Новый фермент - RU2002113653A

Реферат

1. Рекомбинантный белок, обладающий активностью люциферазы и по меньшей мере 60% гомологией по отношению к люциферазе дикого типа, где в последовательности фермента аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, мутирован по сравнению с соответствующей люциферазой дикого типа так, что люцифераза способна испускать свет другой длины волны по сравнению с соответствующей люциферазой дикого типа и/или обладает повышенной термостабильностью по сравнению с люциферазой дикого типа.

2. Рекомбинантный белок по п.1, где последовательность указанной люциферазы дикого типа является люциферазой из Photuris pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia miyako или Photuris pennsyl-vanica.

3. Рекомбинантный белок по п.2, где последовательность люциферазы дикого типа является последовательностью фермента, получаемого из Photuris pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis.

4. Рекомбинантный белок по п.1 или 2, где последовательность указанной люциферазы дикого типа является люциферазой из Photuris pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus plagioph-thalamus, Lampyris noctiluca или Pyrocoelia miyako, и аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, является отличным от аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты.

5. Рекомбинантный белок по п.1 или 2, где последовательность указанной люциферазы дикого типа является люциферазой из Photuris pennsylvanica, и аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, является отличным от валина.

6. Рекомбинантный белок по одному из предшествующих пунктов, где аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, является отличным от аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты или валина.

7. Рекомбинантный белок по одному из предшествующих пунктов, где аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, является незаряженной полярной аминокислотой.

8. Рекомбинантный белок по п.7, где аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, является тирозином, фенилаланином или триптофаном.

9. Рекомбинантный белок по п.8, где аминокислотный остаток, соответствующий остатку 357 в люциферазе Photuris pyralis, является тирозином.

10. Белок по одному из предшествующих пунктов, где белок обладает по меньшей мере 80% гомологией по отношению к люциферазе из Photuris pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis.

11. Белок по одному из предшествующих пунктов, который имеет по меньшей мере одну из следующих мутаций по сравнению с люциферазой дикого типа: (a) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислоте 354 люциферазы Photuris pyralis (356 в люциферазе Luciola), мутирован, (b) аминокислотный остаток, соответствующий положению 215 в люциферазе Photuris pyralis или (217 в люциферазе Luciola), является другой гидрофобной аминокислотой, или (c) аминокислотный остаток, соответствующий остатку 214 в люциферазе Photuris pyralis или остатку 216 люциферазы Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, (d) аминокислотный остаток, соответствующий остатку 232 в люциферазе Photuris pyralis или остатку 234 люциферазы Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, (e) аминокислотный остаток, соответствующий остатку 295 в люциферазе Photuris pyralis или остатку 297 люциферазы Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, (f) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислоте 14 люциферазы Photuris pyralis или остатку 16 Luciola mingrelica или остатку 17 Luciola cruciata или Luciola lateralis, (g) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислоте 35 люциферазы Photuris pyralis или остатку 37 Luciola mingrelica, или остатку 38 Luciola cruciata или Luciola lateralis, (h) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку 105 люциферазы Photuris pyralis или остатку 106 Luciola mingrelica, 107 Luciola cruciata или 108 Luciola lateralis, (i) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку 234 люциферазы Photuris pyralis или остатку 236 Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, (j) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку 420 люциферазы Photuris pyralis или остатку 422 Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, (k) аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку 310 люциферазы Photuris pyralis или остатку 312 Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, является отличным от аминокислоты, которая имеется в соответствующей последовательности дикого типа, и где фермент люцифераза обладает повышенной термостабильностью по сравнению с ферментом, имеющим в данном положении аминокислоту соответствующей люциферазы дикого типа.

12. Белок по одному из предшествующих пунктов, где аминокислотный остаток, соответствующий аминокислоте 354 люциферазы Photuris pyralis (356 в люциферазе Luciola), мутирован.

13. Белок по п.12, где аминокислотный остаток, соответствующий остатку 214 в люциферазе Photuris pyralis или остатку 216 люциферазы Luciola mingrelica, Luciola cruciata или Luciola lateralis, мутирован в другую гидрофобную аминокислоту.

14. Нуклеиновая кислота, которая кодирует люциферазу по одному из предшествующих пунктов.

15. Нуклеиновая кислота по п.14, которая содержит синтетический ген.

16. Нуклеиновая кислота по п.14, где применение кодона оптимизировано для определенного экспрессирующего хозяина и/или введены уникальные сайты рестрикции.

17. Нуклеиновая кислота по п.14 или 15, которая включает нуклеотиды 9-1661 SEQ ID No 1, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% гомологию к ней.

18. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по одному из п.14-17.

19. Клетка, трансформированная вектором, по п.18.

20. Способ получения белка по одному из пп.1-13, где данный способ включает культивирование клетки по п.19.

21. Применение белка по одному из пп.1-13 в биолюминесцентном тесте.

22. Набор, включающий белок по одному из пп.1-13.

23. Набор по п.22, который дополнительно включает люциферин.

24. Аналитический тест для определения присутствия в образце СоА, где данный тест включает добавление к образцу, в котором как полагается находится СоА, люциферазы по одному из пп.1-11 выше вместе с другими реагентами, которые необходимы для проведения реакции люцифераза/люциферин, определение длины волны испускаемого пробой света, и соотнесение результатов с присутствием или отсутствием СоА.

25. Тест по п.24 для применения при диагностике сахарного диабета.