Способы увеличения выработки или активности каталазы - RU2586910C2

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

В основном изобретение имеет отношение к способам увеличения выработки или активности каталазы и, в частности, к способам использования витамина D для увеличения выработки или активности каталазы у животных.

Уровень техники

Каталаза представляет собой обычный фермент, обнаруженный почти у всех живых организмов, подвергающихся действию кислорода. Каталаза катализирует расщепление перекиси водорода до воды и кислорода. В основном каталаза является универсальной у животных и растений, а также найдена у многих грибов и некоторых микроорганизмов.

У животных и многих других организмов окислительный стресс вызывается нарушением равновесия между выработкой реакционноспособного (активного) кислорода и способностью биологических систем полностью нейтрализовать химически активные промежуточные соединения или легко восстанавливать полученное повреждение. Окислительное повреждение клеток связано со старением и большим набором клинических расстройств, включая ишемически-реперфузионное повреждение, нейродегенеративные болезни, диабет, воспалительные заболевания, такие как атеросклероз, артрит, гепатит, токсичность, вызванную лекарственными препаратами, и рак.

Активные формы кислорода (ROS), включая анион супероксидного радикала и перекись водорода, вырабатываются эндогенно в ответ на цитокины, факторы роста, рецепторы, сопряженные с G-белком, физический стресс или стресс, вызванный условиями внешней среды. ROS функционируют как сигнальные молекулы, опосредующие различные биологические ответы. Тем не менее, избыток ROS способствует различным описанным выше патофизиологическим процессам. Для сведения к минимуму вредных воздействий избытка ROS у аэробных организмов развились разные линии антиоксидантной защиты. Одна линия защиты является ферментативной, включающей каталазы, пероксиды, супероксиддисмутазы и глутатион-S-трансферазу, в числе прочего. Например, супероксиддисмутазы (SOD), каталазы и перекиси защищают клетки путем прямого захватывания супероксидных радикалов и перекиси водорода и превращения их в менее реакционноспособные виды. Супероксиддисмутазы (SOD) катализируют дисмутацию аниона супероксида

Таким образом, каталазы являются повсеместно распространенными и важными ферментативными компонентами системы детоксификации ROS, присутствующими в аэробных организмах. У млекопитающих дефицит каталазы связан с пониженной способностью детоксифицировать ROS в различных клетках и тканях, приводящей к или связанной с целым рядом пагубных для здоровья состояний, включая преждевременное старение (и старение вообще; см., например, Harman D., 2009, Biogerontology 10: 773-781), диабет, сердечно-сосудистые заболевания, болезнь почек, образование опухолей, бесплодие и поседение волос. По поводу последнего недавно было установлено, что накопление перекиси водорода и практически отсутствие каталазы в стержнях волос при старении связано с потерей пигмента волос (Wood JM et al., 2009, Faseb J. 23: 2065-2075). Согласно недавним научным исследованиям низкие уровни каталазы могут играть роль в процессе поседения волос у человека. Перекись водорода вырабатывается в организме естественным путем, а каталаза разрушает ее. Если происходит падение уровней каталазы, перекись водорода не может разрушаться. Это является причиной того, что перекись водорода отбеливает волосы изнутри. Ученые полагают, что это открытие когда-нибудь будет включено в методы лечения стареющих волос от поседения.

На основании вышеизложенного понятно, что разработка способов и композиций, предназначенных для увеличения выработки или активности каталазы у животных или других организмов, стала бы продвижением вперед в данной области техники.

Сущность изобретения

Следовательно, задача настоящего изобретения - обеспечить способы увеличения выработки или активности каталазы у животных.

Другая задача изобретения - обеспечить способы повышения экспрессии генов каталазы у животных.

Дополнительная задача изобретения - обеспечить способы установления средств или режимов, повышающих выработку или активность каталазы у животных, включая выявление миметиков витамина D, пригодных для увеличения выработки или активности каталазы у животных, например, путем повышения экспрессии генов каталазы у животных.

Другая задача настоящего изобретения - обеспечить способы продления лучших лет жизни животного.

Еще одна задача настоящего изобретения - обеспечить способы оказания содействия здоровью или оздоровлению животных.

Другая задача настоящего изобретения - обеспечить способы улучшения качества жизни животных.

Дополнительная задача настоящего изобретения - обеспечить способы установления средств или режимов, увеличивающих выработку или активность каталазы в клетках.

Одна или более из этих или других задач достигаются при использовании новых способов и композиций, предназначенных для увеличения выработки или активности каталазы у животного. Данные способы включают введение витамина D животному в количестве, эффективном для увеличения выработки или активности каталазы. Также обеспечиваются способы, использующие введение витамина D для лечения дефицита каталазы у животного, для продления лучшего времени жизни животного, для оказания содействия здоровью и оздоровлению и для улучшения качества жизни животного. Другие способы используют профили экспрессии генов каталазы и других генов, которые кодируют белки, участвующие в антиокислительных ответах, для отбора веществ, модулирующих эти профили способом, сходным с витамином D, т.е. путем увеличения экспрессии генов, кодирующих каталазу. Также предоставляются различные наборы, содержащие комбинации реагентов, ингредиенты зондов, приспособления, использующие зонды, и вещества, а также средства коммуникации для сообщения информации, имеющей отношение к способам данного изобретения.

Другие и дополнительные задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники.

Определения

Термин "животное" означает любое животное или другой организм (например, грибы), который может получить пользу от увеличения выработки или активности каталазы, включая человека и животных семейств птичьих, бычьих, собачьих, лошадиных, кошачьих, козлиных, волчьих, мышиных, овечьих или свиных.

Термин "каталаза" подразумевает включительно ферменты по номенклатуре IUBMB Европейского сообщества 1.11.1.6, катализирующие реакцию 2 H₂O₂=O₂+2H₂O. Другое название(я) каталазы включает: эквилаза, капераза, оптидаза, каталаза-пероксидаза и CAT. Каталаза также может функционировать как пероксидаза (ЕС 1.11.1.7 пероксидаза), для которой донорами водорода могут служить некоторые органические вещества, в частности этанол. Типичная каталаза представляет собой тетрамер из четырех полипептидных цепей, содержащий четыре порфириновые гемовые (содержащие железо) группы, позволяющие ферменту вступать в реакцию с перекисью водорода.

Термин "животные-компаньоны" означает одомашненных животных, таких как собаки, кошки, птицы, кролики, морские свинки, хорьки, хомяки, мыши, песчанки, прогулочные лошади, коровы, козы, овцы, ослы, свиньи и более экзотические виды животных, находящиеся на содержании у людей для компании, увеселения, психологической поддержки, общения и всех других действий, которые люди разделяют с животными других видов.

Термин "диетическая добавка" означает продукт, предназначенный для потребления в дополнение к обычной диете животного. Диетические добавки могут иметь любую форму, например, твердую, жидкую, форму геля, таблеток, капсул, порошка и т.п. Предпочтительно они предоставляются в удобных дозированных формах. В некоторых вариантах осуществления они предоставляются в упаковках для крупных потребителей, например, нерасфасованные порошки или жидкости. В других вариантах осуществления добавки предоставляются в больших количествах с целью включения в другие пищевые продукты, такие как закуски, лакомства, питательные батончики, напитки и т.п.

Термин "продление лучшего времени жизни" означает продление числа лет, во время которых животное остается здоровым, а не просто увеличение числа прожитых лет, например животное может быть здоровым в лучшие годы своей жизни в течение относительно более длинного периода времени. Таким образом, "лучшие годы" жизни животного могут тянуться от периода полового созревания в молодости ("молодой", как описано ниже) до перехода в старейшую или "старческую" популяцию. В самом деле, лучшие годы жизни животного могут продолжаться фактически до смерти животного, исходя из того, что животное является здоровым и активным до старческих лет.

Термин "питание (пища)" или "пищевая композиция" означает композицию, предназначенную для потребления животным, включая человека. "Полный и сбалансированный с точки зрения питания корм для домашних животных" содержит все известные необходимые питательные вещества для предполагаемого реципиента или потребителя пищи, в соответствующих количествах и пропорциях, например, на основе рекомендаций признанных авторитетов в области питания животных-компаньонов. Следовательно, такое питание может служить единственным источником рациона питания для поддержания жизни или оказания содействия продуцированию без добавления дополнительных источников питания. Питательно сбалансированные пищевые композиции для домашних животных общеизвестны и широко используются в данной области техники.

Термин "ген" или "гены" означает полный или частичный сегмент ДНК, участвующий в продуцировании полипептида, включая участки, предшествующие и следующие за кодирующим участком (лидерную и трейлерную последовательности), и встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзоны). Термин включает любую последовательность ДНК, которая гибридизируется с комплементарными последовательностями кодирующих генов.

Термин "здоровье и/или оздоровление животного" означает полное физическое, психическое и социальное здоровье животного, а не просто отсутствие болезни или слабости.

Термин "совместно" означает, что лекарственное средство, питание или другое вещество вводится животному (1) вместе в композиции, в частности, пищевой композиции, или (2) отдельно с той же самой или другой частотой при использовании одинаковых или разных способов введения примерно в то же самое время или периодически. "Периодически" означает, что вещество вводится по схеме, подходящей для конкретного вещества. Как правило, "примерно в то же самое время" означает, что вещество (питание или лекарственное средство) вводится в то же самое время или в пределах около 72 часов друг от друга. В частности, "совместно" включает схемы введения, при которых вещества, например лекарственные средства, вводятся в течение предписанного периода, а композиции настоящего изобретения вводятся в течение неопределенного времени.

Термин "индивидуум" в отношении животного означает отдельное животное любого вида или рода.

Термин "длительное" введение означает периоды свыше одного месяца. Периоды длиннее, чем два, три или четыре месяца включаются. Также включаются более длительные периоды, включая более чем 5, 6, 7, 8, 9 или 10 месяцев. Периоды свыше 11 месяцев или 1 года также включаются. Длительное применение, продолжающееся в течение 1, 2, 3 лет или более, также рассматривается в описании. В случае определенных животных, предполагается, что животному вводятся вещества, установленные с помощью настоящих способов, на регулярной основе. При использовании в описании "регулярная основа" относится, по меньшей мере, к еженедельному введению. Рассматривается также более частое введение, такое как два или три раза в неделю. Кроме того, включаются режимы, содержащие, по меньшей мере, одно, два, три или более ежедневных введений. Любая частота дозирования, вне зависимости от того, приведена ли она в виде примера в описании, считается подходящей. Специалисту понятно, что частота дозирования будет зависеть от вещества, которое вводится, причем некоторые композиции могут требовать большей или меньшей частоты введения для поддержания желательных биохимических, физиологических эффектов или воздействий на экспрессию генов, а именно включая одно или более воздействий на потребление пищи, насыщение, липидный обмен и утилизацию жира, и профиль экспрессии генов, связанный с этим. Термин "длительная регулярная основа" при использовании в описании относится к длительному регулярному введению вещества.

Термин "пероральное введение" означает, что животное потребляет (проглатывает), или человеку предписывается поедать, или человек поедает, одно или более из веществ, описанных здесь. Термин "потребление (пероральное поступление)" используется в описании взаимозаменяемо с термином "пероральное введение", при котором человеку предписывается перорально вводить или поедать вещество; такое указание может инструктировать и/или информировать человека о том, что применение вещества может и/или будет обеспечивать упомянутое преимущество. Такое указание может быть устным указанием (например, устной инструкцией, полученной от врача, ветеринара или другого медицинского сотрудника, или полученной через радио или телевидение (т.е. в виде рекламы)), или письменным указанием (например, письменным указанием от врача, ветеринара или другого медицинского сотрудника, таким как рецепты), профессиональными продажами или мероприятиями (например, распространением брошюр, инструкций или других информативных приспособлений), письменными средствами распространения информации (например, интернетом, электронной почтой или другими, связанными с компьютером средствами распространения информации) и/или указанием на упаковке вещества.

Термин "образец" означает любую ткань или жидкость животного, содержащую, например, полинуклеотиды, полипептиды, антитела, метаболиты и тому подобное, включая клетки и другие ткани, содержащие ДНК и РНК. Примеры включают жировую ткань, кровь, хрящ, соединительную, эпителиальную, лимфоидную, мышечную, нервную ткань, мокроту и т.п. Образец может быть твердым или жидким и может быть ДНК, РНК, кДНК, жидкостями организма, такими как кровь или моча, клетками, препаратами клеток или растворимыми фракциями или аликвотами их сред, хромосомами, органеллами и т.п.

Термин "единая упаковка" означает, что компоненты набора физически соединены в один или с одним или более контейнерами и считаются единицей при производстве, распространении, продаже или применении. Контейнеры включают, но не ограничиваются этим, мешки, коробки, бутылки, упаковки в целлофановой оболочке, скрепленные скобками или иным образом прикрепленные компоненты или комбинации этого. Единая упаковка может представлять собой контейнеры с отдельными пищевыми композициями, физически связанные так, что они считаются единицей при производстве, распространении, продаже или применении.

Термин "местное введение" при использовании в описании означает введение или нанесение композиции на волосы, мех, ногти, когти, кожу, слизистую оболочку, глаза, в дыхательные пути, легкие или на любую другую эпителиальную поверхность.

Термин "витамин D" означает витамин D и любую из его природных или синтетических форм, производных или аналогов, функционирующих подобно витамину D и оказывающих влияние на выработку или активность каталазы у животных. В качестве справки, витамин D может быть получен из пищи или может синтезироваться в организме. Диетический витамин D является доступным в двух формах: витамина D2 (эргокальциферол) из растительных источников и витамина D3 (холекальциферол) из животных источников, обе формы вместе называются витамином D. Витамин D в форме витамина D3 может синтезироваться из 7-дегидрохолестерола (7-DHC) в коже под воздействием ультрафиолетового излучения, в основном света в УФВ-области спектра. Витамин D представляет собой прогормон, превращающийся в конце концов в активную форму 1α,25-дигидроксивитамин D₃ (1,25(OH)₂D₃), известный также как кальцитриол. Таким образом, при использовании в описании термин "витамин D" включает формы витамина D (например, витамин D₂, витамин D₃), которые вырабатываются организмами и могут превращаться с помощью природных или синтетических веществ в биологически активную форму, кальцитриол. Термин также включает синтетические и природные аналоги, которые воспроизводят, по меньшей мере, одну биологическую функцию кальцитриола. В дополнение к стимулированию выработки или активности каталазы, варианты биологической активности кальцитриола и/или его предшественников включают, но не ограничиваются этим, соединение с белком, связывающим витамин D (предшественники), связывание с рецепторами витамина D (кальцитриол) и последующую передачу сигнала, и стимулирование абсорбции кальция.

Термин "виртуальная упаковка" означает, что компоненты набора связаны указаниями в отношении одного или более физических или виртуальных компонентов набора, которые инструктируют потребителя, как получить другие компоненты, например, в пакете, содержащем один компонент, и указаниями, инструктирующими потребителя обратиться к веб-сайту, прослушать записанное сообщение, просмотреть визуальное сообщение или войти в контакт с человеком, осуществляющим уход, или инструктором с целью получить информацию о том, как использовать набор.

"Молодой" в основном относится к индивидууму в молодом зрелом состоянии, т.е. состоянии после наступления половой зрелости или подросткового возраста, что определяется видом или штаммом, породой или этнической группой внутри вида в соответствии с известными параметрами. "Пожилой" или "старый" при использовании в описании относится к индивидууму, который физически или хронологически находится в пределах последних 30% его ожидаемой средней продолжительности жизни, что определяется видом или штаммом, породой или этнической группой внутри вида в соответствии с известными параметрами.

Пределы используются в описании в сокращенном виде для того, чтобы избежать перечисления и описания всех без исключения значений внутри предела. Любое подходящее значение внутри предела может быть выбрано, по необходимости, в качестве верхнего значения, нижнего значения или конечной точки предела.

При использовании в описании форма единственного числа слова включает форму множественного числа и наоборот, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, упоминания терминов в единственном числе включают множественные числа соответствующих терминов. Например, упоминание "соединения" или "способа" включает множество таких "соединений" или "способов." Подобно этому, слова "содержать", "содержит" и "содержащий" следует истолковывать включительно, а не исключительно. Аналогично этому, термины "включать", "включая" и "или" следует истолковывать как включающие, кроме тех случаев, когда такое истолкование явно не противоречит контексту.

Термины "содержащий" или "включающий" имеют целью включать варианты осуществления, охваченные терминами "состоящий в основном из" и «состоящий из». Подобным образом, термин "состоящий в основном из" имеет целью включать варианты осуществления, охваченные термином "состоящий из".

Все представленные в описании процентные отношения являются процентными отношениями по массе композиции в расчете на сухую массу, кроме тех случаев, когда специально не установлено иное. Специалисту в данной области понятно, что термин "в расчете на сухую массу" означает, что концентрация ингредиентов в композиции измеряется после того, как любая свободная влага удалена из композиции.

Способы, композиции и другие достижения, раскрытые здесь, не ограничиваются отдельной методологией, протоколами и реагентами, раскрытыми в описании, потому что, как понятно специалисту в данной области, они могут изменяться. Более того, использованная в описании терминология предназначается только для описания конкретных вариантов осуществления, и не имеет целью ограничить и не ограничивает рамки того, что раскрывается или заявляется.

Если не указано иное, все технические и научные термины, термины данной области техники и сокращения, использованные в описании, имеют значения, обычно понятные среднему специалисту в области(ях) техники изобретения, или в области(ях), где используется термин. Хотя при применении на практике настоящего изобретения могут использоваться любые композиции, способы, изделия производства или другие средства или материалы, подобные или равноценные описанным здесь, предпочтительные композиции, способы, изделия производства или другие средства или материалы представлены в описании.

Все патенты, патентные заявки, публикации, технические и/или научные статьи, и другие ссылки, цитированные или упомянутые в описании, полностью включаются в описание путем отсылки в установленных законом случаях. Обсуждение этих ссылок предназначается только для обобщения утверждений, сделанных в описании. Не делается допущение, что любые такие патенты, патентные заявки, публикации, ссылки или любая их часть являются релевантными, существенными или предшествующего уровня техники. Право оспаривать точность и уместность любого притязания таких патентов, патентных заявок, публикаций и других ссылок как релевантных, существенных или предшествующего уровня техники сохраняется.

Раскрытие изобретения

В одном аспекте изобретение предоставляет способы увеличения выработки или активности каталазы у животных. Данные способы включают идентификацию (установление) животного, нуждающегося в этом, или такого животного, которое получит пользу от увеличения выработки или активности каталазы, и введение животному количества витамина D, увеличивающего выработку или активность каталазы. Изобретение отчасти основано на обнаружении того, что витамин D увеличивает выработку или активность каталазы и вызывает повышение экспрессии генов, связанных с выработкой каталазы у животных, при введении в надлежащих количествах. В частности, как подробно описано в примерах, кальцитриол и некоторые аналоги витамина D увеличивают выработку каталазы, увеличивают активность каталазы и вызывают повышение экспрессии генов, кодирующих каталазу.

Животное может быть любым животным, которое может получить пользу от увеличения выработки или активности каталазы, например, любым аэробным животным, которое дышит воздухом или живет в окружающей среде, содержащей кислород. Например, животное может быть человеком или домашним животным. Конкретнее, животное может быть животным-компаньоном, таким как животное семейства собачьих или кошачьих, включая собак или кошек.

Первый этап способа включает идентификацию животного, нуждающегося в этом, или такого животного, которое может получить пользу от увеличения выработки или активности каталазы. Например, такое животное может быть стареющим животным, животным, у которого имеется дефицит каталазы, или животным, страдающим от болезни или состояния, связанного с дефицитом каталазы, например, акаталазии, гепатомы и тому подобного. Альтернативно, животное может быть здоровым животным, для которого увеличение выработки или активности каталазы может содействовать здоровью или оздоровлению животного, продлить лучшие годы жизни животного или улучшить качество жизни животного.

Витамин D, подходящий для данного способа, представляет собой любой витамин D, увеличивающий выработку или активность каталазы у животного. В одном варианте осуществления витамин D представляет собой кальцитриол (1α,25-дигидроксивитамин D₃). В другом варианте осуществления витамин D представляет собой аналог сеокальцитол (ЕВ 1089, 1α,25-дигидрокси-22,24-диен-24,26,27-тригомовитамин D). В другом варианте осуществления витамин D представляет собой 1α,25-дигидрокси-16-ен-23-ин-витамин D₃ (аналог V). Другие подходящие формы витамина D включают, но не ограничиваются этим, витамин D₃, 25(ОН) витамин D₃, 24,25 (OH)₂ витамин D₃, парикальцитол (синтетический аналог биологически активного витамина D, кальцитриола, в структуре которого имеются модификации в боковой цепи (D₂) и в кольце А (19-нор)), 1,25-дигидрокси-16,23Z-диен-26,27-гексафтор-D₃, 1,25-дигидрокси-16,23Е-диен-26,27-гексафтор-19-нор-D₃, 22-окса-кальцитриол, 1α-(OH)D₅, 20-эпи-1α,25(OH)₂D₃, кальципотриол, 1α24(S)(OH)₂D₂, 1α,24(R)(OH)₃D₃ и KH1060. Комбинации из двух или более любых форм витамина D также включаются в изобретение. В некоторых вариантах осуществления используются формы или аналоги витамина D, обладающие селективной биологической активностью кальцитриола, но у которых уменьшены или утрачены другие виды биологической активности кальцитриола. Например, формы или аналоги витамина D, которые связываются с рецепторами витамина D, но не стимулируют абсорбцию кальция, могут быть пригодны для применения в разных вариантах осуществления изобретения.

Количество витамина D, необходимое для увеличения выработки или активности каталазы у животного будет варьировать в зависимости от формы витамина D, вида животного, биологического состояния животного, ткани(ей), подвергающейся лечению, и других параметров, хорошо понятных квалифицированному специалисту, например, специалисту по медицинской химии или биологу. Дозировка примерно от 1 нанограмма на килограмм (нг/кг) веса тела примерно до 10 миллиграмм на килограмм (мг/кг) веса тела является подходящей в большинстве случаев, предпочтительно примерно от 10 нг/кг веса тела до 5 мг/кг веса тела, более предпочтительно примерно от 100 нг/кг веса тела до 5 мг/кг веса тела, наиболее предпочтительно примерно от 1 микрограмма на килограмм (мкг/кг) веса тела до 1 мг/кг веса тела. В различных вариантах осуществления витамин D вводится в количествах около 1, 10, 50,100, 250 и 500 нг/кг веса тела; около 1, 10, 50, 100, 250, и 500 мкг/кг веса тела; или около 1, 2, 4, 6, 8, и 10 мг/кг веса тела. Когда полезно, витамин D вводится в количествах больше, чем 10 мг/кг веса тела. Перевод этих диапазонов доз в международные единицы (IU) можно осуществить с помощью формулы 40 IU = 1 мкг витамина D. Дозы также можно вычислить, исходя из концентрации витамина D, которая должна доставляться к намеченным клеткам или тканям. Подходящие концентрации включают, по меньшей мере, около 10^-15М, или, по меньшей мере, около 10^-14М, или, по меньшей мере, около 10^-13М, или, по меньшей мере, около 10^-12М, или, по меньшей мере, около 10^-11М, или, по меньшей мере, около 10^-10М, или, по меньшей мере, около 10^-9 М, или, по меньшей мере, около 10^-8 М, или, по меньшей мере, около 10^-7М, или, по меньшей мере, около 10^-6М, или, по меньшей мере, около 10^-5М витамина D, делая его доступным для поглощения намеченными клетками.

В одном варианте осуществления витамин D вводится перорально, например, в составе композиции, созданной для перорального введения животному, такой как таблетка, напиток, лекарство или пищевая композиция. Введение согласно способам может осуществляться по необходимости или по желанию с различной или регулярной частотой. Целью регулярного потребления является предоставление животному постоянной и соответствующей дозы композиции или прямых или непрямых метаболитов, являющихся результатом такого потребления. Такое регулярное и последовательное дозирование направлено на создание постоянных уровней компонентов композиций или их прямых или непрямых метаболитов в крови. Таким образом, регулярное введение может осуществляться один раз в месяц, один раз в неделю, один раз в день или более чем один раз в день. Подобным образом, введение может осуществляться через день, неделю или месяц, каждый третий день, неделю или месяц, каждый четвертый день, неделю или месяц и т.п. Введение может осуществляться несколько раз в день. При использовании в качестве добавки к обычным диетическим потребностям композиция может непосредственно вводиться животному. Альтернативно, композиции могут быть связаны или смешаны с ежедневным кормом или пищей, включая жидкость, такую как питьевая вода, или могут быть введены внутривенно с лекарством, в том случае, если животное получает такое лечение. Введение при использовании в качестве ежедневного корма или пищи хорошо известно специалистам в данной области техники.

Кроме того, введение может осуществляться как часть режима питания животного. Например, режим питания может включать регулярное потребление животным витамина D или композиции витамина D, описанной здесь, в количестве, эффективном для увеличения выработки или активности каталазы у животного.

Согласно способам изобретения введение витамина D, включая введение как части режима питания, может охватывать период времени от рождения вплоть до взрослой жизни животного. В некоторых вариантах осуществления животное является молодым или растущим животным. В других вариантах осуществления животное является взрослым или зрелым животным. В других вариантах осуществления животное является стареющим животным. В частности, подходящим является животное, достигшее примерно 35% предполагаемой продолжительности его жизни. В некоторых вариантах осуществления введение начинается, например, на регулярной или длительной регулярной основе, когда животное достигло более, чем 30%, 40% или 50% предполагаемой или прогнозируемой продолжительности его жизни. В некоторых вариантах осуществления животное достигает 40, 45 или 50% предполагаемой продолжительности его жизни. В других вариантах осуществления животное является пожилым, достигшим 60, 66, 70, 75 или 80% вероятной продолжительности его жизни. Определение продолжительности жизни может быть основано на актуарных таблицах, вычислениях, оценках или т.п., и может учитывать прошлые, настоящие или будущие воздействия или факторы, которые, как известно, положительно или отрицательно влияют на продолжительность жизни. На продолжительность жизни также может оказывать влияние вид, пол, размер, генетические факторы, факторы окружающей среды и стрессогенные факторы, настоящее и прошлое состояние здоровья, прошлый и настоящий пищевой статус и тому подобное, что может учитываться при определении продолжительности жизни.

В различных вариантах осуществления способов витамин D вводится в состав пищевой композиции, такой как пищевая композиция для людей, корм для домашних животных или диетическая добавка. Например, композиция может быть пищевой композицией, дополнительно содержащей примерно от 15% до 50% белка, примерно от 5% до 40% жира, примерно от 5% до 10% зольных веществ и имеющей содержание влаги примерно от 5% до 20%. Как более подробно описано ниже, композиция может содержать дополнительные ингредиенты, включая витамины, минералы, пробиотики, пребиотики, или их комбинации. В описанных здесь способах также могут использоваться фармацевтические или нутрицевтические композиции, созданные для введения любым выбранным способом, как более подробно описано ниже.

В других вариантах осуществления витамин D вводится совместно с одним или более пробиотиками, пребиотиками или их комбинациями с целью принести пользу животным, например, для лечения дефицита каталазы у животного, продления лучших лет жизни животного, оказания содействия здоровью и оздоровлению животного или улучшения качества жизни животного.

В других вариантах осуществления способов выработка или активность каталазы увеличивается в намеченных эпителиальных клетках и тканях посредством местного введения витамина D, предпочтительно в композиции, содержащей витамин D. Клетки и ткани, на которые можно нацелиться таким способом, включают кожу, волосы, мех, ногти, когти, оральную, анальную и вагинальную слизистую оболочку, слизистую оболочку/эпителий желудочно-кишечного тракта, поверхность глаза, поверхности, относящиеся к области отоларингологии (поверхности уха, глотки, гортани и носа) и поверхность дыхательных путей, включая поверхность бронхов и легочных альвеол. Такие способы могут использоваться для восполнения дефицита каталазы в тех клетках и тканях, в которых обострение повреждения вызывается накоплением перекиси водорода. Например, местное нанесение витамина D на волосы и кожу головы может уменьшить или предотвратить поседение волос, являющееся результатом накопления перекиси водорода и дефицита каталазы в ткани, связанной с ростом волос.

В любом из способов витамин D может вводиться в сочетании с одним или более дополнительными средствами, подходящими для увеличения выработки или активности каталазы, или для уменьшения или устранения активных форм кислорода у животного. Например, дополнительное средство(а) может быть введено до, во время или после введения витамина D. Если дополнительные средства вводятся вместе с витамином D, они могут вводиться вместе или отдельно, например, в единой композиции или в отдельных композициях.

В одном варианте осуществления дополнительные средства представляют собой один или более антиоксидантов. Антиоксиданты могут быть любыми антиоксидантами, пригодными для введения животному. Антиоксиданты хорошо известны в данной области техники, в частности в области технологии пищевых продуктов и разработки пищевых композиций. Природные антиокислительные соединения включают витамины (такие как витамины A, C и E, и их производные, конъюгаты или аналоги), а также растительные экстракты, включая экстракты из фруктов, овощей, трав, семян и других типов и/или частей растений. Известно, что такие соединения как α-липоевая кислота, хлорофилл и его производные, глутатион, убихинолы (например, коэнзим Q10), каротиноиды (например, ликопен), флавоноиды, фенольные кислоты, полифенолы и пикногенол являются отличными антиоксидантами. Некоторые примеры растительных источников антиоксидантов включают источники из фруктов, таких как ягоды (вишня, ежевика, клубника, малина, вороника, голубика, черника, брусника, черная смородина), гранат, виноград, слива, апельсин, ананас, киви, грейпфрут; из овощей, включая капусту, чилийский перец, краснокачанную капусту, перец, петрушку, артишок, брюссельскую капусту, шпинат, лимон, имбирь, чеснок, свеклу; из сухофруктов, таких как абрикосы, чернослив и финики; из бобовых растений, включая кормовые бобы, фасоль и сою, а также орехи и семена, такие как орех-пекан, грецкий орех, фундук, арахис и семена подсолнечника; зерновые злаки, такие как ячмень, просо, овес и кукуруза. Кроме того, многие природные антиоксиданты доступны из целого ряда видов растений, включая гвоздику, корицу, розмарин и душицу. Менее широко известные источники антиоксидантов включают гинкго билоба и тропические растения, такие как юкка и папайя. В последнее время большой интерес вызывают антиокислительные свойства чая и зеленого чая, а также ферментированных продуктов, таких как красное вино, все это подходит для использования в изобретении. Отличной «ловушкой» кислорода является селен, который хорошо «работает», в частности с витамином Е или родственными соединениями токоферола. Синтетические пищевые антиоксиданты включают бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), которые обычно используются в пищевых продуктах. Любое из вышеперечисленного, отдельно или в комбинации, годится для использования здесь, равно как и комбинации природных и синтетических антиоксидантов. В одном варианте осуществления антиоксиданты содержат астаксантин, отдельно или в комбинации с другими антиоксидантами.

В другом аспекте изобретение предоставляет способ предотвращения или лечения болезни или состояния, вызванного дефицитом каталазы у животных. Этот способ включает (1) установление, что у животного имеется или возможно имеется дефицит каталазы, и (2) введение витамина D животному в количестве, эффективном для увеличения выработки или активности каталазы у животного, благодаря чему предотвращается или излечивается болезнь или состояние. Состояние является любым состоянием, вызванным дефицитом каталазы, например, акаталазией или гепатомой.

В другом аспекте изобретение предоставляет способ продления лучших лет жизни животного. Способ включает (1) установление животного, находящегося в периоде лучших лет его жизни, или для которого желательно продление лучших лет его жизни; (2) установление, что увеличение выработки или активности каталазы у животного может продлить лучшие годы жизни животного; и (3) введение витамина D животному в количестве, эффективном для увеличения выработки или активности каталазы у животного, благодаря чему продлеваются лучшие годы жизни животного.

В другом аспекте изобретение предоставляет способ оказания содействия здоровью и оздоровлению животного. Способ включает (1) установление животного, чье здоровье или самочувствие будет улучшаться при увеличении выработки или активности каталазы и (2) введение витамина D животному в количестве, эффективном для увеличения выработки или активности каталазы у животного, благодаря чему оказывается содействие здоровью или оздоровлению животного.

В другом аспекте изобретение предоставляет способ улучшения качества жизни животного. Способ включает (1) установление животного, чье качество жизни будет улучшено при увеличении выработки или активности каталазы и (2) введение витамина D животному в количестве, эффективном для увеличения выработки или активности каталазы у животного, благодаря чему увеличивается качество жизни животного.

В другом аспекте изобретение предоставляет композиции, подходящие для увеличения выработки или активности каталазы у животного. Эти композиции содержат витамин D и, по меньшей мере, одно дополнительное средство для увеличения выработки или активности каталазы, или для уменьшения или устранения активных форм кислорода у животного.

Витамин D в композиции является любым витамином D, увеличивающим выработку или активность каталазы у животного. В одном варианте осуществления витамин D представляет собой кальцитриол (1α,25-дигидроксивитамин D₃). В другом варианте осуществления витамин D представляет собой аналог сеокальцитол (ЕВ 1089, 1α,25-дигидрокси-22,24-диен-24,26,27-тригомовитамин D). В другом варианте осуществления витамин D представляет собой 1α,25-дигидрокси-16-ен-23-ин-витамин D₃ (аналог V). Другие подходящие формы витамина D включают, но не ограничиваются этим, витамин D₃, 25(OH) витамин D₃, 24,25 (OH)₂ витамин D₃, парикальцитол (синтетический аналог биологически активного витамина D, кальцитриола, в структуре которого имеются модификации в боковой цепи (D₂) и в кольце А (19-нор)), 1,25-дигидрокси-16,23Z-диен-26,27-гексафтор-D₃, 1,25-дигидрокси-16,23Е-диен-26,27-гексафтор-19-нор-D₃, 22-окса-кальцитриол, 1α-(OH)D₅, 20-эпи-1α,25(OH)₂D₃, кальципотриол, 1α24(S)(OH)₂D₂, 1α,24(R)(OH)₃D₃ и KH1060. Комбинации из двух или более любых форм витамина D также включаются в изобретение. В некоторых вариантах осуществления используются формы или аналоги витамина D, обладающие селективной биологической активностью кальцитриола, но у которых уменьшены или утрачены другие виды биологической активности кальцитриола. Например, формы или аналоги витамина D, которые связываются с рецепторами витамина D, но не стимулируют абсорбцию кальция, могут быть пригодны для применения в разных вариантах осуществления изобретения.

Количество витамина D в композиции составляет любое количество, необходимое для увеличения выработки или активности каталазы у животного. Количество будет изменяться в соответствии с формой витамина D, видом животного, биологическим состоянием животного, ткани(ей), нуждающейся в лечении, и других параметров, хорошо понятных специалисту в данной области, например, специалисту по медицинской химии или биологу. Композиция, созданная для доставки дозировки примерно в пределах между 1 мкг/кг веса тела и 1,000 мкг/кг веса тела, является подходящей для большинства вариантов применения. Конкретнее, может использоваться дозировка, по меньшей мере, около 1 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 5 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 10 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 20 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 30 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 40 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 50 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 100 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 200 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 300 мкг/кг веса тела, или, по меньшей мере, около 400 мкг/кг веса тела или, по меньшей мере, около 500 мкг/кг веса тела. Перевод этих диапазонов доз в международные единицы (IU) можно осуществить с помощью формулы 40 IU=1 мкг витамина D. Также могут быть созданы композиции для доставки дозировок, вычисленных с учетом концентрации витамина D, которая должна быть доставлена в клетки- или ткани-мишени. Подходящие концентрации содержат, по меньшей мере, около 10^-10М, или, по меньшей мере, около 10^-9М, или, по меньшей мере, около 10^-8М, или, по меньшей мере, около 10^-7М, или, по меньшей мере, около 10^-6М, или, по меньшей мере, около 10^-5М витамина D, доступного для поглощения клетками-мишенями.

Дополнительными средствами являются любые средства, подходящие для увеличения выработки или активности каталазы, или увеличения выработки или активности любой антиокислительной системы в организме или для детоксификации одной или более активных форм кислорода. В одном варианте осуществления дополнительные средства являются одним или более антиоксидантами. Антиоксиданты являются любыми антиоксидантами, пригодными для введения животному. Антиоксиданты хорошо известны в данной области техники, в частности в области технологии пищевых продуктов и разработки пищевых композиций. Природные антиокислительные соединения включают витамины (такие как витамины А, С и Е, и их производные, конъюгаты или аналоги), а также растительные экстракты, включая экстракты фруктов, овощей, трав, семян и других типов и/или частей растений. Известно, что такие соединения как α-липоевая кислота, хлорофилл и его производные, глутатион, убихинолы (например, коэнзим Q10), каротиноиды (например, ликопен), флавоноиды, фенольные кислоты, полифенолы, и пикногенол являются отличными антиоксидантами. Некоторые примеры растительных источников антиоксидантов перечислены выше. Отличной «ловушкой» кислорода является селен, который хорошо «работает», в частности с витамином или родственными соединениями токоферола. Синтетические пищевые антиоксиданты включают бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), которые обычно используются в пищевых продуктах. Любое из вышеперечисленного, отдельно или в комбинации, годится для использования здесь, равно как и комбинации природных и синтетических антиоксидантов. В одном варианте осуществления антиоксиданты содержат астаксантин, отдельно или в комбинации с другими антиоксидантами.

Композиции могут дополнительно содержать такие вещества, как минералы, другие витамины, соли, функциональные добавки, например, усилители вкуса, красители, эмульгаторы, антибактериальные и другие консервирующие вещества. Минералы, которые могут использоваться в таких композициях, включают, например, кальций, фосфор, калий, натрий, железо, хлор, бор, медь, цинк, магний, марганец, йод, селен и т.п. Примеры дополнительных витаминов, пригодных здесь, включат такие жирорастворимые витамины как A, E и K. Инулин, аминокислоты, ферменты, коэнзимы и т.п. могут включаться в состав в различных вариантах осуществления.

Могут быть созданы композиции в виде пищевых композиций для людей, корма для домашних животных или диетических добавок. Подобные композиции включают продукты питания, предназначенные для удовлетворения необходимых пищевых потребностей животного, лакомства для животных (например, печенье) или диетические добавки. Композиции могут быть сухими композициями (например, гранулами), полувлажными композициями, влажными композициями или любой их смесью. В другом варианте осуществления композиция является диетической добавкой, такой как соус, питьевая вода, напиток, йогурт, порошок, гранула, паста, суспензия, жвачка, легкое угощение, лакомство, закуска, пеллета, пилюля, капсула, таблетка или любой другой подходящей для доставки формой. Диетическая добавка может содержать высокую концентрацию витамина D. Это позволяет вводить животному добавку в небольших количествах, или в альтернативном варианте, добавку можно разбавить перед введением животному. Может потребоваться примешивать диетическую добавку, или предпочтительно смешивать с водой или другими разбавителями до введения животному.

В одном варианте осуществления композиции представляют собой охлажденные или замороженные композиции. В другом варианте осуществления для предоставления необходимых полезных количеств витамин D предварительно смешивается с другими компонентами. В следующих вариантах осуществления витамин D используется для нанесения (покрытия слоем) на пищевой продукт, закуску, корм или лакомство для домашних животных. В одном варианте осуществления витамин D добавляется к композиции непосредственно перед подачей животному, например, посыпая или смешивая с порошком.

Композиции могут дополнительно содержать одно или более дополнительных веществ, способствующих или поддерживающих общее здоровье, как понятно специалисту в данной области.

В различных вариантах осуществления в составе корма или лакомства для домашних животных содержится примерно от 15% до 50% сырого белка. Сырой белковый материал может содержать растительные белки, такие как соевая мука, концентрат соевого белка, кукурузная глютеновая мука, пшеничная клейковина, семя хлопчатника и арахисовая мука, или животные белки, такие как казеин, альбумин и мясной белок. Примеры пригодного мясного белка включают свинину, баранину, конину, белок мяса птицы и рыбы и их смеси.

Композиции могут дополнительно содержать примерно от 5% до 40% жира. Композиции могут дополнительно содержать источник углеводов. Композиции могут дополнительно содержать примерно от 15% до 60% углеводов. Примеры таких углеводов включают зерновые или хлебные злаки, такие как рис, кукуруза, сорго, люцерна, ячмень, соя, канола, овес, пшеница и их смеси. Кроме того, композиции могут необязательно содержать другие вещества, такие как сухая сыворотка и другие побочные продукты переработки молока.

В некоторых вариантах осуществления содержание зольных веществ композиции находится в пределах менее, чем от 1%, примерно до 15%, предпочтительно примерно от 5% до 10%.

Содержание влаги может изменяться в зависимости от природы композиции. В предпочтительном варианте осуществления композиция является полным и питательно сбалансированным кормом для домашних животных. В этом варианте осуществления корм для домашних животных может быть "влажным кормом", "сухим кормом" или кормом с умеренным влагосодержанием. "Влажный корм" - это корм, как правило, являющийся твердым, содержащийся в жестяных банках или мешках из фольги и имеющий влагосодержание в основном в пределах примерно от 70% до 90%. "Сухой корм" - это корм для домашних животных, который имеет состав, подобный влажному корму, но содержит ограниченное количество влаги, как правило, в пределах примерно от 5% до 15% или 20%, и поэтому имеет вид, например, похожих на сухое печенье небольших гранул. В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления композиции имеют содержание влаги примерно от 5% до 20%. Сухие пищевые продукты включают целый ряд продуктов с различным влагосодержанием, так что они являются относительно стойкими при хранении и устойчивыми к повреждению или заражению микробами или грибками. Предпочтительными также являются композиции, представляющие собой экструдированные пищевые продукты, такие как корма для домашних животных или закусочные пищевые продукты для людей или для животных-компаньонов.

Композиции также могут содержать один или более источников волокна. Термин "волокно" включает все источники "массы" в продукте питания, любые - усваиваемые или неусвояемые, растворимые или нерастворимые, поддающиеся или неподдающиеся ферментации. Предпочтительными волокнами являются волокна, полученные из растительных источников, таких как морские растения, однако также могут использоваться микробные источники волокна. Как известно среднему специалисту в данной области техники, может быть использован целый ряд растворимых или нерастворимых волокон. Источником волокна может быть свекловичный жом (от сахарной свеклы), гуммиарабик, камедь талха, подорожник, рисовые отруби, камедь из бобов рожкового дерева, мякоть цитрусовых, фруктолигосахарид, пектин, олигофруктоза с короткой цепью, маннанолигофруктоза, соевое волокно, арабиногалактан, галактоолигосахарид, арабиноксилан и их смеси.

Альтернативно, источником волокна может быть поддающееся ферментации (ферментируемое) волокно. Ранее было описано, что ферментируемое волокно приносит пользу иммунной системе животного-компаньона. Ферментируемое волокно или другие композиции, известные специалистам в данной области и предоставляющие пребиотик для усиления роста пробиотиков в кишечном тракте, также могут вводиться в состав композиции с целью увеличения пользы, приносимой настоящим изобретением иммунной системе животного.

В различных вариантах осуществления композиции дополнительно содержат один или более пробиотиков. В различных вариантах осуществления композиции содержат (1) один или более убитых или инактивированных пробиотиков, (2) компоненты убитых или инактивированных пробиотиков, которые приносят такую же или подобную пользу для здоровья, как живые пробиотики, или (3) их комбинации. Пробиотики или их компоненты могут включаться в состав композиции (например, равномерно или неравномерно распределяться в композиции) или наноситься на пищевые композиции (например, наноситься поверхностно вместе с носителем или без него). В одном варианте осуществления пробиотики заключаются в оболочку из носителя (инкапсулируются). Типичные пробиотики включают, но не ограничиваются этим, штаммы пробиотиков, выбранные из Lactobacilli, Bifidobacteri или Enterococci, например, Lactobacillus reuteii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium sp., Enterococcus faecium и Enterococcus sp.В некоторых вариантах осуществления пробиотический штамм выбирают из группы, состоящей из Lactobacillus reuteri (NCC2581; CNCM 1-2448), Lactobacillus reuteri (NCC2592; CNCM 1-2450), Lactobacillus rhamnosus (NCC2583; CNCM 1-2449), Lactobacillus reuteri (NCC2603; CNCM 1-2451), Lactobacillus reuteri (NCC2613; CNCM 1-2452), Lactobacillus acidophilus (NCC2628; CNCM 1-2453), Bifidobacterium adolescentis (например, NCC2627), Bifidobacterium sp. NCC2657 или Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415). Композиции содержат пробиотики в количествах, достаточных для обеспечения примерно от 10⁴ до 10¹² КОЕ/животное/день, предпочтительно примерно от 10⁵ до 10¹¹ КОЕ/животное/день, наиболее предпочтительно от 10⁷ до 10¹⁰ КОЕ/животное/день. В случае, когда пробиотики убиты или инактивированы, количество убитых или инактивированных пробиотиков или их компонентов должно давать полезный эффект, аналогичный эффекту живых микроорганизмов. Многие подобные пробиотики и их польза известны специалистам в данной области из, например, ЕР 1213970 В1, ЕР 1143806 В1, US 7189390, ЕР 1482811 В1, ЕР 1296565 В1 US 6929793.

В различных вариантах осуществления съедобные композиции дополнительно содержат один или более пребиотиков, например, фруктоолигосахариды, глюкоолигосахариды, галактоолигосахариды, изомальтоолигосахариды, ксилоолигосахариды, олигосахариды соевых бобов, лактосахарозу, лактулозу и изомальтозу. В некоторых вариантах осуществления пребиотик представляет собой цикорий, экстракт корня цикория, алейрон, инулин или их комбинации. Пребиотики включаются в описанные выше композиции (например, равномерно или неравномерно распределяются в композиции) или наносятся на пищевые композиции (например, наносятся поверхностно вместе с носителем или без него). В большинстве случаев пребиотики вводятся в количествах, достаточных для того, чтобы наверняка стимулировать здоровую микрофлору в кишечнике. Типичные количества составляют примерно от 1 до 10 грамм на порцию или примерно от 5 до 40% рекомендованного ежедневного потребления пищевого волокна для животного.

В различных вариантах осуществления съедобные композиции дополнительно содержат комбинацию одного или более пробиотиков и одного или более пребиотиков.

Композиции и диетические добавки могут создаваться специально для предполагаемых реципиентов или потребителей, например, для взрослых животных или для пожилых или молодых животных. Например, могут быть приготовлены композиции, адаптированные для щенков и котят или адаптированные для активных, беременных, кормящих или стареющих животных. В общем, специализированные композиции содержат количество энергии и питательных веществ, соответствующее животным на разных стадиях развития или разного возраста.

Определенные аспекты изобретения предпочтительно используются в сочетании с полным и сбалансированным питанием. Согласно определенным вариантам осуществления, предоставленным в описании, композиции, содержащие витамин D, предпочтительно используются вместе с высококачественным коммерческим питанием. При использовании в описании "высококачественное коммерческое питание" относится к пище промышленного производства с усвояемостью ключевых питательных веществ 80% или более, как изложено, например, в рекомендациях Национального научно-исследовательского совета для собак, или в рекомендациях, изложенных Ассоциацией американских официальных контролеров по качеству кормов. Подобные высокие стандарты питания могут использоваться в отношении других животных.

В другом варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие композицию настоящего изобретения, как описано выше, и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или эксципиентов (вспомогательных веществ). В большинстве случаев фармацевтические композиции готовят, смешивая соединение или композицию с эксципиентами, буферами, связующими веществами, пластифицирующими веществами, красителями, разбавителями, веществами для прессования, смазывающими веществами, ароматизаторами, увлажняющими веществами и т.п., включая другие, известные специалистам в данной области, ингредиенты, применяемые при производстве лекарственных препаратов и создании композиций, пригодных для введения животному в качестве фармацевтических средств. Может быть создана фармацевтическая композиция, подходящая для любого способа введения. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция создается для перорального введения, как описано выше. В другом варианте осуществления создается композиция, предназначенная для местного введения. Подходящие местные композиции могут включать растворы, эмульсии, кремы, мази, гели, липосомы, биодеградируемые микрочастицы и другие подобные средства доставки, что хорошо понятно химику-фармацевту.

В другом аспекте изобретение предоставляет набор, подходящий для введения композиции, содержащей одну или более форм витамина D, животному. Наборы включают, в отдельных контейнерах в единой упаковке или в отдельных контейнерах в виртуальной упаковке, в зависимости от компонентов набора, (a) одну или более форм витамина D, (b) одно или более из следующего: (1) один или более других ингредиентов, пригодных для потребления животным; (2) одно или более других средств, предназначенных для увеличения выработки или активности каталазы, (3) один или более антиоксидантов; (4) одно или более средств, предназначенных для уменьшения активных форм кислорода; (5) один или более пробиотиков; (6) один или более пребиотиков; (7) одно или более диагностических приспособлений, пригодных для определения, получит ли животное пользу от применения композиций и способов для увеличения выработки или активности каталазы; (8) инструкции о том, как объединить или приготовить витамин D, и любые другие ингредиенты, предоставленные в наборе, для введения животному; (9) инструкции о том, как использовать объединенные компоненты набора, приготовленные компоненты набора или другие компоненты набора с пользой для животного; и (10) устройство для введения объединенных или приготовленных компонентов набора животному.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы установления средства или режима, который увеличивает выработку или активность каталазы в клетках или у животных, в частности, способом, сходным с действием витамина D, например миметика витамина D. Способы включают (a) определение первого профиля экспрессии генов путем измерения продуктов транскрипции или трансляции генов, кодирующих каталазу, марганцевую супероксиддисмутазу, медь-цинк супероксиддисмутазу и необязательно одного или более из числа глутатионпероксидазы, паратиреоидного гормонсвязывающего белка, трансформирующего ростового фактора бета 1 и рецептора витамина D в клеточном образце при отсутствии средства или режима; (b) определение второго профиля экспрессии генов путем измерения продуктов транскрипции или трансляции генов, кодирующих каталазу, марганцевую супероксиддисмутазу, медь-цинк супероксиддисмутазу, и необязательно одного или более из числа глутатионпероксидазы, паратиреоидного гормонсвязывающего белка, трансформирующего ростового фактора бета 1 и рецептора витамина D в клеточном образце в присутствии средства или режима, и (c) сравнение первого профиля экспрессии генов со вторым профилем экспрессии генов, при этом увеличение продуктов транскрипции или трансляции каталазы, но не продуктов транскрипции или трансляции других генов, во втором профиле экспрессии генов указывает, что средство или режим возможно увеличивает выработку или активность каталазы в клетке способом, сходным с действием витамина D.

Методы анализа, с помощью которых можно определить изменения в экспрессии генов или активности ферментов, хорошо известны специалистам в данной области. Как правило, с помощью методов анализа экспрессии генов определяют изменения в продуктах транскрипции или трансляции выбранных генов (1) путем измерения транскрибируемой РНК, например, методом гибридизации или амплификации с использованием нуклеиновокислотных зондов или праймеров, или (2) путем измерения белка, например, с помощью иммунологического анализа связывания, такого как вестерн-блоттинг или ELISA, с использованием антител-зондов. Более того, методы измерения активности одного или более из вышеперечисленных ферментов также хорошо известны в данной области техники. Метод измерения активности каталазы приведен в описании в Примере 3.

Методы этого типа могут дополнительно включать сравнение, по меньшей мере, второго профиля экспрессии генов с эталонным профилем экспрессии генов, полученным путем измерения продуктов транскрипции или трансляции одного или более генов, кодирующих вышеупомянутые белки, в присутствии эталонного вещества (вещества сравнения), такого как кальцитриол, который, как было показано, увеличивает выработку или активность каталазы, т.е. посредством стимулирования экспрессии генов каталазы.

Сравнение между исследуемым профилем экспрессии генов и эталонным профилем может быть относительно одновременным, т.е. клетки или ткани исследуются одновременно. Однако эталон, использованный для сравнения, может основываться на данных, полученных ранее при использовании этого метода.

В одном варианте осуществления способ осуществляется на популяции культивируемых клеток. В одном варианте осуществления продукты транскрипции или трансляции клеток измеряются в присутствии или в отсутствие вещества сравнения или эталонного соединения, т.е. путем обнаружения амплификации с помощью зонда или праймера, который специфически гибридизируется с мРНК, кодируемой перечисленными выше генами, или путем обнаружения с помощью антител, которые специфически связываются с белком, кодированным этими генами. Альтернативно, гены-репортеры могут использоваться в рекомбинантной системе. В любом варианте осуществления клетки-хозяева могут представлять собой линию клеток млекопитающего, предпочтительно происходящих от человека или животного-компаньона, такого как животное семейства псовых или кошачьих. Альтернативно, данные методы могут осуществляться на клетках или тканях, недавно взятых у субъекта.

В другом варианте осуществления метод осуществляется на животных. В большинстве случаев исследуемое соединение или испытываемый режим (диета, нагрузка и т.п.) вводится субъекту и анализируется профиль экспрессии генов в выбранной ткани у субъекта с целью определить действие исследуемого соединения на транскрипцию или трансляцию перечисленных выше генов. Чтобы определить эффект исследуемого соединения, можно проанализировать экспрессию генов in situ или ex vivo. В другом варианте осуществления исследуемое соединение или режим вводится субъекту, а активность белка, экспрессированного геном, анализируется in situ или ex vivo согласно любому способу, принятому в данной области техники для определения эффекта исследуемого соединения на активность представляющих интерес белков. В дополнение к этому, при введении исследуемого соединения субъекту также могут оцениваться физиологический, системный, физический эффекты соединения, а также возможная токсичность соединения.

В другом аспекте изобретение предоставляет вещество или режим, установленный методами идентификации средства или режима, увеличивающего выработку или активность каталазы, как подходящий для того, чтобы увеличить выработку или активность каталазы при введении индивидууму. Поскольку они идентифицированы этим методом, такие вещества должны действовать как миметики витамина D, по меньшей мере, в отношении увеличения выработки каталазы они должны действовать подобно витамину D.

В дополнительном аспекте изобретение предоставляет наборы, пригодные для установления средства или режима, который увеличивает выработку или активность каталазы в клетках, способом, сходным с действием витамина D. Этот тип набора включает (1) реагенты, подходящие для измерения продуктов транскрипции или трансляции двух или более генов, кодирующих каталазу, марганцевую супероксиддисмутазу, медь-цинк супероксиддисмутазу, и необязательно одного или более из числа глутатионпероксидазы, паратиреоидного гормонсвязывающего белка, трансформирующего ростового фактора бета 1 и рецептора витамина D, и (2) инструкции о том, как использовать измерения экспрессии генов, чтобы определить, увеличивает ли средство или режим выработку или активность каталазы в клетках, способом, сходным с действием витамина D. Такие наборы могут дополнительно содержать одно или более из следующего: (1) образец витамина D; и (2) сообщаемую информацию об уровне экспрессии генов, кодирующих каталазу, марганцевую супероксиддисмутазу, медь-цинк супероксиддисмутазу, и необязательно одного или более из числа глутатионпероксидазы, паратиреоидного гормонсвязывающего белка, трансформирующего ростового фактора бета 1 и рецептора витамина D, предполагаемом для клеток, подвергнутых действию витамина D.

В другом аспекте изобретение предоставляет средства для сообщения информации или инструкций в отношении одного или более из числа: (1) преимуществ увеличения выработки или активности каталазы у животного; (2) смешивания одного или более из: форм витамина D, других средств для увеличения выработки или активности каталазы, антиоксидантов, средств для уменьшения активных форм кислорода, пробиотиков, пребиотиков и других ингредиентов, пригодных для потребления животным, с целью получить композиции, предназначенные для увеличения выработки или активности каталазы у животного, (3) инструкций, касающихся введения композиций животному, (4) информации для установления, получит ли животное пользу от увеличения выработки или активности каталазы, и (5) информации, имеющей отношение к отбору форм витамина D по их способности увеличивать выработку или активность каталазы; средства передачи информации включают один или более физических или электронных документов, цифровое запоминающее устройство, средство оптического хранения информации, звуковую презентацию, звуко-визуальную демонстрацию или визуальный показ, содержащий информацию или инструкции. Эти средства передачи информации могут включать одно или более из числа просматриваемого веб-сайта, пункта для визуального показа, брошюры, инструкции по применению, листка-вкладыша в упаковку, рекламы, отпечатанного текста, публичного сообщения, аудиозаписи, видеозаписи, DVD, CD-ROM, чипа, карты или диска, которые можно прочитать с помощью компьютера, USB-устройства, Fire Wire устройства, памяти компьютера и любой их комбинации. Средства сообщения информации в числе прочего подходят для инструктирования о пользе применения настоящего изобретения и для предоставления информации о контактах для потребителя или пользователя изобретения с целью получения помощи при применении или интерпретировании результатов, полученных от изобретения.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет упаковку, содержащую композицию настоящего изобретения и этикетку, прикрепленную к упаковке, содержащую слово или слова, картинку, схему, акроним, слоган, фразу или другое приспособление, или их комбинацию, указывающую, что содержимое упаковки содержит композицию, пригодную для увеличения количества или активности каталазы у животного. Как правило, такое приспособление содержит слова "улучшает антиокислительный ответ", "ослабляет окислительный стресс", "помогает поддерживать животное в лучшие годы его жизни", "способствует здоровью и оздоровлению" или равноценное выражение, напечатанное на упаковке. В изобретении является пригодной любая упаковка или упаковочный материал, подходящий для содержания композиции, например, мешок, коробка, бутылка, жестяная банка, сумка и тому подобное, изготовленное из бумаги, пластика, фольги, металла и тому подобного. В предпочтительном варианте осуществления упаковка содержит пищевую композицию, адаптированную для конкретного животного, такого как человек, животное семейства псовых или кошачьих, в соответствии с этикеткой, предпочтительно пищевую композицию для животного-компаньона.

В другом аспекте изобретение обеспечивает использование витамина D для получения лекарственного средства. Данное лекарственное средство является пригодным для увеличения выработки или активности каталазы у животного, оказания содействия здоровью и оздоровлению животного, продления лучших лет жизни животного и увеличения качества жизни животного. В различных вариантах осуществления лекарственное средство дополнительно содержит одно или более дополнительных средств, подходящих для увеличения выработки или активности каталазы, или для уменьшения или устранения активных форм кислорода у животного. Как правило, лекарственное средство готовят, смешивая витамин D с эксципиентами, буферами, связующими веществами, пластификаторами, красителями, разбавителями, уплотняющими веществами, смазывающими веществами, ароматизаторами, увлажняющими веществами и другими известными специалистам в данной области техники ингредиентами, пригодными для производства лекарственных средств и включения в состав лекарственных средств, пригодных для введения животному. В различных вариантах осуществления лекарственное средство дополнительно содержит пробиотик, пребиотик или их комбинацию.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы производства композиции, содержащей, по меньшей мере, один витамин D и один или более дополнительных средств, подходящих для увеличения выработки или активности каталазы или для уменьшения или устранения активных форм кислорода у животного. Эти способы включают смешивание витамина D и одного или более дополнительных средств. Эти средства являются любым соединением или другим веществом, подходящим для увеличения выработки или активности каталазы или для уменьшения или устранения активных форм кислорода у животного. В том случае, когда композиция представляет собой пищу, композиция может содержать один или более других ингредиентов, пригодных для потребления животным, например белок, жир, углевод, волокно, витамины, минералы, пробиотики, пребиотики и т.п. Альтернативно, способы включают введение витамина D, других средств и ингредиентов, по желанию, отдельно или в любой комбинации в пищу, например, в виде покрытия или покрывающего слоя. Витамин D может быть добавлен в любое время в течение процесса производства и/или обработки пищи. Сюда включается, например, смешивание витамина D и других ингредиентов, выбранных в качестве "основы" пищевой композиции, или нанесение их в качестве покрытия, т.е. главным образом на поверхность пищи после ее изготовления. Композиции могут быть изготовлены в соответствии с любым способом, пригодным в данной области техники.

Примеры

Изобретение может быть дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, при этом следует понимать, что эти примеры включаются только с целью иллюстрации и не предназначаются для ограничения рамок изобретения, если специально не указано обратное.

Пример 1

Клетки переходно-клеточной карциномы мочевого пузыря (cbTCC) собаки выращивали в среде DMEM с добавлением 5% FBS, 5% сыворотки новорожденных телят и пенициллин-стрептомицина (GIBCO BRL, Grand Island, Нью-Йорк, США) при 37°C во влажной атмосфере 5% CO₂. Клетки высевали 50000 клеток/мл в 6-луночные культуральные планшеты (Coming Incorporated Life Sciences, Acton, Массачусетс, США) и инкубировали в течение 24 часов до обработки. Для проведения вестерн-блоттинга клетки обрабатывали кальцитриолом (1α,25-дигидроксивитамин D₃) в концентрациях 10^-7М и 10^-9М и сеокальцитолом (ЕВ 1089, 1α,25-дигидрокси-22,24-диен-24,26,27-тригомовитамин D) в концентрации 10^-9М в течение 24 часов. Для исследования активности ферментов клетки обрабатывали кальцитриолом в концентрации 10^-7М и 10^-9М, сеокальцитолом в концентрации 10^-9М и аналогом V (1α,25-дигидрокси-16-ен-23-ин-витамин D₃) в концентрации 10^-9М в течение 24 часов. Для анализа экспрессии генов клетки обрабатывали кальцитриолом в концентрации 10^-7 М и 10^-9 М, сеокальцитолом в концентрации 10^-7 М и 10^-9 М в течение 24 часов. Обработки проводили, по меньшей мере, в тех экземплярах. Окончательная концентрация растворителя (этанол) во всех контролях была менее, чем 0,1% среды.

Пример 2

Собранные клетки гомогенизировали и исследовали в отношении выработки марганцевой супероксиддисмутазы (MnSOD), медь-цинк супероксиддисмутазы (Cu/ZnSOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GPX). Лизаты клеток собирали после центрифугирования и количественно определяли общий белок. Эквивалентные количества общего белка (20 или 40 мкг) разгоняли на заранее приготовленных 10% полиакриламидных гелях и электронным образом переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После этого мембраны блокировали в течение ночи при 4°C с добавлением 5% обрата (skim milk) в Трис-буферном растворе (TBS). Вырезали мембраны с молекулярным весом 37 кДа (зеленая полоса) и 25 кДа (розовая полоса). Верхнюю часть мембран окрашивали в отношении CAT, GPX и β-актина, а нижнюю часть окрашивали на MnSOD и Cu/ZnSOD. Первичные антитела для отдельных белков были использованы в следующих разведениях: кролик-анти-человек MnSOD 1:2000 (Upstate Biotech); овца-анти-человек Cu/ZnSOD 1:2000 (Calbiochem); овца-анти-человек каталаза 1:1000 (Bidesign); и овца-анти-человек GPX 1:500 (Biodesign). Вторичными антителами являются их соответствующие IgG-HRP конъюгаты, использованные в разведении 1:2000. Данные отмечали в виде интенсивности полос белка относительно контроля (нормализованного по уровням β-актина), принимая контроль за 100 процентов. Для CAT, MnSOD и Cu/ZnSOD n=7; а для GPX n=4. Перед преобразованием данных в виде процентов от контроля, для определения значимости был проведен односторонний парный t-критерий, принимая дисперсии равными. Результаты представлены в Таблице 1.

Значения представляют средний процент интенсивности полосы белка относительно контроля±стандартное отклонение. Значимое различие по сравнению с контролем: *=р<0,05.

Пример 3

Ферментативную активность каталазы определяли с помощью набора для анализа от Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Мичиган, согласно инструкциям производителя. В данном анализе для определения ферментативной активности используется пероксидазная функция CAT, основанная на реакции фермента с метанолом в присутствии оптимальной концентрации H₂O₂. Образованный формальдегид измеряли спектрофотометрически, используя 4-амино-3-гидразино-5 меркапто-1,2,4-триазол (пурпалд) как хромоген. Пурпалд специфически образует бициклический гетероцикл с альдегидами, который после окисления из бесцветного становится пурпурным. Оптическую плотность определяли при 540 нм с помощью планшетного спектрофотометра. Результаты вычисляли, исходя из стандартной кривой, полученной от известных образцов, и с помощью уравнений. В результате ферментативная активность CAT была получена как нмоль/мин/мл CAT. Образцы были сделаны в трех экземплярах. Для определения значимости определяли односторонний парный t-критерий, принимая дисперсии равными. Результаты представлены в Таблице 2.

Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение нмоль/мин/мл CAT. Значимые различия по сравнению с контролем: * =р<0,05 и ** =р<0,01.

Пример 4

Общую РНК выделяли с помощью набора RNAqueous® от Ambion Inc. (Austin, ТХ, США). Коротко, обработанные клетки трипсинизировали (при 37°C в термостате), и гомогенизировали с помощью ручного электрического гомогенизатора (при 4°C). Затем выделяли общую РНК из клеточных лизатов в соответствии с протоколом, предоставленным в наборе RNAqueous®, и хранили при -80°C.Полученную РНК очистили и концентрировали до ~1000 нг/мкл, используя осаждение этанолом. РНК ресуспендировали в воде DEPC и обрабатывали ДНКазой для удаления оставшейся ДНК. Набор для обработки ДНКазой DNA-free™ от компании Ambion (кат. №1906) использовали согласно инструкциям производителя. Очищенную РНК количественно определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop и проверяли на целостность с помощью биоанализатора Agilent 2100, а потом по протоколу набора RNA nano chip (кат. №5067-1511).

Количественная ПЦР. Для определения изменений РНК-экспрессии проводили количественную ПЦР в отношении клеток, обработанных кальцитриолом при 10^-7 М (n=5) и 10^-9 М (n=5), и сеокальцитолом при 10^-7 М (n=3) и 10^-9 М (n=3), относительно контроля (n=5) в течение 24 часов. Реакции с обратной транскриптазой проводили, используя систему для RT-ПЦР Super Script II® First-Strand Synthesis System (от Invitrogen, №11904-018) согласно инструкциям производителя. В случае проведения реакции с каждым образцом 1 мкг РНК добавляли к обработанной и не содержащей нуклеазу DEPC H2O (от Fisher, № ВР561-1) до конечного объема 11,4 мкл. Мастер-микс (общую реакционную смесь) готовили, используя 1,5 мкл 10 мМ dNTP; 1,5 мкл случайных гексамеров и 0,6 мкл праймеров Oligo dT на реакцию (образец). К каждому образцу добавили 3,6 мкл мастер-микс. Образцы инкубировали при 68°C в течение 10 минут и затем снижали до 4°C, по меньшей мере, на 1 минуту, используя GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Часть (0,25X) вышеуказанной реакционной смеси удаляли и использовали как минус-RT-реакцию (отрицательный контроль, не содержащий обратную транскриптазу Super Script II®). С помощью того же самого набора Super Script II® Reverse Transcriptase был приготовлен мастер-микс, содержащий 3 мкл буфера 10 X RT, 6 мкл 25 мМ MgCl₂, 3 мкл 0,1М DTT и 1,5 мкл ингибитора РНКазы. Часть (0,25Х) удалили и добавили 0,375 мкл Н20 на образец минус-RT-реакции мастер-микс. К каждому образцу минус-RT-реакции добавили 3,75 мкл. Что касается остатка мастер-микс, 1,125 мкл Super Script II® Reverse Transcriptase на образец было добавлено для плюс-RT-мастер-микс.11,25 мкл было добавлено к каждому образцу плюс-RT. Затем все реакции инкубировали при 42°C в течение 1 часа, кипятили при 95°C в течение 5 минут и снижали до 4°C, используя GeneAmp PCR System 9700. Затем образцы разбавляли одна часть RT-реакции на 29 частей ТЕ буфера рН~8,0 (Ambion №9858) для получения стокового раствора кДНК для проведения экспериментов.

Праймеры и зонды для 5' нуклеазного анализа были разработаны, исходя из выбранных последовательностей при помощи Primer ExpressTM v3,0, используя стандартные заводские настройки (Applied Biosystems Primer Express® Tutorial for Real Time Quantitative PCR Primer и Probe Design Tutorial). Зонды, связывающиеся с малой бороздкой (ABI Custom Oligo Synthesis Factory) были получены от ABI. АН oligos восстановили с использованием DEPC Н20 до 100 мкМ стоковой концентрации, и затем разбавили DEPC H₂O до рабочей концентрации стока 5 мкМ. Для проведения количественных ПЦР реакций использовали TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2X) (Applied Biosystems, №4352042) согласно инструкциям производителя. Окончательная концентрация праймера составляла 300 мкМ каждый, а окончательная концентрация зонда составляла 200 мкМ (оптимальная, определенная из предыдущих экспериментов). 3,2 мкл реакций плюс-RT и минус-RT использовали для проведения количественных ПЦР-реакций в окончательном объеме 20 мкл. Все положительные реакции были проведены в трех экземплярах, а отрицательные контроли проводились один раз. Были использованы стандартные условия количественной ПЦР, как описано в TaqMan® Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems, 95,0°C в течение 20 секунд и 40-50 циклов 95°C в течение 03 секунд, затем 60°C в течение 30 секунд) до окончательного объема 20 мкл. Образцы запускали в систему ПЦР в реальном времени ABI Prism 7500 при помощи программы для компьютера ABI SDS Software v1.3.

Все образцы запускали поодиночке в отношении каждого комплекта праймер/зонд, чтобы определить какой образец следует использовать для стандартной кривой. Были получены стандартные кривые при использовании серийных разведений РНК от экспериментальных образцов, показывающих самый низкий СТ (порог цикла) для большинства клеток-мишеней. Низкий СТ образец подвергали реакции обратной транскрипции, и серийное разведение 1:10 можно было использовать как стандартную кривую для всех пар праймер/зонд. Затем использовали пороговые значения цикла, чтобы вычислить входящее количество с помощью стандартной кривой и средних входящих количеств. Значения были нормализованы относительно уровней циклофилина А (пептидилпролилизомераза А), определенных с помощью количественной ПЦР. Индукция была вычислена из каждого самого низкого нормализованного значения образца. Тест Дуннетта осуществлялся на основании нулевой гипотезы, где среднее значение каждой обработанной группы равняется среднему значению их общей контрольной группы при доверительном интервале 99% (альфа=0,01). Результаты представлены в Таблице 3.

Значения представляют среднее значение ± стандартные ошибки средних значений, ** показывает значимое различие по сравнению с контролем при доверительном интервале 99%.

В подробном описании представлены типичные предпочтительные варианты осуществления изобретения. Специальные термины используются исключительно в общем и описательном значении, а не с целью ограничения. Рамки изобретения установлены в пунктах формулы изобретения. Очевидно, что в свете представленных выше идей возможны многие модификации и изменения изобретения. Следует понимать, что в рамках прилагаемых пунктов формулы изобретение может быть осуществлено на практике иным способом, чем конкретно описанный способ.

Реферат

Группа изобретений относится к композиции и ее применению для увеличения выработки или активности каталазы у животного. Группа изобретений состоит из композиции для перорального введения животным в виде таблетки, напитка, препарата или пищевой композиции, содержащей витамин D и один или более антиоксидантов, и применения витамина D для получения лекарственного средства, пригодного для увеличения выработки или активности каталазы у животного. Данная группа изобретений позволяет увеличить выработку или активность каталазы, повысить экспрессию генов каталазы у животных, оказать содействие здоровью или оздоровлению животных, улучшить качество жизни животного. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

Формула