Микрофлюидные способы и картриджи для разделения клеток - RU2017104900A
Код документа: RU2017104900A
Формула
1. Способ идентификации и предпочтительного выбора клеток, на поверхности которых экспонирован представляющий интерес белок, включающий:
(a) получение образца, содержащего указанные клетки;
(b) получение функционализированных магнитных гранул, содержащих одну или большее количество аффинных групп, и необязательно гранул-носителей, причем указанная(ые) аффинная(ые) группа(ы) адаптирована(ы) для связывания клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок;
(c) смешивание указанных клеток с указанными функционализированными магнитными гранулами и необязательно с указанными гранулами-носителями,
при этом указанная аффинная группа гранул связывает клетки, на поверхности которых экспонирован указанный белок, для получения магнитно-меченых клеток (ММК), содержащих магнитную метку,
(d) разделение, например, в ходе по меньшей мере одного этапа промывания, не меченых магнитными частицами клеток от указанных ММК, и
(e) идентификацию и предпочтительный выбор клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный представляющий интерес белок представляет собой маркерный белок или продукт трансгенной экспрессии (ТЕР).
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой рекомбинантные клетки, и указанный образец содержит указанные рекомбинантные клетки, которые были трансфицированы трансгеном, при этом указанный представляющий интерес белок представляет собой продукт трансгенной экспрессии (ТЕР); тем, что указанные ММК утрачивают магнитную метку через некоторый интервал времени после связывания с аффинной(ыми) группой(ами), и тем, что указанные ММК идентифицируют и предпочтительно отбирают на основании указанного интервала времени.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что на основании указанного интервала времени рекомбинантные клетки, секретирующие ТЕР, отделяют от рекомбинантных клеток, экспонирующих, однако не секретирующих, указанный ТЕР.
5. Способ по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что выбирают ММК, утрачивающие магнитную метку менее чем через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 часа после связывания, менее чем через 24, менее чем через 36, менее чем через 48, менее чем через 60, менее чем через 72, менее чем через 84 или менее чем через 96 часов после связывания.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный представляющий интерес белок представляет собой маркерный белок для идентификации стволовой клетки, в частности, раковой стволовой клетки или циркулирующей опухолевой клеткой.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная(ые) аффинная(ые) группа(ы) указанных магнитных гранул непосредственно связывает(ют) указанный белок.
8. Способ по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий обеспечение по меньшей мере одной соединяющей молекулы, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна соединяющая молекула связывает аффинную группу и белок, соединяя магнитные гранулы с указанным белком.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанная соединяющая молекула представляет собой антитело или его фрагмент, необязательно биотинилированный.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанные клетки смешивают при температуре, превышающей 20, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 градусов.
11. Способ по любому из пп. 1-10, предусматривающий смесь указанных функционализированных магнитных гранул (гранул для захвата) и гранул-носителей, отличающийся тем, что указанная смесь находится в реакционной камере.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает:
воздействие внешним магнитным полем с некоторой амплитудой и полярностью на указанную реакционную камеру, при этом в указанном внешнем магнитном поле смешиванию гранул для захвата и клеток, экспонирующих указанный белок, способствуют указанные гранулы-носители.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные гранулы для захвата представляют собой суперпарамагнитные гранулы, а указанные гранулы-носители представляют собой ферромагнитные гранулы.
14. Способ по п. 12 или 13, отличающийся тем, что соотношение гранул для захвата к гранулам-носителям составляет от 2:1 до 50:1, от 5:1 до 25:1, предпочтительно от 8:1 до 12:1 или приблизительно 10:1.
15. Способ по п. 12, дополнительно включающий изменение амплитуды и/или полярности для задания последовательных режимов функционирования, отличающийся тем, что указанное смешивание на этапе (с) осуществляют в режиме смешивания и указанное разделение на этапе (d) осуществляют в режиме разделения гранул.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой рекомбинантные клетки, и тем, что экспрессируемый на поверхности белок представляет собой ТЕР; при этом идентификацию согласно (е) осуществляют путем извлечения из реакционной камеры клеток, утрачивающих магнитные гранулы менее чем через 48 ч, предпочтительно менее чем через 36 или 24 ч после связывания.
17. Способ по п. 15 или 16, отличающийся тем, что в режиме смешивания и в режиме разделения гранул магнитное поле используют в режиме кругового или переменного поля с частотой 1-100 Гц и амплитудой 0,1-10000 мА, предпочтительно - 40-500 Гц и 200-500 мА.
18. Способ по пп. 15, 16 или 17, отличающийся тем, что продолжительность использования и режима смешивания, и/или режима разделения гранул составляет менее чем 60 секунд.
19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что интервал времени между смешиванием указанных клеток с указанными функционализированными магнитными гранулами и, необязательно, с указанными гранулами-носителями, и идентификацией и предпочтительным выборов клеток, на поверхности которых экспонирован указанный белок, составляет менее чем 1 час, менее чем 30 минут, менее чем 20 минут, менее чем 15 минут или менее чем 10 минут.
20. Картридж для отбора клеток на основании уровня экспонирования и необязательно секреции ими белка из популяции клеток, содержащей указанные клетки, экспонирующие и необязательно секретирующие указанный белок, содержащий:
a. микрофлюидные каналы,
b. реакционную камеру для смешивания магнитных гранул в суспензии, отличающуюся тем, что указанная реакционная камера содержит по меньшей мере один входной и по меньшей мере один выходной канал для введения текучей среды в указанную реакционную камеру и ее выведения из указанной реакционной камеры,
c. контейнер для образцов клеток, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,
d. по меньшей мере один контейнер для промывочного реагента, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,
e. контейнер для отходов, сообщающийся через текучую среду по выходному каналу с реакционной камерой,
при этом каждый контейнер, соответствующий пп. c.-d., также сообщается посредством одного из микрофлюидных каналов с вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха.
21. Картридж по п. 20, отличающийся тем, что указанный картридж дополнительно содержит контейнер для выделения, куда поступают магнитно-меченые клетки, предпочтительно магнитно-меченые рекомбинантные клетки из реакционной камеры.
22. Картридж по любому из пп. 20-21, дополнительно включающий по меньшей мере один второй входной и по меньшей мере один второй выходной канал, сообщающийся через текучую среду с указанной реакционной камерой, отличающийся тем, что указанный второй входной канал отходит от указанного по меньшей мере одного первого выходного канала, а указанный второй выходной канал отходит от указанного по меньшей мере одного первого входного канала, при этом указанный контейнер для выделения сообщается через текучую среду с реакционной камерой через второй входной канал, и указанный второй выходной канал соединен с дополнительным вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха.
23. Картридж по любому из пп. 20-22, отличающийся тем, что объем реакционной камеры составляет от 10 до 500 мл.
24. Картридж по любому из пп. 20-23, отличающийся тем, что указанный картридж является автономным и одноразовым.
25. Интегральная система для отбора клеток, на основании уровня экспонирования и необязательно секреции ими белка, из популяции клеток, содержащей указанные клетки, экспонирующие и необязательно секретирующие указанный белок, содержащая:
a. микрофлюидные каналы,
b. реакционную камеру для смешивания магнитных гранул в суспензии; при этом указанная реакционная камера содержит по меньшей мере первый входной и по меньшей мере второй выходной канал для введения текучей среды в указанную реакционную камеру и ее выведения из указанной реакционной камеры,
c. контейнер для образцов клеток, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,
d. по меньшей мере один контейнер для промывочного реагента, сообщающийся через текучую среду по входному каналу с реакционной камерой,
e. контейнер для отходов, сообщающийся через текучую среду по выходному каналу с реакционной камерой, причем каждый контейнер, соответствующий пп. c.-d., также сообщается посредством одного из микрофлюидных каналов с вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха;
f. одно или большее количество устройств, создающих контролируемое магнитное поле (устройства для создания магнитного поля = УМП), в частности, один или большее количество электромагнитов, расположенных вокруг реакционной камеры или у реакционной камеры;
g. оборудование для обработки данных, выполненное с возможностью корректировки магнитного поля, создаваемого указанными УМП в реакционной камере, путем коррекции частоты и/или амплитуды, причем каждая корректировка частоты и/или амплитуды задает режим функционирования в реакционной камере.
26. Система по п. 25, отличающаяся тем, что указанное оборудование для обработки данных выполнено с возможностью задания последовательности указанных режимов функционирования, включающей режим смешивания, режим захвата, режим иммобилизации, режим разделения гранул и режим выделения.
27. Система по п. 26, отличающаяся тем, что указанное оборудование для обработки данных адаптировано для установки следующих режимов функционирования УМП:
- в режиме кругового или переменного поля с частотой 1-1000 Гц, предпочтительно 40-500 Гц, и с амплитудой 0,1-10000 мА, предпочтительно 200-500 мА, во время использования режима смешивания и режима разделения гранул;
- в режиме кругового или переменного поля с показателями частоты и амплитуды ниже показателей для режима смешивания, например, с частотой 0,5-40 Гц и с амплитудой 300-600 мА, во время использования режима захвата;
- с частотой 0 Гц и амплитудой, например, 300-600 мА, во время использования режима иммобилизации; и
- с повышенной относительно режима иммобилизации частотой, например, 40-500 Гц, и пониженной амплитудой, например, 30-300 мА, во время использования режима выделения.
28. Система по любому из пп. 25-27, отличающаяся тем, что реакционная камера содержит смесь гранул-носителей и гранул для захвата.
29. Система по любому из пп. 25-28, отличающаяся тем, что указанная система дополнительно содержит контейнер для выделения, куда поступают магнитно-меченые клетки, предпочтительно магнитно-меченые рекомбинантные клетки из реакционной камеры.
30. Система по любому из пп. 25-29, дополнительно включающая по меньшей мере один второй входной и по меньшей мере один второй выходной канал, сообщающийся через текучую среду с указанной реакционной камерой, отличающийся тем, что указанный второй входной канал отходит от указанного по меньшей мере одного первого выходного канала, а указанный второй выходной канал отходит от указанного по меньшей мере одного первого входного канала, при этом указанный контейнер для выделения сообщается через текучую среду с реакционной камерой через второй входной канал, и указанный второй выходной канал соединен с дополнительным вентиляционным отверстием, содержащим элемент для фильтрации воздуха.
31. Система по п. 30, отличающаяся тем, что указанное воздуховодное отверстие контейнера для выделения соединено с насосом для выделения указанных магнитно-меченых клеток в реакционной камере путем прокачивания воздуха через вентиляционное отверстие контейнера для выделения, таким образом, что содержимое реакционной камеры перекачивают в контейнер для выделения через входной канал.
32. Система по любому из пп. 25-31, отличающаяся тем, что объем реакционной камеры составляет от 10 до 500 мл.
33. Система по любому из пп. 25-32, отличающаяся тем, что указанная система является автономной и одноразовой.
34. Набор, содержащий в одном контейнере картридж по пп. 20-24, отличающийся тем, что гранулы для захвата и гранулы-носители находятся в реакционной камере или помещены в дополнительный контейнер, и в отдельном контейнере - инструкции по применению гранул для захвата и гранул-носителей в картридже.
35. Набор по п. 34, отличающийся тем, что указанные гранулы для захвата представляют собой суперпарамагнитные гранулы, а указанные гранулы-носители представляют собой ферромагнитные гранулы, при этом соотношение суперпарамагнитных гранул и ферромагнитных гранул составляет от 2:1 до 50:1.
36. Клетки, идентифицированные и предпочтительно отбираемые в соответствии со способом по любому из пп. 1-19.
37. Выделенная популяция клеток, содержащая предпочтительно рекомбинантные клетки, секретирующие продукт трансгенной экспрессии на уровне, составляющем более чем 20, 40, 60, 80 pcd, отличающаяся тем, что указанная выделенная популяция клеток содержит не более чем 40% исходной популяции клеток, из которой указанные клетки были выделены.
38. Выделенная популяция рекомбинантных клеток, отличающаяся тем, что указанный секретируемый трансген представляет собой терапевтический белок.
