маркеры, такие как триптофан; и маркеры для детекции, такие как β-галактозидаза.

Как используют в настоящем документе, термин "промотор" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая функционирует, направляя транскрипцию расположенного ниже гена. В некоторых вариантах осуществления промотор является подходящим для клетки-хозяина, в которой ген-мишень подлежит экспрессии. Промотор, вместе с другими транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот (также называемыми "последовательностями контроля") необходим для экспрессии данного гена. Как правило, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, участки связывания рибосом, последовательности инициации и терминации транскрипции, и последовательности энхансеров или активаторов.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК, кодирующая секреторную лидерную последовательность (т.е. сигнальный пептид), функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируются в качестве пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосом является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, "функционально связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры на должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в соответствующих участках рестрикции. Если таких участков нет, используют синтетические олигонуклеотидные соединительные элементы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Как используют в настоящем документе, термин "ген" относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки, предшествующие кодирующим областям и следующие после них, а также ко встроенным в них последовательностям (интронам) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Как используют в настоящем документе, термин "гомологичные гены" относится к паре генов из отличающихся, но обычно родственных видов, которые соответствуют друг другу и которые являются идентичными или очень сходными друг с другом. Термин охватывает гены, которые отличаются вследствие видообразования (т.е. развития новых видов) (например, ортологичные гены), а также гены, которые отличаются генетической дупликацией (например, паралогичные гены).

Как используют в настоящем документе, термины "ортолог" и "ортологичные гены" относятся к генам в различных видах, которые эволюционировали из общего предкового гена (т.е. гомологичного гена) вследствие видообразования. Как правило, ортологи сохраняют ту же функцию в процессе эволюции. Идентификация ортолога применима для достоверного предсказания функции гена или вновь отсеквенированных геномов.

Как используют в настоящем документе, термины "паралог" и "паралогичные гены" относятся к генам, которые являются родственными вследствие дупликации в геноме. В то время как ортологи сохраняют ту же функцию в процессе эволюции, у паралогов развиваются новые функции, даже несмотря на то, что некоторые функции часто являются сходными с исходными функциями. Примеры паралогичных генов включают, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие трипсин, химотрипсин, эластазу и тромбин, все которых представляют собой сериновые протеазы и встречаются в одних и тех же видах.

Как используют в настоящем документе, "гомология" относится к сходству или идентичности последовательностей. Эту гомологию определяют с использованием стандартных способов, известных в данной области (смотрите, например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; программы такие как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); и Devereux et al. Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]).

Как используют в настоящем документе, "аналогичная последовательность" представляет собой последовательность, где функция гена является по существу такой же, как и у гена на основе протеазы 1AG3 Streptomyces. Кроме того, аналогичные гены включают по меньшей мере приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичность последовательностей с последовательностью протеазы 1AG3 штамма Streptomyces. Альтернативно, выравнивание аналогичных последовательностей составляет между 70 и 100% генов, находящихся в области протеазы штамма 1AG3 Streptomyces, и/или по меньшей мере между 5-10 генов, находящихся в этой области, выравниваются с генами в хромосоме штамма 1AG3 Streptomyces. В дополнительных вариантах осуществления к последовательности применимо более одного из указанных выше свойств. Аналогичные последовательности определяют известными способами выравнивания последовательностей. Широко используемым способом выравнивания является BLAST, хотя, как указано выше и ниже, существуют другие способы, которые также применимы для выравнивания последовательностей.

Одним из примеров пригодного алгоритма является PILEUP. PILEUP осуществляет множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессирующего попарного выравнивания. Он также строит дерево, показывающее кластерную взаимосвязь, используемую для проведения выравнивания. В PILEUP используется упрощение способа прогрессирующего выравнивания Feng and Doolittle (Feng and Doolittle, Mol. Evol., 35:351-360 [1987]). Используемый способ является сходным со способом, описанным Higgins and Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]). Пригодные параметры PILEUP включают штраф за делецию по умолчанию 3,00, штраф за продолжение делеции по умолчанию 0,10, и оцениваемые концевые делеции.

Другим примером пригодного алгоритма является алгоритм BLAST, описанный Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol, 215:403-410, [1990]; и Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Особенно пригодной программой BLAST является программа WU-BLAST-2 (смотрите, Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]). В WU-BLAST-2 используется несколько параметров, большинство из которых установлены как значения по умолчанию. Для изменяемых параметров устанавливают следующие значения: область перекрывания=1, доля перекрывания=0,125, порог для слова (T)=11. Параметры HSP S и HSP S2 представляют собой динамические значения и устанавливаются программой самостоятельно, в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, в которой проводят поиск представляющей интерес последовательности. Однако значения можно корректировать для повышения чувствительности. Значение % идентичности аминокислотной последовательности определяют по числу совпавших идентичных остатков, деленному на общее число остатков "более длинной" последовательности в выравниваемой области. "Более длинная" последовательность представляет собой последовательность, имеющую большинство истинных остатков в выравниваемой области (пропуски, внесенные WU-Blast-2 для максимизации показателя выравнивания, игнорируются).

Таким образом, "процентная (%) идентичность последовательностей нуклеиновых кислот" определяют как процент нуклеотидных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны с нуклеотидными остатками исходной последовательности (т.е. представляющей интерес последовательности). В способе используется модуль BLASTN WU-BLAST-2, установленный на параметры по умолчанию, с областью перекрывания и долей перекрывания 1 и 0,125, соответственно.

Как используют в настоящем документе, термин "гибридизация" относится к процессу, посредством которого цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью путем спаривания оснований, как известно в данной области.

Последовательность нуклеиновой кислоты считают "селективно гибридизующейся" с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты, если две последовательности специфично гибридизуются друг с другом в условиях гибридизации и промывания от умеренной до высокой строгости. Условия гибридизации основаны на температуре отжига (Tm) связывающего нуклеиновую кислоту комплекса или зонда. Например, "максимальная строгость", как правило, имеет место при приблизительно Tm-5ºC (на 5º ниже Tm зонда); "высокая строгость" при приблизительно 5-10ºС ниже Tm; "промежуточная строгость" при приблизительно 10-20ºС ниже Tm зонда; и "низкая строгость при приблизительно" 20-25ºС ниже Tm. Функционально, условия максимальной строгости можно использовать для идентификации последовательностей, имеющих строгую идентичность или практически строгую идентичность с зондом для гибридизации; в то время как гибридизацию промежуточной или низкой строгости можно использовать для идентификации или детекции гомологов полинуклеотидной последовательности.

Условия гибридизации умеренной и высокой строгости хорошо известны в данной области. Пример условий высокой строгости включает гибридизацию при приблизительно 42ºС в 50% формамиде, 5×SSC, 5× растворе Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя, с последующим промыванием два раза в 2×SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре и два дополнительных раза в 0,1×SSC и 0,5% SDS при 42ºС. Пример условий умеренной строгости включает инкубацию в течение ночи при 37ºС в растворе, содержащем 20% формамид, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ трицитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5×раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной расщепленной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 1×SSC при приблизительно 37-50ºС. Специалистам в данной области известно, как корректировать температуру, ионную силу и т.д. при необходимости, для учета таких факторов, как длина зонда и т.п.

Как используют в настоящем документе, "рекомбинантный" включает указание на клетку или вектор, которые были модифицированы путем введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, или на то, что клетка происходит из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не встречаются в идентичной форме в нативной (нерекомбинантной) форме клетки или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае аномально экспрессируются, экспрессируются на сниженном уровне или вообще не экспрессируются в результате преднамеренного вмешательства человека. "Рекомбинация", "рекомбинирование" и получение "рекомбинированной" нуклеиновой кислоты, как правило, представляют собой объединение двух или более фрагментов нуклеиновых кислот, где объединение дает начало химерному гену.

В одном варианте осуществления создают мутантные последовательности ДНК с помощью мутагенеза с насыщением участка по меньшей мере в одном кодоне. В другом варианте осуществления мутагенез с насыщением участка проводят для двух или более кодонов. В следующем варианте осуществления мутантные последовательности ДНК имеют более чем 50%, более чем 55%, более чем 60%, более чем 65%, более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90%, более чем 95% или более чем 98% гомологию с последовательностью дикого типа. В альтернативных вариантах осуществления мутантную ДНК создают in vivo с использованием любого известного способа мутагенеза, например, такого как облучение, применение нитрозогуанидина и т.п. Затем требуемую последовательность ДНК выделяют и используют в способах, представленных в настоящем документе.

Как используют в настоящем документе, термин "последовательность-мишень" относится к последовательности ДНК в клетке-хозяине, которая кодирует последовательность, где желательно, чтобы вводимая последовательность встраивалась в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления последовательность-мишень кодирует функциональный ген дикого типа или оперон, а в других вариантах осуществления последовательность-мишень кодирует функциональный мутантный ген или оперон, или нефункциональный ген или оперон.

Как используют в настоящем документе, "фланкирующая последовательность" относится к любой последовательности, которая находится либо выше, либо ниже рассматриваемой последовательности (например, для генов A-B-C, ген B фланкируется последовательностями генов A и C). В одном варианте осуществления вводимая последовательность фланкируется боксом гомологии с каждой стороны. В другом варианте осуществления вводимая последовательность и боксы гомологии содержат элемент, который фланкируется спейсерной последовательностью с каждой стороны. В некоторых вариантах осуществления фланкирующая последовательность присутствует только с одной стороны (либо 3', либо 5'), однако в одном варианте осуществления она находится с каждой стороны фланкируемой последовательности. В некоторых вариантах осуществления фланкирующая последовательность присутствует только с одной стороны (либо 3', либо 5'), а в других вариантах осуществления она присутствует с каждой стороны фланкируемой последовательности.

Как используют в настоящем документе, термин "спейсерная последовательность" относится к любой дополнительной ДНК, которая фланкирует боксы гомологии (как правило, последовательности вектора). Однако термин включает любую негомологичную последовательность ДНК. Не ограничиваясь теорией, спейсерная последовательность обеспечивает некритичную мишень для начала клеткой захвата ДНК.

Как используют в настоящем документе, термин "встраивание в хромосому" относится к процессу, при котором вводимая последовательность встраивается в хромосому клетки-хозяина. Гомологичные области трансформирующей ДНК располагаются рядом с гомологичными областями хромосомы. Затем последовательность между боксами гомологии заменяется вводимой последовательностью путем двойного кроссинговера (т.е. гомологичной рекомбинации). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, гомологичные участки инактивирующего хромосомного сегмента конструкции ДНК располагаются рядом с фланкирующими гомологичными областями собственной хромосомной области хромосомы Bacillus. Затем собственная хромосомная область удаляется конструкцией ДНК путем двойного кроссинговера (т.е. гомологичной рекомбинации).

"Гомологичная рекомбинация" означает обмен фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК или спаренными хромосомами в участке идентичных или практически идентичных нуклеотидных последовательностей. В одном варианте осуществления встраивание в хромосому происходит путем гомологичной рекомбинации.

Термин "гомологичные последовательности", как используют в настоящем документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты или полипептида, имеющую приблизительно 100%, приблизительно 99%, приблизительно 98%, приблизительно 97%, приблизительно 96%, приблизительно 95%, приблизительно 94%, приблизительно 93%, приблизительно 92%. приблизительно 91%, приблизительно 90%, приблизительно 88%, приблизительно 85%, приблизительно 80%, приблизительно 75% или приблизительно 70% идентичность последовательности с другой последовательностью нуклеиновой кислоты или полипептида при оптимальном выравнивании для сравнения. В некоторых вариантах осуществления гомологичные последовательности имеют идентичность последовательностей между приблизительно 85% и приблизительно 100%, а в других вариантах осуществления существует идентичность последовательностей между приблизительно 90% и приблизительно 100%, и, более того, в некоторых вариантах осуществления существует идентичность последовательностей между приблизительно 95% и приблизительно 100%.

Как используют в настоящем документе, "аминокислота" относится к последовательностям пептидов или белков или их частей. Термины "белок", "пептид" и "полипептид" используются взаимозаменяемо.

Как используют в настоящем документе, "представляющий интерес белок" и "представляющий интерес полипептид" относятся к белку/полипептиду, который является желательным и/или подвергается оценке. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес белок экспрессируется внутриклеточно, в то время как в других вариантах осуществления он представляет собой секретируемый полипептид. В конкретных вариантах осуществления этот фермент включает сериновые протеазы, описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой секретируемый полипептид, слитый с сигнальным пептидом (т.е. N-концевым удлинением белка для секреции). Практически во всех секретируемых белках используется N-концевое удлинение белка, которое играет ключевую роль в нацеливании белков-предшественников на мембрану и их транслокации через мембрану. Это удлинение протеолитически устраняется сигнальной пептидазой в процессе или непосредственно после переноса через мембрану.

Как используют в настоящем документе, термин "гетерологичный белок" относится к белку или полипептиду, который не является встречающимся в природе в клетке-хозяине. Примеры гетерологичных белков включают ферменты, такие как гидролазы, в том числе протеазы. В некоторых вариантах осуществления гены, кодирующие белки, представляют собой встречающиеся в природе гены, а в других вариантах осуществления используют мутантные и/или синтетические гены.

Как используют в настоящем документе, "гомологичный белок" относится к белку или полипептиду, нативному или встречающемуся в природе в клетке. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой грамположительную клетку, а в других вариантах осуществления клетка представляет собой клетку-хозяина Bacillus. В альтернативных вариантах осуществления гомологичный белок представляет собой нативный белок, продуцируемый другими организмами, включая, но не ограничиваясь ими, E. coli, Streptomyces, Trichoderma и Aspergillus. Также это описание относится к клеткам-хозяевам, продуцирующим гомологичный белок посредством технологии рекомбинантных ДНК.

"Штамм-хозяин" или "клетка-хозяин" относятся к пригодному хозяину для экспрессирующего вектора, содержащего ДНК, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

Фермент "сверхэкспрессируется" в клетке-хозяине, если фермент экспрессируется в клетке на более высоком уровне, чем уровень, на котором он экспрессируется в соответствующей клетке дикого типа.

"Пропоследовательность" представляет собой аминокислотную последовательность между сигнальной последовательностью и зрелой протеазой, которая необходима для секреции протеазы. Отщепление пропоследовательности приводит к зрелой активной протеазе.

Термин "сигнальная последовательность" или "сигнальный пептид" относится к любой последовательности нуклеотидов и/или аминокислот, которая может участвовать в секреции зрелой формы или формы предшественника белка. Это определение сигнальной последовательности является функциональным, что означает, что она включает все аминокислотные последовательности, кодируемые N-концевой частью гена белка, которые участвуют в осуществлении секреции белка. Они часто, но не всегда, связываются с N-концевой частью белка или с N-концевой частью предшественника белка. Сигнальная последовательность может быть эндогенной или экзогенной. Сигнальная последовательность может представлять собой последовательность, в норме ассоциированную с белком (например, протеазой), или она может быть из гена, кодирующего другой секретируемый белок. Одна иллюстративная экзогенная сигнальная последовательность содержит первые семь аминокислотных остатков сигнальной последовательности из субтилизина Bacillus subtilis, слитые с остальной частью сигнальной последовательности из субтилизина Bacillus lentus (ATCC 21536).

Термин "зрелая" форма белка или пептида относится к конечной функциональной форме белка или пептида. Например, зрелая форма рассматриваемой протеазы включает по меньшей мере аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:9.

Термин форма "предшественника" белка или пептида относится к зрелой форме белка, имеющей пропоследовательность, функционально связанную с N- или C-концом белка. Предшественник также может иметь "сигнальную" последовательность, функционально связанную с N-концом пропоследовательности. Предшественник также может иметь дополнительные полинуклеотиды, которые вовлечены в посттрансляционную активность (например, полинуклеотиды, отщепляемые от него, чтобы осталась зрелая форма белка или пептида).

"Встречающийся в природе фермент" относится к ферменту, имеющему немодифицированную аминокислотную последовательность, идентичную последовательности, встречающейся в природе. Встречающиеся в природе ферменты включают нативные ферменты, ферменты, экспрессирующиеся в природе или встречающиеся в конкретном микроорганизме.

Термины "происходящий из" и "полученный из" относятся не только к протеазе, продуцированной или продуцируемой рассматриваемым штаммом организма, но также к протеазе, кодируемой последовательностью ДНК, выделенной из такого штамма, и продуцированной в организме хозяина, содержащем такую последовательность ДНК. Кроме того, термин относится к протеазе, которая кодируется последовательностью ДНК синтетического происхождения и/или из кДНК, и которая имеет отличительные признаки рассматриваемой протеазы. Для иллюстрации, термин "протеазы, происходящие из Streptomyces," относится к ферментам, имеющим протеолитическую активность, которые в природе продуцируются Streptomyces, а также к сериновым протеазам, подобным протеазам, продуцируемым источниками Streptomyces, но которые при помощи способов генетической инженерии продуцируются не являющимися Streptomyces организмами, трансформированными нуклеиновой кислотой, кодирующей указанные сериновые протеазы.

"Производное" в объеме этого определения, как правило, сохраняет характерную протеолитическую активность, наблюдаемую в форме дикого типа, нативной или исходной форме, до той степени, что производное является пригодным для целей сходных с формой дикого типа, нативной или исходной формой. Функциональные производные сериновой протеазы охватывают встречающиеся в природе, синтетически или рекомбинантно продуцируемые пептиды или пептидные фрагменты, которые обладают основными характеристиками рассматриваемой сериновой протеазы.

Термин "функциональное производное" относится к производному нуклеиновой кислоты, которое имеет функциональные характеристики нуклеиновой кислоты, которая кодирует сериновую протеазу. Функциональные производные нуклеиновой кислоты, которые кодируют рассматриваемую сериновую протеазу, охватывают встречающиеся в природе, синтетически или рекомбинантно продуцируемые нуклеиновые кислоты или фрагменты, и кодируют характерную сериновую протеазу по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота дикого типа, кодирующая сериновые протеазы в соответствии с изобретением, включает встречающиеся в природе аллели и гомологи на основе вырожденности генетического кода, известные в данной области.

Термин "идентичный" в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие, при определении с использованием одного из представленных ниже алгоритмов сравнения или анализа последовательностей.

Термин "оптимальное выравнивание" относится к выравниванию, дающему наиболее высокий показатель процентной идентичности.

"Процентная идентичность последовательностей", "процентная идентичность аминокислотных последовательностей", "процентная идентичность последовательностей генов" и/или "процентная идентичность последовательностей нуклеиновых кислот/полинуклеотидов" в отношении двух последовательностей аминокислот, полинуклеотидов и/или генов (в зависимости от случая), относятся к проценту остатков, которые являются идентичными в двух последовательностях при оптимальном выравнивании последовательностей. Таким образом, 80% идентичность аминокислотных последовательностей означает, что 80% аминокислот в двух оптимально выровненных полипептидных последовательностях являются идентичными.

Выражение "по существу идентичный" в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, таким образом, относится к полинуклеотиду или полипептиду, который обладает по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% и по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью при применении программ или алгоритмов (например, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) с использованием стандартных параметров. Одним из признаков того, что два полипептида являются по существу идентичными, является то, что первый полипептид иммунологически перекрестно реагирует со вторым полипептидом. Как правило, полипептиды, которые отличаются консервативными аминокислотными заменами, являются иммунологически перекрестно реагирующими. Таким образом, полипептид является по существу идентичным второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативной заменой. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновых кислот являются по существу идентичными является то, что две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях (например, в диапазоне от средней до высокой строгости).

Термин "выделенный" или "очищенный" относится к материалу, который извлечен из его исходного окружения (например, природного окружения, если он является встречающимся в природе). Например, материал называют "очищенным", когда он присутствует в конкретной композиции в более высокой или более низкой концентрации, чем существует во встречающемся в природе организме или организме дикого типа, или в сочетании с компонентами, в норме не присутствующими при экспрессии из встречающегося в природе организма или организма дикого типа. Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, имеющийся у живого животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех из сосуществующих с ним материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могут быть частью вектора, и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут быть частью композиции, и, тем не менее, они могут быть выделенными, поскольку такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота или белок называют очищенным, например, если он дает по существу одну полосу на электрофоретическом геле или блоте.

Термин "выделенный", при использовании в отношении к последовательности ДНК, относится к последовательности ДНК, которая извлечена из ее природного генетического окружения и, таким образом, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей, и находится в форме, пригодной для применения в полученных способами генетической инженерии системах белкового продуцирования. Такие выделенные молекулы представляют собой молекулы, которые отделены от их природного окружения и включают кДНК и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК по настоящему изобретению не содержат других генов, с которыми они обычно ассоциированы, но могут включать встречающиеся в природе 5'- и 3'-нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация ассоциированных участков очевидна специалисту в данной области (смотрите, например, Dynan and Tijan. Nature 316:774-78 [1985]). Термин "выделенная последовательность ДНК" альтернативно обозначается как "клонированная последовательность ДНК".

Термин "выделенный", при использовании в отношении белка, относится к белку, который находится в условиях, отличных от его природного окружения. В одной форме, выделенный белок по существу не содержит других белков, в частности, других гомологичных белков. Выделенный белок может быть более чем на 10% чистым, более чем на 20% чистым и более чем на 30% чистым, при определении посредством SDS-PAGE. Дополнительные аспекты изобретения охватывают белок в высоко очищенной форме (т.е. более чем на приблизительно 40% чистый, более чем приблизительно на 60% чистый, более чем приблизительно на 80% чистый, более чем приблизительно на 90% чистый, более чем приблизительно на 95% чистый, более чем приблизительно на 97% чистый, и даже более чем приблизительно на 99% чистый), при определении посредством SDS-PAGE.

Как используют в настоящем документе, термин "функциональный анализ" относится к анализу, который обеспечивает данные об активности белка. В конкретных вариантах осуществления термин относится к системам для анализа, в которых белок анализируют в отношении его способности функционировать в его обычном объеме. Например, в случае ферментов, функциональный анализ вовлекает определение эффективности фермента в катализе реакции.

Как используют в настоящем документе, термин "намеченное свойство" относится к свойству исходного гена, которое подлежит изменению. Не подразумевается, чтобы настоящее изобретение было ограничено каким-либо конкретным намеченным свойством. Однако в некоторых вариантах осуществления намеченное свойство представляет собой стабильность продукта гена (например, устойчивость к денатурации, протеолиз или другие деградирующие факторы), а в других вариантах осуществления изменяют уровень продуцирования в продуцирующем хозяине. Действительно, предусматривается, что любое свойство исходного гена может найти применение в настоящем изобретении.

Термин "свойство" или его грамматические эквиваленты в контексте полипептида, как используют в настоящем документе, относится к любой характеристике или признаку полипептида, которые можно выбирать и подвергать детекции. Эти свойства включают, но не ограничиваются ими, устойчивость к окислению, субстратную специфичность, каталитическую активность, термическую стабильность, устойчивость к щелочам, pH-профиль активности, устойчивость к протеолитической деградации, KM, kcat, отношение kcat/k_M, сворачивание белка, индукцию иммунного ответа, способность связывать лиганд, способность связываться с рецептором, способность к секреции, способность к экспонированию на поверхности клетки, способность олигомеризоваться, способность к передаче сигнала, способность стимулировать пролиферацию клеток, способность ингибировать пролиферацию клеток, способность индуцировать апоптоз, способность к модификации фосфорилированием или гликозилированием, способность к лечению заболевания.

Термины "модифицированная последовательность" и "модифицированные гены" используются в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к последовательности, которая включает делецию, инсерцию или обрыв во встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления продуктом экспрессии модифицированной последовательности является укороченный белок (например, если модификация представляет собой делецию или обрыв последовательности). В некоторых конкретных вариантах осуществления укороченный белок сохраняет биологическую активность. В альтернативных вариантах осуществления продуктом экспрессии модифицированной последовательности является удлиненный белок (например, модификации, включающий вставку в последовательность нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления вставка приводит к укороченному белку (например, когда вставка приводит к образованию стоп-кодона). Таким образом, вставка может приводить либо к укороченному белку, либо к удлиненному белку в качестве продукта экспрессии.

Термины "последовательность дикого типа" или "ген дикого типа" используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и они относятся к последовательности, которая является нативной или встречающейся в природе в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления последовательность дикого типа относится к представляющей интерес последовательности, которая является исходной точкой в проекте по инженерии белка. Последовательность дикого типа может кодировать либо гомологичный, либо гетерологичный белок. Гомологичный белок представляет собой белок, который клетка-хозяин может продуцировать без вмешательства. Гетерологичный белок представляет собой белок, который клетка-хозяин не может продуцировать без вмешательства.

Как используют в настоящем документе, термин "антитела" относится к иммуноглобулинам. Антитела включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, полученные прямо из любого вида, из которого является желательным получение антител. Кроме того, настоящее изобретение относится к модифицированным антителам. Также термин относится к фрагментам антител, которые сохраняют способность связываться с эпитопом, который связывает интактное антитело, и включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, химерные антитела, антиидиотипические (анти-ID) антитела. Фрагменты антител включают, но не ограничиваются ими, определяющие комплементарность области (CDR), фрагменты одноцепочечных вариабельных участков (scFv), вариабельный участок тяжелой цепи (VH), вариабельный участок легкой цепи (VL). Поликлональные и моноклональные антитела также охватываются настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой моноклональные антитела.

Термин "устойчивый к окислению" относится к протеазам по настоящему изобретению, которые сохраняют определенный уровень ферментативной активности в течение данного периода времени в условиях, преобладающих в ходе протеолиза, гидролиза, очистки или других процессов по изобретению, например, при воздействии отбеливателей или окислителей или контактировании с ними. В некоторых вариантах осуществления протеазы сохраняют по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% протеолитической активности после контакта с отбеливателем или окислителем в течение данного периода времени, например, в течение по меньшей мере 1 минуты, 3 минут, 5 минут, 8 минут, 12 минут, 16 минут, 20 минут и т.д. В некоторых вариантах осуществления стабильность измеряют, как описано в разделе "Примеры".

Термин "стабильный к хелатирующим агентам" относится к протеазам по настоящему изобретению, которые сохраняют определенный уровень ферментативной активности в течение данного периода времени в условиях, преобладающих в ходе протеолиза, гидролиза, очистки или других процессов по изобретению, например, при воздействии хелатирующих агентов или контактировании с ними. В некоторых вариантах осуществления протеазы сохраняют по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% протеолитической активности после контакта с хелатирующим агентом в течение данного периода времени, например, в течение по меньшей мере 10 минут, 20 минут, 40 минут, 60 минут, 100 минут и т.д.

Термин "термически стабильный" относится к протеазам по настоящему изобретению, которые сохраняют определенный уровень ферментативной активности после воздействия определенных температур в течение данного периода времени в условиях, преобладающих в ходе протеолиза, гидролиза, очистки или других процессов по изобретению, например, при воздействии измененных температур. В некоторых вариантах осуществления протеазы сохраняют по меньшей мере приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% протеолитической активности после воздействия измененных температур в течение данного периода времени, например, в течение по меньшей мере 60 минут, 120 минут, 180 минут, 240 минут, 300 минут и т.д.

Термин "повышенная стабильность" в контексте устойчивой к окислению, хелатирующим агентам, температурам и/или pH протеазы относится к более высокой сохраненной протеолитической активности с течением времени по сравнению с другими сериновыми протеазами (например, субтилизиновыми протеазами) и/или ферментами дикого типа.

Термин "сниженная стабильность" в контексте устойчивой к окислению, хелатирующим агентам, температурам и/или pH протеазы относится к более низкой сохраненной протеолитической активности с течением времени по сравнению с другими сериновыми протеазами (например, субтилизиновыми протеазами) и/или ферментами дикого типа.

Термин "активность очистки" относится к эффективности очистки, достигаемой с помощью протеазы в условиях, преобладающих в ходе протеолиза, гидролиза, очистки или других процессов по изобретению. В некоторых вариантах осуществления эффективность очистки определяют путем применения различных анализов очистки чувствительных к ферментам пятен, например, травы, крови, молока или яичного белка при определении путем различных хроматографических, спектрофотометрических или других количественных способом после воздействия на пятна стандартных условий мытья. Иллюстративные анализы включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в WO 99/34011, и патенте США 6605458 (оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок), а также способы, включенные в раздел "Примеры".

Термин "эффективное для очистки количество" протеазы относится к количеству протеазы, описанной в настоящем документе выше, которое достигает требуемого уровня ферментативной активности в конкретной моющей композиции. Такие эффективные количества легко определяет специалист в данной области, и они основаны на множестве факторов, таких как конкретная используемая протеаза, применение для очистки, конкретный состав моющей композиции, и потребности в жидкой или сухой (например, гранулярной, в виде бруска) композиции, и т.д.

Термин "вспомогательные моющие материалы", как используют в настоящем документе, означает любой жидкий, твердый или газообразный материал, выбранный для конкретного желаемого типа моющей композиции и формы продукта (например, жидкой, гранулярной, порошковой композиции, композиции в виде бруска, пасты, аэрозоля, таблетки, геля или пены), который совместим с протеазным ферментом, используемым в композиции. В некоторых вариантах осуществления гранулярные композиции находятся в "компактной" форме, а в других вариантах осуществления жидкие композиции находятся в "концентрированной" форме.

Термин "повышенная эффективность" в контексте активности очистки относится к повышенной или увеличенной активности очистки определенных чувствительных к ферментам пятен, таких как пятна от яиц, молока, травы или крови, при определении путем обычной оценки после стандартного цикла мытья и/или множества циклов мытья.

Термин "сниженная эффективность" в контексте активности очистки относится к сниженной или уменьшенной активности очистки определенных чувствительных к ферментам пятен, таких как пятна от яиц, молока, травы или крови, при определении путем обычной оценки после стандартного цикла мытья и/или множества циклов мытья.

Термин "сравнительная эффективность" в контексте активности очистки относится к по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% по меньшей мере приблизительно 90% по меньшей мере приблизительно 95% активности очистки сравнительной субтилизиновой протеазы (например, коммерчески доступных протеаз), включая, но не ограничиваясь ими, протеазу OPTIMASE^TM (Genencor), протеазу PURAFECT^TM (Genencor), протеазу SAVINASE^TM (Novozymes), варианты BPN' (смотрите, например, патент США № Re 34606), протеазу RELASE^TM, DURAZYME^TM, EVERLASE^TM, KANNASE^TM (Novozymes), протеазы MAXACAL^TM, MAXAPEM^TM, PROPERASE^TM (Genencor; также смотрите патент США № Re 34606, патенты США № 5700676; 5955340; 6312936; 6482628), и продукты вариантов протеаз B. lentus (например, продукты, описанные в WO 92/21760, WO 95/23221 и/или WO 97/07770 (Henkel)). Иллюстративные варианты субтилизиновых протеаз включают, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие замены или делеции в положениях остатков, эквивалентных положениям 76, 101, 103, 104, 120, 159, 167, 170, 194, 195, 217, 232, 235, 236, 245, 248 и/или 252 BPN'. Эффективность очистки можно определять путем сравнения протеаз по настоящему изобретению с эффективностью очистки субтилизиновыми протеазами в различных анализах очистки чувствительных к ферментам пятен, таких как пятна травы, крови или молока, при определении обычным спектрофотометрическим или аналитическим способом после условий стандартного цикла мытья.

Как используют в настоящем документе, система с "низкой концентрацией детергента" включает детергенты, где в воде для мытья присутствует менее чем приблизительно 800 м.д. детергентных компонентов. Японские детергенты, как правило, считают системами с низкой концентрацией детергента, поскольку они обычно имеют приблизительно 667 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Как используют в настоящем документе, системы со "средней концентрацией детергента" включают детергенты, где в воде для мытья присутствует между приблизительно 800 м.д. и 2000 м.д. детергентных компонентов. Североамериканские детергенты, как правило, считают системами со средней концентрацией детергента, поскольку они обычно имеют приблизительно 975 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья. Бразильские детергенты, как правило, имеют приблизительно 1500 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Как используют в настоящем документе, системы с "высокой концентрацией детергента" включают детергенты, где в воде для мытья присутствует более чем приблизительно 2000 м.д. детергентных компонентов. Европейские детергенты, как правило, считают системами с низкой концентрацией детергента, поскольку они обычно имеют приблизительно 3000-8000 м.д. детергентных компонентов в воде для мытья.

Как используют в настоящем документе, "моющие композиции для тканей" включают детергентные композиции для ручной и автоматической стирки, включая композиции добавок для стирки и композиции, пригодные для применения в замачивании и/или предварительной обработке тканей с пятнами (например, одежды, белья и других тканей).

Как используют в настоящем документе, "моющие композиции не для тканей" включают моющие композиции для нетекстильных (т.е. нетканевых) поверхностей, включая, но не ограничиваясь ими, детергент для мытья посуды композиции, композиции для полоскания полости рта, моющие композиции для зубных протезов, и моющие композиции для личной гигиены.

"Компактная" форма моющих композиций в настоящем документе наилучшим образом отражается плотностью и, с точки зрения состава, количеством наполнителя в виде неорганической соли. Наполнители в виде неорганических солей являются общепринятыми ингредиентами детергентных композиций в порошковой форме. В общепринятых детергентных композициях, соли наполнителей присутствуют в существенных количествах, как правило, 17-35% по массе всей композиции. Напротив, в компактных композициях, соль наполнителя присутствует в количествах, не превышающих 15% от всей композиции. В некоторых вариантах осуществления соль наполнителя присутствует в количествах, которые не превышают 10%, или 5%, по массе композиции. В некоторых вариантах осуществления наполнители в виде неорганических солей выбраны из солей щелочных и щелочноземельных металлов, представляющих собой сульфаты и хлориды. Иллюстративной солью наполнителя является сульфат натрия.

II. Ферменты-сериновые протеазы и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты-сериновые протеазы

Настоящее изобретение относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим аминокислотные последовательности, кодирующие протеазы. В некоторых вариантах осуществления эти полинуклеотиды кодируют полипептиды, которые обладают по меньшей мере 65% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 70% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 75% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 85% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 92% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 95% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 97% идентичностью аминокислотной последовательности, по меньшей мере 98% идентичностью аминокислотной последовательности, и по меньшей мере 99% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, 8 и 11 (например, по меньшей мере с частью аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидом, имеющим протеолитическую активность, включая зрелую протеазу, катализирующую гидролиз пептидных связей в субстрате), и/или демонстрируют сравнимую или улучшенную эффективность очистки в определенных условиях мытья.

В некоторых вариантах осуществления процентную идентичность (аминокислотных последовательностей, последовательностей нуклеиновых кислот, последовательностей генов) определяют путем прямого сравнения информации о последовательности между двумя молекулами путем выравнивания последовательностей, подсчета точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, делением на длину более короткой последовательности, и умножением результата на 100. Для этого анализа применимы легко доступные компьютерные программы, такие как программы, описанные выше. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (Genetics Computer Group, Madison, WI) например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также основаны на алгоритме Smith and Waterman. Эти программы легко использовать с параметрами по умолчанию, рекомендованными изготовителем и описанными в Wisconsin Sequence Analysis Package, указанном выше.

Примером алгоритма, пригодного для определения сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST находится в свободном доступе через National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает первичную идентификацию пар последовательностей с максимальным сходством (HSP) посредством идентификации коротких слов с длиной W в представляющей интерес последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому оцениваемому положительно порогу значения T при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Эти первоначальные совпадения соседних слов выступают в роли предшественников для начала поиска с целью обнаружения более длинных HSP, содержащих их. Поиск совпадений слов распространяется в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарное значение для выравнивания может возрастать. Продолжение поиска совпадений слов в каждом направлении останавливается, если: суммарное значение для выравнивания уменьшается по величине X относительно его максимального достигнутого значения; суммарное значение снижается до нуля или ниже; или если достигнут конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, T и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (W) 11, оценочную матрицу BLOSUM62 (смотрите Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) выравнивание (B) 50, ожидаемое значение (E) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (смотрите, например, Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]). Одним параметром сходства, получаемым с помощью алгоритма BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая предполагает указание вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайным образом. Например, нуклеиновую кислоту считают сходной с нуклеиновой кислотой сериновой протеазы по этому изобретению, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении анализируемой нуклеиновой кислоты с нуклеиновой кислотой сериновой протеазы составляет менее чем приблизительно 0,1, менее чем приблизительно 0,01 или менее чем приблизительно 0,001. Когда анализируемая нуклеиновая кислота кодирует полипептид сериновой протеазы, его считают сходным с определенной нуклеиновой кислотой сериновой протеазы, если сравнение приводит к наименьшей суммарной вероятности, составляющей менее чем приблизительно 0,5 (например, менее чем приблизительно 0,2).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, последовательности анализировали с помощью BLAST и инструментов для транслированных последовательностей белков. В некоторых экспериментах использовали Basic BLAST версии 2.0. Выбранной программой являлась "BlastX", а выбранная база данных представляла собой "nr". Использовали значения стандартных параметров/параметров по умолчанию.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду длиной приблизительно 1389 пар оснований, указанному в SEQ ID NO:1, который кодирует протеазу 1AG3, описанную в настоящем документе. Инициирующий кодон и стоп-кодон показан полужирным шрифтом и потенциальный участок связывания рибосом подчеркнут в SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полинуклеотиды, кодирующие эти аминокислотные последовательности, содержат участок из 1362 пар оснований (остатки 1-1362 SEQ ID NO:2), которые, если экспрессируются, предположительно кодируют сигнальную последовательность (нуклеотиды 1-75 SEQ ID NO:2) (т.е. SEQ ID NO:4), кодирующую аминокислоты 1-25 SEQ ID NO:3 (т.е. SEQ ID NO:5), N-концевую пропоследовательность (нуклеотиды 76-591 SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:6), кодирующую аминокислотные остатки 26-197 SEQ ID NO:3) (т.е. SEQ ID NO:7); последовательность зрелой протеазы (нуклеотиды 592-1359 SEQ ID NO:2, кодирующие аминокислотные остатки 198-453 SEQ ID NO:3 (аминокислотные остатки 1-256 SEQ ID NO:9). Альтернативно сигнальный пептид, N-концевая пропоследовательность и последовательность зрелой сериновой протеазы пронумерованы в отношении аминокислотных остатков зрелой протеазы SEQ ID NO:9, пронумерованной как 1-256 (т.е. остатки сигнального пептида с -198 по -173), N-концевой пропоследовательности (остатки с -172 по -1), последовательности зрелой сериновой протеазы (остатки 1-256). В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, имеющую протеолитическую активность, содержит нуклеотидную последовательность из нуклеотидов с 1 по 1362 части SEQ ID NO:2, кодирующей сигнальный пептид и предшественник протеазы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, содержит последовательность нуклеотидов с 1 по 1287 полинуклеотида (SEQ ID NO:10), кодирующую предшественник протеазы Streptomyces (SEQ ID NO:11). В другом варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, содержит последовательность нуклеотидов с 1 по 768 части полинуклеотида (SEQ ID NO:8), кодирующего зрелую протеазу Streptomyces (SEQ ID NO:9). Эти последовательности представлены ниже.

В SEQ ID NO:1 представлена полная нуклеотидная последовательность 1AG3, включая фланкирующие области:

В указанной выше последовательности предполагаемый участок связывания рибосом подчеркнут. Кодон инициации и стоп-кодон указаны полужирным шрифтом. В SEQ ID NO:2, ниже, представлена полинуклеотидная последовательность протеазы 1AG3/открытая рамка считывания протеазы 1AG3:

В SEQ ID NO:3 представлена полипептидная последовательность протеазы 1AG3:

В SEQ ID NO:3, представленной выше, предсказанный сигнальный пептид указан двойным подчеркиванием, а предсказанная пропоследовательность указана однократным подчеркиванием, и предсказанная зрелая цепь указана полужирным шрифтом.

В SEQ ID NO:4 представлена полинуклеотидная последовательность сигнальной последовательности 1AG3:

SEQ ID NO:5 (MHRRRGALFA GAVAIAALTI AAAPA) представляет собой полипептидную последовательность, соответствующую сигнальной последовательности SEQ ID NO:4.

В SEQ ID NO:6 представлена полинуклеотидная последовательность N-концевой пропоследовательности 1AG3:

В SEQ ID NO:7 представлена соответствующая полипептидная последовательность N-концевой пропоследовательности, указанная в SEQ ID NO:6.

В SEQ ID NO:8 представлена полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность зрелой протеазы:

В SEQ ID NO:9, ниже, представлена аминокислотная последовательность зрелой протеазы 1AG3. В этой последовательности каталитическая триада указана полужирным шрифтом.

В SEQ ID NO:10, ниже, представлена полинуклеотидная последовательность предшественника протеазы 1AG3.

В SEQ ID NO:11, ниже, представлена аминокислотная последовательность предшественника протеазы 1AG3.

В SEQ ID NO:12, ниже, представлена неполная полинуклеотидная последовательность последовательности гена 16S рРНК штамма 1AG3:

В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фрагментам или частям ДНК, которые кодируют протеазы, при условии, что кодируемый фрагмент сохраняет протеолитическую активность. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к полинуклеотидам, имеющим по меньшей мере 20% длины последовательности, по меньшей мере 30% длины последовательности, по меньшей мере 40% длины последовательности, по меньшей мере 50% длины последовательности, по меньшей мере 60% длины последовательности, 70% длины последовательности, по меньшей мере 75% длины последовательности, по меньшей мере 80% длины последовательности, по меньшей мере 85% длины последовательности, по меньшей мере 90% длины последовательности, по меньшей мере 92% длины последовательности, по меньшей мере 95% длины последовательности, по меньшей мере 97% длины последовательности, по меньшей мере 98% длины последовательности и по меньшей мере 99% последовательности из полинуклеотидных последовательностей SEQ ID NO:2, 8, 10 или 15. В некоторых альтернативных вариантах осуществления эти фрагменты или участки длины последовательности являются непрерывными частями длины последовательности, пригодными для перестановки последовательности ДНК в последовательностях рекомбинантных ДНК (смотрите, например, патент США № 6132970, включенный в настоящий документ в качестве ссылки).

Другой вариант осуществления изобретения относится к фрагментам ДНК, описанным в настоящем документе, которые применимы в соответствии с известными в данной области способами при получении фрагментов ДНК неполной длины, которые можно использовать для выделения или идентификации полинуклеотидов, кодирующих зрелый протеазный фермент, описанный в настоящем документе, из 1AG3 Streptomyces, или его сегмент, имеющий протеолитическую активность. Более того, ДНК, представленная в SEQ ID NO:1, применима для идентификации гомологичных фрагментов ДНК других видов, и, в частности, Streptomyces sp., которые кодируют протеазу или ее часть, имеющую протеолитическую активность.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению последовательностей праймеров или зондов, сконструированных из SEQ ID NO:1, или ее пригодной части или фрагмента (например, по меньшей мере приблизительно 5-20 или 10-15 последовательно расположенных нуклеотидов), в качестве зонда или праймера для скрининга нуклеиновой кислоты либо геномного происхождения, либо из кДНК. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к зондам ДНК требуемой длины (т.е., как правило, между 100 и 1000 оснований в длину), на основе последовательностей, указанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления фрагменты ДНК электрофоретически отделяют, вырезают из геля, и извлекают из агарового матрикса геля. В некоторых вариантах осуществления этот очищенный фрагмент ДНК затем подвергают мечению (с использованием, например, системы для мечения Megaprime в соответствии с инструкциями изготовителя) для включения P³² в ДНК. Меченный зонд подвергают денатурации нагреванием до 95ºC в течение данного периода времени (например, 5 минут), и сразу добавляют на мембрану и в раствор для прегибридизации. Реакция гибридизации протекает в течение соответствующего времени и в соответствующих условиях (например, в течение 18 часов при 37ºС), при осторожном встряхивании или вращении. Мембрану промывают (например, два раза в SSC/0,3% SDS), а затем отмывают в соответствующем растворе для промывания при осторожном встряхивании. Требуемая строгость представляет собой отражение условий, в которых мембрану (фильтр) промывают. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе условия "низкой строгости" вовлекают промывание раствором 0,2×SSC/0,1% SDS при 20°C в течение 15 минут, а в других вариантах осуществления условия "средней строгости" вовлекают дополнительную стадию промывания, включающую промывание раствором 0,2×SSC/0,1% SDS при 37°Св течение30 минут, а в других вариантах осуществления условия "высокой строгости" вовлекают дополнительную стадию промывания, включающую промывание раствором 0,2×SSC/0,1% SDS при 37°С в течение 45 минут, и в следующих вариантах осуществления условия "максимальной строгости" вовлекают дополнительную стадию промывания, включающую промывание раствором 0,2×SSC/0,1% SDS при 37°С в течение 60 минут. Таким образом, различные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к полинуклеотидам, способным гибридизоваться с зондом, образованным из нуклеотидной последовательности(ей), представленной в настоящем документе, в условиях средней, высокой и/или максимальной строгости.

После промывания мембрану высушивают и проводят детекцию связавшегося зонда. Если в качестве реагента для мечения используют P³² или другой радиоизотоп, проводят детекцию связавшегося зонда ауторадиографией. Другие способы визуализации других зондов хорошо известны специалистам в данной области. Детекция связавшегося зонда указывает на то, что последовательность нуклеиновой кислоты имеет требуемую гомологию, и, таким образом, идентичность последовательностям, указанным в настоящем документе, и охватывается настоящим изобретением. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам детекции нуклеиновой кислоты, кодирующей протеазу, охватываемую настоящим изобретением, которые включают гибридизацию части или всех последовательностей нуклеиновой кислоты, указанных в настоящем документе, с другой нуклеиновой кислотой либо геномного происхождения, либо из кДНК.

Как указано выше, в других вариантах осуществления условия гибридизации основаны на температуре отжига (Tm) связывающего нуклеиновую кислоту комплекса, для обеспечения определенной "строгости" как объяснено ниже. "Максимальная строгость", как правило, имеет место при приблизительно Tm-5ºC (на 5º ниже Tm зонда); "высокая строгость" при приблизительно 5-10ºС ниже Tm; "промежуточная строгость" при приблизительно 10-20ºС ниже Tm зонда; и "низкая строгость при приблизительно" 20-25ºС ниже Tm. Как известно специалистам в данной области, выбирают гибридизацию средней, высокой и/или максимальности строгости так, чтобы оптимизировать условия для идентификации или детекции полинуклеотидной последовательности, гомологичной или эквивалентной полинуклеотидной последовательности.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот (т.е. экспрессирующим векторам), содержащим полинуклеотиды, кодирующие протеазы по настоящему изобретению. В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным по меньшей мере одним из этих векторов.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям, дополнительно кодирующим сигнальную последовательность (смотрите SEQ ID NO:4). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полинуклеотидам, имеющим сигнальную активность, содержащим нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 65% идентичность последовательности, по меньшей мере 70% идентичность последовательности, по меньшей мере 75% идентичность последовательности, по меньшей мере 80% идентичность последовательности, по меньшей мере 85% идентичность последовательности, по меньшей мере 90% идентичность последовательности, по меньшей мере 95% идентичность последовательности, по меньшей мере 97% идентичность последовательности, по меньшей мере 98% идентичность последовательности и по меньшей мере 99% идентичность последовательности с SEQ ID NO:4. Таким образом, в этих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательности с предполагаемой сигнальной последовательностью, и к полинуклеотидам, способным гибридизовываться с зондом, образованным из нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO:4, в условиях средней, высокой и/или максимальной строгости, где сигнальные последовательности имеют по существу ту же сигнальную активность, что и сигнальная последовательность, кодируемая полинуклеотидом по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления на сигнальную активность указывает по существу тот же уровень секреции протеазы в сбраживаемую среду, что и у исходного материала. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к уровням протеазы в сбраживаемой среде, составляющим по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% от уровней секретируемой протеазы в сбраживаемой среде, обеспечиваемых сигнальной последовательностью SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления уровни секретируемой протеазы определяют посредством анализа активности протеазы, такого как анализ pNA (смотрите, например, Del Mar, [1979], ниже). Дополнительные способы определения уровней секреции гетерологичного или гомологичного белка в грамположительных клетках-хозяевах и детекции секретируемых белков включают применение либо поликлональных, либо моноклональных антител, специфичных к белку. Их примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA) и активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS), а также способы, известные в данной области.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим аминокислотную последовательность сигнального пептида (нуклеотиды 1-75 SEQ ID NO:2), как представлено в SEQ ID NO:4, положениях нуклеотидных остатков с 1 по 75 в SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4. Кроме того, изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:4 в условиях низкой, средней, высокой и/или максимальной строгости, но которые имеют по существу ту же сигнальную активность, что и последовательность. Настоящее изобретение охватывает все такие полинуклеотиды. В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, которые комплементарны нуклеотидным последовательностям, описанным в настоящем документе.

Другие аспекты настоящего изобретения охватывают полипептиды, имеющие протеолитическую активность, имеющие 65% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 70% идентичность последовательности, по меньшей мере 75% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 80% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 85% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 92% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 95% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 97% идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере 98% идентичность аминокислотной последовательности и по меньшей мере 99% идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 (т.е. сигнальной последовательностью и предшественником протеазы), SEQ ID NO:11 (т.е. предшественником протеазы), и/или SEQ ID NO:9 (т.е. зрелой протеазой). Протеолитическую активность этих полипептидов определяют с использованием способов, известных в данной области, и они включают такие способы, как способы, используемые для оценки детергентной функции. В следующих вариантах осуществления полипептиды являются выделенными. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения, полипептиды содержат аминокислотные последовательности, идентичные аминокислотной последовательности, указанной в настоящем документе. В некоторых других вариантах осуществления полипептиды идентичны участкам аминокислотных последовательностей, указанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим протеолитической активностью, имеющим аминокислотную последовательность длиной приблизительно 453 аминокислоты, как представлено в SEQ ID NO:3. В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим протеолитической активностью, имеющим аминокислотную последовательность длиной приблизительно 428 аминокислот, представленную в SEQ ID NO:11. В некоторых вариантах осуществления эти аминокислотные последовательности содержат сигнальную последовательность (аминокислоты 1-25 SEQ ID NO:5); и предшественник протеазы (аминокислоты 1-428 SEQ ID NO:11). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим N-концевую пропоследовательность (аминокислоты 1-172 SEQ ID NO:7) и последовательность зрелой протеазы (аминокислоты 1-256 SEQ ID NO:9). В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательность предшественника протеазы (например, аминокислоты 1-428 SEQ ID NO:11). В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательность зрелой протеазы, содержащую аминокислоты (например, 1-256 SEQ ID NO:9).

В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам и/или протеазам, содержащим аминокислотные последовательности с описанной выше последовательностью, происходящим из бактериальных видов, включая, но не ограничиваясь ими, Streptomycetaceae, которые идентифицированы посредством исследований гомологии аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток предшественника протеазы Streptomycetaceae эквивалентен остатку Streptomyces штамма 1AG3, если он является либо гомологом (т.е. соответствует положению либо в первичной, либо в третичной структуре) либо аналогом конкретного остатка или части этого остатка в протеазе штамма 1AG3 Streptomyces (т.е. имеет ту же или сходную функциональную способность для комбинирования, реакции или химического взаимодействия).

В некоторых вариантах осуществления, для установления гомологии с первичной структурой, аминокислотную последовательность предшественника протеазы прямо сравнивают с аминокислотной последовательностью зрелой протеазы штамма 1AG3 Streptomyces и, в частности, с набором консервативных остатков, которые определили как инвариантные во всех или в большинстве протеаз, подобных протеазам Streptomyces, для которых известна последовательность. После выравнивания консервативных остатков, позволяющего необходимые вставки и делеции для осуществления выравнивания (т.е. избежания устранения консервативных остатков посредством случайной делеции и инсерции), определяют остатки, соответствующие конкретным аминокислотам в зрелой протеазе (SEQ ID NO:9) и протеазе 1AG3 Streptomyces. Выравнивание консервативных остатков должно сохранить 100% таких остатков. Однако выравнивание более чем приблизительно 75% или менее чем приблизительно 45% консервативных остатков также является подходящим для определения эквивалентных остатков. Однако должно поддерживаться сохранение каталитической триады His36/Asp64/Ser145 SEQ ID NO:9.

Например, в некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность протеаз из штамма 1AG3 Streptomyces, и других Streptomycetaceae sp., описанных выше, выравнивают для обеспечения максимальной величины гомологии между аминокислотными последовательностями. Сравнение этих последовательностей указывает на то, что в каждой последовательности содержится ряд консервативных остатков. Они представляют собой остатки, которые идентифицированы и используются для установления эквивалентных положений остатков аминокислот, идентифицированных в анализируемом предшественнике или зрелой протеазе Streptomycetaceae.

Эти консервативные остатки используют для установления соответствующих аминокислотных остатков протеазы штамма 1AG3 Streptomyces в одном или нескольких гомологах Streptomycetaceae. Эти конкретные аминокислотные последовательности выравнивают с последовательностью протеазы 1AG3 Streptomyces для получения максимальной гомологии консервативных остатков. Посредством этого выравнивания последовательности и положения конкретных остатков 1AG3 Streptomyces исследуют в сравнении с другими организмами (например, видами Streptomyces). Таким образом, проводят идентификацию эквивалентной аминокислоты для каталитической триады (например, в протеазе 1AG3 Streptomyces) в других видах Streptomycetaceae. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, гомологи протеазы содержат эквивалент His36/Asp64/Ser145 SEQ ID NO:9.

Другим признаком того, что два полипептида являются по существу идентичными, является то, что первый полипептид иммунологически перекрестно реагирует со вторым полипептидом. Способы определения иммунологической перекрестной реактивности описаны в данной области и в разделе "Примеры" настоящего документа. Как правило, полипептиды, которые отличаются консервативными аминокислотными заменами, являются иммунологически перекрестно реагирующими. Таким образом, полипептид является по существу идентичным второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативной заменой.

Настоящее изобретение относится к протеазам, получаемым из различных источников. В некоторых вариантах осуществления протеазы получают из бактерий, а в других вариантах осуществления протеазы получают из грибов.

В некоторых других аспектах настоящего изобретения, источником полинуклеотида являются бактерии, имеющие нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98% идентичностью последовательности с (неполной) нуклеотидной последовательностью гена 16S рРНК штамма 1AG3 Streptomyces (SEQ ID NO:12).

Штамм 1AG3 проявляет наиболее близкую взаимосвязь 16S рДНК с членами Streptomyces семейства Streptomycetaceae. Наиболее близким родственником предположительно является Streptomyces somaliensis (DSM40738) с по меньшей мере 97% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью гена 16S рРНК штамма 1AG3 Streptomyces.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, штамм представляет собой 69B4, как описано в патентной заявке США с серийным № 10/576331, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Хотя могут существовать варианты последовательности встречающегося в природе фермента в организме данного вида, ферменты конкретного типа, продуцируемые организмами одного вида, как правило, являются по существу идентичными в отношении субстратной специфичности и/или уровней протеолитической активности в данных условиях (например, температура, pH, жесткость воды, условия окисления, условия образования хелатных соединений, и концентрация), и т.д. Таким образом, для целей настоящего изобретения, предусматривается, что другие штаммы и виды Streptomyces также продуцируют протеазу Streptomyces по настоящему изобретению и, таким образом, обеспечивают пригодные источники для протеаз по настоящему изобретению. Действительно, как представлено в настоящем документе, предусматривается, что другие члены Streptomycetaceae могут быть применимы в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления протеолитические полипептиды по этому изобретению охарактеризованы физико-химически, а в других вариантах осуществления они охарактеризованы на основе их функциональности, а в следующих вариантах осуществления они охарактеризованы с использованием обоих наборов свойств. Для физико-химической охарактеризации используют хорошо известные способы, такие как SDS-электрофорез, гель-фильтрация, определение аминокислотного состава, масс-спектрометрия (например, MALDI-TOF-MS, LC-ES-MS/MS и т.д.), и осаждение для определения молекулярной массы белков, изоэлектрическое фокусирование для определения pI белков, секвенирование аминокислот для определения последовательностей аминокислот в белке, кристаллографические исследования для определения третичных структур белков, и связывание антитела для определения антигенных эпитопов, находящихся в белках.

В некоторых вариантах осуществления функциональные характеристики определяют способами, хорошо известными специалисту в области протеаз, и они включают, но не ограничиваются ими, гидролиз различных коммерческих субстратов, таких как диметилказеин ("DMC") и/или AAPF-pNA. Этот способ функциональной охарактеризации более подробно описан в разделе "Примеры", представленном в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, протеаза имеет молекулярную массу от приблизительно 17 кДа до приблизительно 22 кДа, например, приблизительно от 18 кДа до 19 кДа, например, от 18700 дальтон до 18800 дальтон, например, приблизительно 18764 дальтон, при определении посредством MALDI-TOF-MS). В другом аспекте настоящего изобретения, измеряют спектр MALDI-TOF-MS протеазы, как указано на фиг.3.

Зрелая протеаза также обладает протеолитической активностью (например, гидролитической активностью в отношении субстрата, имеющего пептидные связи), например, в отношении DMC. В следующих вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную эффективность очистки в определенных условиях. Хотя настоящее изобретение охватывает протеазу 1AG3, как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению проявляют по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% протеолитической активности по сравнению с протеолитической активностью 1AG3. В некоторых вариантах осуществления протеазы проявляют по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% протеолитической активности по сравнению с протеолитической активностью протеаз, продаваемых под торговыми названиями SAVINASE® (Novzymes) или PURAFECT® (Genencor) в тех же условиях. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению проявляют сравнимую или повышенную эффективность очистки в определенных условиях по сравнению с 1AG3 в тех же условиях. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению проявляют сравнимую или повышенную эффективность очистки в определенных условиях, по сравнению с протеазами, продаваемыми под торговыми названиями SAVINASE® (Novozymes) или PURAFECT® (Genencor) в тех же условиях.

В других вариантах осуществления протеазы и/или полинуклеотиды, кодирующие протеазы по настоящему изобретению, предоставлены в очищенной форме (т.е. присутствуют в конкретной композиции в более высокой или более низкой концентрации, чем во встречающемся в природе организме или организме дикого типа), или в сочетании с компонентами, в норме не присутствующими при экспрессии из встречающегося в природе организма или организма дикого типа. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается протеазами с любым конкретным уровнем чистоты, поскольку в различных способах применения, в которых протеазы по настоящему изобретению являются пригодными, применимы диапазоны чистоты протеазы.

Как отмечалось выше, также предусматривается рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую рассматриваемую протеазу. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит экспрессирующую кассету, содержащую функционально связанные: промотор, последовательность, кодирующую рассматриваемую протеазу, и последовательность терминатора, где экспрессирующая кассета является достаточной для получения протеазы в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления промотор является гетерологичным кодирующей последовательности.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный полинкулеотид также кодирует сигнальную последовательность для регуляции рассматриваемой протеазы для секреции. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота также содержит селектируемый маркер для селекции клеток, которые содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту, поверх других клеток, которые не содержат рекомбинантную кислоту. Типичные селектируемые маркеры включают, но не ограничиваются ими, селектируемые маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам (например, устойчивость к гигромицину, блеомицину, хлорамфениколу, флеомицину, канамицину, стрептомицину, ампициллину, тетрациклину и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность является кодон-оптимизированной для экспрессии слитого белка в используемой клетке-хозяине. Поскольку таблицы использования кодонов, в которых приводится использование каждого кодона во множестве клеток, известны в данной области (смотрите, например, Nakamura et al., Nucl. Acids Res., 28:292 [2000]) или легко приобрести, такие нуклеиновые кислоты легко конструируют с учетом аминокислотной последовательности подлежащего экспрессии белка.

В некоторых вариантах осуществления рассматриваемая рекомбинантная нуклеиновая кислота находится (например, встроена) в геноме (т.е. ядерном геноме) клетки-хозяина, а в других вариантах осуществления она присутствует в векторе (например, фаговом, плазмидном, вирусном или ретровирусном векторе), который автономно реплицируется в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор для экспрессии белка в клетке-хозяине.

Выбор сигнальной последовательности, промотора и терминатора в большой степени зависит от используемой клетки-хозяина. Как отмечалось выше, в некоторых вариантах осуществления используется клетка-хозяин Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность celA. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность celA представляет собой сигнальную последовательность, кодируемую геном целлюлазы A S. lividans, CelA, как описано Kluepfel et al. (Kluepfel et al., Nature Biotechnol, 14:756-759 [1996]). В других вариантах осуществления, в которых используется клетка-хозяин Bacillus, сигнальная последовательность представляет собой любую аминокислотную последовательность, которая способна направлять слитый белок на секреторный каскад клетки-хозяина Bacillus. В некоторых вариантах осуществления сигнальные последовательности, которые применимы, включают сигнальные последовательности белков, которые секретируются из клеток Bacillus дикого типа. Такие сигнальные последовательности включают сигнальные последовательности, кодируемые генами α-амилазы, протеазы (например, aprE или субтилизина E) или β-лактамазы. Иллюстративные сигнальные последовательности включают, но не ограничиваются ими, сигнальные последовательности, кодируемые геном α-амилазы, геном субтилизина, геном β-лактамазы, геном нейтральной протеазы (например, nprT, nprS, nprM) или геном prsA из любого пригодного вида Bacillus, включая, но не ограничиваясь ими, B. stearothermophilus, B. licheniformis, B. licheniformis, B. subtilis и B. amyloliquefacien. В одном варианте осуществления сигнальная последовательность кодируется геном aprE B. subtilis (сморите, например, Olmos-Soto and Contreras-Flores, Appl. Microbiol. Biotechnol., 62:369-73 [2003]). Кроме того, сигнальные пептиды описаны Simonen and Palva (Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]) и известны в данной области.

Пригодные промоторы и терминаторы для применения в клетках-хозяевах Bacillus и Streptomyces известны и включают: промоторы и терминаторы генов apr (щелочная протеаза), npr (нейтральная протеаза), amy (α-амилаза) и β-лактамазы, а также гена левансукразы B. subtilis (sacB), гена альфа-амилазы B. licheniformis (amyL), гена амилазы B. stearothermophilus maltogenic (amyM), гена альфа-амилазы B. amyloliquefaciens (amyQ), гена пенициллиназы B. licheniformis (penP), генов B. subtilis xylA и xylB, а также промоторы и терминаторы, описанные в WO 93/10249, WO 98/07846 и WO 99/43835. Экспрессирующие кассеты для применения в клетках-хозяевах Streptomyces можно конструировать с использованием промоторов и терминаторов, известных в данной области (смотрите, например, Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories [1985]; Hopwood et al., In Booth and Higgins (Eds.) Symposium of the Society for General Microbiology, Regulation of Gene Expression, Cambridge University Press, pgs. 251-276; Fornwald et al., Proc. Natl. Acad. ScL, 84: 2130-2134 [1987], Pulido et al. Gene 56: 277-82 [1987]; Dehottay et al., Eur. J. Biochem., 166: 345-50 [1987]), Taguchi, Gene 84: 279-86 [1989], Schmitt-John et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36: 493-8 [1992], Motamedi, Gene 160: 25-31 [1995], и Binnie, Protein Expr. Purif., 11: 271-8 [1997]). В некоторых вариантах осуществления используется промотор A4 (смотрите, WO 06/054997, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки).

Векторные системы для экспрессии рекомбинантных белков в Streptomyces, Bacillus, Aspergillus, Trichoderma и других клетках-хозяевах хорошо известны в данной области. Предусматривается, что любая пригодная система может быть применима в настоящем изобретении.

III. Получение полинуклеотидов, кодирующих протеазы Streptomycetaceae (например, Streptomyces) по настоящему изобретению

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазу по настоящему изобретению, получают стандартными способами, известными в данной области, например, из клонированной ДНК (например, "библиотеки" ДНК), химическим синтезом, клонированием кДНК, ПЦР, клонированием геномной ДНК или ее фрагментов, или очисткой из требуемой клетки, такой как виды бактерий или грибов, как хорошо известно в данной области. Действительно, способы синтеза полинуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области (смотрите, например, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 [1981]), включая применение автоматизированных устройств для синтеза (смотрите, например, Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res., 12:6159-6168 [1984]). Последовательности ДНК также можно могут быть изготовлены на заказ и их можно заказывать в различных коммерческих источниках. Как более подробно описано в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот, образованные из геномной ДНК, в дополнение к кодирующим областям содержат регуляторные области.

В некоторых вариантах осуществления, вовлекающих молекулярное клонирование гена из геномной ДНК, получают фрагменты ДНК, некоторые из которых содержат по меньшей мере часть требуемого гена. В некоторых вариантах осуществления ДНК расщепляют в определенных участках с использованием различных ферментов рестрикции. В некоторых альтернативных вариантах осуществления для фрагментации ДНК используют ДНКазу в присутствии марганца, или ДНК расщепляют физически (например, облучением ультразвуком). Затем образованные линейные фрагменты ДНК разделяют в соответствии с размером и амплифицируют стандартными способами, включая, но не ограничиваясь ими, гель-электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле, ПЦР и колоночную хроматографию.

После получения фрагментов нуклеиновых кислот проводят идентификацию конкретного фрагмента ДНК, кодирующего протеазу, с использованием любого пригодного способа. Например, в некоторых вариантах осуществления протеолитический гидролизующий фермент, кодирующий ген 1AG3 или его специфическую РНК, или их фрагмент, такой как зонд или праймер, выделяют, метят, а затем используют в анализах с гибридизацией, хорошо известных специалистам в данной области, для детекции полученного гена (смотрите, например, Benton and Davis, Science 196:180 [1977]; и Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3961 [1975]). В некоторых вариантах осуществления фрагменты ДНК, обладающие существенным сходством последовательности с зондом, гибридизуются в условиях от средней до высокой строгости.

В некоторых вариантах осуществления проводят амплификацию с использованием ПЦР, как известно в данной области. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты в качестве праймеров для ПЦР используют по меньшей мере приблизительно 4 нуклеотида и не более чем приблизительно 60 нуклеотидов (т.е. фрагментов) (например, приблизительно от 12 до 30 нуклеотидов или приблизительно 25 нуклеотидов) в любых пригодных сочетаниях. Эти фрагменты также применимы в качестве зондов в способах гибридизации и детекции продукта.

В некоторых вариантах осуществления при выделении конструкций нуклеиновых кислот по изобретению из кДНК или геномной библиотеки используют ПЦР с использованием вырожденных олигонуклеотидных праймеров, полученных на основе аминокислотной последовательности белка, имеющего аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:3 и/или 8. Праймеры могут представлять собой сегмент любой длины, например, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 8, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, нуклеотидов в длину. В иллюстративных зондах в настоящей заявке используются праймеры, содержащие последовательность, соответствующую полинуклеотидной последовательности для TTGWHCGT (SEQ ID NO:20) и GDSGG (SEQ ID NO:21), как более подробно описано в разделе "Примеры".

Ввиду указанного выше, будет понятно, что полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе и основанные на полинуклеотидных последовательностях, представленных в настоящем документе, пригодны для получения идентичных или гомологичных фрагментов полинуклеотидов из других видов, и, в частности, из бактерий, которые кодируют ферменты, имеющие активность сериновой протеазы, проявляемую протеазой 1AG3.

IV. Экспрессия и выделение сериновых протеаз по настоящему изобретению

В данном случае применимы любые пригодные способы экспрессии и выделения сериновых протеаз по настоящему изобретению. Действительно, специалистам в данной области известно множество способов, пригодных для клонирования полипептида, происходящего из Streptomyces, имеющего протеолитическую активность, а также дополнительного фермента (например, второго пептида, имеющего протеолитическую активность, такого как протеаза, целлюлаза, маннаназа или амилаза и т.д.). В данной области известно множество способов для введения по меньшей мере одной (например, множества) копии полинуклеотида(ов), кодирующего фермент(ы) по настоящему изобретению, вместе с любыми дополнительными требуемыми последовательностями, в гены или геном клеток-хозяев.

Как правило, для получения производного протеазы 1AG3 Streptomyces или ее гомолога применимы стандартные способы клонирования генов и введения экзогенных участков, кодирующих протеазы (включая множество копий экзогенных кодирующих участков) в указанные гены. Действительно, в настоящем описании, включая "Примеры", представлены такие указания. Однако также пригодны дополнительные способы, известные в данной области (смотрите, например, Sambrook et al., выше (1989); Ausubel et al., выше [1995]; и Harwood and Cutting, (eds.) Molecular Biological Methods for Bacillus", John Wiley and Sons, [1990]; и WO 96/34946).

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению экспрессируют посредством функционального их связывания с последовательностями контроля экспрессии в соответствующем экспрессирующем векторе и они используются этим экспрессирующим вектором для трансформации соответствующих хозяев в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, продуцируемые при экспрессии последовательностей ДНК по этому изобретению, выделяют из сбраживаемых клеточных культур и очищают различными способами в соответствии с хорошо известными в данной области способами. Специалисты в данной области способны выбрать наиболее пригодные способы выделения и очистки.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к конструкциям, векторам, содержащим полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами, протеазам, экспрессируемым такими клетками-хозяевами, способам экспрессии и системам для получения ферментов сериновых протеаз, происходящих из микроорганизмов, в частности, членов Streptomycetaceae, включая, но не ограничиваясь ими, виды Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид(ы), кодирующие сериновую протеазу(ы), используют для получения рекомбинантных клеток-хозяев, пригодных для экспрессии сериновой протеазы(протеаз). В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие хозяева способны продуцировать протеазу(ы) в рентабельных количествах.

V. Рекомбинантные векторы

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к векторам, содержащим указанные выше полинуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления векторы (т.е. конструкции) по изобретению, кодирующие протеазу, имеют геномное происхождение (например, они получены с использованием геномной библиотеки и скрининга последовательностей ДНК, кодирующих все или часть из протеаз, гибридизацией с использованием синтетических олигонуклеотидных зондов в соответствии со стандартными способами). В некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК, кодирующую протеазу, получают выделением хромосомной ДНК из штамма 1AG3 Streptomyces и амплификацией последовательности способами ПЦР, как описано в разделе "Примеры" настоящего документа.

В альтернативных вариантах осуществления конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению, кодирующую протеазу, получают синтетически общепринятыми стандартными способами (смотрите, например, Beaucage and Caruthers, Tetra. Lett. 22:1859-1869 [1981]; и Matthes et al., EMBO J., 3: 801-805 [1984]). Согласно способу с фосфорамидитом, олигонуклеотиды синтезируют (например, в автоматизированном устройстве для синтеза ДНК) очищают, подвергают отжигу, лигируют и клонируют в пригодные векторы.

В дополнительных вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты имеет смешанное синтетическое и геномное происхождение. В некоторых вариантах осуществления конструкцию получают лигированием фрагментов синтетической или геномной ДНК (в зависимости от ситуации), где фрагменты соответствуют различным частям целой конструкции нуклеиновой кислоты, в соответствии со стандартными способами.

В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к векторам, содержащим по меньшей мере одну конструкцию ДНК по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам. Предусматривается, что в настоящем изобретении может быть применим любой пригодный вектор, включая автономно реплицирующийся вектор, а также векторы, которые встраиваются (либо временно, либо стабильно) в геном клетки-хозяина). Действительно, специалистам в данной области известно широкое множество векторов и экспрессирующих кассет, пригодных для клонирования, трансформации и экспрессии в клетках грибов (плесени и дрожжей), бактерий, насекомых и растений. Как правило, вектор или кассета содержит последовательности, направляющие транскрипцию и трансляцию нуклеиновой кислоты, селективного маркера, и последовательностей, позволяющих автономную репликацию или встраивание в хромосому. В некоторых вариантах осуществления пригодные векторы содержат участок с 5'-стороны от гена, который содержит последовательности контроля инициации транскрипции, и участок с 3'-стороны фрагмента ДНК, который контролирует терминацию транскрипции. Эти участки контроля происходят из генов, гомологичных или гетерологичных хозяину, при условии, что выбранный участок контроля способен функционировать в клетке-хозяине.

В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой экспрессирующий вектор, в котором последовательность ДНК, кодирующая протеазу по изобретению, функционально связана с дополнительными сегментами, требуемыми для транскрипции ДНК. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор образован из плазмидной или вирусной ДНК, а в некоторых альтернативных вариантах осуществления он содержит элементы обеих из них. Иллюстративные векторы включают, но не ограничиваются ими, pSEA4C, pSEGCT, pSEACT и/или pSEA4CT, а также все векторы, описанные в разделе "Примеры" настоящего документа. Конструирование таких векторов описано в настоящем документе, и эти способы хорошо известны в данной области (смотрите, например, патент США № 6287839; и WO 02/50245). В некоторых вариантах осуществления для конструирования вектора, содержащего полинуклеотиды, описанные в настоящем документе вектор применим pSEA4C, описанный в настоящем документе (например, pSEA4CT-1AG3). Действительно, подразумевается, что в настоящем изобретении могут быть применимы все векторы, описанные в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления дополнительные сегменты, требуемые для транскрипции, включают регуляторные сегменты (например, промоторы, секреторные сегменты, ингибиторы, общие регуляторы, и т.д.), как известно в данной области. Один пример включает любую последовательность ДНК, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине и образована из генов, кодирующих белки, либо гомологичные, либо гетерологичные клетке-хозяину. Конкретно, примеры пригодных промоторов для применения в бактериальных клетках-хозяевах включают, но не ограничиваются ими, промотор гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus, гена амилазы Bacillus amyloliquefaciens (BAN), гена щелочной протеазы Bacillus subtilis, гена щелочной протеазы Bacillus clausii, гена ксилозидазы Bacillus pumilus, cryIIIA Bacillus thuringiensis и гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis. Дополнительные промоторы включают промотор A4, как описано в настоящем документе. Другие промоторы, которые применимы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, промоторы P_R или P_L фага лямбда, а также промоторы lac, trp или tac E. coli.

В некоторых вариантах осуществления промотор происходит из гена, кодирующего протеазу или ее фрагмент, имеющего по существу ту же промоторную активность, что и указанная последовательность. Кроме того, изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с промоторными последовательностям в условиях промежуточной, высокой и/или максимальной строгости, или которые имеют по меньшей мере приблизительно 90% гомологию и приблизительно 95% гомологию с таким промотором, но которые имеют по существу такую же промоторную активность. В некоторых вариантах осуществления этот промотор используют для запуска экспрессии последовательности ДНК протеазы и/или гетерологичной последовательности ДНК (например, другого фермента в дополнение к протеазе по настоящему изобретению). В дополнительных вариантах осуществления вектор также содержит по меньшей мере один селективный маркер.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные векторы по изобретению дополнительно содержит последовательность ДНК, обеспечивающую репликацию вектора в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающих бактериальные клетки-хозяева, эти последовательности содержит все последовательности, требуемые для обеспечения репликации плазмиды (например, последовательности ori и/или rep).

В некоторых конкретных вариантах осуществления также в вектор включены сигнальные последовательности (например, лидерная последовательность или препоследовательность), для направления полипептида по настоящему изобретению на секреторный каскад клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления секреторная сигнальная последовательность связана с последовательностью ДНК, кодирующей предшественника протеазы, в правильной рамке считывания. В зависимости от того, подлежит ли протеаза внутриклеточной экспрессии или секреции, конструируют полинуклеотидную последовательность или экспрессирующий вектор по изобретению с природной полипептидной сигнальной последовательностью или сигнальной последовательностью, которая функционирует в бактериях (например, Bacillus sp.), грибах (например, Trichoderma), других прокариотах или эукариотах, или без нее. В некоторых вариантах осуществления экспрессии достигают путем либо удаления, либо частичного удаления сигнальной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления, вовлекающих секрецию из бактериальных клеток, сигнальный пептид представляет собой встречающийся в природе сигнальный пептид, или его функциональную часть, а в других вариантах осуществления он представляет собой синтетический пептид. Пригодные сигнальные пептиды включают, но не ограничиваются ими, последовательности, происходящие из альфа-амилазы Bacillus licheniformis, щелочной протеазы Bacillus clausii и амилазы Bacillus amyloliquefaciens. Одна сигнальная последовательность представляет собой сигнальный пептид, происходящий из штамма 1AG3 Streptomyces, как описано в настоящем документе. Таким образом, в некоторых конкретных вариантах осуществления сигнальный пептид содержит сигнальный пептид из протеазы, описанной в настоящем документе. Этот сигнальный пептид применим для облегчения секреции протеазы 1AG3 и/или гетерологичной последовательности ДНК (например, второй протеазы, такой как другая протеаза дикого типа, вариант протеазы BPN', вариант протеазы GG36, липаза, целлюлаза, маннаназы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления эти вторые ферменты кодируются последовательностью ДНК и/или аминокислотными последовательностями, известными в данной области (смотрите, например, патенты США №№ 6465235, 6287839, 5965384 и 5795764; а также WO 98/22500, WO 92/05249, EP 0305216B1 и WO 94/25576). Более того, предусматривается, что в некоторых вариантах осуществления последовательность сигнального пептида также функционально связана с эндогенной последовательностью для активации и секреции такой эндогенной кодируемой протеазы.

Способы, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих протеазу по настоящему изобретению, промотор и/или секреторную сигнальную последовательность, соответственно, и для встраивания их в пригодные векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области. Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления конструкцию нуклеиновой кислоты получают с использованием ПЦР со специфическими праймерами.

VI. Клетки-хозяева

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным векторами, описанными выше. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий протеазу(ы) по настоящему изобретению, который вводят в клетку-хозяина, является гомологичным, а в других вариантах осуществления полинуклеотид является гетерологичным хозяину. В некоторых вариантах осуществления, в которых полинуклеотид является гомологичным клетке-хозяину (например, вводят дополнительные копии нативной протеазы, продуцируемой клеткой-хозяином), он функционально связан с другой гомологичной или гетерологичной промоторной последовательностью. В альтернативных вариантах осуществления в настоящем изобретении применима другая секреторная сигнальная последовательность, и/или последовательность терминатора. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность ДНК полипептида содержит множество копий последовательности гомологичного полипептида, последовательности гетеролоичного полипептида из другого организма, или последовательности(ей) синтетического полипептида. Действительно, не подразумевается, чтобы настоящее изобретение было ограничено какими-либо конкретными клетками-хозяевами и/или векторами.

Действительно, клетка-хозяин, в которую вводят конструкцию ДНК по настоящему изобретению, включает любую клетку, которая способна продуцировать щелочную протеазу по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, клетки бактерий, грибов и высших эукариот.

Примеры бактериальных клеток-хозяев, которые применимы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, грамположительные бактерии, такие как Bacillus, Streptomyces и Thermobifida, например, штаммы B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. clausii, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium, B. thuringiensis, S. griseus, S. lividans, S. coelicolor, S. avermitilis и T. fusca; а также грамотрицательные бактерии, такие как члены Enterobacteriaceae (например, Escherichia coli). В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой B. subtilis, B. clausii и/или B. licheniformis. В дополнительных вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой штаммы S. lividans (например, TK23 и/или TK21). Для настоящего изобретения применим любой пригодный способ трансформации бактерий, включая, но не ограничиваясь ими, трансформацию протопластов, применение компетентных клеток и т.д., как известно в данной области. В некоторых вариантах осуществления для настоящего изобретения применим способ, представленный в патенте США № 5264366 (включенном в настоящий документ в качестве ссылки). В случае S. lividans, одним из способов трансформации и экспрессии белков является способ, описанный Fernandez-Abalos et al. (смотрите, Fernandez-Abalos et al., Microbiol., 149:1623-1632 [2003]; смотрите также Hopwood, et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: Laboratory Manual, Innis [eds.], [1985], оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылки). Безусловно, способы, описанные в разделе "Примеры" настоящего документа, применимы в настоящем изобретении.

Примеры клеток-хозяев, являющихся грибами, которые применимы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, виды Trichoderma и виды Aspergillus. В некоторых конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева представляют собой Trichoderma reesei и/или Aspergillus niger. В некоторых вариантах осуществления трансформацию и экспрессию в Aspergillus проводят, как описано в патенте США 5364770, включенном в настоящий документ в качестве ссылки. Безусловно, способы, описанные в разделе "Примеры" настоящего документа, применимы для настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления требуются конкретные промоторные и сигнальные последовательности для обеспечения эффективной трансформации и экспрессии протеазы(протеаз) по настоящему изобретению. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, вовлекающих применение клеток-хозяев Bacillus, используют промотор aprE в сочетании с известной происходящей из Bacillus сигнальной последовательностью и другими регуляторными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающих экспрессию в Aspergillus, используют промотор glaA. В некоторых вариантах осуществления, вовлекающих клетки-хозяева Streptomyces, используют промотор глюкозоизомеразы (GI) Actinoplanes missouriensis, а в других вариантах осуществления используют промотор A4.

В некоторых вариантах осуществления, вовлекающих экспрессию в бактериях, таких как E. coli, протеаза удерживается в цитоплазме, как правило, в качестве нерастворимых гранул (т.е. телец включения). Однако в других вариантах осуществления протеаза направляется в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В первом случае, клетки подвергают лизису и гранулы выделяют и денатурируют, после чего протеазу подвергают повторному сворачиванию путем разбавления денатурирующего средства. В последнем случае, протеазу выделяют из периплазматического пространства путем разрушения клеток (например, облучением ультразвуком или осмотическим шоком), для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения протеазы.

В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки-хозяева по настоящему изобретению культивируют в пригодной питательной среде в условиях, позволяющих экспрессию протеазы по настоящему изобретению, после чего полученную протеазу выделяют из культуры. Среда, используемая для культивирования клеток, включает любую общепринятую среду, пригодную для выращивания клеток-хозяев, такую как минимальные или комплексные среды, содержащие соответствующие добавки. Пригодные среды доступны от коммерческих поставщиков и/или их получают в соответствии с опубликованными рецептурами, хорошо известными специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления протеазу, продуцируемую клетками, выделают из культуральной среды общепринятыми способами, включая, но не ограничиваясь ими, отделение клеток-хозяев от среды центрифугированием или фильтрацией, осаждением белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли (например, сульфата аммония), хроматографической очисткой (например, ионообменной, гель-фильтрационной, аффинной и т.д.). Таким образом, может быть применим любой способ, пригодный для выделения протеазы(протеаз) по настоящему изобретению. Действительно, не подразумевается, чтобы настоящее изобретение было ограничено каким-либо конкретным способом очистки.

VII. Применение ферментов-сериновых протеаз

Как более подробно описано в настоящем документе, протеазы по настоящему изобретению имеют важные свойства, которые делают их пригодными для некоторых применений. Например, протеазы по настоящему изобретению имеют повышенную термическую стабильность, повышенную устойчивость к окислению, и повышенную устойчивость к хелатирующим агентам, по сравнению с некоторыми используемыми в настоящее время протеазами. Таким образом, протеазы применимы в моющих композициях. Действительно, в некоторых условиях мытья, протеазы по настоящему изобретению проявляют сравнительную или улучшенную эффективность очистки по сравнению с используемыми в настоящее время субтилизиновыми протеазами. Таким образом, предусматривается, что моющие и/или ферментные композиции по настоящему изобретению могут быть предоставлены в различных моющих композициях. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению применяют таким же образом, как и субтилизиновые протеазы (т.е. протеазы, используемые в настоящее время). Таким образом, протеазы по настоящему изобретению применимы в различных моющих композициях, а также в способах применения для кормов для животных, при обработке кожи (например, мягчении), гидролизе белков, и в способах применения для тканей. Указанные протеазы также применимы в способах применения для личной гигиены.

Таким образом, протеазы по настоящему изобретению применимы в ряде промышленных применений, в частности, при отраслях промышленности, связанных с очисткой, дезинфекцией, кормами для животных и текстилем/кожей. В некоторых вариантах осуществления протеазу(ы) по настоящему изобретению комбинируют с детергентами, моющими компонентами, отбеливателями и другими общепринятыми ингредиентами для получения множества новых моющих композиций, пригодных для стирки, и других моющих изделий, например, таких как детергенты для стирки (как порошковые, так и жидкие), средства для предварительного замачивания, все отбеливатели для тканей, автоматические детергенты для мытья посуды (как жидкие, так и порошковые), бытовые моющие средства, в частности, мыло и жидкое мыло, и очистителей/разрыхлителей для водосточных труб. Кроме того, протеаза применима для мытья контактных линз, а также других предметов, путем контактирования таких материалов с водным раствором моющей композиции. В дополнение к этому, встречающиеся в природе протеазы можно использовать, например, при гидролизе пептидов, переработке отходов, в способах, применяемых для текстильных изделей, очистке медицинского оборудования, удаления биопленки и в качестве ферментов для слияния-расщепления при получении белков, и т.д. Композиция этих продуктов не является критической для настоящего изобретения, при условии, что протеаза(ы) сохраняет ее функцию в используемых условиях. В некоторых вариантах осуществления композиции легко получать комбинированием эффективного для очистки количества протеазы или композиции фермента, содержащей препарат протеазного фермента, с общепринятыми компонентами таких композиций в их принятых в данной области количествах.

Протеазы по настоящему изобретению, в частности, применимы в связанной с очисткой промышленности, включая, но не ограничиваясь ими, детергенты для стирки и мытья посуды. Эти применения помещают ферменты в условия различных окружающих стрессов. Протеазы по настоящему изобретению обеспечивают преимущества относительно множества используемых в настоящее время ферментов, вследствие их стабильности в различных условиях.

Действительно, существует множество условий промывания, включая варьирующие детергентные составы, объемы воды для мытья, температуру воды для мытья и длительность мытья, которым подвергаются протеазы, вовлеченные в мытье. Кроме того, детергентные составы, используемые в различных географических областях, имеют различные концентрации их соответствующих компонентов, присутствующих в воде для мытья. Например, европейский детергент, как правило, имеет приблизительно 4500-5000 м.д. детергентных компонентов в промывочной воде, японский детергент, как правило, имеет приблизительно 667 м.д. детергентных компонентов в воде для мытья. В Северной Америке, в частности, в США, детергенты, как правило, имеют приблизительно 975 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Система с низкой концентрацией детергента включает детергенты, где в воде для мытья присутствует менее чем приблизительно 800 м.д. детергентных компонентов. Японские детергенты, как правило, считают системами с низкой концентрацией детергента, поскольку они обычно имеют приблизительно 667 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Системы со средней концентрацией детергента включают детергенты, где в воде для мытья присутствует между приблизительно 800 м.д. и 2000 м.д. детергентных компонентов. Североамериканские детергенты, как правило, считают системами со средней концентрацией детергента, поскольку они обычно имеют приблизительно 975 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья. Бразильские детергенты, как правило, имеют приблизительно 1500 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Системы с высокой концентрацией детергента включают детергенты, где в воде для мытья присутствует более чем приблизительно 2000 м.д. детергентных компонентов. Европейские детергенты, как правило, считают системами с низкой концентрацией детергента, поскольку они обычно имеют приблизительно 4500-5000 м.д. детергентных компонентов в воде для мытья.

Латиноамериканские детергенты, как правило, представляют собой высоко пенящиеся детергенты с фосфатным моющим компонентом, и диапазон детергентов, используемых в Латинской Америке, может соответствовать как средним, так и высоким концентрациям детергентов, поскольку он варьирует от 1500 м.д. до 6000 м.д. детергентных композиций в воде для мытья. Как указано выше, в Бразилии, как правило, в воде для мытья присутствует приблизительно 1500 м.д. детергетных компонентов. Однако в других географических областях, где применяют высоко пенящиеся детергенты с фосфатным моющим компонентом, не ограниченные странами Латинской Америки, системы с высокой концентрацией детергента имеют вплоть до приблизительно 6000 м.д. детергентных компонентов, присутствующих в воде для мытья.

Ввиду указанного выше, очевидно, что концентрации детергентных композиций в типичных растворах для мытья по всему миру варьируют от менее чем приблизительно 800 м.д. детергентной композиции ("географические области низкой концентрации детергента"), например, приблизительно 667 м.д. в Японии, до между приблизительно 800 м.д. и приблизительно 2000 м.д. ("географические области средней концентрации детергента"), например, приблизительно 975 м.д. в США и приблизительно 1500 м.д. в Бразилии, и до более чем приблизительно 2000 м.д. ("географические области высокой концентрации детергента"), например, от приблизительно 4500 м.д. до приблизительно 5000 м.д. в Европе и приблизительно 6000 м.д. в географических областях, где применяют высоко пенящиеся фосфатные моющие компоненты.

Концентрации в типичных растворах для мытья определяют эмпирически. Например, в США типичная моечная машина содержит объем раствора для мытья, составляющий приблизительно 64,4 л. Таким образом, для получения концентрации приблизительно 975 м.д. детергента в растворе для мытья, необходимо добавить приблизительно 62,79 г детергентной композиции в 64,4 л раствора для мытья. Это количество представляет собой типичное количество, отмеряемое в воду для мытья с использованием мерного цилиндра, предоставляемого с детергентом.

В качестве следующего примера, в различных географических областях используют различные температуры мытья. Температура воды для мытья в Японии, как правило, является меньшей, чем температура, используемая в Европе. Например, температура воды для мытья в Северной Америке и Японии может составлять между 10 и 30ºC (например, приблизительно 20ºC), а температура воды для мытья в Европе, как правило, составляет между 30 и 60ºC (например, приблизительно 40ºС).

В качестве дополнительного примера, в различных географических областях, как правило, жесткость воды различается. Жесткость воды, как правило, описывают в значениях количества зерен смешанных Ca²⁺/Mg²⁺ на галлон. Жесткость является показателем количества кальция (Ca²⁺) и магния (Mg²⁺) в воде. Большая часть воды в США является жесткой, однако степень жесткости варьирует. Вода от умеренно жесткой (60-120 м.д.) до жесткой (121-181 м.д.) имеет от 60 до 181 миллионных долей (миллионные доли, конвертированные в зерна на галлон, принятые в США, представляют собой м.д. #, деленные на 17,1, что равно количеству зерен на галлон) обеспечивающих жесткость минералов.

Жесткость европейской воды, как правило, превышает 10,5 (например, 10,5-20,0) зерен смешанных Ca²⁺/Mg²⁺ на галлон (например, приблизительно 15 зерен смешанных Ca²⁺/Mg²⁺ на галлон). Жесткость североамериканской воды, как правило, превышает жесткость японской воды, но является меньшей, чем жесткость европейской воды. Например, жесткость североамериканской воды может составлять между 3 и 10 зернами, 3-8 зернами или приблизительно 6 зерен. Жесткость японской воды, как правило, ниже, чем жесткость североамериканской воды, обычно она составляет менее 4, например, 3 зерна на галлон смешанных Ca²⁺/Mg²⁺.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к протеазам, которые демонстрируют неожиданную эффективность очистки по меньшей мере в одном наборе условий мытья (например, температура воды, жесткость воды и/или концентрация детергента). В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению сравнимы по эффективности очистки с субтилизиновыми протеазами. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению проявляют улучшенную эффективность очистки по сравнению с субтилизиновыми протеазами. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, протеазы, представленные в настоящем документе, проявляют повышенную устойчивость к окислению, повышенную термическую стабильность и/или повышенную устойчивость к хелатирующим агентам.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к протеазе 1AG3, а также к гомологам и вариантам протеазы. Эти протеазы применимы в любых применениях, в которых является желательной очистка текстильных изделий или тканей от пятен на основе белка.

В некоторых вариантах осуществления моющие композиции по настоящему изобретению изготовлены в качестве детергентных композиций для ручной и автоматической стирки, включая композиции добавок для стирки, и композиций, пригодных для применения в предварительной обработке тканей с пятнами, композиций смягчителей тканей для ополаскивания, и композиций для применения в очистке обычных бытовых твердых поверхностей, а также при мытье посуды. Специалистам в данной области известны различные составы, которые можно использовать в качестве моющих композиций. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению имеют сравнительную или улучшенную эффективность в детергентных композициях (т.е. по сравнению с другими протеазами). В некоторых вариантах осуществления эффективность очистки оценивают путем сравнения протеаз по настоящему изобретению с субтилизиновыми протеазами в различных анализах очистки, в которых используются чувствительные к ферментам пятна, такие как пятна от яиц, травы, крови, молока и т.д., в стандартных способах. Действительно, специалистам в данной области известны спектрофотометрические и другие аналитические способы, используемые для оценки эффективности детергентов в стандартных условиях цикла мытья.

Анализы, которые применимы для настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, анализы, описанные в WO 99/34011, и патенте США № 6605458 (смотрите, например, пример 3). В патенте США № 6605458, пример 3, используется доза детергента 3,0 г/л при pH 10,5, время мытья 15 минут, при 15ºС, жесткость воды 6ºdH, концентрация фермента 10 нМ в 150-мл стеклянных стаканах с мешалкой, 5 кусков ткани (phi 2,5 см) в 50 мл, тестируемый материал EMPA 117 от Center for Test Materials Holland. Измерение отражательной способности "R" на тестируемом материале проводили при 460 нм с использованием фотометра Macbeth Color Eye 7000. Дополнительные способы представлены в разделе "Примеры" настоящего документа. Таким образом, эти способы также применимы в настоящем изобретении.

Добавление протеаз по изобретению в общепринятые моющие композиции не приводит к каким-либо конкретным ограничениям. Иными словами, любая температура и pH, пригодные для детергента, также пригодны для композиций по настоящему изобретению, при условии что pH находится в диапазоне, указанном в настоящем документе, и температура является меньшей, чем описанная температура денатурации протеазы. Кроме того, протеазы по настоящему изобретению применимы в моющих композициях, которые не включают детергентов, также либо отдельно, либо в сочетании с моющими компонентами и стабилизаторами.

При использовании в моющих композициях или детергентах, кроме того, учитывают устойчивость к окислению. Таким образом, в некоторых применениях, стабильность усиливается, снижается или является сравнимой с субтилизиновыми протеазами, в зависимости от потребности при различных применениях. В некоторых вариантах осуществления желательной является повышенная устойчивость к окислению. Некоторые из протеаз по настоящему изобретению, в частности, применимы в таких способах применения.

При использовании в моющих композициях или детергентах, кроме того, учитывается термическая стабильность. Таким образом, в некоторых способах применения, стабильность повышается, снижается или является сравнимой с субтилизиновыми протеазами, в зависимости от того, что является желательным для различных применений. В некоторых вариантах осуществления желательной является повышенная термостабильность. Некоторые из протеаз по настоящему изобретению, в частности, применимы в таких способах применения.

При применении в моющих композициях или детергентах, кроме того, учитывают устойчивость к хелатирующим агентам. Таким образом, в некоторых способах применения стабильность повышается, снижается или является сравнимой с субтилизиновыми протеазами, в зависимости от того, что является желательным для различных применений. В некоторых вариантах осуществления желательной является повышенная устойчивость к хелатирующим агентам. Некоторые из протеаз по настоящему изобретению применимы, в частности, в таких способах применения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, предусматриваются встречающиеся в природе протеазы, которые обладают модифицированной ферментативной активностью при различных значениях pH по сравнению с субтилизиновыми протеазами. Профиль pH-активности представляет собой график pH против активности фермента, сконструированного, как описано в разделе "Примеры", и/или способами, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления желательным является получение встречающихся в природе протеаз с более широкими профилями (т.е. протеаз, имеющих более высокую активность при ряде pH, чем сравнительная субтилизиновая протеаза). В других вариантах осуществления ферменты не имеют значимо повышенной активности при любых pH, также как и встречающиеся в природе гомологи с более резкими профилями (т.е. гомологи, имеющие повышенную активность по сравнению с субтилизиновыми протеазами при данном pH, и меньшую активность в других случаях). Таким образом, в различных вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению имеют отличающиеся оптимумы и/или диапазоны pH. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным pH или диапазоном pH.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, моющие композиции содержат протеазы по настоящему изобретению на уровне от 0,00001% до 10% 1AG3 и/или другой протеазы по настоящему изобретению по массе композиции и остальную часть (например, от приблизительно 99,999% до приблизительно 90,0%), содержащую вспомогательные моющие материалы, по массе композиции. В других аспектах настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению содержат 1AG3 и/или другие протеазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% 69B4 или другой протеазы по настоящему изобретению по массе композиции и остальную часть моющей композиции (например, от приблизительно 99,9999% до приблизительно 90,0%, от приблизительно 99,999% до приблизительно 98%, от приблизительно 99,995% до приблизительно 99,5% по массе), содержащую вспомогательные моющие материалы.

В некоторых вариантах осуществления моющие композиции, в дополнение к препарату протеаз по изобретению, содержат один или несколько дополнительных ферментов или производных ферментов, которые обеспечивают эффективность очистки и/или пользу для ухода за тканью. Такие ферменты включают, но не ограничиваются ими, другие протеазы, липазы, кутиназы, амилазы, целлюлазы, пероксидазы, оксидазы (например, лакказы) и/или маннаназы.

В композициях по настоящему изобретению применима любая другая протеаза, пригодная для применения в щелочных растворах. Пригодные протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. В конкретных вариантах осуществления используют микробные протеазы. В некоторые варианты осуществления включаются химически или генетически модифицированные мутанты. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой сериновую протеазу, щелочную микробную протеазу или трипсин-подобную протеазу. Примеры щелочных протеаз включают субтилизины, особенно субтилизины, происходящие из Bacillus sp. (например, B. subtilis, B. lentus и B. amyloliquefaciens), а также субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, GG36, субтилизин 147 и субтилизин 168. Дополнительные примеры включают мутантные протеазы, описанные в патентах США №№ RE 34606, 5955340, 5700676, 6312936 и 6482628, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок. Дополнительные примеры протеаз включают, но не ограничиваются ими, трипсин (например, из свиней или крупного рогатого скота), и протеазу Fusarium, описанную в WO 89/06270. Коммерчески доступные протеазные ферменты включают ферменты, продаваемые под торговыми названиями MAXATASE®, MAXACAL^TM, MAXAPEM^TM, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT® и PURAFECT® OXP (Genencor), ферменты, продаваемые под торговыми названиями ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM^TM, RELASE® и ESPERASE® (Novozymes); и ферменты, продаваемые под торговым названием BLAP^TM (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany. Различные протеазы описаны в WO95/23221, WO 92/21760 и патентах США №№ 5801039, 5340735, 5500364, 5855625. Дополнительный вариант BPN' ("BPN'-var 1" и "BPN-вариант 1"; как указано в настоящем документе) описан в US RE 34606. Дополнительный GG36-вариант ("GG36-var.1" и "GG36-вариант 1"; как указано в настоящем документе) описан в патентах США №№ 5955340 и 5700676. Дополнительный GG36-вариант описан в патентах США №№ 6312936 и 6482628. В одном аспекте настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению содержат дополнительные протеазные ферменты на уровне от 0,00001% до 10% дополнительной протеазы по массе композиции и от 99,999% до 90,0% вспомогательных моющих материалов по массе композиции. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению также содержат протеазы на уровне от 0,0001% до 10%, от 0,001% до 5%, от 0,001% до 2%, от 0,005% до 0,5% протеазы 69B4 (или ее гомологов или вариантов) по массе композиции и остальную часть моющей композиции (например, от приблизительно 99,9999% до приблизительно 90,0%, от приблизительно 99,999% до приблизительно 98%, от приблизительно 99,995% до приблизительно 99,5% по массе), содержащую вспомогательные моющие материалы.

Кроме того, в настоящем изобретении применима любая липаза, пригодная для применения в щелочных растворах. Пригодные липазы включают, но не ограничиваются ими, липазы бактерий или грибов. Настоящее изобретение охватывает химически или генетически модифицированные мутанты. Примеры пригодных липаз включают липазу Humicola lanuginosa (смотрите, например, EP 258068, и EP 305216), липазу Rhizomucor miehei (смотрите, например, EP 238023), липазу Candida, такую как липаза C. antarctica (например, липаза A или B C. antarctica; сморите, например, EP 214761), липазу Pseudomonas, такую как липаза P. alcaligenes и P. pseudoalcaligenes (смотрите, например, EP 218272), липазу P. cepacia (смотрите, например, EP 331376), липазу P. stutzeri (смотрите, например, GB 1372034), липазу P. fluorescens, липазу Bacillus (например, липазу B. subtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); липазу B. stearothermophilus [смотрите, например, JP 64/744992]; и липазу B. pumilus [смотрите, например, WO 91/16422]).

Более того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применим ряд клонированных липаз, включая, но не ограничиваясь ими, липазу Penicillium camembertii (смотрите, Yamaguchi et al., Gene 103: 61-67 [1991]), липазу Geotricum candidum (смотрите, Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989]), и различные липазы Rhizopus, такие как липаза R. delemar (смотрите, Hass et al., Gene 109:117-113 [1991]), липаза R. niveus (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) и липаза R. oryzae.

Другие типы липолитических ферментов, такие как кутиназы, также применимы в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включая, но не ограничиваясь ими, кутиназу из Pseudomonas mendocina (смотрите, WO 88/09367), или кутиназу из Fusarium solani pisi (смотрите, WO 90/09446).

Дополнительные пригодные липазы включают коммерчески доступные липазы, такие как M1 LIPASE^TM, LUMA FAST^TM и LIPOMAX^TM (Genencor); LIPOLASE® и LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); и LIPASE P^TM "Amano" (Amano Pharmaceuticals Co. Ltd., Japan).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению, кроме того, содержат липазы на уровне от 0,00001% до 10% дополнительной липазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных моющих материалов по массе композиции. В других аспектах настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению также содержат липазы на уровне от 0,0001% до 10%, от 0,001% до 5%, от 0,001% до 2%, от 0,005% до 0,5% липазы по массе композиции.

Любая амилаза (альфа и/или бета), пригодная для применения в щелочных растворах, также применима в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения. Пригодные амилазы включают, но не ограничиваются ими, амилазы из бактерий или грибов. В некоторые варианты осуществления включаются химически или генетически модифицированные мутанты. Амилазы, которые применимы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, α-амилазы, получаемые из B. licheniformis (смотрите, например, GB 1296839). Коммерчески доступные амилазы, которые применимы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, BAN^TM, STAINZYME® и NATALASE® (Novozymes) и RAPIDASE® и MAXAMYL® P (Genencor International).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат амилазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной амилазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных моющих материалов по массе композиции. В других аспектах настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению также содержат амилазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% амилазы по массе композиции.

В некоторых вариантах осуществления применима любая целлюлаза, пригодная для применения в щелочных растворах. Пригодные целлюлазы включают, но не ограничиваются ими, целлюлазы из бактерий или грибов. В некоторых вариантах осуществления включаются химически или генетически модифицированные мутанты. Пригодные целлюлазы включают, но не ограничиваются ими, целлюлазы Humicola insolens (смотрите, например, патент США № 4435307). Особенно пригодными целлюлазами являются целлюлазы, имеющие преимущества, связанные с обеспечением сохранения цвета (смотрите, например, EP 0495257).

Коммерчески доступные целлюлазы, которые применимы в настоящее время, включают, но не ограничиваются ими, CELLUZYME® (Novozymes), и KAC-500(B)^TM (Kao Corporation). В некоторых вариантах осуществления целлюлазы включают в качестве частей или фрагментов зрелых целлюлаз или вариантов целлюлаз, где удалена часть с N-конца (смотрите, например, патент США № 5874276).

В некоторых вариантах осуществления моющие композиции по настоящему изобретению, кроме того, могут содержать целлюлазы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной целлюлазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных моющих материалов по массе композиции. В других аспектах настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению также содержат целлюлазы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% целлюлазы по массе композиции.

В настоящем документе применимы любые маннаназы, пригодные для применения в детергентных композициях и/или щелочных растворах. Пригодные маннаназы включают, но не ограничиваются ими, маннаназы из бактерий или грибов. В некоторых вариантах осуществления включаются химически или генетически модифицированные мутанты. Известны различные маннаназы, которые применимы в настоящем изобретении (смотрите, например, патенты США №№ 6566114, 6602842 и 6440991, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок).

В некоторых вариантах осуществления моющие композиции по настоящему изобретению, кроме того, могут содержать маннаназы на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной маннаназы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных моющих материалов по массе композиции. В других аспектах настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению также содержат маннаназы на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% маннаназы по массе композиции.

В некоторых вариантах осуществления используют пероксидазы в сочетании с пероксидом водорода или его источником (например, перкарбонатом, перборатом или персульфатом). В альтернативных вариантах осуществления используют оксидазы в сочетании с кислородом. Оба типа ферментов используют для "отбеливания раствора" (т.е. для предотвращения переноса текстильного красителя с одной окрашенной ткани на другую ткань, когда ткани стирают вместе в моющем растворе), вместе с усиливающим средством (смотрите, например, WO 94/12621 и WO 95/01426). Пригодные пероксидазы/оксидазы включают, но не ограничиваются ими, пероксидазы/оксидазы растений, бактерий или грибов. В некоторые варианты осуществления включаются химически или генетически модифицированные мутанты.

В некоторых вариантах осуществления моющие композиции по настоящему изобретению, кроме того, могут содержать пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от приблизительно 0,00001% до приблизительно 10% дополнительной пероксидазы и/или оксидазы по массе композиции и остальную часть из вспомогательных моющих материалов по массе композиции. В других аспектах настоящего изобретения, моющие композиции по настоящему изобретению также содержат пероксидазные и/или оксидазные ферменты на уровне от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,005% до приблизительно 0,5% пероксидазных и/или оксидазных ферментов по массе композиции.

Настоящим описанием охватываются смеси указанных выше ферментов, в частности, смесь фермента 1AG3, одной или нескольких дополнительных протеаз, по меньшей мере одной амилазы, по меньшей мере одной липазы, по меньшей мере одной маннаназы и/или по меньшей мере одной целлюлазы. Действительно, предусматривается, что в настоящем изобретении могут быть применимы различные смеси этих ферментов.

Предусматривается, что различные уровни протеазы и одного или нескольких дополнительных ферментов, независимо в каждом случае составляют до приблизительно 10%, причем остальной частью моющей композиции являются вспомогательные моющие материалы. Конкретный выбор вспомогательных моющих материалов легко проводить с учетом поверхности, предмета или ткани, подлежащих очистке, и требуемой формы композиции для условий очистки в процессе применения (например, при применении детергента для мытья).

Примеры пригодных вспомогательных моющих материалов включают, но не ограничиваются ими, поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, отбеливатели, активаторы отбеливания, катализаторы отбеливания, другие ферменты, стабилизирующие ферменты системы, хелатирующие агенты, оптические отбеливатели, высвобождающие грязь полимеры, агенты для переноса красителя, диспергирующие средства, ингибиторы пены, красители, отдушки, красящие вещества, соли наполнителей, гидротропные вещества, фотоактиваторы, флуоресцирующие вещества, кондиционеры для тканей, гидролизуемые поверхностно-активные вещества, консерванты, антиоксиданты, средства против сжатия, средства против сморщивания, гермициды, фунгициды, цветные зерна, средства, защищающие серебряный цвет, средства против потускнения и/или антикоррозийные средства, источники щелочности, солюбилизирующие средства, носители, технологические добавки, пигменты и средства для регуляции pH (смотрите, например, патенты США №№ 6610642, 6605458, 5705464, 5710115, 5698504, 5695679, 5686014 и 5646101, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок). Варианты осуществления конкретных материалов моющей композиции подробно проиллюстрированы ниже.

Если вспомогательные моющие материалы не совместимы с протеазами по настоящему изобретению в моющих композициях, тогда используют пригодные способы содержания вспомогательных моющих материалов и протеазы(протеаз) раздельно (т.е. они не контактируют друг с другом) до комбинирования этих двух компонент соответствующим образом. Такие способы разделения включают любой пригодный способ, известный в данной области (например, желатиновые капусулы, инкапсулирование, таблетки, физическое разделение и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество одной или нескольких протеазы(протеаз), представленной в настоящем документе, включено в композиции, пригодные для очистки различных поверхностей, предназначенных для удаления белковых пятен. Такие моющие композиции включают моющие композиции для таких применений, как очистка твердых поверхностей, тканей и посуды. Действительно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моющим композициям для тканей, в то время как в других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моющим композициям не для тканей. Примечательно, что настоящее изобретение также относится к моющим композициям, пригодным для личной гигиены, включая уход за полостью рта (включая зубные порошки, зубные пасты, средства для полоскания полости рта, и т.д., а также моющие композиции для челюстей), моющие композиции для кожи и волос. Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает детергентные композиции в любой форме (т.е. жидкой, гранулярной, в виде брусков, полутвердой, в виде гелей, эмульсий, таблеток, капсул и т.д.).

В качестве примера ниже более подробно описано несколько моющих композиций, в которых применима протеаза по настоящему изобретению. В вариантах осуществления, в которых моющие композиции по настоящему изобретению изготавливают в качестве композиций, пригодных для применения в способе(способах) машинной стирки, композиции по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и по меньшей мере одно соединение моющего компонента, а также один или несколько вспомогательных моющих материалов, выбранных из органических полимерных соединений, отбеливателей, дополнительных ферментов, ингибиторов пены, диспергирующих средств, диспергирующих веществ на основе известкового мыла, средства для суспендирования грязи и средства против повторного отложения грязи и ингибиторов коррозии. В некоторых вариантах осуществления композиции для стирки также содержит смягчители (т.е. дополнительные вспомогательные моющие материалы).

В композициях по настоящему изобретению также применимы вспомогательные детергентные продукты в твердой или жидкой форме. Такие вспомогательные продукты предназначены для дополнения и/или усиления эффективности общепринятых детергентных композиций и их можно добавлять на любой стадии процесса очистки.

Некоторые варианты осуществления изготовленные в качестве композиций для применения в ручных способах мытья посуды, содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и/или по меньшей мере один дополнительный вспомогательный моющий материал, выбранный из органических полимерных соединений, средств, усиливающих пену, ионов металлов группы II, растворителей, гидротропных веществ и дополнительных ферментов.

В некоторых вариантах осуществления плотность композиций детергента для стирки, описанных в настоящем документе, находится в диапазоне от приблизительно 400 до приблизительно 1200 г/литр, а в других вариантах осуществления она находится в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 950 г/литр композиции при измерении при приблизительно 20ºC.

В некоторых вариантах осуществления с протеазами по настоящему изобретению применимы различные моющие композиции, такие как композиции, представленные в патенте США № 6605458. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, представляет собой компактную гранулярную моющую композицию для тканей, а в других вариантах осуществления композиция представляет собой гранулярную моющую композицию для тканей, пригодную для стирки цветных тканей, в следующих вариантах осуществления композиция представляет собой гранулярную моющую композицию для тканей, которая обеспечивает смягчение посредством моющей способности, в дополнительных вариантах осуществления композиция представляет собой усиленную жидкую моющую композицию для тканей.

В некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, представляют собой моющие композиции для тканей, такие как композиции, описанные в патенте США № 6610642 и патенте США № 6376450. Кроме того, протеазы по настоящему изобретению применимы в гранулярных композициях детергента для стирки, в частности, пригодных в европейских или японских условиях стирки (сморите, например, патент США № 6610642).

В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к моющим композициям для твердых поверхностей, содержащим по меньшей мере одну протеазу, представленную в настоящем документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, представляет собой моющую композицию для твердых поверхностей (смотрите, например, патенты США №№ 6610642, 6376450 и 6376450).

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям для мытья посуды, содержащим по меньшей мере одну протеазу, представленную в настоящем документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, представляет собой моющую композицию для твердых поверхностей (смотрите, например, патенты США №№ 6610642 и 6376450).

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям для мытья посуды, содержащим по меньшей мере одну протеазу, представленную в настоящем документе. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, включают композиции для ухода за полостью рта (смотрите, например, патенты США №№ 6376450 и 6376450).

Составы и описания соединений и вспомогательных моющих материалов описаны (смотрите, например, патенты США №№ 6376450, 6605458, 6605458 и 6610642, включенные в настоящий документ в качестве ссылок). Дополнительные примеры указаны в разделе "Примеры", ниже.

Более того, настоящее изобретение относится к композициям и способам для получения продуктов питания или кормов для животных, характеризующихся тем, что с продуктами питания или кормами для животных смешивают протеазу по этому изобретению. В некоторых вариантах осуществления протеазу добавляют в качестве сухого продукта до переработки, а в других вариантах осуществления ее добавляют в качестве жидкости до или после обработки. В некоторых вариантах осуществления, в которых используют сухой порошок, фермент наносят в виде жидкости на сухой носитель, такой как измельченное зерно. Протеазы по настоящему изобретению применимы в качестве компонентов кормов для животных и/или добавок (смотрите, например, патенты США №№ 5612055, 5314692 и 5147642, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок).

Ферментную добавку в корм в соответствии с настоящим изобретением можно изготавливать рядом способов. Например, в некоторых вариантах осуществления ее получают просто путем смешивания различных ферментов, имеющих соответствующую активность, с получением смеси ферментов. В некоторых вариантах осуществления эту смесь ферментов смешивают непосредственно с кормом, а в других вариантах осуществления ею пропитывают материал-носитель на основе злаков, такой как измельченная пшеница, кукурузная или соевая мука. Также настоящее изобретение относится к пропитанным носителям, поскольку они применимы в качестве ферментных добавок в корм.

В некоторых альтернативных вариантах осуществления носитель на основе злаков (например, измельченной пшеницы или кукурузы) пропитывают либо одновременно, либо последовательно, ферментами, имеющими соответствующие виды активности. Например, в некоторых вариантах осуществления на носитель в виде измельченной пшеницы сначала наносят ксиланазу, затем протеазу, и необязательно β-глюканазу. Настоящее изобретение также охватывает эти пропитанные носители, поскольку они применимы в качестве ферментных добавок в корм. В некоторых вариантах осуществления эти пропитанные носители содержат по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления добавку в корм по настоящему изобретению прямо смешивают с кормом для животных, а в альтернативных вариантах осуществления ее смешивают с одной или несколькими другими добавками в корм, такими как витаминная добавка в корм, минеральная добавка в корм и/или аминокислотная добавка в корм. Затем полученную добавку в корм, включающую несколько различных типов компонентов, смешивают в соответствующем количестве с кормом.

В некоторых вариантах осуществления добавку в корм по настоящему изобретению, включая носители на основе злаков, обычно смешивают в количествах от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 г на килограмм корма (например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 г/килограмм, или приблизительно 1 г/килограмм).

В альтернативных вариантах осуществления ферментная добавка в корм по настоящему изобретению вовлекает конструирование рекомбинантных микроорганизмов, которые продуцируют требуемый фермент(ы) в требуемых относительных количествах. В некоторых вариантах осуществления это осуществляют увеличением числа копий гена, кодирующего по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, и/или с использованием пригодного сильного промотора, функционально связанного с полинуклеотидом, кодирующим протеазу(ы). В следующих вариантах осуществления некоторые ферментативные виды активности штамма рекомбинантного микроорганизма устранены (например, целлюлазы, эндоглюканазы и т.д.), если желательно.

В дополнительных вариантах осуществления ферментные добавки в корм по настоящему изобретению также включают другие ферменты, включая, но не ограничиваясь ими, по меньшей мере одну ксиланазу, α-амилазу, глюкоамилазу, пектиназу, маннаназу, α-галактозидазу, фитазу и/или липазу. В некоторых вариантах осуществления ферменты, имеющие требуемые виды активности, либо смешивают с ксиланазой и протеазой до пропитывания ими носителя на основе злаков, либо альтернативно такими ферментами пропитывают носитель на основе злаков одновременно или последователно. Затем носитель в свою очередь смешивают с кормом на основе злаков с получением конечного корма. В альтернативных вариантах осуществления ферментную добавку в корм изготавливают в качестве раствора отдельных ферментных активных веществ, а затем смешивают с материалом корма, предварительно сформированным в качестве гранул или в качестве кашицы.

В других вариантах осуществления ферментную добавку в корм включают в рационы животных путем включения во второй (т.е. отличающийся) корм или питьевую воду животных. Таким образом, не обязательно, чтобы ферментная смесь по настоящему изобретению была включена непосредственно в корм на основе злаков, хотя такое включение формирует конкретный вариант осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления соотношение единиц ксиланазной активности на г добавки в корм и единиц протеазной активности на г добавки в корм составляет приблизительно 1:0,001-1,000, приблизительно 1:0,01-100 или приблизительно 1:0,1-10. Как указано выше, ферментная смесь по настоящему изобретению, применима в качестве добавки в корм при приготовлении корма на основе злаков.

В некоторых вариантах осуществления корм на основе злаков содержит по меньшей мере приблизительно 25% по массе, или более чем по меньшей мере приблизительно 35% по массе, пшеницы или кукурузы или сочетания обоих из этих злаков. Кроме того, корм содержит протеазу (т.е. по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению) в таком количестве, что корм включает от приблизительно 100 до приблизительно 100000 единиц протеазной активности на кг.

Корма на основе злаков по настоящему изобретению применимы в качестве корма для различных не относящихся к человеку животных, включая птиц (например, индюков, гусей, уток, кур и т.д.), домашний скот (например, свиней, овец, крупный рогатый скот, коз и т.д.), и животных-компаньонов (например, лошадей, собак, кошек, кроликов, мышей и т.д.). Корма, в частности, пригодны для птиц и свиней, и, в частности, бройлерных кур.

Также настоящее изобретение относится к композициям для обработки текстиля, которые включают по меньшей мере одну из протеаз по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна протеаза по настоящему изобретению представляет собой компонент композиций, пригодных для обработки шелка или шерсти (смотрите, например, патент США RE № 216034, EP 134267, патент США № 4533359, и EP 344259).

Кроме того, протеазы по настоящему изобретению применимы во множестве способах применения, где является желательным отделение фосфора от фитата. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам получения шерсти или материала волосяного покрова животных с улучшенными свойствами. В некоторых вариантах осуществления эти способы включают стадии предварительной обработки шерсти, шерстяного волокна или материала волосяного покрова животных в процессе, выбранном из группы, состоящей из процессов плазменной обработки и процесса Delhey; и воздействия на предварительно обработанную шерсть или материал волосяного покрова животных обработки протеолитическим ферментом (например, по меньшей мере одной протеазой по настоящему изобретению) в количестве, эффективном для улучшения свойств. В некоторых вариантах осуществления обработку протеолитическим ферментом проводят до плазменной обработки, а в других вариантах осуществления ее проводят после плазменной обработки. В некоторых других вариантах осуществления ее проводят в качестве отдельной стадии, а в других вариантах осуществления ее проводят в сочетании с очисткой или окраской шерсти или материала волосяного покрова животного. В дополнительных вариантах осуществления в процессе стадии обработки ферментом присутствует по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество и/или по меньшей мере один смягчитель, а в других вариантах осуществления поверхностно-активное вещество(а) и/или смягчитель(и) включают на отдельной стадии, где шерсть или материал волосяного покрова животных подвергают смягчающей обработке.

В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению применимы в способах предупреждения усадки шерстяных волокон (смотрите, например, JP 4-327274). В некоторых вариантах осуществления композиции используют в способах обработки для предупреждения усадки шерстяных волокон путем воздействия на волокна плазменной обработки при низкой температуре, с последующей обработкой предупреждающей усадку смолой, такой как блок-уретанановая смола, полиамидная эпохлоргидриновая смола, глиоксалевая смола, смола на основе этилен-мочевины или акрилатная смола, а затем обработки уменьшающим массу протеолитическим ферментом для получения эффекта смягчения). В некоторых вариантах осуществления стадия плазменной обработки представляет собой обработку при низкой температуре (например, обработку коронным разрядом) или обработку тлеющим разрядом.

В некоторых вариантах осуществления плазменную обработку при низкой температуре проводят с использованием газа (например, газа, выбранного из группы, состоящей воздуха, кислорода, азота, аммиака, гелия или аргона). Обычно используют воздух, но в некоторых вариантах осуществления применимы другие газы.

Плазменную обработку при низкой температуре можно проводить при давлении между приблизительно 0,1 торр и 5 торр в течение от приблизительно 2 секунд до приблизительно 300 секунд (например, в течение от приблизительно 5 секунд до приблизительно 100 секунд, или от приблизительно 5 секунд до приблизительно 30 секунд).

Как указано выше, настоящее изобретение применимо в сочетании со способами, такими как процесс Delhey (смотрите, например, DE-A-4332692). В этом процессе шерсть обрабатывают водным раствором пероксида водорода в присутствии растворимого вольфрамата, необязательно с последующей обработкой раствором или дисперсией синтетических полимеров для улучшения свойств шерсти против сваливания. В этом способе, шерсть обрабатывают водным раствором пероксида водорода (от приблизительно 0,1 до приблизительно 35% (масс./масс.) (например, от приблизительно 2 до приблизительно 10% (масс./масс.)), в присутствии от приблизительно 2 до приблизительно 60% (масс./масс.) (например, от приблизительно 8 до приблизительно 20% (масс./масс.)) катализатора (например, Na₂WO₄), и в присутствии неионного смачивающего вещества. Обработку можно проводить при pH от приблизительно 8 до приблизительно 11 и при комнатной температуре. Время обработки зависит от концентрации пероксида водорода и катализатора, однако оно может составлять 2 минуты или менее. После окислительной обработки шерсть промывают водой. Для удаления остаточного пероксида водорода, и необязательно для дополнительного отбеливания, шерсть далее обрабатывают водными растворами восстановителей (например, сульфитов, фосфитов и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления стадию обработки ферментом проводят в течение между приблизительно 1 минутой и приблизительно 120 минутами. В некоторых вариантах осуществления эту стадию проводят при температуре между приблизительно 20ºC и приблизительно 60ºC (например, между приблизительно 30ºC и приблизительно 50ºC). Альтернативно шерсть пропитывают или заливают водным раствором фермента, а затем подвергают пропариванию при общепринятых температурах и давлении, как правило, в течение от приблизительно 30 секунд до приблизительно 3 минут. В некоторых вариантах осуществления обработку протеолитическим ферментом проводят в кислой или нейтральной или щелочной среде, которая в некоторых вариантах осуществления включает буфер.

В альтернативных вариантах осуществления стадию обработки ферментом проводят в присутствии одного или нескольких общепринятых анионных, неионных (например, Dobanol; Henkel AG) или катионных поверхностно-активных веществ. Примером пригодного неионного поверхностно-активного вещества является Dobanol (Henkel AG). В следующих вариантах осуществления шерсть или материал волосяного покрова животного подвергают ультразвуковой обработке, либо до обработки протеолитическим ферментом, либо одновременно с ней. В некоторых вариантах осуществления ультразвуковую обработку проводят при температуре приблизительно 50ºС в течение приблизительно 5 минут. В некоторых вариантах осуществления количество протеолитического фермента, используемого на стадии обработки ферментом, составляет между приблизительно 0,2% масс./масс. и приблизительно 10% масс./масс., в расчете на массу шерсти или материала волосяного покрова животного. В некоторых вариантах осуществления для уменьшения количества стадий обработки, обработку ферментом проводят в процессе окрашивания и/или очистки шерсти или материала волосяного покрова животного, просто путем добавления протеазы в ванну для окрашивания, ополаскивания и/или очистки. В некоторых вариантах осуществления обработку ферментом проводят после плазменной обработки, но в других вариантах осуществления эти две стадии обработки проводят в обратном порядке.

Смягчители, обычно используемые для шерсти, как правило, представляют собой катионные смягчители, либо органические катионные смягчители, либо продукты на основе силикона, однако также пригодны анионные или неионные смягчители. Примеры пригодных смягчителей включают, но не ограничиваются ими, полиэтиленовые смягчители и силиконовые смягчители (т.е. диметилполисилоксаны (силиконовые масла)), H-полисилоксаны, силиконовые эластомеры, аминофункциональные диметилполисилоксаны, аминофункциональные силиконовые эластомеры и эпоксифункциональные диметилполисилоксаны и органические катионные смягчители (например, алкильные производные четвертичного аммония).

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям для обработки шкуры животного, которая включает по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению применимы в композициях для обработки шкуры животного, таких как описаны в WO 03/00865 (Insect Biotech Co., Taejeon-Si, Korea). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам переработки шкур и/или кожи в кожаное изделие, включающим ферментативную обработку шкуры или кожи протеазой по настоящему изобретению (смотрите, например, WO 96/11285). В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям для переработки кожи или шкуры животного в кожаное изделие, которые включают по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению.

Шкуры и кожу, как правило, получают в дубильнях в форме просоленных или высушенных сырых шкур или кожи. Переработка шкур или кожи в кожаное изделие включает несколько различных стадий обработки, включая стадии вымачивания, обезволашивания и мягчения. Эти стадии представляют собой влажную переработку и их проводят в дубильнях. Ферментативная обработка с использованием протеаз по настоящему изобретению применима в любой момент времени в ходе процесса, вовлеченного в обработку кожи. Однако протеазы обычно используют в процессе влажной переработки (т.е. в процессе вымачивания, обезволашивания и мягчения). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления ферментативную обработку по меньшей мере одной из протеаз по настоящему изобретению проводят в ходе стадии влажной переработки.

В некоторых вариантах осуществления процессы вымачивания по настоящему изобретению проводят в общепринятых условиях вымачивания (например, при pH в диапазоне от приблизительно pH 6,0 до приблизительно 11). В некоторых вариантах осуществления диапазон составляет от приблизительно pH 7,0 до приблизительно 10,0. В альтернативных вариантах осуществления температура находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 30ºС, а в других вариантах осуществления она находится в диапазоне от приблизительно 24 до приблизительно 28ºС. В других вариантах осуществления время реакции находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 24 часов (например, в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 16 часов). В дополнительных вариантах осуществления предусматриваются поверхностно-активные вещества и/или консерванты, если желательно.

Вторая фаза стадии мягчения, как правило, начинается с добавления самого мягчителя. В некоторых вариантах осуществления ферментативная обработка происходит в процессе мягчения. В некоторых вариантах осуществления ферментативная обработка происходит в процессе мягчения после фазы обеззоливания. В некоторых вариантах осуществления процесс мягчения по настоящему изобретению проводят с использованием общепринятых условий (например, при pH в диапазоне от приблизительно pH 6,0 до приблизительно 9,0). В некоторых вариантах осуществления диапазон pH составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,5. В следующих вариантах осуществления температура находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 30ºC, а в других вариантах осуществления температура находится в диапазоне от приблизительно 25 до приблизительно 28ºС. В некоторых вариантах осуществления время реакции находится в диапазоне от приблизительно 20 до приблизительно 90 минут, а в других вариантах осуществления оно находится в диапазоне от приблизительно 40 до приблизительно 80 минут. Процессы изготовления кожаных изделий хорошо известны специалистам в данной области (смотрите, например, WO 94/069429 WO 90/1121189, патент США № 3840433, EP 505920, GB 2233665 и патент США № 3986926, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок).

В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мягчителям, содержащим по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению. Мягчитель представляет собой средство или содержащий фермент препарат, содержащий химически активные ингредиенты для применения в процессах в дубильне, в частности, на стадии мягчения в процессе изготовления кожаных изделий. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мягчителям, содержащим протеазу и пригодные эксципиенты. В некоторых вариантах осуществления средства включают, но не ограничиваясь ими, химические вещества, известные и используемые в данной области (например, разбавители, эмульгаторы, средства для обеззоливания и носители). В некоторых вариантах осуществления изготавливают мягчитель, содержащий по меньшей мере одну протеазу по настоящему изобретению, как известно в данной области (смотрите, например, GB-A2250289, WO 96/11285 и EP 0784703).

В некоторых вариантах осуществления мягчитель по настоящему изобретению содержит от приблизительно 0,00005 до приблизительно 0,01 г активной протеазы на г мягчителя, а в других вариантах осуществления мягчитель содержит от приблизительно 0,0002 до приблизительно 0,004 г активной протеазы на г мягчителя.

Таким образом, протеазы по настоящему изобретению применимы во множестве способах применения и условий.

ЭКСПЕИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Настоящее изобретение более подробно описано в представленном ниже разделе "Примеры", который никоим образом не предназначен для ограничения объема заявленного изобретения. Подразумевается, что прилагаемые фигуры являются неотъемлемой частью спецификации и описания изобретения. Все ссылки, цитированные в настоящем документе, конкретно включены в качестве ссылок для всего, что описано в них. Представленные ниже примеры предоставлены для иллюстрации, но не для ограничения заявленного изобретения.

В описании экспериментальной части, которое следует далее, применяются следующие сокращения: PI (ингибитор протеазы), м.д. (миллионные доли); M (молярный); мМ (миллимолярный); мкМ (микромолярный); нМ (наномолярный); моль (количество моль); ммоль (миллимоль); мкмоль (микромоль); нмоль (наномоль); г (грамм); мг (миллиграмм); мкг (микрограмм); пг (пикограмм); L (литры); мл и мЛ (миллилитры); мкл и мкЛ (микролитры); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); Ед (единицы); В (вольты); ММ (молекулярная масса); с (секунды); мин (минута/минуты); ч (час/часы); ºС (градусы Цельсия); QS (достаточное количество); ND (не проводили); NA (не применимо); об/мин (обороты в минуту); H₂O (вода); dH₂O (деионизированная вода); (HCl (хлористоводородная кислота); а.к. (аминокислота); п.н. (пары оснований); т.п.н. (тысячи пар оснований); кДа (килодальтон); кДНК (копийная или комплементарная ДНК); ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота); ssDNA (одноцепочечная ДНК); dsDNA (двухцепочечная ДНК); dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфат); РНК (рибонуклеиновая кислота); MgCl₂ (хлорид магния); NaCl (хлорид натрия); масс./об. (масса к объему); об./об. (объем к объему); g (сила тяжести); OD (оптическая плотность); фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS); SOC (2% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl); бульон Terrific (TB; 12 г/л бакто-триптона, 24 г/л глицерина, 2,31 г/л KH₂PO₄ и 12,54 г/л K₂HPO₄); OD₂₈₀ (оптическая плотность при 280 нм); OD₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм); A₄₀₅ (поглощение при 405 нм); Vmax (максимальная начальная скорость катализируемой ферментом реакции); PAGE (полиакриламидный гель-электрофорез); PBS (фосфатно-солевой буфер [150 мМ NaCl, 10 мМ фосфатно-натриевый буфер, pH 7,2]); PBST (PBS+0,25% TWEEN® 20); PEG (полиэтиленгликоль); ПЦР (полимеразная цепная реакция); ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией); SDS (додецилсульфат натрия); Tris (трис(гидроксиметил)аминометан); HEPES (N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N-[2-этансульфоновая кислота]); HBS (забуференный HEPES солевой раствор); SDS (додецилсульфат натрия); Tris-HCl (трис[гидроксиметил]аминометан-гидрохлорид); Tricine (N-[трис(гидроксиметил)метил]глицин); CHES (2-(N-циклогексиламино)этансульфоновая кислота); TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота); CAPS (3-(циклогексиламино)пропансульфоновая кислота; ДМСО (диметилсульфоксид); DTT (1,4-дитио-DL-треитол); SA (синапиновая кислота (s,5-диметокси-4-гидроксикоричная кислота); TCA (трихлоруксусная кислота); Glut5 и GSH (восстановленный глутатион); GSSG (окисленный глутатион); TCEP (трис[2-карбоксиэтил]фосфин); Ки (Кюри); мКи (милликюри); мкКи (микрокюри); ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография); ОФ-ВЭЖХ (обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография); TLC (тонкослойная хроматография); MALDI-TOF (времяпролетная лазерная десорбция/ионизация в присутствии матрицы); Ts (тозил); Bn (бензил); Ph (фенил); Ms (мезил); Et (этил), Me (метил); Taq (ДНК-полимераза Thermus aquaticus); Klenow (большой (Кленова) фрагмент ДНК-полимеразы I); об/мин (обороты в минуту); EGTA (этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота); ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота); bla (β-лактамаза или ген устойчивости к ампициллину); HDL (жидкость высокой плотности); MJ Research (MJ Research, Reno, NV); Infors (InforsAG, Bottmingen-Basel, Switzerland); Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, the Netherlands); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA); ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San Jose, CA); Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ); Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Germany); Pall (Pall Corp., East Hills, NY); Spectrum (Spectrum Laboratories, Dominguez Rancho, CA); Molecular Structure (Molecular Structure Corp., Woodlands, TX); Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA); Chemical Computing (Chemica Computing Corp., Montreal, Canada); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ); CFT (Center for Test Materials, Vlaardingeng, the Netherlands); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healtheare, Chalfont St. Giles, United Kingdom); DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, CA); OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK); Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray. Co., Wicklow, Ireland); Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finland); Kelco (CP Kelco, Wilmington, DE); Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY); (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA); Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Norway); Dynal (Dynal, Oslo, Norway); Bio-Synthesis (Bio-Synthesis. Lewisville, TX); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD); Gibco/BRL (Gibco/BRL. Grand Island, NY); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ); NCBI (National Center for Biotechnology Information); Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA); BD Biosciences и/или Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA); Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA); MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC); Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR); Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA); Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY); Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ); GIBCO BRL или Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD); Millipore (Millipore, Billerica, MA); Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA); Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL); Takara (Takara Bio Inc. Otsu. Japan); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland); EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ); Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia. CA); Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine); Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA); R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN); Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA); Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY); Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT); (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ); PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ); SynPep (SynPep, Dublin, CA); New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ); Waters (Waters, Inc., MiIf ord, MA); Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA); Дионх (Дионх, Corp., Sunnyvale, CA); Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO); Wintershall (Wintershall AG, Kassel, Germany); BASF (BASF Co., Florham Park, NJ); Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT); Enichem (Enichem Iberica, Barcelona, Spain); Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, the Netherlands); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); ServiceXS (Service XS, the Netherlands) и Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA).

В некоторых примерах, ниже, предусматриваются различные детергентные составы. В представленной ниже таблице указаны определения для некоторых из компонентов, используемых в этих детергентах.

Определения детергентов

ПРИМЕР 1

Выделение и культивирование штаммов микроорганизмов

В этом примере описано выделение и культивирование штамма 1AG3 Streptomyces. В качестве среды для выделения использовали агар с экстрактом щелочной почвы с селективным давлением рифампицина. Среду с экстрактом почвы получали, как описано:

Получение среды с экстрактом почвы

Раствор A:

Суспендировать 1 кг садовой почвы в 1 литре воды и автоклавировать в течение 20 мин при 120ºС. Охладить до комнатной температуры и пропустить суспензию через фильтр из стекловолокна с получением прозрачного фильтрата. Промыть ретентат почвы два раза 200 мл и 100 мл деминерализованной воды. Добавить количество воды, достаточное для обеспечения объема 1 литр.

Раствор B:

NaCl 80 г/л

Na₂CO₃ 20 г/л

Смешать и стерилизовать при 120ºС в течение 20 минут.

Исходный раствор рифампицина:

50 мг/мл рифампицина (Sigma R3501) растворяли в ДМСО и стерилизовали фильтрацией через 20-мкм мембрану.

Во-первых, 20 г агара добавляли к 500 мл раствора A и раствор стерилизовали при 120ºC в течение 20 мин. Затем 500 мл раствора A смешивали с 500 мл раствора B и охлаждали до 60ºС. Затем добавляли рифампицин до конечной концентрации 50 мкг/мл. Затем смесь с агаром выливали на чашки Петри и хранили при 4ºС в закрытых полиэтиленовых мешках до инокуляции организмами.

Осадок из озерной воды и воду смешивали с раствором B соотношении 1:1 и тщательно встряхивали. После осаждения серийные разведения супернатанта наносили на агар с экстрактом почвы, pH 10, содержащий рифампицин. Чашки инкубировали при 30ºС в плотно закрытой пластмассовой коробке, в которой были постелены смоченные бумажные полотенца для поддержания влажности и предотвращения выпаривания, в течение нескольких недель. Чашки периодически исследовали стереомикроскопией. Нитевидные колонии, наблюдаемые в ходе этих исследований, собирали и инокулировали на свежую среду.

ПРИМЕР 2

Охарактеризация штамма 1AG3 путем секвенирования 16S РНК

В этом примере описаны эксперименты, проведенные для охарактеризации штамма 1AG3 Streptomyces путем секвенирования 16S рДНК. Получали фракцию хромосомной ДНК, содержащую первые 500 пар оснований гена рРНК 16S посредством ПЦР, как описано ниже. Определяли нуклеотидную последовательность фрагмента. Те же праймеры использовали для синтеза и секвенирования.

Праймеры

3338 5'-G(A/T)A TTA CCG CGG C(G/T)G CTG-3' (SEQ ID NO:22)

3572 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' (SEQ ID NO:21)

Протокол ПЦР

Реакционная смесь содержала 10 мкл буфера Pwo (Boehringer Mannheim), 80,5 мкл деионизированной воды, 2 мкл dNTP (10 мМ каждого), 1 мкл каждого праймера (10 мкг/мкл), 0,5 мкл полимеразы Pwo (5 Ед/мкл) (Boehringer Mannheim) в 500-мкл пробирке Eppendorf.

Условия для ПЦР представляли собой: 25 циклов при 95ºС в течение 45 с, затем 55ºС в течение 45 с, а затем 72ºС в течение 2 мин. Фрагменты ПЦР очищали агарозным гель-электрофорезом, а затем вырезали и извлекали из геля с использованием набора QIAquick® Gel Extraction (Qiagen), с использованием реагентов и инструкций изготовителя. Неполный ген 16S рРНК штамма 1AG3 Streptomyces, идентифицированный в этом эксперименте, имеет следующую последовательность:

Поиск Blastn в GenBank выявил, что наиболее близким соседом штамма 1AG3 является Streptomyces somaliensis с 97% идентичностью в области перекрывания размером 434 п.н., указывая на то, что 1AG3, наиболее вероятно, является видом Streptomyces.

ПРИМЕР 3

Идентификация неполной последовательности гена новой протеазы, присутствующей в штамме 1AG3 алкалофильных Streptomyces

В этом примере, описаны способы и композиции, используемые для идентификации неполной последовательности гена протеазы 1AG3 Streptomyces. Проводили ПЦР с вырожденными праймерами StreptomycProt_FW и StreptomycProt_RV на хромосомной ДНК природного изолята 1AG3 Streptomyces. ПЦР привела к фрагменту ДНК, кодирующему новую протеазу, сходную с белками, известными как "стрептогрисины".

Способы ПЦР использовали со следующим набором вырожденных праймеров:

StreptomycProt_FW 5'-CGCTGYTCVVTSGGCTTC-3' (SEQ ID NO:13)

StreptomycProt_RV 5'-GCAGTYGCCNNNGCCGCCGGASGT-3' (SEQ ID NO:14)

ПЦР проводили на термоблоке с высокоточной Taq полимеразой High Fidelity Platinum Taq polymerase (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя (температура отжига 50ºС). Выделяли геномную ДНК штамма 1AG3 Streptomyces, как описано в Kieser et al. (Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom [2000]) и использовали ее в качестве матричной ДНК в ПЦР. ПЦР привела к фрагменту ПЦР приблизительно из 400 п.н. и секвенирование ДНК (ServiceXS) показало, что последовательность ДНК этого фрагмента ПЦР кодирует белок, сходный с другими сериновыми протеазами. Неполная нуклеотидная последовательность этой протеазы 1AG3 представлена ниже. В этой последовательности, последовательность вырожденного FW-праймера подчеркнута. RV-праймер не был выявлен, вследствие плохого качества информации о последовательности в конце анализа (что указано рядом N).

Следующая последовательность является неполной (транслированной) аминокислотной последовательностью протеазы 1AG3

RCSLGFPVRR GTQAGFATAG HCGRVGTTTR GFNQVAQGTF QGSIFPGRDM

GWVAVNSNWN TTPFVRGQGG ANVTVAGSQQ APVGSSVCRS GSTTGWHCGT

IQQHNTSVRY PEG (SEQ ID NO:16)

Поиск Blast показал сходство с белком стрептогрисином C из Streptomyces coelicolor и другими стрептогрисинами или сериновыми протеазами из различных видов Streptomyces и других микроорганизмов.

ПРИМЕР 4

Установление полной последовательности гена белка протеазы 1AG3

В этом примере описаны эксперименты, проведенные для установления полных последовательностей гена и белка протеазы 1AG3. В этих экспериментах проводили эксперименты с инвертированной ПЦР на хромосомной ДНК нового штамма 1AG3 Streptomyces для выделения и клонирования полноразмерного гена протеазы 1AG3 из штамма 1AG3 алкалофильных Streptomyces. На основе последовательности ДНК фрагмента гена протеазы штамма 1AG3 Streptomyces, составляющего приблизительно 400 п.н., описанного в примере 3, были сконструированы новые ДНК-праймеры:

1AG3prot_RV 5'-GCGAAGCCCGCCTGAGTTCCGCGGCGAACG-3' (SEQ ID NO:18)

1AG3prot_FW 5'-GTGCCGTTCCGCCTCCACCACCGGCTGGCAC-3' (SEQ ID NO:17)

Хромосомную ДНК штамма 1AG3 алкалофильных Streptomyces расщепляли рестрикционными ферментами ApaI, BamHI, BssHII, KpnI, NarI, NcoI, NheI, PvuI, SalI или SstII, очищали с использованием набора для очистки Qiagen PCR purification kit (Qiagen, каталожный # 28106) и подвергали самолигированию с помощью ДНК-лигазы T4 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя, прилагаемыми в каждом случае. Смеси для лигирования очищали с использованием набора для очистки Qiagen PCR purification kit (Qiagen) и ПЦР проводили с праймерами 1AG3prot_RV и 1AG3prot_FW. ПЦР на фрагментах ДНК, которые расщепляли NcoI, NarI, BssHII или SalI, а затем подвергали самостоятельному лигированию, приводила к продуктам ПЦР между приблизительно 0,6 и 2,5 т.п.н. ПЦР проводили в термоблоке с высокоточной Taq-полимеразой High Fidelity Platinum Taq polymerase (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя (температура отжига 55ºС, 35 циклов). Анализ секвенированием ДНК (BaseClear, The Netherlands) показал, что фрагмент ДНК охватывает основную часть гена стрептогрисин-подобной протеазы из Streptomyces griseus.

Полная последовательность гена протеазы 1AG3 была установлена путем дополнительных реакций для анализа последовательности (BaseClear) на тех же продуктах ПЦР с праймером 1AG3-up1 (5'-GTGGTGGCCACGACCAGCTCGGCGGTCTC-3'; SEQ ID NO:27) и 1AG3-up2 (5'-TGGTCCAGGAACCGGCGAAGGTGTC; SEQ ID NO:28). Анализ последовательности с помощью этих праймеров привел к идентификации полной последовательности гена протеазы 1AG3 из 1362 п.н. Эта последовательность представлена ниже.

В указанной выше последовательности участок связывания рибосом подчеркнут, кодон инициации и стоп-кодон представлены полужирным шрифтом, (предсказанная) сигнальная последовательность указана курсивом, (предсказанная) N-концевая пропоследовательность подчеркнута двойной линией, и последовательность зрелой цепи протеазы подчеркнута волнистой линией.

В указанной выше последовательности сигнальный пептид (предсказанный) указан двойным подчеркиванием, пропоследовательность (предсказананая) указана подчеркиванием, и зрелая цепь указана полужирным шрифтом.

Молекулярную массу (ММ) протеазы 1AG43 определяли с использованием способов LC-MS, как известно в данной области. Измеренная ММ (посредством LC-MS, смотрите хроматограммы и спектры, ниже) гомолога ASP 1AG3 составила 21261 Да. Эта ММ соответствует последовательности 1AG3 [49-256] (вычисленная ММ составляет 21250 Да).

ПРИМЕР 5

Клонирование и экспрессия гена протеазы 1AG3 в Streptomyces lividans

В этом примере описаны клонирование и экспрессия протеазы 1AG3. Таким образом, в этом примере описаны плазмиды, содержащие полинуклеотиды, кодирующие полипептид, имеющий протеолитическую активность, и использование таких векторов для трансформации клеток-хозяев Streptomyces lividans. Способы трансформации, используемые в этом примере, известны в данной области (смотрите, например, патент США № 6287839; и WO 02/50245, включенные в настоящий документ в качестве ссылок).

Вектор (т.е. плазмида), использованный в этих экспериментах, содержал полинуклеотид, кодирующий протеазу по настоящему изобретению, полученную из штамма 1AG3 алкалофильных Streptomyces. Эту плазмиду использовали для трансформации Streptomyces lividans. Конечный плазмидный вектор обозначен в настоящем документе как "pSEA4CT-1AG3". Как и в случае предыдущих векторов, в конструкции pSEA4CT-1AG3 использовался плазмидный вектор pSEA4CT (смотрите выше). Для запуска экспрессии протеазы использовали регуляторную последовательность Aspergillus niger ("A4"), связанную со структурным геном, кодирующим протеазу 1AG3 Streptomyces (1AG3). Фрагмент ДНК, содержащий сигнальную последовательность CelA Streptomyces, пропоследовательность 1AG3 и последовательность зрелой протеазы 1AG3, конструировали способами ПЦР, известными в данной области, в качестве фрагмента NheI-BamHI. Полинуклеотидные праймеры для клонирования протеазы 1AG3 Streptomyces (1AG3) в pSEA4CT основаны на SEQ ID NO:1. Прямой праймер и обратный праймер представлены ниже:

pSEA4C-1AG3-Fw:

5'-GACTGCGCTAGCCGGCCCCCCGGCACAGGCCACCGCCGGACCGGCCCTCGCCCCGCCACCG-3' (SEQ ID NO:29)

pSEA4C-1AG3-Rv:

5'-GCTCGCGGATCCCCATTGTCACACGCGCTGCCAGAGGGCGGGCGTGTTC-3' (SEQ ID NO:30)

ПЦР проводили в термоблоке с высокоточной Taq-полимеразой High Fidelity Platinum Taq polymerase (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя (температура отжига 55ºС, 28 циклов). Полученный фрагмент ПЦР расщепляли ферментами рестрикции BamHI и NheI, и плазмиду pSEA4CT расщепляли ферментами рестрикции BamHI и XbaI. Как расщепленные ПЦР-фрагменты 1AG3, так и фрагменты плазмидной ДНК, очищали с использованием набора для очистки Qiagen PCR purification kit (Qiagen, каталожный # 28106). Фрагмент протеазы 1AG3 клонировали в плазмиду pSEA4CT с помощью набора ДНК-лигазы T4 (Invitrogen) с использованием инструкций изготовителя, с получением в результате плазмиды pSEA4CT-1AG3.

Хозяина Streptomyces lividans TK23 трансформировали плазмидным вектором pSEA4CT-1AG3 с использованием способа протопластов, описанного в предыдущем примере (т.е. с использованием способа Hopwood et al., выше).

Трансформированную культуру размножали с получением трех сбраживаемых культур в среде TS*. Состав среды TS* представлял собой (г/л): триптон (Difco) 16, сойтон (Difco) 4, гидролизат казеина (Merck) 20, K₂HPO₄ 10, глюкоза 15, пеногаситель Basildon 0,6, pH 7,0. Условия инкубации: 30ºС, 250 об/мин (Infors HT). В различные моменты времени отбирали образцы бульонов для ферментации для анализа. Для целей этого эксперимента, для подтверждения успешного клонирования использовали способ с обезжиренным молоком. В этом тесте 30 мкл супернатанта из встряхиваемых флаконов пипетировали в штампованных отверстиях на чашках с агаром с обезжиренным молоком и инкубировали при 37ºС.

Инкубированные чашки визуально осматривали после инкубации в течение ночи в отношении наличия прозрачных зон (гало), указывающих на экспрессию протеолитического фермента. Для целей этого эксперимента образцы также оценивали в отношении активности протеазы и в отношении молекулярной массы (SDS-PAGE). В конце сбраживания полноразмерную протеазу исследовали посредством SDS-PAGE. Образец бульона для сбраживания оценивали следующим образом: 10 мкл разбавленного супернатанта собирали и добавляли к 190 мкл раствора субстрата AAPF (концентрация 1 мг/мл, в 0,1 M Tris/0,005% TWEEN®-80, pH 8,6).

Проводили мониторинг скорости повышения поглощения при 410 нм вследствие высвобождения п-нитроанилина (25ºС). Результаты анализа для 3 клонов представлены в таблице (5.1), ниже.

Эти результаты отчетливо демонстрируют, что полинуклеотид из Streptomyces sp 1AG3, который кодирует полипептид, имеющий протеолитическую активность, экспрессировался в Streptomyces lividans.

ПРИМЕР 6

Взаимосвязь протеазы 1AG3 и других протеаз

В этом примере описаны способы, использованные для определения взаимосвязи между протеазой 1AG3 и другими протеазами. Поиск BLASTP по последовательности полипептида 1AG3 (SEQ ID NO:3) в Swissprot показал, что стрептогрисин C (SGPC) (SEQ ID NO:23) из Streptomyces griseus является наиболее близким известным гомологом с 59,7% идентичностью и 68,0% сходством, как указано в выравнивании, представленном на фиг.2. Когда сравнивают только последовательности зрелых (т.е. каталитический домен) протеаз, идентичность протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:9) и SGPC (SEQ ID NO:24) повышается до 74,2% и 80,1% сходства, как указано на фиг.3. На этой фигуре, аминокислоты активного центра his-asp-ser обозначены полужирным шрифтом и характерные 3 дисульфидных мостика указаны соединительными линиями.

Протеаза 1AG3 и протеаза Cellulomonas 69B4 (ASP) являются ортологами. Однако выравнивание последовательностей протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:3) и протеазы ASP (SEQ ID NO:25) показало, что их идентичность является низкой на уровне 39,6%, со сходством 49,6%, как указано на фиг.4. Когда сравнивают только зрелую (каталитическую) часть протеаз, идентичность 1AG3 (SEQ ID NO:9) c ASP (SEQ ID NO:26) возрастает до сходства 44,1% и 53,1%, как указано на фиг.5. Таким образом, результаты указывают на то, что 1AG3 имеет более чем 50% гомологию с ASP. Кроме того, было отмечено, что 1AG3 имеет большую молекулярную массу (приблизительно 21 кДа), чем ASP. Более того, было определено, что 1AG3 имеет более низкое значение pI, чем ASP.

ПРИМЕР 7

Эффективность протеазы 1AG3 на микрообразцах ткани в жидких детергентах

В этом примере эффективность мытья для протеазы 1AG3 определяли с использованием теста на микрообразце ткани BMI (кровь, молоко, чернила).

Определение активности очистки

Для тестов на микрообразцах ткани использовали инкубатор (Innova 4330 Incubator, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) при 20ºС и 30ºС, соответственно.

Образцы тканей с пятнами крови-молока-чернил (EMPA 116) получали от CFT и предварительно обрабатывали посредством воздействия 0,3% пероксида водорода в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем сушили. Из высушенных образцов нарезали круги диаметром 6,5 мм и помещали их вертикально, по одному на лунку, в 96-луночный микропланшет (MTP).

Образцы протеазы, полученные, например, из трансформированной культуры, описанной в примере 5, разбавляли в 10 мМ NaCl, 0,005% Tween 80 (полиоксиэтилена сорбитана моноолетат) [Sigma P-1754] с получением требуемой концентрации 5-60 мкг/мл (белок) для анализа.

Растворы детергентов:

1,6 г жидкого детергента без отбеливателя и ферментов приготавливали в 1 литре дионизированной воды, и добавляли кальций и магний из исходных растворов, для достижения конечной величины жесткости воды 6 зерен на галлон (т.е. североамериканских условий). Раствор детергента I доводили до pH 6,0 с помощью 4 Н NaOH и раствор детергента II буферизовали с использованием 5 мМ Hepes и 4 Н NaOH при pH 8,2.

Способ тестирования:

Инкубатор был установлен на требуемую температуру: 20ºC для условий низкой температуры (раствор детергента II), и 30ºC для условий с низким значением pH (раствор детергента I). Предварительно обработанные и предварительно нарезанные микрообразцы тканей помещали в каждую лунку 96-луночного MTP, как описано выше. В каждую лунку MTP, содержащего один микрообразец ткани на лунку, добавляли соответствующий раствор детергента в количестве 190 мкл. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл предварительно разбавленного раствора фермента с получением в результате конечной концентрации 0,25-3,0 мкг/мл (для обеспечения общего объема 200 мкл/лунка). Затем MTP закрывали для предотвращения вытекания, помещали в держатель на инкубаторе/устройстве для встряхивания, установленных на 20ºС (раствор детергента II при низкой температуре) или 30ºС (раствор детергента I при низком pH) и 350 об/мин, и позволяли встряхиваться в течение одного часа. После инкубации 100 мкл реакционной жидкости удаляли из каждой лунки и помещали в новый микропланшет (Costar 9017, Corning Incorporated, NY, USA). Поглощение при 405 нм считывали для каждой аликвоты на устройстве для считывания микропланшетов Microplate Reader (SpectraMax 340, Molecular Devices) и сравнивали против пустых контролей (т.е. лунок, содержащих микрообразец ткани и детергент, но не образец фермента).

Вычисление эффективности мытья BMI:

Полученную величину поглощения корректировали по значению пустого контроля (полученному после инкубации микрообразца в отсутствие фермента). Полученное поглощение использовали в качестве показателя гидролитической активности.

Результаты в виде кривых доза-ответ, на которых представлено поглощение при 405 нм в качестве функции концентрации (м.д. белка в лунке) для протеазы 1AG3 представлены на фиг.7 и 8.

ПРИМЕР 8

Жидкие моющие композиции для тканей

В этом примере представлены жидкие моющие композиции для тканей, которые применимы совместно с настоящим изобретением. Предусматривается, что эти композиции, в частности, применимы в японских условиях машинной стирки, а также для применений, вовлекающих очитку тонких и/или чувствительных тканей. В таблице 8-1 представлена пригодная композиции. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этим конкретным составом, поскольку многие другие составы применимы с настоящим изобретением.

ПРИМЕР 9

Жидкие композиции для мытья посуды

В этом примере представлены жидкие композиции для мытья посуды, которые применимы совместно с настоящим изобретением. Предусматривается, что эти композиции, в частности, применимы в японских условиях мытья посуды. В таблице 9-1 представлены пригодные композиции. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этим конкретным составом, поскольку многие другие составы применимы с настоящим изобретением.

ПРИМЕР 10

Жидкие моющие композиции для тканей

Протеазы по настоящему изобретению, в частности, применимы в моющих композициях. Например, предусматривается, что жидкую моющую композицию для тканей, в частности, применимую в японских условиях машинной стирки, получают в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах осуществления эти композиции содержат следующие компоненты, представленные в таблице 10-1. Если нет иных указаний, "протеаза" в этой таблице и в таблицах в представленных ниже примерах представляет собой протеазу 1AG3, представленную в настоящем документе.

ПРИМЕР 11

Гранулярные моющие композиции для тканей

В этом примере предоставлены различные гранулярные моющие композиции для тканей, которые применимы с настоящим изобретением. В представленных ниже таблицах указаны пригодные композиции. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этими конкретными составами, поскольку многие другие составы применимы с настоящим изобретением.

Предусматривается, что представленные ниже композиции детергентов для стирки обеспечивают применимость, в частности, в европейских условиях автоматической стирки.

ПРИМЕР 12

Составы детергентов

В этом примере представлены различные составы детергентов, которые применимы с 1AG3 и/или вариантами 1AG3. Понятно, что способы тестирования, представленные в этом разделе, необходимо использовать для определения соответствующих значений параметров настоящего изобретения.

В проиллюстрированных детергентных композициях, уровни ферментов выражены как чистый фермент по массе всей композиции и если нет иных указаний, детергентные ингредиенты выражены по массе всех композиций.

В следующей таблице (таблица 12-1) представлены жидкие композиции детергентов для стирки, которые получены.

В следующей таблице (12-2) представлены жидкие композиции для ручного мытья посуды, которые получены.

pH этих композиций составляет от приблизительно 8 до приблизительно 11.

В таблице 12-3 представлены композиции жидких детергентов для автоматического мытья посуды, которые получены.

В таблице 12-4 представлены композиции для стирки, которые получены в форме гранул или таблеток.

В таблице 12-5 представлен составы жидких детергентов для стирки, которые получены.

В таблице 12-6 представлены компактные высоко плотные детергенты для мытья посуды, которые получены.

pH указанных выше композиций составляет от приблизительно 9,6 до приблизительно 11,3.

В таблица 12-7 представлены детергентные композиции по настоящему изобретению в виде таблеток, которые получены прессованием гранулярной композиции детергента для мытья посуды под давлением 13 кН/см² с использованием стандартного ротационного пресса с 12 головками:

pH этих композиции составляет от приблизительно 10 до приблизительно 11,5.

Масса таблеток этих композиций составляет от приблизительно 20 грамм до приблизительно 30 грамм.

В таблице 12-8 представлены жидкие моющие детергентные композиции для твердых поверхностей по настоящему изобретению, которые получены.

pH этих композиций составляет от приблизительно 7,4 до приблизительно 9,5.

Безусловно, следует понимать, что можно проводить широкий диапазон изменений и модификаций варианта осуществления, описанного выше. Таким образом, подразумевается, что указанно выше подробное описание следует понимать в контексте представленной ниже формулы изобретения, включая все эквиваленты, которые предназначены для определения объема этого изобретения.

ПРИМЕР 13

Корм для животных, содержащий 1AG3

Настоящее изобретение также относится к композициям кормов для животных, содержащим 1AG3 и/или варианты 1AG3. В этом примере представлен один такой корм, пригодный для птиц. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этим конкретным составом, поскольку протеазы по настоящему изобретению применимы с множеством других составов кормов. Кроме того, подразумевается, что корма по настоящему изобретению пригодны для введения любому животному, включая, но не ограничиваясь ими, домашний скот (например, крупный рогатый скот, свиней, овец и т.д.), и животных-компаньонов (например, собак, кошек, лошадей, грызунов и т.д.). В представленной ниже таблице указан состав для кормовой смеси, а именно начального корма на основе кукурузы, пригодного для введения птенцам индюка в возрасте вплоть до 3 недель.

В некоторых вариантах осуществления этот состав корма дополнен различными концентрациями протеазы(протеаз) по настоящему изобретению (например, 2000 едини/кг, 4000 единиц/кг и 6000 единиц/кг).

Все патенты и публикации, упомянутые в описании, являются ориентировочными для уровня специалистов в области, к которой относится изобретение. Все патенты и публикации включены в настоящий документ в качестве ссылок в той же степени, как если бы отдельные публикации были конкретно и индивидуально указаны, как включенные в качестве ссылок. Однако цитирование любой публикации не следует истолковывать как допущение того, что она является уровнем техники для настоящего изобретения.

После описания иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области очевидно, что можно проводить различные модификации описанных вариантов осуществления, и подразумевается, что такие модификации включены в объем настоящего изобретения.

Специалисты в данной области легко поймут, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для осуществления задач и получения упомянутых результатов и преимуществ, а также результатов и преимуществ, свойственных ему. Композиции и способы, описанные в настоящем документе, являются репрезентативными и не предназначены для ограничения объема изобретения. Специалисту в данной области очевидно, что можно проводить различные изменения и модификации изобретения, описанного в настоящем документе, без отклонения от объема и сущности изобретения.

Изобретение, иллюстративно описанное в настоящем документе, можно пригодным образом применять на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые не описаны конкретно в настоящем документе. Термины и выражения, которые использованы, используют для описания, а не для ограничения, и не подразумевается, что применение таких терминов и выражений исключает какие-либо эквиваленты представленных и описанных признаков или их части, однако признается, что возможны различные модификации в объеме заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что несмотря на то, что настоящее изобретение конкретно описано с помощью иллюстративных вариантов осуществления и необязательных признаков, специалисты в данной области могут прибегнуть к модификации и вариации идей, описанных в настоящем документе, и что такие модификации и вариации считают относящимися к объему этого изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение описано широко и обобщенно в настоящем документе. Каждый из более узких типов и субродовых групп, относящихся к общему описанию, также формируют часть изобретения. Это включает общее описание изобретения при условии или отрицательном ограничении, устраняющем какой-либо объект из рода, независимо о того, приведен или не приведен конкретно в настоящем документе удаленный материал.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новую сериновую протеазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. Также настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих протеазу, а также к клеткам-хозяевам, моющим композициям и корму для животных, содержащим предлагаемую сериновую протеазу. Изобретение позволяет расширить ассортимент ферментов, а именно сериновых протеаз, имеющих высокую ферментативную активность. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 8 ил., 16 табл., 13 пр.

Формула