Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, и набор для его осуществления - RU2016103685A
Код документа: RU2016103685A
Формула
1. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, включающий:
а) получение образца плазмы крови у человека;
б) изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот плазмы крови;
в) очистку нуклеиновых кислот из реакционной смеси, полученной по п. б)
г) проведение количественного анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и определение коэффициента К в пробах:
К=С1, или
,или
,или
,
где
,
Ct - величина порогового цикла полимеразной цепной реакции;
д) сравнение коэффициента К с референсным значением;
е) диагностику заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, при значении коэффициента К менее референсного значения.
2. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что изотермическая амплификация нуклеиновых кислот плазмы крови проводится без предварительного выделения нуклеиновых кислот из плазмы крови.
3. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что изотермическая амплификация нуклеиновых кислот плазмы крови проводится в одной пробирке с плазмой крови.
4. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где нуклеиновые кислоты плазмы крови включают геномную ДНК, митохондриальную ДНК, информационную РНК, транспортные РНК, микроРНК, нуклеиновые кислоты экзосом.
5. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где заболеванием, сопровождающимся повышенной гибелью клеток, является онкологическое заболевание.
6. Способ диагностики онкологического заболевания по п. 5, где онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы, рак тимуса, рак предстательной железы, рак яичников, глиома мозга.
7. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где заболеванием, сопровождающимся повышенной гибелью клеток, является гепатоз.
8. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где референсное значение определяется как среднее значение коэффициента К, полученное при массовом обследовании здорового населения.
9. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где заболеванием, сопровождающимся повышенной гибелью клеток, является рак молочной железы, а референсное значение равно 2.
10. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где заболеванием, сопровождающимся повышенной гибелью клеток, является гепатоз, а референсное значение равно 2.
11. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где фермент гликолиза выбран из группы, включающей гексокиназу, фосфоглюкозоизомеразу, фосфофруктокиназу, фруктобифосфатальдолазу, триозофосфат изомеразу, глицеральдегидфосфат дегидрогеназу, фосфоглицерат киназу, фосфоглицератмутазу, энолазу и пируваткиназу.
12. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где фрагмент митохондриальной ДНК выбран из группы митохондриальных генов, включающей ген транспортной РНК, ген 12S рРНК, ген 16S рРНК, ген субъединицы NADH-дегидрогеназы, ген субъединицы цитохромоксидазы, ген субъединицы АТФ-синтазы и ген цитохром С редуктазы.
13. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что изотермическая амплификация нуклеиновых кислот плазмы крови проводится с использованием ДНК полимеразы phi29.
14. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 13, характеризующийся тем, что изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот плазмы крови проводят с использованием белка, связывающегося с однонитевой ДНК, трегалозы, случайных праймеров, детергента, дезоксинуклеозидтрифосфатов, хлористого магния.
15. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 14, характеризующийся тем, что случайные праймеры представляют собой Random-7 thio.
16. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что изотермическую амплификацию нуклеиновых кислот плазмы крови останавливают путем добавления в реакционную смесь этилендиаминтетраацетата.
17. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 16, характеризующийся тем, что после остановки изотермической амплификации нуклеиновых кислот плазмы крови проводят выделение ДНК.
18. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 17, характеризующийся тем, что выделение ДНК осуществляют следующим образом: добавляют в реакционную смесь протеиназу К, инкубируют реакционную смесь в течение 15 минут при температуре 55°С, обрабатывают реакционную смесь реагентом DNAzol® BD, осаждают ДНК изопропанолом и промывают ДНК этанолом.
19. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 18, характеризующийся тем, что выделенную ДНК растворяют в ТЕ буфере и определяют ее концентрацию.
20. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что ген, кодирующий фермент гликолиза, представляет собой ген, кодирующий пируваткиназу.
21. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 20, характеризующийся тем, что Ct для гена пируваткиназы определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 1, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 2, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 3.
22. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 20, характеризующийся тем, что Ct для гена пируваткиназы определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 1, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 2, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность SEQ ID NO: 3.
23. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что Ct для фрагмента 12-ой хромосомы NC_018923.2 определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 4, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 5, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 6.
24. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что Ct для фрагмента 12-ой хромосомы NC_018923.2 определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 4, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 5, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность SEQ ID NO: 6.
25. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что Ct для гена M6PRBP определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 7, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 8, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 9.
26. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что Ct для гена M6PRBP определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 7, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 8, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность SEQ ID NO: 9.
27. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, характеризующийся тем, что митохондриальный ген представляет собой ген COX1.
28. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 27, характеризующийся тем, что Ct для гена COX1 определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 10, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 11, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 12.
29. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 27, характеризующийся тем, что Ct для гена COX1 определяют с использованием пары олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда для детекции, при этом один олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 10, второй олигонуклеотидный праймер имеет последовательность SEQ ID NO: 11, олигонуклеотидный зонд для детекции имеет последовательность SEQ ID NO: 12.
30. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по любому из пп. 21-26, 28, 29, характеризующийся тем, что олигонуклеотидный зонд для детекции на 5'-конце содержит флуоресцентный краситель, на 3'-конце содержит гаситель флуоресценции.
31. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 30, характеризующийся тем, что указанный флуоресцентный краситель выбран из группы: JOE, FAM, R6G, ROX, Cy5, Cy5.5, HEX.
32. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 30, характеризующийся тем, что указанный гаситель флуоресценции выбран из группы: BHQ1, BHQ2, BHQ3, RTQ.
33. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где
.
34. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где
.
35. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где
.
36. Способ диагностики заболевания, сопровождающегося повышенной гибелью клеток, по п. 1, где
.
37. Набор реагентов для осуществления способа по п. 1, включающий по меньшей мере пару олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена, кодирующего фермент гликолиза, и пару олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для митохондриального гена.
38. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что ген, кодирующий фермент гликолиза, представляет собой ген, кодирующий пируваткиназу, а пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена, кодирующего пируваткиназу имеют последовательности, гомологичные по меньшей мере на 90% последовательностям SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно.
39. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что ген, кодирующий фермент гликолиза, представляет собой ген, кодирующий пируваткиназу, а пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена, кодирующего пируваткиназу, имеют последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO :3, соответственно.
40. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что митохондриальный ген представляет собой ген COX1, а пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена COX1 имеют последовательности, гомологичные по меньшей мере на 90% последовательностям SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно.
41. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что митохондриальный ген представляет собой ген COX1, а пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена COX1 имеют последовательности SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно.
42. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что дополнительно содержит пару олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для фрагмента 12-ой хромосомы NC_018923.2.
43. Набор реагентов по п. 42, характеризующийся тем, что пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для фрагмента 12-ой хромосомы NC_018923.2 имеют последовательности, гомологичные по меньшей мере на 90% последовательностям SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
44. Набор реагентов по п. 42, характеризующийся тем, что пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для фрагмента 12-ой хромосомы NC_018923.2 имеют последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно.
45. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что дополнительно содержит пару олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена M6PRBP.
46. Набор реагентов по п. 45, характеризующийся тем, что пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена M6PRBP имеют последовательности, гомологичные по меньшей мере на 90% последовательностям SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно.
47. Набор реагентов по п. 45, характеризующийся тем, что пара олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена M6PRBP имеют последовательности SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно.
48. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что дополнительно содержит пару олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения
Ct для фрагмента 12-ой хромосомы (43119006-43120809) и пару олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидный зонд для детекции для определения Ct для гена M6PRBP.
49. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что дополнительно содержит реагенты для изотермической амплификации.
50. Набор реагентов по п. 49, характеризующийся тем, что реагенты для изотермической амплификации включают ДНК полимеразу phi29, белок, связывающийся с однонитевой ДНК, трегалозу, случайные праймеры, детергент, дезоксинуклеозидтрифосфаты, хлористый магний.
51. Набор реагентов по п. 37, характеризующийся тем, что дополнительно содержит реагенты для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
52. Набор реагентов по п. 51, характеризующийся тем, что реагенты для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени включают термостабильную ДНК-полимеразу, буферный раствор для полимеразной цепной реакции, дезоксинуклеозидтрифосфаты.
