Способ и вещество для активируемого сайтом комплексообразования биологических молекул - RU2571924C2

Чертежи

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта патентная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США с серийным №61/209260, поданной 4 марта 2009 года и озаглавленной «АКТИВНОЕ ВЯЖУЩЕЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ РАСТЕНИЙ», которая тем самым является включенной сюда посредством ссылки во всей ее полноте для всех целей.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в целом, относится к контролируемому увеличению аффинности биологических соединений к связыванию белка. Более конкретно, данное изобретение относится к стабилизации и контролируемой активации растительных биополимеров ферментами животных, растений, бактерий и/или другими катализаторами для того, чтобы вызвать локально усиленное окисление и/или поперечное связывание белков, микроорганизмов и биологических тканей.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Несмотря на сотни миллионов лет дивергентной эволюции, почти все растения, животные и патогены имеют некоторые общие биохимические основы и стратегии защиты от окружающей среды. Это делает ботанику богатым источником полезных и совместимых соединений для контроля патогенов у животных. Применение функциональной биохимии из растений в течение длительного времени было основой традиционной медицины и гомеопатии, и часто считается, что оно с меньшей вероятностью запустит нежелательные иммунологические ответы между менее генетически отдаленными видами в пределах тех же самых типов, чем высокоочищенные, большие, сложные белки или полимеры.

Иммунные системы большинства высших организмов защищают от инфекции посредством защитных механизмов повышенной специфичности. Самым простым является физический барьер, который предупреждает проникновение в организм патогенов, таких как бактерии и вирусы. Растения и животные также имеют системы врожденного иммунитета, которые представляют собой либо генетически закодированные ответные реакции на специфических патогенов, либо различные неспецифические ответные реакции на химические соединения патогенов.

Растения типично имеют две ветви иммунной системы. Первая распознает и отвечает на молекулы, общие для многих классов микробов, включая непатогенов, посредством повышенной экспрессии ферментов, генерирующих АФК (активные формы кислорода), способных инициировать окислительные взрывы, однако, такой прямой окислительный ответ является энергозатратным и должен строго регулироваться для предотвращения аутотоксичности. Многие патогенные микроорганизмы (бактерии, грибы, протисты) имеют пероксидазы или каталазы в качестве мер противодействия против таких взрывов АФК. Второй ветвью системы врожденного иммунитета является многокомпонентный ответ на повреждение, который, как описано выше, инициируется реакцией между хиноновыми соединениями и аминокислотами при повреждении клеток. Эти соединения обычно являются разделенными между разными компартментами и не взаимодействуют в живых системах. В растениях разрушение клеток приводит к контакту разных фенольных соединений и активных форм кислорода с полифенолоксидазами (ПФО), окисляющими данные фенольные соединения с образованием хиноновых соединений, которые активно взаимодействуют друг с другом и с аминокислотами клеток или любых присутствующих микроорганизмов. Это приводит ко многим физиологическим явлениям, таким как образование коричневой окраски или обесцвечивание пищевых продуктов, осаждение белков, бактерицидная активность, вяжущие свойства, изменения перевариваемости пищи и так далее.

Окисление полифенолов в растительных системах генерирует окисленные полифенолы (также именуемые о-полифенолы, окисленные биополимеры, полихиноны и хиноновые соединения) с множеством хиноновых групп, которые способны к ковалентному связыванию. Сразу после образования высокоаффинные о-полифенолы спонтанно образуют ковалентные внутри- и межцепочечные поперечные связи, которые конденсируют белки значительно более активно, чем водородные связи, характерные для неокисленных полифенолов. В растительных системах о- полифенолы поперечно связывают белки поврежденной клетки с образованием прочного щита между здоровыми тканями и дальнейшим распространением патогена. Они также предотвращают распространение патогенов путем активного связывания с компонентами их метаболических путей, отключая ферменты вирулентности и останавливая подвижность патогена.

Высшие позвоночные имеют дополнительную стадию защиты, адаптивную иммунную систему, которая обеспечивает более сильный немедленный иммунный ответ на патогены, с которыми сталкивались ранее. Агрегация меньших молекул на патогене создает большие комплексы с повышенной антигенностью данного патогена к иммунной системе хозяина. Каждый патоген «запоминается» по характерному антигену. При инфицировании патогеном организма более чем один раз эти специфичные клетки памяти используются для его быстрого и эффективного устранения; однако, для развития этих специализированных ответных реакций может потребоваться много суток. В промежуточный интервал времени первичная защита против патогенов, встреченных впервые, особенно при инфекции иммунодефицитных или незрелых животных, полагается исключительно на системы врожденного иммунитета и часто связана с негативными физиологическими ответами, такими как диарея, рвота, лихорадка, воспаление и т.д. Такие системные ответы на инфекцию представляют собой экспрессию очень больших чисел иммунных эффекторов, что может быть крайне затратным метаболически, даже фатальным для хозяина.

Одной из наиболее распространенных угроз, связанных с неконтролируемой системной ответной реакцией посредством системы врожденного иммунитета, является дегидратация при диарее, вызываемая инфекционными заболеваниями или паразитами. Дегидратация при диарее каждый год поражает более 2 миллиардов людей и является самой обычной причиной смерти младенцев в странах третьего мира, вызывая более чем 1,5 миллиона смертей в год. Помимо регидратации, большинство усилий для лечения диареи сосредоточены на повышении человеческого иммунитета, связанного со слизистыми оболочками, путем модуляции системных иммунных ответов, как, например, путем применения лекарственных средств, снижающих перистальтику кишечника, модификаторов проницаемости слизистой оболочки и терапий антибиотиками. Эти подходы имели ограниченный успех, но привносили нежелательные риски побочных эффектов, устойчивости к патогенам или физиологического старения.

На рынке существует постоянная потребность в растительных альтернативах антибиотиков и синтетических химических дезинфицирующих средств для контроля заболевания, связанного с патогенами, передающимися с водой, на поверхности и с пищей. Взрывной рост заболеваний, устойчивых к антибиотикам, был связан с чрезмерным использованием антибиотиков как у людей, так и у скота. Многие региональные правительства и международные организации здравоохранения потребовали введения фазы без необязательного применения антибиотиков, особенно в кормах для скота, где они используются субтерапевтически для усиления роста. В настоящее время является общепризнанным то, что существует мало экономичных и надежных по отношению к окружающей среде альтернатив для безопасного контроля патогенов. Десятилетия исследований на растениях в качестве источников новых противомикробных средств, главным образом, были сосредоточены на механической экстракции и экстракции растворителями специфических растительных соединений и не были успешными при получении композиций с эффективностью, безопасностью, предпочтением пользователя и профилем воздействия на окружающую среду, необходимыми для соответствия эффективности современных антибиотиков и бактерицидных препаратов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте биохимическая композиция, включающая переработанную жидкость, содержащую молекулу, имеющую гидроксильную группу, объединена с активирующим механизмом для активации данной молекулы путем окисления данной гидроксильной группы окисляющим агентом и катализатором. Активация данной молекулы увеличивает аффинность связывания данной молекулы.

В одном воплощении данная молекула включает полифенол. В альтернативном воплощении данная молекула включает молекулу полимерного углевода или производные полисахаридов. В другом воплощении полифенол происходит из растения. В одном воплощении растение включает Camellia sinensis или Punica granatum, или другое растение, содержащее полифенолы. В другом воплощении полифенол происходит из корня, листьев, стеблей, коры, плодов или других тканей растений, содержащих полифенолы.

В альтернативном воплощении данная молекула включает танин, лигнин, флавоноид, гидроксикумарин или алкалоиды. В другом воплощении данная молекула содержит по меньшей мере одну искусственную синтетическую часть. В одном воплощении данный катализатор включает каталазу, пероксидазу, фенолоксидазы, тирозиназу или металлический катализатор. В альтернативном воплощении данный катализатор локализован в животной клетке. В другом воплощении патоген образует данный катализатор. В одном воплощении данный патоген включает вирус, бактерии, грибы, эукариотический организм или прион. В альтернативном воплощении данный окисляющий агент содержит активные формы кислорода (АФК).

В другом воплощении данная активная форма кислорода включает пероксид водорода. В другом воплощении данная активная форма кислорода включает неорганические или органические пероксиды. В одном воплощении данная активная форма кислорода включает продукт восстановления озона супероксиддисмутазой, глюкозооксидазой, гидратации перкарбоната или гидратации пероксида карбамида (пероксида мочевины) или другой непрямой способ образования стабильных активных форм кислорода. В альтернативном воплощении данную переработанную жидкость получают из сухой смеси, содержащей полифенол или производное полисахарида. В другом воплощении данную переработанную жидкость получают из интактного растительного материала, содержащего полифенол. В другом воплощении данный активирующий механизм инициируется, когда данный полифенол или полисахаридное производное находится в контакте с ферментом и окисляющим агентом в растворе. В одном воплощении гидроксильная группа первращается в карбонильную группу после активации данной гидроксильной группы. В альтернативном воплощении данная молекула содержит хиноновую группу после активации данной гидроксильной группы. В другом воплощении данная молекула оказывает эффект инактивации патогена после активации данной гидроксильной группы. В одном воплощении данный окисляющий агент обеспечивает свободные радикалы. В альтернативных воплощениях данная активированная молекула обеспечивает свободные радикалы.

Во втором аспекте способ получения композиции включает получение биополимера из растения и активацию гидроксильной группы на данном биополимере так, что увеличивается аффинность молекулярного связывания данного биополимера.

В одном воплощении данный биополимер включает полифенол, производное полисахарида или полимерную молекулу. В альтернативных воплощениях активацию осуществляют путем приведения данного биополимера в контакт с ферментом или окисляющим агентом. В другом воплощении данный способ дополнительно включает поперечное связывание активированного биополимера с белком животного. В одном воплощении данный способ дополнительно включает множество биополимеров, образующих между собой поперечно-связанные структуры. В альтернативном воплощении данный способ дополнительно включает связывание данного биополимера с патогеном. В альтернативном воплощении данный способ включает связывание данного биополимера с клеткой. В другом воплощении данный способ включает связывание данного биополимера с вирусом. В дополнительном воплощении связывание данного полимера с множеством патогенов вызывает агломерацию или удаление микроорганизмов, белков или белковых структур из раствора. В другом воплощении связывание прекращает распространение данного патогена. В некоторых воплощениях данный активированный биополимер способен блокировать метаболический путь патогена. В альтернативном воплощении данный способ дополнительно включает лечение симптома диареи животного с использованием данного активированного биополимера. В дополнительном воплощении данный способ включает лечение любой поврежденной ткани животного с использованием активированного биополимера. В другом воплощении активация гидроксильной группы запускается ферментом в сайте животного. В одном воплощении активация гидроксильной группы достигается экзогенным добавлением фермента. В альтернативном воплощении данный способ дополнительно включает удаление или инактивацию оксидоредуктазы или восстанавливающего соединения, которое реагирует с окислителем. В другом воплощении данный способ дополнительно включает образование барьера посредством поперечного связывания данного биополимера с белком животного так, что предотвращают инвазию патогена. В дополнительном воплощении данный способ включает поперечное связывание данного биополимера с белком животного так, чтобы стимулировать ускоренное заживление раны.

В третьем аспекте способ облегчения местной реакции включает локализацию добавленных активных форм кислорода в реакционной близости от гидроксильной группы на биополимере, активацию данной гидроксильной группы биополимера и нанесение данного биополимера на сайт-мишень.

В одном воплощении данный биополимер включает полифенол или производное полисахарида. В альтернативном воплощении данная активация достигается путем взаимодействия с ферментом. В другом воплощении активная форма кислорода включает пероксид водорода. В одном воплощении данный способ дополнительно включает увеличение концентрации пероксида водорода в реакционной близости от гидроксильной группы путем добавления пероксида водорода в раствор, содержащий данный биополимер. В альтернативном воплощении данный биополимер содержит множество гидроксильных групп.

В четвертом аспекте способ контролируемой химической доставки включает получение биомолекулы, содержащей предварительно выбранное химическое вещество, и осуществление выбора размера, массы или их комбинации для контроля скорости проникновения данной биомолекулы через ткань животного.

В одном воплощении данное химическое вещество включает фенольное соединение. В альтернативном воплощении данное химическое вещество включает хиноновое соединение. В дополнительном воплощении данная биомолекула содержит некоторое количество экстракта из растения. В одном воплощении получение молекулы включает выделение данной молекулы. В альтернативном воплощении выбор включает экстрагирование. В другом воплощении скорость проникновения является умеренной, так что применение данной биомолекулы у животного не вызывает токсического ответа ткани данного животного. В дополнительном воплощении применение данной биомолекулы у животного снижает внешнюю стимуляцию иммунного ответа системы животного. В одном воплощении прием внутрь данной биомолекулы улучшает использование корма для роста в животных системах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 проиллюстрировано несколько реакционных путей для превращения фенольных единиц в хиноны согласно воплощению настоящей заявки.

На Фиг.2 проиллюстрирована композиция, полученная согласно одному воплощению настоящей заявки.

На Фиг.3 проиллюстрирована блок-схема способа получения композиции на основе растения согласно одному воплощению настоящей заявки.

На Фиг.4 проиллюстрирована блок-схема способа инактивации восстанавливающих агентов/ферментов с использованием растворителя согласно одному воплощению настоящей заявки.

На Фиг.5 проиллюстрирована блок-схема способа тепловой инактивации восстанавливающих агентов/ферментов согласно одному воплощению настоящей заявки.

На Фиг.6 проиллюстрировано применение композиции на основе растения согласно некоторым воплощениям.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает новые биоактивные композиции. В одном аспекте биохимическая система включает биополимер или синтетический эквивалент, объединенные со стабильным источником активных форм кислорода (АФК), и отдельный источник оксидоредуктазного фермента или катализатора. Комбинации данных веществ способны вызывать образование окисленного биополимера с повышенной аффинностью связывания белка и активностью контроля микробов:

Некоторые воплощения настоящего изобретения содержат смесь вещества на основе растения с вяжущими и/или бактерицидными свойствами и предшественника активации в стабильном растворе. Данный раствор по существу не содержит ферментов и каталитических веществ, которые могут вызвать реакцию других компонентов таким способом, который вызывает деградацию. Смесь этого бактерицидного вещества на основе растения и предшественника активации катализируется разными ферментами животных, растительных или микробных клеток с высвобождением окислительных радикалов и с образованием активированного вещества на основе растения со значительно улучшенными вяжущими и бактерицидными свойствами. Высвобождение окислительных радикалов и образование активированного растительного вещества обычно локализованы у источника катализирующего биологического фермента, таким образом, концентрируя такую активность поблизости от запускающего биологического объекта или вещества, для максимального эффекта. Данный запускающий катализатор также может иметь небиологическое происхождение как, например, металл, который вызывает восстановление предшественника активации для того, чтобы вызвать автоокисление вещества на основе растения в его активированную форму.

В альтернативных воплощениях данная биоактивная и бактерицидная система содержит смесь вещества на основе растения, такого как полифенолы. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что можно использовать любые макромолекулы, полимеры, совокупность небольших молекул, фрагменты клеточной мембраны, поперечно-связанные соединения, содержащие множество экспонированных фенольных единиц, и предшественник активации (например, окислитель, такой как пероксид водорода) или их комбинации.

В других воплощениях активаторные вещества содержат озон или пероксон. В некоторых воплощениях данное растительное вещество может быть источником встречающегося в природе пероксида водорода. Однако эндогенная концентрация H₂O₂ является сильно варьирующей и обычно может быть потеряна при переработке данного растительного материала. Одним из полезных аспектов некоторых воплощений является то, что источник данного окисляющего агента может происходить из экзогенно добавленного пероксида водорода, озона, пероксона или другого имеющегося в продаже окислителя в качестве предшественника активации.

В некоторых воплощениях фенольная единица может нести от 1 до 3 гидроксильных групп (OH), которые могут реагировать с данным окислителем. Следовательно, макромолекула, содержащая фенольные группы, по существу состоящая из них, может нести от сотен до тысяч или более гидроксильных групп. Этот молекулярный кластер гидроксильных групп высокой плотности дает различные другие возможности образования нековалентных связей, притяжения зарядов и физической секвестрации молекул пероксида водорода в пределах тесной и реакционной близости к фенольным единицам. Секвестрация согласно воплощениям настоящего изобретения дает новый способ поддержания стабильности и повышенного насыщения пероксидом водорода в пределах реакционной близости полифенольного субстрата при более низких концентрациях растворов, чем эквивалентные несеквестрированные компоненты. Секвестрация может быть результатом объединения достаточно высокой концентрации пероксида водорода в воде для установления межмолекулярных сил притяжения между значительной частью гидроксильных функциональных групп полифенолов и молекулами пероксида водорода. Увеличение секвестрации может значительно снижать потерю окислителя в результате нагревания, воздействия ультрафиолета, восстанавливающих примесей и спонтанной деградации при увеличении потенциального числа высокоаффинных сайтов связывания на полимере при встрече с подходящими ферментами.

В некоторых воплощениях в качестве структуры секвестрации пероксида водорода может функционировать некоторое количество неочищенных экстрактов растительного материала, включая фрагменты растительных клеток, заполненные частично денатурированными ферментами переработки активных форм кислорода (АФК), подобными каталазе, пероксидазе, дисмутазе, глюкозооксидазе или их сочетанию. Эти АФК включают пероксид водорода (Н₂O₂), супероксид (O₂^-), синглетный кислород (¹O₂^*) и гидроксильный радикал (·ОН). В альтернативных воплощениях данный предшественник активации может быть генерирован деградацией растворенного озона (O₃) или его превращением активными дисмутазами в Н₂O₂. В других воплощениях данный предшественник активации также может быть генерирован ферментативным превращением любого супероксида, такого как пероксид жирной кислоты.

Компонент данной композиции, который обеспечивает фенольные группировки, может содержать полифенол и/или любую гетерогенную или гомогенную макромолекулу, которая является синтетической, происходящей из растения или животного. В некоторых воплощениях данный полифенол содержит более чем две фенольные группы. В альтернативных воплощениях данный полифенол содержит более чем 30 фенольных групп. В других воплощениях данный полифенол содержит от 100 до 10000 фенольных групп. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что в данной композиции может содержаться любое число фенольных групп до тех пор, пока данные композиции имеют описанные здесь желательные характеристики, такие как умеренную скорость абсорбции.

Описанные здесь вещества на основе растений включают, но не ограничиваются, полифенолы, лигнины, полисахариды и другие вещества с большими молекулами или структурами, которые преимущественно заканчиваются карбонильными группами, которые доступны для превращения в хиноны. Эффективные растворы можно перерабатывать из огромного разнообразия разных растительных тканей разных видов из-за общей природы подходящих веществ.

Типичная технология для получения противомикробных соединений из растительных источников основана на механической экстракции или экстракции растворителем органических молекул способами, которые не дают практических средств, чтобы использовать химическую ответную реакцию живых растительных тканей на повреждение для практического применения, особенно в животных или других растительных системах. Разрушение клеток, имеющее место в результате промышленной переработки, атаки патогена, травоядного животного, повреждения в результате воздействия факторов окружающей среды или естественного разложения, запускает данные реакции и делает противомикробные соединения бесполезными за очень короткий период времени.

Полифенолы составляют обширный ряд органических полимеров, продуцируемых растениями, и являются важными субстратами в ответной реакции растений на повреждение. Эти полимеры способны претерпевать некоторое оксилительное превращение с образованием противомикробных соединений, но могут демонстрировать слегка отличающиеся свойства. Полисахариды также могут претерпевать некоторое окислительное превращение, образуя биоадгезивные вещества с противомикробными и ранозаживляющими возможными свойствами, и могут быть эффективными аналогами хинонов.

Лежащие в основе процессы имеют в основе сложную серию химических реакций, которые могут включать многочисленные прямые и опосредованные ферментативные образования высокоактивных промежуточных соединений. Оксидоредуктазы могут опосредовать этот химический каскад, типично в присутствии источника активных форм кислорода, с несколькими возможными способами превращения гидроксильных (OH) функциональных групп ароматических полимеров в карбонильные группы (=O), которые образуют ковалентные связи, ответственные за высокопрочные биологические структуры и противомикробные защитные механизмы. Карбонильные группы представляют собой функциональные группы, содержащие атом углерода, связанный двойной связью с атомом кислорода: С=O. Кетогруппы содержат карбонильные группы (С-С(=O)-С), так что каждая из карбонильных групп связана с двумя другими атомами углерода с атомом углерода карбонила. Некоторые из особенно интересных субстратов включают соединения с множеством ароматических субъединиц, образующих органические молекулы с полностью конъюгированными циклическими дионовыми структурами с>С(=O) группами с любым расположением двойных связей, включая полициклические и гетероциклические аналоги, которые образуют ковалентные связи с нуклеофильными аминокислотами и белками. Термин "хиноновый", используемый в этом документе, включает любые соединения, содержащие субъединицы с любым числом карбонильных групп.

Преобразованные или окисленные гидроксильные субъединицы демонстрируют повышенную аффинность связывания, характерную для мночисленных хинонов и полухинонов в конфигурации гетерополимера или гомополимера. Окисление может происходить только на части данных функциональных групп полифенола. Типичный гетерогенный характер этих окисленных полифенолов может представлять хиноновую активность при сохранении некоторых основных характеристик полифенолов. Различия в общей структуре, третичной форме и молекулярной массе будут вызывать разные аффинности для разных белков, причем увеличенная общая смесь или внутримолекулярная гетерогенность обеспечивают потенциал более широкого спектра.

Помимо того, что они были идентифицированы в качестве временного кофактора в целом ряде биологических активностей поперечного связывания, хиноновые мономеры в течение длительного времени были известны как обладающие очень мощным бактерицидным эффектом. Помимо обеспечения источника стабильных свободных радикалов, хиноны способны необратимо образовать комплексы с нуклеофильными аминокислотами в белках, часто приводя к инактивации данного белка и потере ассоциированной биологической функции. По этой причине потенциальный антимикробный эффект хиноновых соединений является огромным. Вероятными мишенями в микробной клетке являются экспонированные на поверхности адгезивные молекулы, полипептиды клеточной стенки, эффекторы, обеспечивающие подвижность, и связанные с мембраной ферменты. Хиноны также могут делать субстраты недоступными для микроорганизма.

Как и в случае со всеми противомикробными соединениями, происходящими из растений, возможные токсические эффекты хинонов должны быть тщательно проверены. Некоторые хиноны продемонстрировали противомикробную эффективность при разведении от 5 до 6 log. Хиноновые мономеры представляют собой небольшие молекулы, которые легко проникают через ткани и демонстрируют токсичность, которая может ограничивать их медицинское применение, тогда как полихиноновые соединения содержат множество хиноновых сегментов в биополимере, сложной молекуле или синтетическом аналоге. Полихиноновые соединения достаточной молекулярной массы и размера могут иметь сниженное системное поглощение, соответствующее пониженному потенциалу токсичности для высших организмов.

Исследование бактерицидной активности хиноновых соединений началось уже в 1900-х годах, но не было как следует осмыслено до 1940-х годов. Ингибирование формалином цветной реакции между хиноном и многими различными белками, такими как яичный альбумин, казеин, лошадиная сыворотка и пептон, указывает на то, что данная реакция принципиально осуществляется между хинонами и аминогруппой белков. Бактерицидный механизм одного полихинона может принимать три основные формы: реакции ковалентного связывания с бактериальными белками, поперечного связывания цитобелков разорванной клетки с образованием вяжущего барьера, непроницаемого для патогенов, и режима редокс-циклирования, который генерирует пероксиды и свободные радикалы, которые вызывают окислительное повреждение оболочки патогена.

Главные продукты окисления фенолов были идентифицированы Приором (Pryor) в 1940 году как о-дифенолы. Эта продукция может происходить в результате автоокисления в присутствии радикалов кислорода или в результате ферментативного превращения фенолоксидазами. Фенолоксидазы (например, L-dopa: кислород оксидоредуктаза; EC 1.14.18.1), также известные как полифенолоксидазы и тирозиназы (например, лизилоксидаза; EC 1.4.3.13), представляют собой содержащие медь белки, которые катализируют окисление монофенолов в о-дифенолы и последующее окисление о-дифенолов до соответствующих о-хинонов. Фенолоксидазы являются широко распространенными в царстве животных, а также у растений, грибов и прокариотов. Насекомые также используют их при склеротизации при быстром образовании высокопрочных оболочек яиц, коконов и структур шелка.

Хотя они являются результатом сотен миллионов лет дивергентной эволюции, очень близкое структурное сходство окислительных ферментов, включая пероксидазу, полифенолоксидазу, лакказу и т.д., обнаруженных у растений, грибов, бактерий, и пероксидаз, таких как миелопероксидаза, лактопероксидаза и все пероксидазы из разных животных тканей, указывает на необходимость достижения тех же самых базовых биологических целей. Это функциональное сходство может использоваться в качестве нового способа для запуска контролируемого окисления полифенолов во всех биологических царствах или типах.

Например, тирозиназа представляет собой основной фермент семейства фенолоксидаз, наряду с несколькими другими оксидоредуктазами, которые катализируют стадию в образовании меланиновых пигментов. Тирозиназа у млекопитающих является функционально сходной с фенолоксидазой в химическом каскаде, который вызывает склеротизацию, меланизацию и продукцию противомикробных пептидов у насекомых.

Пероксид водорода является одним из самых обычных биологических источников активных форм кислорода, участвующих в ферментативном создании полихинонов. Он экспрессируется в значительном количестве в живых тканях многих растений. Он является распространенным метаболическим продуктом и ключевым инициатором, который потребляется в процессе окисления полифенолов, который происходит в поврежденных тканях. Как сам окислитель (Н₂O₂), так и продукты его реакции, опосредованной ферментом, полихиноны, обладают антимикробными свойствами, причем последние также имеют сильные вяжущие свойства. Они являются основными соединениями, которые обеспечивают традиционное медицинское применение многих свежих растительных материалов в качестве повязок на рану. Однако противомикробный потенциал поблизости от свежесрезанной растительной ткани значительно снижается в течение нескольких минут из-за короткого периода существования этих соединений в поврежденной растительной ткани.

Смесь растительных материалов, окислителей и ферментов использовали для образования окисленных полифенолов и углеводов для целого ряда промышленных и коммерческих применений, однако, композиция растительного материала с денатурированными или удаленными ферментами для обеспечения стабильной комбинации с окислителем с целью нанесения на мишень, которая обеспечивает отдельный источник катализатора или фермента для влияния на биологические системы, является новой.

Ссылки, описывающие композиции растительных веществ и окислителей для применения в биологических системах, немногочисленны. В US 2002/0034553 описан гель на основе алоэ и ирландский мох в качестве загущающего пассивного носителя для доставки пероксида водорода или пероксида цинка в качестве источника окисления для создания неблагоприятных условий для анаэробных бактерий на ранах кожи. В патенте США №5260021 раскрыта гелевая мазь, содержащая пероксид водорода, в качестве носителя для переноса кислорода для применения только в качестве дезинфицирующего агента для контактных линз и тому подобного. В патенте США №4696757 описан гель, несущий пероксид водорода, для лечения поверхностных порезов и для обесцвечивания волос. Ни в одном из этих патентов не сделана ссылка на комбинирование окислителя, такого как пероксид водорода, и полифенольного компонента с целью вызвать или обеспечить реакции между ними.

В физиологии высших растений пероксид водорода, полифенолы, белки и оксидоредуктазы разделены в структурированной цитоплазме, органеллах и мембранных структурах живой клетки. Разрушение данной клетки путем инфицирования, повреждения, дробления, измельчения, высушивания, силосования или других физически повреждающих процессов приводит к смешиванию и исчерпанию полезного реакционного потенциала этих компонентов. В настоящем уровне техники экстракции растений не предложено очевидного способа сохранения стабильной комбинации этих компонентов. Поэтому неудивительно, что, несмотря на то, что с момента открытия и документирования функции систем окисленных полифенолов в растениях прошло более 50 лет, эта мультимолекулярная химия не была успешно использована в промышленности, производящей товары для здоровья и сельского хозяйства на основе растений, которая вместо этого была сфокусирована на обнаружении стабильных по своей природе пищевых и фармакологических молекул, которое можно легко упаковать или экстрагировать.

В ботанических науках существует значительное понимание ферментативно-окисленных полифенолов, но нет известной ссылки на стабильный способ ex-vivo и на композицию для восстановления, воспроизведения или усиления способности этой системы окисления полифенолов для применения в физиологии животных или других биологических приложениях вне контекста биохимии растений in vivo.

Поверхности, через которые осуществляется контакт со средой, и иммунологические потребности царства растений во многих отношениях являются сходными с таковыми у животных. Наружные ткани растений, такие как кутикулы листьев, кожура плодов и шелуха семян, представляют собой живые ткани, адаптированные для защиты против аналогичных патогенов и физических стрессов, как и человеческая кожа и слизистая оболочка. Животные и растения также имеют некоторые аналогичные механизмы для того, чтобы справляться с поражением. Биохимические механизмы, используемые в растениях, как таковые, могут применяться к животным.

В другом аспекте способ получения стабильных биохимических систем включает экстрагирование стабильного полифенольного субстрата в композиции, не содержащей активных восстановительных агентов, ферментов или катализаторов, и объединение данного полифенольного субстрата с концентрированным источником активных форм кислорода, что стимулирует инициацию и развитие окислительных реакций при использовании или объединении с раздельным источником подходящих оксидоредуктаз или катализаторов.

Композиции согласно некоторым воплощениям данного изобретения вводят пероксид водорода в достаточно высоких концентрациях в водный раствор растительного биополимера для установления секвестрирования или стабилизации концентрированных окислителей в тесной реакционной близости с гидроксильными функциональными группами данных полифенолов. Данный секвестрированный окислитель не подвержен диффузии из данного биополимера, когда его подвергают разведению. Восстанавливающие агенты в препаратах, содержащих комбинацию окислитель-полифенол, удаляют или денатурируют для того, чтобы сделать данную комбинацию окислитель-полифенол по существу неактивной по отношению к белкам до приведения в контакт с поверхностью, тканью, организмом, покрытием или раствором, который дает источник оксидоредуктазных ферментов или других каталитических агентов, которые прямо или косвенно опосредуют превращение данного биополимера в активированную форму.

В другом аспекте данные композиции обеспечивают эффективное специфичное в отношении мишени образование окисленных биополимеров, опосредованное ферментами животного происхождения. Этот механизм обеспечивает доставку полезных с медицинской и промышленной точки зрения эффектов в тракты или ткани животного организма. Эти эффекты являются аналогичными основным растительным ответам на повреждение. Многие из вовлеченных биохимических реакций хорошо изучены, но все еще не полностью понятны. Тем не менее, нет данных из предшествующего уровня техники по стабилизации и применению стабилизированной комбинации окислителей и полифенолов к физиологии животных или патогенам в качестве источника ферментативной активации. Обычные во многих растениях, бактериях и грибах ферменты, действующие на образование комплексов фенолов, такие как лакказы или фенолоксидазы, являются функционально аналогичными обычным животным ферментам, таким как каталазы, пероксидазы, которые также могут вызывать образование хиноновых групп с повышенной аффинностью в отношении аминокислот белков.

В некоторых воплощениях полученный жидкий раствор имеет много существенных практических преимуществ над традиционными типичными противомикробными растительными экстрактами. Они включают повышенную растворимость в воде и способность к доставке, стабильность в более широком диапазоне pH, более высокую температурную стабильность, предсказуемую эффективность, низкую токсичность для животных, низкие минимальные ингибиторные концентрации в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий, слабый запах и вкус, эффективность при использовании сырья и отсутствие вредных для окружающей среды продуктов распада.

Некоторые воплощения настоящего изобретения имитируют защитные механизмы растения, которые развивались вместе с патогенами окружающей среды в течение многих миллионов лет. Неспецифичное белок-связывающее действие активированных биополимеров включает многие активности, которые могут вызвать инактивацию микробов. Все они являются радикально отличными от традиционных бактерицидных действий или действий антибиотиков и со значительно меньшей вероятностью стимулируют устойчивость способом, который был ассоциирован с субтерапевтическим применением и загрязнением окружающей среды антибиотиками.

Данные окисленные полифенолы могут иметь несколько биологических механизмов действия. Одна такая полихиноновая молекула может содержать от нескольких до тысяч сайтов связывания в плотной и неразбавленой популяции так, что данное соединение может поперечно связывать и конденсировать аминокислоты и белки поврежденных организмов с образованием стойкого барьера против патогенов и раздражителей. Данное соединение способно связываться и вызывать значительное нарушение и инактивацию метаболических путей и вирулентных эффектов данных патогенов. Они способны физически агломерировать, уносить или иммобилизировать патогены для предупреждения распространения данных патогенов. Хиноновые или фенольные формы также могут вызывать высвобождение окислительных радикалов, обуславливая повреждение мембраны и лизиса патогенов. Они также способны блокировать рецепторы, ответственные за болевые и воспалительные ответы.

Полифенолы, полученные в соответствии с воплощениями данного изобретения, могут быть отдельными растворимыми полимерами, сложными молекулами, макромолекулярными конгломератами или агрегатами с белками или клеточными фрагментами. Стабилизирующая секвестрация окислителей может происходить в результате аффинностей на основе водородных связей, поделенных электронов или в результате капиллярных эффектов в большем масштабе.

Во многих ситуациях может быть полезной стимуляция гетерогенных смесей активированных биополимеров с целью максимизации биоактивности/биодоступности против более широкого интервала патогенов. Данная комбинация полифенолов, экстрагированных из многих растительных материалов, может служить для дальнейшего расширения спектра связывания. В некоторых случаях не все фенольные субъединицы претерпевают превращение в хиноны, и данный субстрат может сохранять характеристики и свойства неокисленных соединений, помимо хиноновых свойств.

Обычному специалисту в данной области будет понятно, что многие другие природные или синтезированные органические полимеры также могут окисляться с образованием множества карбонильных или хиноновых функциональных групп, которые можно использовать вместо полифенолов или в сочетании с ними.

В некоторых аспектах для запуска окисления полифенолов используют нерастительные ферменты. Это обеспечивает введение раствора стабильного полифенольного окислителя для пассивного прохождения через тракты организма животного с целью доставки непрореагировавших веществ в пораженные ткани, доступ в которые практически не может быть получен другими способами, увеличивая посредством этого эффективную биодоступность данной полезной композиции. Катализируемое мишенью образование хинонов ограничивает неспецифичные биохимические реакции непосредственной близостью пораженной ткани, посредством этого уменьшая риск нежелательных эффектов на всю ткань или системного взаимодействия.

Существование функционально идентичных ферментов в животном и растительном царствах делает возможным новый перенос реакций полифенолов, опосредованных ферментами, на нерастительные применения. Например, ЖК (желудочно-кишечный) тракт высших позвоночных имеет два разных типа пероксидаз. Первый тип включает растворимую пероксидазу, обнаруженную в слизи пищеварительного тракта как крыс, так и свиней, которая секретируется из эозинофилов иммунной системы. Второй тип включает нерастворимую пероксидазу, обнаруженную в клетках слизистой ЖК тракта, которая высвобождается только при ранении. Данный второй тип пероксидазы в основном представляет собой функциональный эквивалент пероксидаз, участвующих в образовании полихинонов при ответной реакции растений на повреждение, и может сайт-специфично запускать хиноновую активность в непосредственной близости поврежденных, восприимчивых или инфицированных клеток, оставаясь пассивным в здоровой ткани.

Такая стабильная композиция полифенол-окислитель оказывает особенно полезные биохимические эффекты при поражении ткани или на раздраженную слизистую оболочку пищеварительного тракта, дыхательных путей, мочевых путей, половых путей или на другие слизистые поверхности в организмах высших животных. При проглатывании данная композиция в жидком растворе будет пассивно доставляться к месту поврежденных клеток и инфекции, где оксидоредуктазные ферменты будут катализировать полихиноновую активность. Данные полихиноны будут поперечно связывать и конденсировать клеточные белки поврежденных клеток хозяина в защитный барьер. Неспецифичное высокоаффинное связывание с поверхностными белками, ферментами, рецепторами и структурами, важными для метаболизма, вирулентности и подвижности, иммобилизует и инактивирует очень широкий спектр патогенов. Скопление патогенов также может увеличивать потенциальную антигенность для вызова иммунных ответов хозяина.

В одном аспекте настоящего изобретения сильный, но локализованный вяжущий эффект на пораженную ткань может уменьшать жидкие экссудаты. Известно, что нелокализованные общие вяжущие свойства от высоких концентраций танинов и других полифенолов в пищеварительной системе препятствуют поглощению питательных веществ и могут вызывать повреждения слизистой; тогда как локализованная у мишени активация свойств хинонов минимизирует эти проблемы.

В некоторых аспектах данные композиции включают новые биоактивные системы микробного контроля и защиты тканей. Данная смесь биоактивного вещества и предшественников активации катализируется различными ферментами животных, растительных или микробных клеток. При ассоциации активирующего фермента с интересующей тканью, такой как раненая или инфицированная ткань, прием внутрь или нанесение неактивированной композиции будет обеспечивать проход к пораженной ткани, даже находящейся глубоко в тракте организма. Высвобождение окислительных радикалов и сайт-специфичное образование активированного растительного материала на ткани-мишени значительно увеличивает биодоступность и ограничивает повышенную активность в непосредственной близости от источника фермента для пониженного коллатерального взаимодействия с другими тканями.

В некоторых из данных воплощений биоактивным веществом на основе растений могут быть полифенолы или любые биомолекулы, синтетические полимеры, агрегаты маленьких молекул, клеточные фрагменты или поперечно-связанные группы соединений, включающие до десятков тысяч экспонированных активных сайтов.

Многие растения можно использовать в качестве недорогого источника подходящих полифенолов. Лист Camellia sinensis является примером хорошего источника растительного сырья из-за общедоступности культивируемых источников, подтвержденной в литературе низкой природной токсичности и высокого содержания водорастворимых полифенолов. Флавонольная группа полифенолов (неокисленные катехины) составляет вплоть до 30% сухой массы листа Camellia sinensis, делая его экономически выгодным источником. Эффективные противомикробные вяжущие композиции также получали из многих различных видов растений и тканей, включая зерна ржи, золотистую фасоль, кожицу японской редьки, кожуру граната, ягоды толокнянки, кожицу алое, свечевой кактус (organ pipe cactus), китайский галл, листья душицы, плод хурмы, зародыши пшеницы, зерна ячменя и кофе-бобы, что демонстрирует повсеместную природу этого растительного защитного механизма в царстве растений.

В некоторых аспектах способы экстрагирования полифенольного субстрата из растительных материалов обеспечивают стабильное приготовление в виде препарата, хранение и доставку за счет того, что имеются экстракты, которые содержат по существу свободные активные оксидоредуктазы или другие восстанавливающие агенты. Некоторые аспекты данного изобретения включают тепловую денатурацию или денатурацию растворителем растительного сырья с получением растительного биополимерного компонента, не содержащего активных ферментов, окисляющих полифенолы. Доступность запасов сырья и разные типы растительных тканей возможно могут влиять на выбор переработки. Например, обезвоженные или высушенные растительные материалы уже лишены пероксида водорода и, следовательно, могут претерпевать ферментативные процессы денатурации после экстракции полифенолов.

Пример эффективного способа получения экономически выгодного источника полифенольного сырья, не содержащего деградирующих ферментов, включает быстрое высушивание свежесобранных целых листьев Camellia sinensis в воздухе при высокой температуре для денатурации полифенолоксидаз, которые могут вызвать окисление полифенолов зеленых листьев. Этот способ сохраняет состав, очень близкий к составу живых листьев чая, за исключением потери пероксида водорода, воды и небольшого числа ферментативных изменений, которые обычно очень быстро происходят при сборе. Данные листья затем измельчают, чтобы способствовать обработке и эффективности экстракции.

Напротив, черный чай подвергают примеру альтернативного способа изготовления. В данном способе изготовления листья Camellia sinensis дробят, и их клеточные структуры разрушаются в то время, как они все еще содержат активную полифенолоксидазу. Это инициирует ферментативное аэробное окисление катехинов до хинонов, которые спонтанно конденсируются с образованием летучих соединений. Растительный материал, переработанный таким образом, все еще способен быть полезным источником полифенолов, но данный растительный материал будет иметь меньшее содержание полифенолов и потребуется дополнительная денатурация ферментов путем нагревания растительного материала или его экстракта до достаточной температуры (предпочтительно от 80°C до 110°C) для обесцвечивания или денатурации ферментов. Растворитель, денатурирующий белки, такой как этанол, можно использовать в качестве альтернативы в способе экстракции растительного материала для разрушения или удаления клеточных ферментов.

Большинство растений продуцируют пероксид водорода как часть обычных биологических активностей, а также в ответ на стресс. Концентрация H₂O₂ в растительной ткани чрезвычайно варьирует в зависимости от вида, типа ткани, стресса, вызванного влиянием окружающей среды, и сезонов. Он теряется или потребляется при типичной переработке после сбора, и его получение из природных источников обычно не является практичным, особенно принимая во внимание низкую стоимость синтетических эквивалентных окислителей.

В некоторых воплощениях способы и композиции согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения включают экзогенную добавку пероксида водорода, что может быть практичным с промышленной точки зрения, и стабильного источника активных форм кислорода для улучшенного образования хиноновых субъединиц в полифенолах. Обычный специалист в данной области также поймет, что для разных применений можно использовать другие прямые источники активных форм кислорода, такие как озон, пероксид цинка, пероксидазы, пероксид карбамида, перкарбонат натрия, пероксид кальция, пероксид магния, перборат натрия моногидрат, озонид (О₃^-), супероксид (O₂^-), оксид (О^2-), диоксигенил (O₂⁺), или можно использовать непрямые источник(и) активных форм кислорода, такие как газообразный кислород, диссоциированная вода, каталитически расщепленные жирные кислоты, глюкоза и полифенолы.

В некоторых аспектах воплощения настоящего изобретения включают комбинации высокой концентрации активной формы кислорода, такой как пероксид водорода, с полифенольным субстратом для обеспечения стабилизирующей среды, которая препятствует диффузии молекул пероксида водорода из непосредственной реакционной близости к данным фенольным субъединицам. Полифенольные структуры обеспечивают много возможностей образования нековалентных связей и притяжения зарядов с молекулами пероксида водорода. Пероксид водорода также представляет собой продукт автоокисления полифенолов, помогая поддерживать общее равновесие в растворе. Стабильные секвестрации способны защищать пероксид водорода от нагревания, воздействия ультрафиолета, восстанавливающих примесей и спонтанной деградации.

На Фиг.1 проиллюстрированы несколько путей реакции для превращения фенольной субъединицы 102 в хиноны 104 или полихиноны 106 согласно одному воплощению данного изобретения. Термин «хинон» в том виде, как он здесь используется, относится ко всем хиноновым соединениям, таким как хиноны и полухиноны. Пероксид водорода 108 может быть и источником активных форм кислорода для инициации окисления, и также может быть продуктом окисления полифенолов. Следовательно, в растворе с полифенолами может устанавливаться стабильное равновесие. Сразу после возникновения данный источник активных форм кислорода (АФК) облегчает эффективное развитие образования хинонов через полифенольные субстраты даже без прямого ферментативного опосредования. Концентрированный Н₂О₂ в воде, следовательно, является хорошим окислительным компонентом. Однако образования пероксида водорода можно достичь непрямым способом через другие реакции, такие как, например, разложение озона, жирных кислот или перкарбонатов. Клеточные оксидоредуктазы также могут участвовать в непрямой генерации форм кислорода, участвующих в инициации или развитии каскада окислительных реакций. Например, каталаза, которая защищает животные клетки и многих патогенов от повреждения АФК, будет разлагать H₂O₂ на воду и активные формы кислорода.

Пероксид водорода продуцируется в растительных и животных клетках естественным путем, но его концентрация может чрезвычайно варьировать, в зависимости от вида, сезона, стресса и типа ткани. Несмотря на то, что определенные типы растений, такие как суккуленты, могут запасать в своих тканях значительные количества пероксида водорода, обычно является нецелесообразным экстрагировать его из растительных источников из-за присутствия восстанавливающих ферментов, отделенных от пероксида водорода и/или полифенолов лишь хрупкими субклеточными перегородками, которые неизбежно разрушаются типичными промышленными способами экстракции. Смешивание запускает окислительную ответную реакцию на повреждение и быстро потребляет данный пероксид водорода, оставляя избыток полифенолов, ферментов и других невовлеченных растительных соединений.

Некоторые аспекты настоящей заявки включают применение отдельно изготовленного или генерированного источника активных форм кислорода в комбинации с полифенольным субстратом, по существу не содержащим активных восстанавливающих агентов или ферментов.

В некоторых воплощениях композиции окислитель-биополимер представляют собой водные растворы. В альтернативных воплощениях волокна, гидрогели, микропористые среды, мицеллы, эмульсии и другие структуры физически инкапсулируют данную композицию биополимер-окислитель. В других воплощениях смеси сухих порошков, гранул или других нежидких веществ, несущих полифенолы, объединенные с сухим оксилителем, таким как перкарбонат калия, используют в виде набора для осуществления гидратации с получением полезного раствора полифенол-окислитель.

В некоторых воплощениях данный катализатор доставляют в сайт-мишень раздельно в виде жидкости, аэрозоля или в виде поверхностного покрытия на аппликаторе, повязке или очистительном приспособлении. Примером этого является абсорбирующая губка, пропитанная восстанавливающим агентом, таким как каталаза или медь, которая будет вызывать быстрое высвобождение радикалов кислорода и образование хинона при приведении в контакт с композицией полифенол-окислитель. Это можно использовать для генерации сильного бактерицидного действия, особенно для разрушения вирусов на небиологических поверхностях и для дезинфекции здоровых тканей в отсутствие экспонированных каталитических ферментов. Например, вирусные оболочки обычно не имеют ферментов, но составлены из белков, которые могут связываться полихинонами. Таким образом, для инициации противовирусных/бактерицидных реакций можно использовать раздельно доставленные катализатор или фермент.

В некоторых аспектах полихиноновые соединения согласно данным воплощениям содержат такие средства, как микробный флокулянт. Добавление этих полихиноновых соединений в загрязненный источник воды может вызывать агрегацию микроорганизмов в массы, которые либо выпадают в осадок, либо могут легче отфильтровываться механическими способами. Отложение полихиноновых соединений на механические фильтрующие среды может улавливать белки и микроорганизмы, придавая бактерицидные характеристики. Это может осуществляться нанесением активированного полихинона на фильтрующую среду или циркуляцией композиций, образующих полихиноны, через фильтрующие среды, которые имеют каталитическую составляющую на их поверхности, такую как бактериальная биопленка. Это может найти применение во многих приложениях с рециркуляцией и фильтрацией с одним пропусканием.

На Фиг.2 проиллюстрирована композиция 200, полученная согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения. Данная композиция 200 содержит биополимеры 202, содержащие молекулы 204, содержащие гидроксильные группы. Молекулы 204, содержащие гидроксильные группы, проиллюстрированы как полифенолы, но могут представлять собой фенолы, полифенолы, полисахариды или их комбинации. В альтернативных воплощениях молекулы 204, содержащие гидроксильные группы, представляют собой танины, лигнины и флавоноиды. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что биополимеры 202 могут быть любыми молекулами с короткими связями (как, например, от 2 до 100 повторяющихся единиц или от 100 до 1000 повторяющихся единиц), макромолекулами, длинноцепочечными молекулами, молекулами с циклическими структурами, молекулами с упакованными л-электронами и/или молекулами с упакованной структурой. Кроме того, биополимеры 202 также могут представлять собой любое вещество, которое можно производить или получать из растений, или искусственные синтетические молекулы. Кроме того, биополимеры 202 можно получать из комбинаций растений. Например, экстракт растения А содержит высокое соотношение полифенолов, и экстракт растения Б содержит высокое соотношение полисахаридов. Биополимер 202 можно получать из смеси экстрактов как растения А, так и растения Б. В таком случае 70% биополимера 202 может происходить из растения А, и 30% биополимера 202 может происходить из растения Б, так что композиция 200 может иметь химические свойства, более близкие к полифенолам, чем к химическим свойствам полисахаридов. Таким образом, желательные реакционные свойства композиции 200, такие как желательная реакционная способность и скорость реакции, могут быть разработаны посредством использования разных комбинаций растений А и Б.

Композиция 200 также может содержать окислительный реагент 206 и/или фермент 208. В некоторых воплощениях окислительный агент 206 содержит активные формы кислорода. В некоторых воплощениях окислительный агент 206 происходит из имеющегося в продаже пероксида водорода 210, например, более 60%, 20%-60%, 35% и 8%-20% H₂O₂ в воде. В альтернативных воплощениях окислительный агент 206 содержит 1-2% или менее чем 10% H₂O₂ в воде. В некоторых воплощениях окислительный агент 206 образуется из реакции озона 212, жирной кислоты 214 или перкарбоната 216. В некоторых воплощениях окислительный агент 206, такой как пероксид водорода, продуцируется эндогенно данным биополимером или данными растениями. В альтернативных воплощениях окислительный агент 206 экзогенно добавляют в данную систему, как, например, путем добавления имеющегося в продаже пероксида водорода в раствор биополимера 202 и фермента 208.

В некоторых воплощениях фермент 208 образуется эндогенно или его добавляют экзогенно. Например, фермент 208, используемый для активации или облегчения данной реакции, образуется патогенами 230 на ткани животного 218. В качестве альтернативы, фермент 218 образуется в клетках/тканях животных 218 и/или растений 232. Кроме того, данный фермент можно добавлять в раствор, содержащий биополимер 202 и окислительный агент 206, перед нанесением композиции 200 на животное или растение.

В некоторых воплощениях молекула 204, содержащая гидроксильную группу, образует хиноновые соединения 234 и/или 246. Хиноновые соединения 234, 242, 244, 246, гидроксильная группа 236, 238, 240 и молекула 204, содержащая гидроксильную группу, могут обеспечивать взаимодействия, такие как силы ковалентного связывания, взаимодействия за счет водородных связей или взаимодействия упакованных электронов, для поддержания активных форм кислорода (АФК), локализованных в реакционной близости. Данные активные формы кислорода могут быть окислительными реагентами.

На Фиг.3 показана стадия 300 способа получения композиции на основе растения согласно одному воплощению настоящего изобретения. На стадии 302 активные восстанавливающие агенты или катализаторы инактивируют или удаляют. На стадии 304 экстрагируют полифенольные субстраты, по существу не содержащие активных восстанавливающих агентов или катализаторов. На стадии 306 данные полифенольные субстраты смешивают с источником активных форм кислорода и/или катализаторами для инициации и развития окислительных реакций. Как описано выше, источник активных форм кислорода, таких как пероксид водорода, может добавляться экзогенно или эндогенно генерироваться растительным экстрактом. Аналогичным образом, катализаторы для инициации окислительных реакций могут добавлять экзогенно или эндогенно получать в используемом сайте, таком как сайт, инфицированный патогеном, или область пораженной ткани. На стадии 308 данную смесь наносят на сайт-мишень, такой как пораженная область животного. Способ 300, описанный выше, представляет собой одно воплощение. Все данные стадии являются необязательными, и могут быть добавлены дополнительные стадии. Последовательность данных стадий может находиться в любом порядке. Применимыми являются другие вариации. Например, раствор, по существу не содержащий восстанавливающих катализаторов и содержащий полифенолы, экстрагированные из растения, смешивают с пероксидом водорода. Данный раствор можно хранить в контейнере для последующего процесса активации. Данный раствор активируют через активирующий механизм после доставки в сайт животного, инфицированный патогеном, который генерирует катализаторы для активации данных реакций. В других примерах раствор, содержащий полифенол и пероксид водорода, активируют экзогенным добавлением катализаторов до нанесения на мишень, такую как сайт животного или растения.

На Фиг.4 показана стадия 400 способа инактивации восстанавливающих агентов/ферментов растворителем согласно воплощению данного изобретения. На стадии 402 выбирают растения, которые используют для создания композиции на основе растений. На стадии 404 полифенольные композиции экстрагируют из данного растения с использованием раствора. На стадии 406 данный раствор нагревают до температуры от 80°C до 110°C с обесцвечиванием для денатурации данных ферментов. На стадии 408 используют растворитель, денатурирующий белки, такой как этанол, для разрушения или удаления клеточных ферментов, содержащихся в данном растении.

На Фиг.5 показана стадия 500 способа инактивации восстанавливающих агентов/ферментов нагреванием согласно воплощению данного изобретения. На стадии 502 выбирают растение, используемое для получения композиции на основе растения. На стадии 504 полифенолоксидазу из данного растения денатурируют быстрым высушиванием целых листьев Camellia sinensis в воздухе при высокой температуре. На стадии 506 данный водный клеточный фермент удаляют и/или инактивируют. На стадии 508 листья измельчают. На стадии 510 добавляют растворитель для экстракции полифенолов.

На Фиг.6 проиллюстрированы некоторые варианты применения композиции на основе растения согласно некоторым воплощениям. Данные варианты применения включают, например, животные пищевые добавки, коагуляцию ткани животного, образование барьера для патогена, реакции, запускаемые мишенью, экзогенное добавление окислительного фермента для биоцидных применений, секвестрацию пероксида водорода, рассчитанную по времени доставку, остановку метаболизма патогена, лекарственные напитки, антагонисты рецепторов, микробные флокулянты, консервацию биологического вещества, противомикробную промывку, сельскохозяйственные применения, очистку прудовой воды, обработки поверхности медицинских устройств и носители для медицинской доставки.

Некоторые механизмы действия согласно воплощениям включают функцию активации мишенью плотной популяции высокоаффинных, низкоспецифичных сайтов связывания на относительно большом биомолекулярном субстрате. В некоторых воплощениях используют экстракт целого растения. В некоторых воплощениях смесь растений смешивают с разными доминирующими фенольными соединениями с разными молекулярными массами со слегка отличающимися аффинностями в отношении белков так, чтобы можно было обеспечить самый широкий возможный интервал активности.

Типично концепция разработки традиционных лекарственных средств была сфокусирована на высокоспецифичных молекулярных взаимодействиях. Для сравнения, в некоторых воплощениях данного изобретения используют неселективную активность, которую делают высокоэффективной и безопасной посредством сайт-специфичной активации. В некоторых воплощениях настоящего изобретения молекулярные комплексы проходят через пищеварительную систему в водном растворе молекул, что сохраняет необходимые многочисленные активные компоненты, секвестрированные в прямой реакционной близости к друг другу, несмотря на градиенты диффузии при высоких уровнях разведения. Это поддерживает полную биодоступность до достижения поврежденных слизистых тканей или патогенов, которые представляют подходящие ферменты для активации данного комплекса. Активация в данном сайте катализирует высоколокализованную трансформацию пассивного молекулярного комплекса в активный связывающий белки агент с сотнями или тысячами потенциальных активных сайтов, которые являются значительно более активными, чем два сайта связывания, находящиеся на антителах. Эта высокоспецифичная для сайта активация и неабсорбированная природа больших «клейких» полимеров создает мощное, точно нацеленное действие, которое представляет минимальный вредный системный потенциал. Скопление этих «клейких» растительных биополимеров прочно прикрепляется к сайту-мишени и начинает имитировать высокоэффективную механическую иммунную реакцию, которая обычно происходила бы в месте повреждения растения.

В некоторых воплощениях данные механизмы в растительной иммунологии, описанные выше, применяют к животным. Данные механизмы включают (1) неспецифичное связывание с функциональными путями инфицирующих бактерий или дрожжей, что может уничтожать данные бактерии или дрожжи путем ухудшения их метаболизма и репродукции, (2) связывание с токсинами (обычно белковыми), присутствующими в данном сайте, и/или блокирование экспрессии патогенами большего количества ферментативных факторов вирулентности, (3) иммобилизацию и/или ухудшение их подвижности или вызывание агломерации, которая предотвращает распространение и выделение, (4) эффекты поперечного связывания белков поврежденных клеток в физический барьер, который уменьшает воздействие дополнительной инфекции или раздражения, (5) связывание с рецепторами воспалительных сигналов, функционирующими в качестве антагонистов для целого ряда физиологических ответов, (6) блокирование механизма проникновения в клетку или захват вирусов и/или предупреждение распространения и вирусовыделения и (7) локализованный вяжущий и барьерный эффект для уменьшения потери интерстициальной жидкости из поврежденных тканей.

В некоторых воплощениях эффективные дозировки являются очень небольшими по сравнению с физическими вяжущими веществами, используемыми в традиционном способе остановки диареи, и считается, что они являются недостаточными для создания какого-либо физического вяжущего эффекта, который был ассоциирован с повреждением кишечника или ухудшением поглощения питательных веществ, связанным с применением танинов.

Некоторые эксперименты проводят с использованием комплекса, полученного согласно воплощениям настоящего изобретения. Эффективность данных комплексов подтверждается соответствующим наблюдением улучшенного роста свиней, обработанных комплексами, приготовленными согласно некоторым из данных воплощений. Нечувствительность данных комплексов к разбавлению, пассивная природа на здоровой слизистой и минимальная активность на непатогенных бактериях являются некоторыми из факторов, которые обеспечивают и делают предпочтительной и более эффективной доставку в низкой концентрации в водном растворе.

Смесь, полученную согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения, можно использовать на пораженной ткани или на раздраженной слизистой оболочке пищеварительного тракта, дыхательных путей, мочевых путей, половых путей или другой поверхности слизистой у высших животных. Эти ткани и инфицирующие бактерии могут быть источником окислительных ферментов, которые катализируют превращение полифенольного субстрата в его окисленную форму. В некоторых воплощениях прием внутрь данной композиции фенола/окислителя, описанной выше, может направлять и/или опосредованно превращать данные полифенолы в полихиноновое (или о-полифенольное) соединение через прямое ферментативное превращение или автоокисление гидроксильных единиц пероксидом водорода, разложенным ферментом. Данная полихиноновая молекула затем может ковалентно связываться с белками данных клеток поврежденной ткани или с поверхностными белками патогенов для их иммобилизации, инактивации и/или конденсации. Связанные белки могут образовать защитный матрикс, который уменьшает способность патогенов к колонизации, обеспечивает сильное вяжущее действие, которое стягивает рану и уменьшает жидкий экссудат. Лежащие в основе этого реакции могут идти разными путями, в зависимости от специфичных ферментов, структуры и типа полифенольной молекулы, относительной концентрации окислителя, разбавляющей среды и т.д. Окислитель, который непосредственно не участвует в ферментативном образовании хиноновых единиц, может высвобождать окислительные радикалы, которые непосредственно повреждают клеточные структуры данных патогенов. Локализованный взрыв таких радикалов вблизи иммобилизованных патогенов создает сфокусированное бактерицидное действие, которое является значительно более эффективным, чем диффузное действие бактерицидных веществ в свободном растворе. Применение более чем одного растительного вещества в качестве субстратов или комбинаций с растениями с известной бактерицидной активностью без окисления в качестве дополнительных компонентов может быть желательным для увеличения спектра или эффективности противомикробной активности.

В других воплощениях данные окислительные ферменты могут быть доставлены к сайту реакции раздельно. В качестве примера, одно из воплощений включает уничтожение вирусов в отсутствие инфицированной ткани или бактерий путем обеспечения источника катализирующих ферментов. Вирусные оболочки обычно не имеют данных ферментов, но составлены из белков, которые могут связываться макромолекулой сразу после превращения в полихинон. Применение такого предварительно превращенного полихинона является пригодным в некоторых воплощениях.

Некоторые воплощения настоящего изобретения можно использовать в растворе в качестве бактерицидной добавки. Ее могут приводить в действие ферменты микроорганизмов, такие как бактерии и грибы, в отсутствие другой растительной или животной ткани. Данную бактерицидную эффективность на поверхностях или в растворе можно дополнительно усиливать путем добавления фермента или другого катализатора к поверхности, подлежащей лечению, или раствору, или нанесением данных композиций на поверхность, инструмент или сосуд, которые обрабатывают активирующим ферментом или катализатором.

Некоторые воплощения настоящего изобретения можно использовать в качестве микробного флокулянта, агрегирующего данные микроорганизмы в массы, которые либо выпадают в осадок, либо могут отфильтровываться механическими средствами. Агрегация возбудителей инфекции и их продуктов также может увеличивать потенциальную антигенность для стимуляции иммунных ответов. Вяжущая активность может быть цитотоксичной для данных возбудителей инфекции в результате (1) поперечного связывания, которое блокирует поверхностные белки клеток возбудителей инфекции и ферменты или рецепторы, компоненты трансдукции сигнала, поглощение питательных веществ и функции передачи и (2) снижения или ухудшения подвижности возбудителей инфекции и вирусов. Оба типа действий могут блокировать инфективность вирусов.

Бактерицидный тест продемонстрировал, что количество пероксида водорода, которое может быть израсходовано бактериями за 16 часов, можно использовать для полного умерщвления всех бактерий, без его потребления, при использовании композиции, приготовленной согласно воплощениям настоящего изобретения. Вещество на основе растения, которое не подвергается реакциям окисления, не показывает какого-либо бактерицидного эффекта. Это показало, что по меньшей мере некоторые из растворимых полифенольных соединений превращались в полихинон. В среде in vivo этот бактерицидный эффект на основе растения будет дополнительно увеличиваться, если количество каталазы или пероксидазы не является таким ограниченным. Трансформированное растение табака с химерной анионной пероксидазой табака способно продуцировать высокий уровень пероксидазы, и было продемонстрировано, что оно в 7 раз быстрее заживляет раны, чем нетрансформированное растение табака. Более вероятно, что повышенная эффективность превращения полифенола до хинона обусловлена значительным количеством ферментов, чем количеством данного субстрата.

Некоторые аспекты настоящего изобретения включают способность к поперечному связыванию белков. Танин имеет хорошо известную способность к связыванию белка. Однако связывание танин-белок основано на водородных связях, и предпочтительный связываемый белок представляет собой обогащенный пролином белок, обычно в слюне и в слизистой жидкости пищеварительной системы. В тесте на поперечное связывание белка и осаждение продемонстрировано, что яичный альбумин формировал густой и полный осадок в пределах 10 минут. Осаждение с использованием только растений занимало 3 суток для получения аналогичных результатов. Образец с одним лишь окислителем вообще не имел эффекта осаждения. Это указывает на то, что воплощения настоящего изобретения имеют значительно повышенную способность и эффективность поперечного связывания белка.

Некоторые из данных воплощений включают смесь бактерицидной и поперечно-связывающей белок композиции на основе растений и окислителя. Данная бактерицидная и поперечно-связывающая белок композиция на основе растений может содержать растение, имеющее высокое содержание фенольных соединений. Окислителем может быть пероксид водорода. Некоторые из способов, которые можно использовать для изготовления таких композиций, раскрыты в заявке на патент США с серийным №12/317638, поданной 23 декабря 2008 года и озаглавленной «БИОЦИДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ РАСТЕНИЙ», которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.

Некоторые воплощения настоящего изобретения можно применять к окислительно-восстановительным и/или радикальным реакциям растительных фенольных соединений. Данные растительные фенольные соединения могут включать фенолы, полифенолы, гидроксикумарины, флавоноиды, алкалоиды и любые другие компоненты с химическими субъединицами, аналогичными монофенолам или дифенолам, для окисления, восстановления или поперечного связывания других молекул в или на микроорганизмах, растениях и животных, генерируя, посредством этого, противомикробные эффекты, противовирусные эффекты, вяжущие эффекты и эффекты заживления ран на разных организмах или тканях-мишенях. Термины «хинон» и «полихинон», используемые в настоящем изобретении, включают любой мономер или органический полимер с конфигурациями ароматического кольца с одним или более чем одним кислородом, связанным двойной связью.

Данные композиции и способы можно использовать для облегчения заживления нанесенной раны на коже или для введения в пищеварительную систему для лечения любой инфекции пищеварительной системы. Данные композиции и способы также можно использовать в различных нацеленных приложениях, связанных с окружающей средой, таких как применения in vitro и in vivo.

В некоторых воплощениях применения по настоящему изобретению включают противомикробные средства, противогельминтные средства, закрепляющие/противодиарейные средства, анальгетики, противовоспалительные средства, косметические ингредиенты, кератолитические агенты, окислители для промышленных процессов, агенты, хелатирующие металлы и органические адгезивные средства. В альтернативных воплощениях данные физиологические применения включают антисептики, дезинфицирующие средства, вирулициды, фунгициды, вяжущие средства, тканевые адгезивные средства, защитные средства для ран, биопленочные предохранительные средства, противовоспалительные средства, анальгетики, гемостатические средства, консерванты продуктов, коагулянты, флокулянты, полоскания для полости рта, ирригационные средства, агенты для обработки ран, тонизирующие средства для желудка, антидиарейные средства, средства для лечения язвы, склеротирующие агенты, очистители воды, консерванты воды, окисляющие очистительные средства и дезодоранты. В альтернативных воплощениях данные применения включают прием внутрь данных композиций людьми или животными для лечения или предупреждения инфицирования, повреждения или поглощения патогенов или патогенных молекул тканями их пищеварительных систем. В других воплощениях данные применения включают предупреждение или лечение диареи животного через уменьшение жидких секретов посредством вяжущего, противовоспалительного или противомикробного действия. В некоторых воплощениях данные применения включают лечение эрозий, связанных с желудочным рефлюксом, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки или других поражений пищеварительной системы. В альтернативных воплощениях данные применения включают лечение раздражений или инфекций полости носа или уха. В других воплощениях данные применения включают противомикробные спреи для дыхательных путей для уменьшения патогенов и также для защиты выстилки дыхательных путей от инвазии патогенов, таких как бактерии, вирусы и грибы. В некоторых воплощениях данные применения включают спреи для дыхательных путей и промывания для пазух для того, чтобы смывать контактные аллергены. В альтернативных воплощениях данные применения включают промывания для мочевых путей для противоинфекционных или противовоспалительных лечений или обычные антисептические промывания для импланта мочевых путей и пациентов, которым проводится гемодиализ. В других воплощениях данные применения включают антисептическую защиту органа для трансплантации органа.

В некоторых воплощениях данные применения включают противомикробную промывную жидкость для бактерий, вирусов и дрожжевых инфекций на нормальной или поврежденной коже, поверхностных ранах или в любой слизистой полости. В альтернативных воплощениях данные применения включают тканевые адгезивные средства для ускоренного заживления, закрытия или гемостаза хирургических надрезов или ран. В других воплощениях данные применения включают лечение хирургических надрезов или местных ран для уменьшения рубцов. В некоторых воплощениях данные применения включают первую помощь при местных порезах, ожогах или царапинах. В альтернативных воплощениях данные применения включают асептические кремы, промывания, мази или средства для ирригации для лечения язв слизистой полости рта и для зубных процедур. В других воплощениях данные применения включают лечение периодонтита и лечение чувствительных зубов, такое как заливку микротрещин зубов. В некоторых воплощениях данные применения включают ополаскиватели для полости рта для галитоза. В альтернативных воплощениях данные применения включают примочки для дерматита, паховой эпидермофитии, вагинальных инфекций и эпидермофитии стопы. В других воплощениях данные применения включают противомикробные и заживляющие лечения ожогов, хронических ран и язв. В некоторых воплощениях данные применения включают предупреждение или уменьшение образования биопленки на тканях или поверхностях.

В альтернативных воплощениях данные применения включают сельскохозяйственные применения. Например, количество поверхностного патогена может быть уменьшено, и микрораны могут быть закрыты опрыскиванием или смачиванием растения композицией полифенол-окислитель. Кроме того, общее состояние здоровья растений может быть улучшено усилением поверхностной структуры или стимулированием усиленного роста или развития посредством реакций поперечного связывания.

В других воплощениях данные применения включают аэрозольные или жидкие спреи композиции в виде дезинфицирующего средства для биобезопасности для оборудования животных ферм. В некоторых воплощениях данные применения включают стерилизацию корма для животных. В альтернативных воплощениях данные применения включают добавки в пищу или в воду для консервации и предупреждения передачи заболеваний. В других воплощениях данные применения включают промывки для растений, свежих фруктов и овощей. Опрыскивающий или промывающий раствор, содержащий раскрытую здесь композицию, может убивать или подавлять рост поверхностных бактерий, продлевать срок хранения и защищать поверхность от инвазии вредителя или останавливать ее в живых сельскохозяйственных культурах или в сельскохозяйственной продукции. В некоторых воплощениях данные применения включают дезинфекцию растительных семян для хранения и очистку перед проращиванием. В альтернативных воплощениях данные применения включают консервирующий спрей или водную обработку для свежесрезанных цветов. В других воплощениях данные применения включают тканевое адгезивное средство для прививки растений и восстановления грунтовой воды.

В некоторых воплощениях данные применения включают спрей для консервации мяса и морских продуктов для уменьшения количества бактерий и для образования тонких слоев против переваривания для предупреждения микробной инвазии. Альтернативные воплощения включают дезинфицирующие средства для переработки мяса для предупреждения микробного загрязнения. В альтернативных воплощениях данные применения включают очистку прудовой воды для рыбных ресурсов, таких как рыба, креветки, устрицы, морские ушки и мидии. В других воплощениях данные применения включают лечение заболевания водных растений и животных. В некоторых воплощениях данные применения включают аквариумные дезинфицирующие средства, консервирующие добавки для продуктов, содержащих жидкость, дезинфицирующие ингредиенты для поверхностных очистителей, покрытия для медицинских устройств на основе хинонового редокс-циклирования, оборудование для подготовки одежды и пищи, дезинфекцию больничных помещений и инструментов, противомикробные гидратирующие растворы для медицинских устройств с гидрофильным покрытием и органические антикоррозийные обработки для металлов.

В альтернативных воплощениях данные применения включают средства против загрязнения промышленных вод, консерванты или средства против обрастания. В других воплощениях данные применения включают дезинфекцию воды в джакузи и бассейне. В некоторых воплощениях данные применения включают носители для низкомолекулярных терапевтических соединений. В альтернативных воплощениях данные применения включают стабилизаторы для окислителей, модификацию аромата пищевых продуктов и инъекцию в опухоли и кисты.

В некоторых воплощениях данные композиции могут присутствовать в форме сухого порошка. Данную композицию можно скармливать животному в форме сухого порошка или в комбинации с по меньшей мере одной жидкостью. Данные композиции в сухой форме могут содержать полифенол или полимерные молекулы, активные формы кислорода, катализаторы или их комбинацию. Активные формы кислорода могут содержать перкарбонат натрия, перкарбонат калия и/или любое другое вещество, которое может активировать полифенол и/или полимерные молекулы. Активные формы кислорода, вещество, содержащее полифенол или полимерные молекулы, катализатор или их комбинацию можно скармливать животным одновременно или раздельно.

В некоторых воплощениях используемый здесь термин «полифенолы» включает более чем одну фенольную единицу или строительный блок на молекулу. В альтернативных воплощениях термин "полифенолы" включает одну фенольную единицу на молекулу. В других воплощениях термин "полифенолы" включает гидролизуемые танины (эфиры галловой кислоты глюкозы и других Сахаров) и фенилпропаноиды, такие как лигнины, флавоноиды и конденсированные танины.

В некоторых воплощениях количество пероксида водорода, добавленного к раствору, содержащему полифенол, составляет 1-2%. В альтернативных воплощениях количество пероксида водорода, добавленного к раствору, содержащему полифенол, составляет менее чем 10%. Специалисту обычной квалификации в данной области будет понятно, что можно использовать любые концентрации пероксида водорода, пока концентрация пероксида водорода не является слишком высокой для чрезмерного взаимодействия с полифенолами в данном растворе. Реакции с чрезмерным взаимодействием включают обеспечение концентрации пероксида водорода, которая делает активированные полифенолы неспособными к выполнению функций, описанных в настоящей заявке.

В некоторых воплощениях используемый здесь термин «жидкость» включает жидкость, газ, сверхкритическую жидкость, подвижную твердую форму вещества или их комбинацию. В некоторых воплощениях термин «патоген» включает любые инфекционные агенты, микробы, бактерии, вирусы или их комбинацию. В некоторых воплощениях термин «патоген» включает любые биологические вещества, которые могут потенциально вызывать заболевание, расстройство, повреждение, вред или отрицательное влияние на хозяина, такого животное или другая биологическая субстанция. В некоторых воплощениях термин "биополимер" включает любые вещества, которые можно производить или получать из растения, животного или биологических веществ. В альтернативных воплощениях термин «биополимер» включает любые полимерные молекулы, продуцируемые биологическим организмом, таким как живое растение. Кроме того, термин «биополимер» может включать целлюлозу и крахмал, белки и пептиды, ДНК и РНК. В некоторых воплощениях термин «биополимер» включает многочисленные единицы сахаров, аминокислот и нуклеотидов. В некоторых воплощениях термин «аффинность связывания» включает любые межмолекулярные или внутримолекулярные взаимодействия и/или связи. Например, ковалентные связи, ионные связи, водородные связи, дипольные моменты, индуцированные дипольные моменты и электростатические силы. В некоторых воплощениях термин «реакционная близость» относится к любому взаимодействию, которое существует между двумя или более чем двумя молекулами/атомами, так что данные две или более чем две молекулы не беспорядочно свободно движутся в растворе.

В некоторых воплощениях термин «эффект в инактивации патогена», раскрытый здесь, включает блокирование доступа патогенов к животным/растительным тканям, затруднение метаболических путей патогенов, связывание вирусных факторов, иммобилизацию/агрегацию патогенов и/или осуществление окислительных повреждений патогенов. В некоторых воплощениях источники активных форм кислорода и/или пероксида водорода могут быть получены из природных и искусственных источников, таких как мякоть алоэ и/или кинза. В некоторых воплощениях данный активированный полифенол включает о-полифенол, окисленный полифенол, полифенон и полихинон.

Термин «переработанная жидкость» может включать жидкость, которая переработана искусственно и/или биологически. Термин «биологически переработанный» может относиться к тому, что добавленная композиция переработана биологической субстанцией, такой как животное. Термин «искусственно переработанный» может включать фильтрацию, высушивание, выделение, экстракцию или любые другие промышленные или химические/биологические лабораторные способы. Например, термин «переработанная жидкость» может включать ситуацию, когда сухую порошковую форму веществ скармливают животным, и, при наличии жидкости животных или добавленной жидкости для растворения или диспергирования данного сухого порошка, тем самым получают переработанную жидкость. Данный сухой порошок может содержать и полифенолы, и активные формы кислорода, такие как перкарбонат натрия и перкарбонат калия, для скармливания животным. В качестве альтернативы, данный сухой порошок может содержать главным образом полифенолы. Активные формы кислорода можно скармливать животному в жидкой форме совместно или раздельно с сухим порошком. В другом альтернативном воплощении данная сухая порошковая форма может содержать, главным образом, активные формы кислорода. Молекулы, содержащие полифенолы или гидроксильные группы, можно скармливать животным в жидкой форме совместно или раздельно с сухим порошком.

Следующие эксперименты показывают эффективность композиций, полученных согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения.

Эксперимент 1

Три образца очищенного порошкообразного бычьего сывороточного альбумина (БСА) получали в водном растворе. Образец №1 содержал только БСА. Образец №2 содержал БСА и полифенолоксидазу. Образец №3 содержал БСА, полифенолоксидазу и пероксид водорода. Каждый образец показывал аналогичную стационарную мутность через 30 минут при измерении спектрофотометром. К каждому из образцов добавляли водный раствор полифенолов (танин) из китайского галла. Через один час образец №1 показывал мало видимых изменений. Образец №2 демонстрировал увеличение мутности из-за возросшего размера частиц, указывая на небольшую коагуляцию белка. Образец №3 показывал тяжелый осадок на дне пробирки и отсутствие мутности, демонстрируя то, что может достигаться значительное увеличение коагуляции белка посредством ферментативной реакции полифенолов с источником активных форм кислорода.

Эксперимент 2

Раствор китайского галла и пероксида водорода добавляли в (1) пробирку, содержащую порошковый куриный яичный белок (способы сушки, используемые в изготовлении порошкового яичного белка, денатурируют ферменты), разведенный в воде, и (2) пробирку, содержащую свежий куриный яичный альбумин в воде. Значительно большее осаждение наблюдали в образце свежего куриного яичного альбумина, демонстрируя то, что ферменты животного происхождения могут катализировать превращение растительных полифенолов для увеличения связывания белка, сопоставимого с образованием хинонов при повреждении растения.

Эксперимент 3

Препарат А получали с использованием способа, описанного ниже. Один грамм имеющегося в продаже порошкообразного зеленого чая готовили в 1 литре деионизированной воды в 1-литровом стакане Pyrex и оставляли экстрагироваться при комнатной температуре в течение 6 часов. В данный раствор добавляли 35%-ный пероксид водорода пищевого качества, давали постоять в течение 4 часов, затем фильтровали через среду с 2 мкм отверстиями или фильтр. Образующийся маточный раствор разводили водой с сопротивлением 18 мОм в соотношении 1000:1, 200:1 и 100:1. 15 мл разбавленных растворов добавляли к равной части культуральных растворов, содержащих 10⁷ (клеток) культур дикого штамма Е. coli (водные контроли), и инкубировали при 37°C. В момент 2 ч, 4 ч, 6 ч и 8 ч образец из каждой серии тестов наливали на чашки с агаром, инкубировали и проводили подсчеты колоний вручную. В образце с разведением 100:1 достигалось 100%-ное умерщвление за 4 часа, в образце с разведением 200:1 достигалось 100%-ное умерщвление за 6 часов, и образец с разведением 1000:1 оказывал лишь бактериостатическое действие. Это демонстрирует возможность производства композиции на основе растений с высокими бактерицидными возможностями с исключительно низкими затратами сырья и энергии.

Эксперимент 4

Культуру дикого штамма Е. coli добавляли к трем образцам. Образец А содержал 25 млн^-1 пероксида водорода в воде. Образец Б содержал раствор препарата А, разбавленный до эквивалента 25 млн^-1 доли пероксида водорода. Раствор В содержал раствор, имеющий экстракт зеленого чая такой же концентрации, что и препарат А, но без пероксида водорода. Данная популяция бактерий в пероксиде водорода (образец А) исходно уменьшалась, но начинала демонстрировать повышенную видимую мутность через 16 часов, указывая на истощение противомикробного потенциала. Один экстракт зеленого чая (препарат В) демонстрировал небольшую заметную противомикробную активность. Препарат А (образец Б) продолжал уничтожать бактерии и не демонстрировал обратной реакции через 3 суток, указывая на 100%-ное уничтожение и/или на повышенную противомикробную эффективность, что демонстрирует значительно улучшенную бактерицидную эффективность, возникающую из-за комбинации экстракта зеленого чая и пероксида водорода.

Эксперимент 5

Образец №2 представлял собой раствор, предварительно приготовленный с использованием препарата А, приведенного выше, который разбавляли для дублирования такой же концентрации полифенолов, что и в предварительно приготовленном образце №1. В образце №3 полифенол и разбавленный пероксид водорода объединяли для достижения того же самого соотношения полифенола и пероксида водорода, что и в образце №2. Готовили последовательные разведения каждого образца и оставляли их отстаиваться в течение 24 часов. К каждому образцу добавляли раствор, содержащий 10⁵/мл дикого штамма Е. coli, который затем инкубировали и высаживали на чашки с агаром для визуальных подсчетов колоний. Предварительно приготовленные растворы полифенол-окислитель из образца №2 продолжали эффективно уничтожать бактерии в значительно более низких концентрациях, чем в разведениях образца №3, демонстрируя повышенную эффективность при низких концентрациях, когда композиция полифенольный субстрат-окислитель образуется в высокой концентрации (в отсутствие активных оксидоредуктаз или других восстанавливающих агентов) перед разбавлением, поддерживая концепцию секвестрирования на основе межмолекулярных сил для улучшенной стабильности.

Эксперимент 6

Следующее представляет собой способ получения препарата Б и демонстрацию способа экстракции полифенольного субстрата. Используют 30 граммов сушеной кожуры граната, которую сушили при 150°C в течение 1 ч, растирали до тонкого порошка и объединяли с 10 литрами деионизированной воды, нагретой до 80°C в течение 20 минут, затем охлаждали до комнатной температуры в течение 2 часов. Добавляли 35%-ный пероксид водорода пищевого качества, давали отстояться в течение 6 часов и затем фильтровали через среду 5 микрон. Концентрация добавленного пероксида водорода в растворе составляла менее чем 10% после добавления в раствор для предупреждения чрезмерного взаимодействия с полифенолами. Последовательные разведения в воде образующегося раствора добавляли в 10⁷-10⁸ жидкие бактериальные культуры. Образующийся раствор инкубировали в течение 24 часов и визуально наблюдали на предмет мутности. Как показано в Таблице 1, мутность (+мутный, - не мутный) указывает на наличие жизнеспособных бактерий.

Эксперимент 7

Нанесение препарата А с разведением 200:1 на двухсторонние симметричные раны на лабораторных мышах, сделанные ланцетом, продемонстрировало закрытие раны приблизительно в одной трети случаев ран, обработанных контролем в виде физиологического раствора или мази с антибиотиком.

Эксперимент 8

Хлопковую подкладку, пропитанную препаратом А с разведением 200:1, наносили на воспаленную слизистую рта на 10 минут. Все три волонтера испытывали значительное ослабление боли и припухлости в пределах одного часа. Инфекцию полностью устраняли через два, что демонстрировало противовоспалительный и противоинфекционный потенциал на слизистую ткань.

Эксперимент 9

Десяти людям-волонтерам с текущей диареей и историей прошлых симптомов частой или хронической диареи давали 5 мл препарата Б с разведением 40:1 в 250 мл воды в течение 5 суток. У девяти было выражено значительное уменьшение дискомфорта и симптомов в течение 1 недели или более.

Эксперимент 10

По 0,5 мл препарата А и препарата Б с разведением 100:1 вводили в перфорированную лунку на чашке с агаром с овечьей кровью, на поверхность которого инокулировали E. coll. На периметре данной лунки быстро формировалась непрозрачная область поперечно связанных белков крови, которые были стойкими к проникновению комплекса РР-O и не показывали зоны подавления бактерии вокруг данной лунки. По сравнению с этим, минимальный питательный агар без белков крови показывал значительную зону подавления, указывающую на диффузию РР-O через среду, демонстрируя низкое проникновение через ткань композиций, поддерживающее пониженный потенциал токсичности.

Пример 11

5-суточных гибридных поросят породы азиатский ландрас на коммерческой ферме делили на 13 тестируемых субъектов и 3 контрольных субъектов, всех кормили идентичными количествами и типами пищи с рождения до 3 месяцев. Тестируемым субъектам давали 5 микрограммов (эквивалент сухой массы растения) препарата А каждые третьи сутки в воде для питья и такую же дозу ежесуточно в случае диареи. Контрольным животным делали инъекции антибиотиков для лечения диареи. В возрасте 21 суток в тестируемой группе диарея встречалась реже, и в среднем эти животные были на 1 кг тяжелее, чем из контрольной группы. В 3 месяца средняя масса данных тестируемых субъектов была на 25-30% больше, чем масса контрольных субъектов, на основе измерения обхвата, что демонстрирует пригодность препарата А как альтернативы антибиотикам в качестве профилактического средства и стимулятора роста.

Эксперимент 12

Отслеживали и оценивали рост 99 чистопородных поросят породы ландрас. Данных поросят кормили композицией окислитель-полифенол препарата Б в заменителе свиного молока. Участников теста в возрасте 21 суток подвергали стрессу посредством изменения окружающей среды, и они имели повышенную частоту случаев диареи в течение приблизительно одной недели. Экспериментальная группа показывала на 18% более высокий средний прирост массы на протяжении этого периода, чем контрольная группа, что демонстрирует промышленную ценность в оптимизации роста и совместимость с заменителем молока.

Эксперимент 13

Токсикологическую безопасность тестировали с использованием 10 специфичных, не содержащих патогенов чистопородных поросят породы ландрас, каждый из которых имел возраст 23 суток. Данным поросятам ежесуточно в течение 45 суток вводили одну дозу 250 мкг или одну дозу 2500 мкг. Отслеживали гематологию и рост и осуществляли гистологический анализ, не показывающие негативного влияния на ткани или органы.

Эксперимент 14

50 отнятых от матки испытуемых поросят делили на 5 групп, и каждой давали дозу 12 мкг один раз в каждые третьи сутки в течение 5 недель. Статистический анализ показывает превосходный прирост массы в экспериментальных группах. Приведенные выше эксперименты являются доказательством эффективных применений композиций полифенол-окислитель в контроле патогенов и показывают измеримое значение в многочисленных промышленных и полезных для медицины приложениях. Несмотря на то, что данные эксперименты демонстрируют прямую пользу стимуляции роста в сельскохозяйственном производстве животных, известно, что применение свиней имеет тесное физиологическое и иммунологическое сходство с людьми и обычно используется в качестве прогностических параметров эффективности и безопасности у людей. Потенциальные эффекты, следовательно, можно проецировать и заявлять для людей. Это подтверждается прямым опытом быстрого подавления возникающего время от времени пищеварительного дискомфорта и диареи, не имеющих специфических причин. Наблюдали, что одиночные дозировки, варьирующие от 20 мкг до 250 мкг (экв. сухой массы) являются эффективными при устранении диареи у людей с облегчением симптомов, типично наблюдаемым в пределах одного часа. Получение

Некоторые из данных воплощений получали согласно описанным здесь способам. В данном способе производства могут применяться органические производственные вещества и методики с использованием Национальной органической программы National Organic Program, NOP), одобренные и в общем признанные как безопасные (GRAS) пищевые вещества. Данный производственный процесс можно проводить в лаборатории с чистой комнатой согласно надлежащей производственной практике (GMP).

Некоторые способы получения включают растительный предварительный процесс, денатурацию белка и экстракцию, внутримолекулярную секвестрацию реагентов в метастабильный фенольный комплекс, последующий переработку, разбавление и приготовление в виде препарата с дополнительными ингредиентами.

Раскрытый здесь способ применим к широкому диапазону видов растений и типов тканей из-за общей природы интересующих химических соединений. Растительные источники могут быть выбраны на основе доступности источников культивирования, содержания главной фракции и вторичных компонентов, которые потенциально могут придавать желательные или нежелательные характерные эффекты, такие как токсичность и автодеградация.

Изготовление раскрытой здесь композиции может включать несколько способов стандартизированного контроля качества, в которых непосредственно измеряются содержание субстратов, эффективность инициации, микробиологическая эффективность и способность к связыванию молекул. Изготовление данной композиции тестировали при комнатной температуре в течение года. Результат показывает ускоренное тестирование стабильности с сохранением образцов. Порог разведения данного соединения для микробиологической стабильности определили, как превышающий тот, который делает его самоконсервирующим.

Некоторые из данных воплощений успешно получали из целого ряда разных растительных основ. Предпочтительные результаты получают при использовании не вызывающих сомнений, хорошо охарактеризованных пищевых растений с длительной историей применения в современной и альтернативной медицине. Обычному специалисту в данной области будет понятно, что многие растения, растительные ткани или комбинации можно использовать для получения разных препаратов для разных рынков до тех пор, пока рабочий механизм является функционально, структурно, химически, биологически или физически эквивалентным описанным здесь воплощениям.

Настоящее изобретение описано в терминах конкретных воплощений, включающих подробности для облегчения понимания принципов построения и действия данного изобретения. Подразумевают, что такая ссылка, сделанная здесь на его конкретные воплощения и подробности, не ограничивает объем формулы изобретения, приложенной к нему. Специалисту в данной области будет совершенно очевидно, что могут быть сделаны разные модификации воплощений, выбранных для иллюстрации, без отступления от сущности и объема данного изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой противомикробную композицию для желудочно-кишечного применения, содержащую смесь водорастворимого экстракта растительной ткани, содержащего полифенол, включающий танин, и экзогенного пероксида водорода; где экстракт оказывает секвестрирующий эффект на пероксид водорода в смеси и композиция уничтожает бактерии при контакте с бактериями. В следующем варианте осуществления композиция может также дополнительно содержать инактивированных эндогенных ферментов. Изобретение позволяет получить противомикробные композиции, эффективно работающие для лечения желудочно-кишечных инфекций. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 14 пр.

Формула