Способ электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул в исследуемых растворах - RU2107296C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к области медицины, а также к фармакологии, биотехнологии, сельскому хозяйству, экологии, а именно к способам лабораторных исследований и анализов различных биологических жидкостей - сывороток крови, лимфы, мочи, слюны и пр., проводимых с целью медицинской диагностики, производственного и экологического мониторинга объектов как природного, так и искусственного происхождения.

Под иммунохимически активными макромолекулами (далее макромолекулами) или антигенами (Ag) следует понимать такие макромолекулы природного и искусственного происхождения, которые при проникновении в организм высшего животного (включая и человека) вызывают образование в организме специальных белковых молекул - "антител" (Ag), обладающих способностью специфически связывать антиген с образованием слабодиссоциирующего комплекса. Антитела тоже могут являться антигенами.

Схематично реакцию взаимодействия антигена с антителом можно представить с следующем виде:
Ab + Ag = AbAg.

Константа равновесия этой реакции определяется как:
K = [AbAg]/[Ab][Ag].

Отсюда при фиксированной концентрации антитела равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигенов количественно связано с общей концентрацией антигена. Это соотношение лежит в основе всех иммунохимических методов индикации антигенов и антител.

Одним из основных методов индикации является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на взаимодействии иммобилизованного на твердой фазе антигена (или антитела) со специфическим к нему антителом (антигеном) с последующим разделением связанного и свободного компонентов иммунохимической пары и использовании меченных ферментной меткой антител для выявления связанного компонента.

Существенный недостаток этого метода - длительность проведения аналитических операций. Время осуществления большинства методов ИФА составляет 24 и более, что связано с необходимостью проведения ряда последовательных иммунохимических реакций, а также регистрации ферментативной активности.

Другой недостаток этого метода - необходимость использования значительного количества специальной аппаратуры и реагентов: микротитрационных планшетов, промывателей, термостатов, красителей, приборов для регистрации активности ферментной метки и т.п., что сказывается на трудоемкости и себестоимости анализа.

Подобные недостатки характерны и для методов, основанных на использовании и других меток: флюоресцентных, хемилюминесцентных, радионуклидных и др. Поэтому к настоящему времени появился ряд работ, в которых предпринимаются попытки объединить иммунохимические методы индикации макромолекул с электрохимическими способами детектирования, что связано с их относительно простотой и невысокой стоимостью в электрохимическом иммуноанализе. (Грин М. Дж. Новые подходы. Биосенсоры : Основы и приложения М.: Мир, 1992).

Основной проблемой, с которой приходится сталкиваться авторам этих работ, является то, что образование комплекса антиген-антитело не сопровождается каким-либо переносом электричества, которое может быть зарегистрировано при помощи простых амперометрических (измеряющих величину силы тока) измерительных систем.

В связи с этим большинству авторов приходится вводить в электрохимическую измерительную систему меченные ферментной меткой антитела и осуществлять амперометрическое детектирование продуктов ферментной реакции после образования комплекса антиген-антитело. Следует отметить, что методы с использованием амперометрических систем имеют те же недостатки, что и классический иммуноферментный способ детектирования [Aizawa M. et al, Enzyme Immunosensor, III. Amperometric determination of human chorionic gonadotropin by membrane bound antibody. Analitical Biochemistry, 94, 22-8, 1979].

Использование потенциометрических методов (измеряющих величину электрохимического потенциала) для индикации макромолекул основано на предпосылке, что в водных растворах белки являются полиэлектролитами, поэтому взаимодействие антигена и антитела должно изменять их заряд.

Однако применение потенциометрических датчиков, модифицированных антителами или антигенами, для непосредственного определения в растворах иммунохимически активных макромолекул показало, что подобные детектирующие системы отличаются низкой чувствительностью и крайне низкой специфичностью, что связано с высоким уровнем неспецифических взаимодействий компонентов исследуемых растворов с поверхностями датчиков (Yamamoto N et al, Potentimetric investigations of antigen-antibody and enzyme-enzyme inhibitor reactions using chemically modified metal electrodes. J. of Jmmunology Methads, 22, 309-17, 1978).

Наиболее перспективными представляются электрохимические способы индикации макромолекул в растворах, основанные на регистрации изменения изоэлектрической точки антител или антигенов вследствие образования ими комплексов в ходе иммунохимической реакции.

Под изоэлектрической точкой белка понимают такую величину pH белкового раствора, при которой молекулы белка имеют суммарный нулевой заряд. При смещении величины pH раствора от значения, соответствующего изоэлектрической точке белка, в кислую или щелочную область белковая молекула будет приобретать соответственно положительный или отрицательный заряд. Поскольку взаимодействующие антиген и антитело, как правило, имеют разные значения изоэлектрической точки, то образовавшийся в ходе иммунохимической реакции комплекс антиген-антитело будет иметь значение изоэлектрической точки, отличающееся от исходных значений последних. Регистрация изменения изоэлектрической точки антител и антигенов вследствие иммунохимических реакций может быть осуществлена методом ионного удара (the ion-step procedure). При этом используется ионочувствительный датчик, модифицированный антителами или антигенами (Bergveld P. , A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors and Bioelectronics, 6, 1991).

Известен способ электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул в растворах при помощи иммуночувствительного сенсора [1, 2, 3].

Способ основан на определении смещения значения изоэлектрической точки мембраны, размещенной на электрохимическом датчике и включающей соответствующие рецепторы, после взаимодействия последних с макромолекулами. При этом полагают, что заряд мембраны однозначно определяется зарядом расположенных в ней рецепторов и что при фиксированном времени взаимодействия величина смещения значения изоэлектрической точки пропорциональна содержанию макромолекул в исследуемом растворе.

Данный способ заключается в следующем.

1. На поверхности электрохимического датчика - ионоселективного полевого транзистора (ИСПТ) формируют в результате химического синтеза проницаемую для ионов мембраны из латекса и агарозы.

2. Проводят иммобилизацию в мембрану соответствующих рецептов (антигенов или антител), приводя ИСПТ с мембраной в контакт с раствором рецепторов, получая таким образом иммуночувствительный сенсор.

3. Составляют электрохимическую измерительную ячейку, помещая связанные между собой электрическим измерительным прибором иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в емкость, через которую прокачивается рабочий раствор.

4. Плавно изменяют pH рабочего раствора при помощи градиентного смесителя, смещая pH из кислой или нейтральной области в щелочную.

5. В ходе выполнения п.4 периодически ступенчато изменяют ионную силу рабочего раствора путем введения в последний солевого раствора с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой.

6. В ходе выполнения пп. 4 и 5 при помощи электрического измерительного прибора измеряют величину напряжения на электрохимической ячейке, а также при помощи pH-метра величину pH рабочего раствора.

7. В ходе выполнения п.6 строят график зависимости величины напряжения на электрохимической ячейке от величины pH рабочего раствора путем непрерывной регистрации при помощи соединенного с измерительным прибором двухкоординатного самописца значений величин напряжения и pH.

8. Находят на графике, полученном после выполнения п.7, точку пересечения в осью абсцисс, которую определяют как изоэлектрическую точку мембраны с иммобилизованными рецепторами. Инкубируют в течение фиксированного отрезка времени иммуночувствительный сенсор с мембраной, содержащей рецепторы, в растворе, содержащем известное количество специфичных к рецепторам макромолекул.

9. Инкубируют в течение фиксированного отрезка времени иммуночувствительный сенсор с мембраной, содержащей рецепторы, с раствором, содержащим известное количество специфичных к рецепторам макромолекул.

10. По завершении выполнения п.9 выполняют пп.3-8.

11. Определяют величину смещения значения изоэлектрической точки мембраны вследствие взаимодействия рецепторов с макромолекулами.

12. Последовательно выполняют пп. 3-11, используя при этом растворы с различным содержанием специфических макромолекул, и строят калибровочный график зависимости величины смещения значения изоэлектрической точки мембраны от концентрации макромолекул в растворе.

13. Полученный калибровочный график используют затем для определения содержания макромолекул в различных исследуемых растворах.

Описанный выше способ имеет ряд недостатков:
высокая стоимость анализа, что обусловлено использованием в качестве электрохимического датчика ИСПТ и, соответственно, сложного прибора для измерения напряжения на измерительной ячейке с ИСПИ, а также другого дорогостоящего оборудования - проточной ячейки сложной конструкции, перистальтических насосов для прокачивания рабочего раствора и раствора с высокой ионной силой, смесителя для создания градиента pH, pH-метра;
высокая трудоемкость и низкая технологичность процесса нанесения на затвор ИСПТ проницаемой для ионов мембраны;
высокая вероятность получения невоспроизводимых результатов вследствие отсутствия контроля за свойствами мембраны в ходе химического синтеза и контроля процесса иммобилизации рецепторов;
значительная продолжительность анализа за счет того, что процесс взаимодействия рецепторов с макромолекулами разнесен во времени и пространстве с процессом собственно электрохимического измерения.

Все эти недостатки делают данный способ мало пригодным для использования его в качестве альтернативы традиционным методам индикации макромолекул.

Технический результат, достигается заявленным изобретением, заключается в разработке способа электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул, в значительной степени лишенного недостатков, характерных для способа, описанного выше, а именно в его упрощении и удешевлении, уменьшении времени проведения и увеличении чувствительности анализа, повышении достоверности получаемых результатов.

Сущность изобретения заключается в достижении упомянутого технического результата в способе электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул в исследуемых растворах, предусматривающем формирование иммуноспецифического сенсора с мембраной с иммобилизованными в нее специфическими рецепторами, составление электрохимической измерительной ячейки из связанных измерительным прибором иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения, помещение последних в рабочий раствор, определения смещения изоэлектрической точки мембраны путем измерения напряжения на ячейке при ступенчатом изменении ионной силы рабочего раствора, в котором мембрану формируют из электропроводящего полимера путем его электрохимического синтеза из раствора мономера с помещенными в последний специфическими рецепторами на поверхности электрода для потенциометрических измерений, при этом для определения смещения изоэлектрической точки мембраны добавляют в рабочий раствор исследуемый раствор с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой при постоянном значении pH рабочего раствора.

Более подробно изобретение заключается в следующем:
1 В качестве электрохимического датчика используют электрод для потенциометрических измерений. Электрод может иметь произвольную форму и может быть выполнен из любого материала, обладающего металлической проводимостью и устойчивого в водных растворах.

Это позволяет существенно снизить стоимость анализа за счет использования менее дорогого по сравнению с ИСПТ электрохимического датчика, а также за счет того, что появляется возможность использования в качестве измерительного прибора стандартных и недорогих приборов для потенциометрии.

2. Мембрану на поверхности электрохимического датчика формируют из электропроводящего полимера путем электрохимического синтеза. Мембрана из электропроводящего полимера выполняет при этом двоякую функцию, обеспечивая, с одной стороны, фиксацию рецепторов на поверхности электрохимического датчика и, с другой стороны, чувствительность электрохимического датчика к изменению ионной силы раствора.

3. Иммобилизацию рецептора в мембрану проводят одновременно с электрохимическим синтезом мембраны, что позволяет контролировать процесс иммобилизации.

Это позволяет существенно поднять технологичность процесса изготовления иммуночувствительного сенсора, упростить и удешевить его конструкцию, а использование электрохимического синтеза для формирования мембраны позволяет не только строго контролировать ее свойства, но и управлять ими (например, проводимостью и чувствительностью к ионам). Все это в конечном итоге ведет к снижению стоимости анализа и способствует повышению воспроизводимости получаемых результатов.

4. Измерения величины напряжения на электрохимической измерительной ячейке проводят при фиксированном значении pH рабочего раствора за счет использования в качестве последнего растворов с высокой буферной емкостью.

Это позволяет при осуществлении заявленного способа обойтись без дорогостоящего оборудования для изменения и контроля pH рабочего раствора и проточных ячеек, увеличивая тем самым технологичность и экспрессность анализа, существенно снижая его стоимость и увеличивая достоверность получаемых результатов за счет элиминирования погрешностей, связанных с изменением и контролем pH.

5. В качестве раствора с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой используют раствор, содержащий макромолекулы, специфичные к биорецепторам на электрохимическом датчике.

Это ведет к существенному уменьшению времени проведения анализа за счет совмещения во времени и пространстве процесса взаимодействия рецепторов с макромолекулами и процесса электрохимического измерения.

6. О величине смещения значения изоэлектрической точки мембраны в результате взаимодействия рецепторов с макромолекулами судят по характеру изменения величины напряжения на электрохимической ячейке во время и после взаимодействия электрохимического датчика с раствором с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой, содержащим макромолекулы, специфичные к рецепторам на сенсоре.

Заявленный способ поясняется чертежами, где изображены основные этапы его осуществления.

Фиг. 1 - формирование на поверхности электрохимического датчика 1 ионочувствительной мембраны из электропроводящего полимера 2 с рецепторами 3;
фиг. 2 - составление электрохимической ячейки, где 4 - электрохимический датчик с мембраной, 5 - электрод сравнения, 6 - измерительный прибор, 7 - регистратор, 8 - рабочий раствор;
фиг. 3 - введение в электрохимическую ячейку раствора 9, содержащего макромолекулы 10, специфичные к рецепторам на сенсоре;
фиг. 4 - графики изменения величины напряжения на электрохимической ячейке во время взаимодействия иммуночувствительного сенсора с раствором, содержащим макромолекулы, специфичные к рецепторам на сенсоре в различной концентрации 11 - 13 и с раствором, не содержащим макромолекул, специфичных к рецепторам на сенсоре 14.

Новизна заявленного технического решения состоит в том, что заявителем предложен новый способ с новой совокупностью признаков, отличающихся от прототипа.

Все признаки, характеризующие заявленный объект и внесенные в формулу изобретения, являются существенными, т.к. только благодаря их совокупности достигается тот положительный эффект, который ожидается от использования заявленного технического решения.

Кроме того, указанные отличительные признаки проявляют новые свойства, не известные в науке и технике.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "положительный эффект" и "существенные отличия".

Заявленный способ осуществляют следующим образом.

1. Формируют на поверхности электрода для потенциометрических измерений мембраны из электропроводящего полимера.

Основными требованиями, предъявляемыми к электроду, используемому для осуществления заявленного способа, являются наличие металлической или квазиметаллической проводимости и устойчивость в водных средах. В качестве электрода можно использовать как стандартные потенциометрические электроды, пригодные для биохимических исследований, так и специально сконструированные для осуществления заявленного способа (Хаваш Е., Ионо- и молекулярно-селективные электроды в биохимических системах. М.: Мир, 1988).

Формирование мембраны осуществляют путем электрохимического синтеза из раствора мономера (анилина, тиофена, фурана, пиррола) в полярном растворителе (воде, ацетонитриле). Способы электрохимического синтеза, которые могут быть использованы при осуществлении заявленного способа, известны и описаны в Электрохимии полимеров. М.: Наука, 1990.

2. Одновременно с электрохимическим синтезом мембраны осуществляют включение в последнюю рецепторов. Для этого рецепторы растворяют в растворе для электрохимического синтеза. В качестве рецепторов в зависимости от типа анализа можно использовать моноклональные и поликлональные антитела (для индикации антигенов), белковые антигены (вирусные лизаты, рекомбинантные белки, синтетические пептиды, гормоны) (для индикации антител), однонитиевые молекулы ДНК (для индикации ДНК), фрагменты микробных, растительных и животных клеток, целые микробные клетки, различные химические соединения, коньюгированные с инертными белками (гаптены). Концентрация рецепторов в растворе может варьировать в пределах 0,1 - 10000 мкг/мл. Наличие в растворе для электрохимического синтеза рецепторов может привести к некоторому изменению режимов синтеза (времени синтеза, величины силы тока, величины приложенного потенциала) по сравнению с режимами, при которых используется раствор, содержащий только мономер. В каждом конкретном случае эти режимы подбираются специально в зависимости от типа рецепторов, их концентрации и т.п.

Таким образом получают иммуночувствительный сенсор. Выбор в качестве материала для мембраны иммуночувствительного сенсора электропроводящих полимеров обусловлен их высокой технологичностью и дешевизной, хорошими ионообменными и ионселективными свойствами, обеспечивающими сенсору чувствительность к изменению ионной силы раствора, а также способностью электропроводящих полимеров удерживать значительное количество белкового материала (Электрохимия полимеров. М.: Наука, 1990).

3. Составляют электрохимическую ячейку путем погружения связанных измерительным прибором иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения в емкость, заполненную рабочим раствором с фиксированным значением pH. В качестве электрода сравнения можно использовать как стандартные продажные электроды сравнения (Органическая электрохимия. М.: Химия, 1988), так и специально сконструированные для использования в медицинских измерениях. В качестве измерительного прибора можно использовать стандартные приборы для потенциометрических измерений или потенциостат (Методы измерения в электрохимии. М. : Мир, 1977). Возможно также использование и специально сконструированных для осуществления заявленного способа измерительных устройств. В качестве рабочего раствора можно использовать водные буферные растворы с высокой буферной емкостью, обеспечивающей постоянство значения pH, пригодные как для электрохимических измерений, так и для иммунологических исследований - фосфатно-солевой, Tris-HCl, карбонатно-бикарбонатный, ацетатный, боратный и др. (Иммунологические методы исследования. М.: Мир, 1988).

В отличие от прототипа заявленного способа, в котором использовалась исключительно проточная ячейка специальной конструкции, при осуществлении заявленного способа в качестве емкости для рабочего раствора можно использовать любую подходящую по размерам емкость, выполненную из материала с минимальными адсорбционными свойствами, например лунку стандартного микротитрационного планшета. Объем рабочего раствора в электрохимической ячейке может составлять от 50 до 5000 мкл в зависимости от типа анализа.

4. Регистрируют в течение фиксированного отрезка времени (100-300 c в зависимости от типа анализа) при помощи регистрирующего прибора (самописца или специальной платы расширения для персонального компьютера), связанного с измерительным прибором, величину напряжения на электрохимической ячейке.

Таким образом получают значение фонового напряжения на ячейке при фиксированном значении pH рабочего раствора.

5. Ступенчато изменяют ионную силу раствора в электрохимической ячейке и одновременно осуществляют контакт иммуночувствительного сенсора с определяемыми макромолекулами путем введения в электрохимическую ячейку раствора с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой с известным содержанием определяемых макромолекул.

В случае, когда заявленный способ используется для индикации иммунохимически активных макромолекул в биологических жидкостях (сыворотках крови, лимфе, моче, слюне, сперме), в качестве раствора с большей ионной силой используют эти же биологические жидкости. Использование последних возможно, поскольку их ионная сила, как правило, существенно превышает ионную силу буферных растворов, использующихся в качестве рабочего раствора. С целью уменьшения естественной вариабельности ионного состава и pH биологических жидкостей используют их максимально возможное разведение рабочим раствором. В зависимости от типа анализа разведение может составлять 1:10 - 1:1000.

В случае, когда заявленный способ используется для исследования других жидкостей природного или искусственного происхождения, в качестве раствора с большей ионной силой используют эти жидкости, а их ионную силу повышают искусственно (если это необходимо), добавляя фоновый электролит, не сдвигающий значение pH и не препятствующий протеканию иммунохимической реакции (например, NaCl, KCl или Na₂SO₄).

Введение раствора в электрохимическую ячейку может быть осуществлено либо добавлением непосредственно в емкость с рабочим раствором, либо переносом иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения из емкости с чистым рабочим раствором в емкость, содержащую рабочий раствор и раствор с большей ионной силой. Последнее боле предпочтительно, поскольку позволяет точно контролировать разведение раствора с большей ионной силой и, следовательно, повышает точность анализа.

Содержание определяемых макромолекул в растворе с большей ионной силой может варьироваться в зависимости от типа анализа в пределах от 0 до 10000 мкг/мл.

6. В течение фиксированного отрезка времени регистрируют (аналогично п. 4) величину напряжения на электрохимической ячейке, а также характер изменения напряжения в присутствии раствора с большей ионной силой.

Время нахождения раствора с большей ионной силой в электрохимической ячейке и, соответственно, время регистрации величины и характера изменения напряжения в зависимости от типа анализа может составлять от 30 до 1200 c. Критерием является минимальное время, за которое реакция между иммунохимически активными макромолекулами и рецепторами в мембране сенсора приведет к заметному изменению значения изоэлектрической точки мембраны.

7. По завершении выполнения п. 6 замещают раствор с большей ионной силой в электрохимической ячейке на рабочий раствор. Замещение осуществляют либо путем вытеснения раствора с большей ионной силой из емкости с рабочим раствором, либо путем переноса иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения из емкости с раствором с большей ионной силой в емкость с рабочим раствором.

8. По завершении выполнения п. 7 регистрируют (аналогично п. 6) величину напряжения на электрохимической ячейке, а также характер изменения напряжения в рабочем растворе. Период времени, в течение которого осуществляют регистрацию, может составлять в зависимости от типа анализа 60-1200 с, что обусловлено десорбцией с поверхности мембраны иммуночувствительного сенсора не прореагировавших с рецепторами макромолекул, а также с установлением ионного равновесия между мембраной и рабочим раствором.

Таким образом получают значение конечного напряжения на ячейке после взаимодействия иммуночувствительного сенсора с раствором с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой.

9. Оценивают величину смещения изоэлектрической точки мембраны, исходя из изменения величины напряжения на электрохимической ячейке во время и после взаимодействия иммуночувствительного сенсора с раствором с большей ионной силой.

Это осуществимо при фиксированном значении pH рабочего раствора, поскольку смещение изоэлектрической точки мембраны вследствие иммунохимической реакции приводит к изменению отклика иммуночувствительного сенсора на изменение ионной силы раствора практически при всех значениях pH.

Для количественной оценки характера изменения величины напряжения можно использовать ряд показателей, в том числе:
разность между величинами фонового и конечного напряжений на электрохимической ячейке;
разность между максимальной величиной напряжения, зарегистрированной в ходе выполнения п. 6, и величиной фонового напряжения;
разность между максимальной величиной напряжения, зарегистрированной в ходе выполнения п. 6, и величиной конечного напряжения;
величину (в условных единицах) площади под кривой изменения во времени величины напряжения, полученной в ходе выполнения п. 6;
начальную, конечную, среднюю или максимальную скорости изменения величины напряжения на электрохимической ячейке в ходе выполнения п. 6.

Возможно также комплексное использование вышеперечисленных показателей для повышения достоверности получаемых результатов.

10. Выполняют пп. 4-9, используя растворы с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой с различным известным содержанием определяемых макромолекул.

11. На основании полученных в ходе выполнения п. 10 данных строят калибровочный график зависимости характера изменения напряжения на электрохимической ячейке от содержания определяемых макромолекул в растворе с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой.

12. Полученный калибровочный график используют для определения содержания (индикации) макромолекул в исследуемых растворах (с неизвестным содержанием макромолекул). Для этого выполняют пп. 4-8, используя в качестве растворов с большей ионной силой исследуемые растворы. При этом исследуемые растворы должны быть аналогичными по ионной силе, pH и ионному составу растворам, которые были использованы в ходе выполнения п. 11.

Заявленный способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

1.1 Использовали следующие реактивы и материалы:
в качестве мономера - пиррол (Pyrrole, > 98%, Merck, ФРГ), который перед применением был дважды очищен методом вакуумной перегонки и хранился под N₂ в непроницаемой для света посуде при температуре +4^o C;
в качестве фонового электролита для электрохимического синтеза - KCl (≈ 99%, Sigma, США);
в качестве специфических рецепторов - мышиные моноклональные антитела к хорионическому гонадотропину человека (Mouse Monoclanal antibodies Anti-Chorionic Gonadotropin, Human, Affinity constant 1•10⁹ L/mol, Calbiochem, США), которые перед применением хранились в фосфатно-солевом буферном растворе при температуре +4^oC;
для приготовления водных растворов - деионизованную воду (reagent grade, сопротивление > 18 МОм), полученную при помощи установки "Milli-Ro/Milli-Q" (Millipore, США);
для приготовления рабочего раствора - "Phosphate Buffered Saline Tablets" (Sigma, США);
в качестве электрода для потенциометрических измерений - торец запаянной в стеклянную трубку платиновой проволоки площадью 0,07 см², предпочтительно отшлифованный абразивной пастой с диаметром частиц 0,3 мкм и промытый деонизованной водой;
в качестве электрода сравнения - стандартный продажный хлорсеребряный электрод сравнения (Ag/AgCl/3 M KCl, Radelkis, Венгрия);
в качестве емкости для рабочего раствора - лунки микротитрационного планшета, выполненного из полистирола (Linbro, Великобритания);
в качестве исследуемого раствора с известным содержанием определяемых макромолекул - образцы женской мочи с фиксированным содержанием хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (Chorionic Gonadotropin, Standard Grade, Female Human Urine, > 3000 IU/mg, Calbiochem, США), разделенные рабочим раствором в разных пропорциях;
в качестве исследуемого раствора с неизвестным содержанием макромолекул - образцы мочи, взятые от различных лиц.

1.2. Использовали следующее оборудование:
для проведения электрохимического синтеза - тефлоновую ячейку объемом 100 мл и потенциостат-гальваностат ПИ-50.1 (Россия);
для контроля pH рабочего раствора - pH-метр Checkmate (Mettler, Швейцария);
для измерения напряжения на электрохимической ячейке - цифровой милливольтметр OP 211/1 (Radelkis, Венгрия);
для контроля за процессом электрохимического синтеза и регистрации напряжения на электрохимической ячейке - двухканальный самописец 2210 (LKB-Приборы, Швеция).

1.3 Проводили электрохимический синтез мембраны на электроде из водного раствора пиррола в присутствии фонового электролита и специфических рецепторов. Концентрации пиррола, фонового электролита и специфических рецепторов при этом составляли 0,10 М, 0,15 М и 50 мг/Л соответственно. Синтез проводили в режиме циклического развертывания потенциала электрода в диапазоне от -800 до +1200 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения) и скоростью развертки 100 мВ/с. По достижении заданной толщины мембраны (≈ 1 мкм) процесс останавливали. Далее электрод с мембраной извлекали из ячейки, промывали раствором фонового электролита и помещали в ячейку для электрохимического синтеза, заполненную чистым раствором фонового электролита, где потенциостатировали при потенциале +500 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения) до стабилизации фонового тока.

Полученный таким образом иммуночувствительный сенсор хранили при температуре +4^o C в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 0,01% азида натрия.

1.4. Готовили рабочий раствор со значением pH 7,4.

1.5. Готовили серию образцов исследуемого раствора с содержанием ХГЧ в диапазоне 0,1-10 IU/мл.

1.6. Составляли электрохимическую ячейку, помещая иммуночувствительный сенсор и хлорсеребряный электрод сравнения в рабочий раствор и подключая их к входам цифрового милливольтметра, соединенного с самописцем. При этом иммуночувствительный сенсор помещали в лунку микротитрационного планшета, содержащую 100 мкл рабочего раствора, а электрод сравнения помещали в большую по объему емкость с рабочим раствором. Контакт между лункой планшета и емкостью, в которой находился электрод сравнения, осуществляли с помощью солевого мостика, заполненного 0,1 М раствором KCl.

1.7. В течение 100 с регистрировали величину напряжения на электрохимической ячейке - получали значение фонового напряжения на ячейке,
1.8. В лунку микротитрационного планшета, предварительно отобрав из него 20 мкл рабочего раствора, добавляли образец исследуемого раствора в количестве 20 мкл с наименьшим содержанием ХЧГ.

1.9. Регистрировали в течение 400 с изменение напряжения на ячейке.

1.10. По завершении выполнения п. 1.9. переносили иммуночувствительный сенсор и солевой мостик в лунку с чистым рабочим раствором и регистрировали в течение 600 с величину напряжения на ячейке - получали значение конечного напряжения на ячейке.

1.11. Последовательно выполняли пп. 1.7 - 1.10, используя каждый раз образец исследуемого раствора с более высоким содержанием ХГЧ.

1.12. Характер смещения потенциала на ячейке численно оценивали по разности в милливольтах между величинами фонового и конечного напряжения на ячейке.

1.13. Строили калибровочный график зависимости разности фонового и конечного напряжений на ячейке от содержания ХГЧ в исследуемом растворе.

1.14. Полученный калибровочный график использовали затем для определения содержания ХГЧ в образцах мочи, взятых от разных пациентов. Для этого выполняли пп. 1.7 - 1.12, используя при этом в качестве исследуемого раствора вышеозначенные образцы.

Пример 2.

2.1. Использовали следующие реактивы и материалы:
в качестве мономера - см. п. 1.1;
в качестве фонового электролита для электрохимического синтеза - Na₂SO₄ (ACS Reagent, Sigma, США);
в качестве специфических рецепторов - рекомбинантные белки оболочки вируса HIV-1 p24, gp41 и gp120 (American Bio-Technologies Inc., США), которые перед применением хранились в фосфатно-солевом буферном растворе при температуре +4^oC;
для приготовления водных растворов - см. п. 1.1;
для приготовления рабочего раствора - см. п. 1.1;
в качестве электрода для потенциометрических измерений - планарный электрод 0,5 • 10 мм, выполненный из золота и расположенный на керамической подложке размером 8,0 • 30 мм, предварительно обезжиренный горячим изопропанолом (Merck, ФРГ) и высушенный в парах последнего;
в качестве электрода сравнения для проведения электрохимического синтеза - см. п. 1.1;
в качестве электрода сравнения для составления электрохимической ячейки - специально сконструированный миниатюрный Ag/AgCl-электрод сравнения диаметром 3 мм и заполненный насыщенной KCl агарозой (Serva, ФРГ);
В качестве емкости для рабочего раствора - см. п.1.1.;
в качестве образцов исследуемого раствора с известным содержанием определяемых макромолекул - смесь моноклональных антител к p24, gp41 и gp 120 (Orbit Enterprises, США), разведенную нормальной человеческой сывороткой (Кардиологический Научный центр АМН РФ, Россия) в разных пропорциях;
в качестве исследуемого раствора с неизвестным содержанием макромолекул - образцы сывороток крови, взятых у лиц, инфицированных ВИЧ-1.

2.2. Использовали следующее оборудование:
для проведения электрохимического синтеза - см. п.1.1;
для контроля pH рабочего раствора - см. п.1.1;
для измерения и регистрации напряжения на электрохимической ячейке - специально сконструированное на базе IBM-совместимого персонального компьютера измерительное устройство, включающее усилитель и аналого-цифровой преобразователь и управляемое специализированной программой;
2.3. Проводили электрохимический синтез мембраны на электроде из водного раствора пиррола в присутствии фонового электролита и специфических рецепторов. Концентрации пиррола, фонового электролита и специфических рецепторов при этом составляли 0,30 М, 0,15 М и 100 мг/л соответственно. Синтез проводили в потенциостатическом режиме при потенциале +950 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения). По достижении заданной толщины мембраны (≈ 3 мкм) процесс останавливали. Далее электрод с мембранной извлекали из ячейки, промывали раствором фонового электролита и помещали в ячейку для электрохимического синтеза, заполненную раствором фонового электролита, где потенциостатировали при потенциале +700 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения) до стабилизации фонового тока.

Полученный таким образом иммунночувствительный сенсор хранили при температуре +4^o C в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 0,01% азида натрия.

2.4. Готовили рабочий раствор со значением pH 7,4.

2.5. Готовили серию образцов исследуемого раствора с содержанием антител в диапазоне 0 - 10 мкг/мл.

2.6. Составляли электрохимическую ячейку, помещая иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в лунку микротитрационного планшета, заполненную 100 мкл рабочего раствора, и подключая их в входам измерительного устройства.

2.7. В течение 200 с регистрировали величину напряжения на электрохимической ячейке - получали значение фонового напряжения на ячейке.

2.8. В лунку микротитрационного планшета, предварительно отобрав из него 5 мкл рабочего раствора, добавляли образец исследуемого раствора в количестве 5 мкл с наименьшим содержанием антител.

2.9. Регистрировали в течение 900 с изменение напряжения на ячейке.

2.10. По завершении выполнения п.2.9 переносили иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в лунку с чистым рабочим раствором и регистрировали в течение 900 с величину напряжения на ячейке - получали значение конечного напряжения на ячейке.

2.11. Последовательно выполняли пп. 2.7 - 2.10, используя каждый раз образец исследуемого раствора с более высоким содержанием антител.

2.12. Характер смещения потенциала на ячейке численно оценивали по максимальному значению напряжения на ячейке, зарегистрированному в ходе выполнения п. 2.9.

2.13. Строили калибровочный график зависимости максимального значения напряжения на ячейке от содержания антител в исследуемом растворе.

2.14. Полученный калибровочный график использовали затем для определения содержания антител в образцах сыворотки крови лиц, инфицированных ВИЧ-1.

Пример 3.

3.1. Использовали следующие реактивы и материалы:
в качестве мономера - см. п.1.1;
в качестве фонового электролита для электрохимического синтеза - NaCl (ACS Reagent, Sigma, США);
в качестве специфических рецепторов - мышиные моноклональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B (Mouse Monoclonal Anti-HBsAg, Affinity constant 1 • 10¹⁰ L/Mol, Calbiochem, США), которые перед применением хранились в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 0,01% азида натрия при температуре +4^oC;
для приготовления водных растворов - см. п.1.1;
для приготовления рабочего раствора - см. п.1.1;
для изготовления электрода для потенциометрических измерений - пленка лавсановая толщиной 500 мкм (Владимирский химкомбинат, Россия), распыляемая в вакууме хромовая мишень, раствор хлорного золота (Sigma, США), фоторезист ФП-383 (НИИПИК, Россия), раствор сернокислого церия (Sigma, США), водный раствор KOH (Sigma, США);
в качестве электрода сравнения для проведения электрохимического синтеза - см. п.1.1;
в качестве электрода сравнения для составления электрохимической ячейки - см. п.2.1;
в качестве емкости для рабочего раствора - см. п.1.1.;
в качестве образцов исследуемого раствора с известным содержанием определяемых макромолекул - лиофилизированный препарат поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) (Государственный институт стандартизации и контроля при Комитета по санитарно-эпидемиологическому надзору РФ, Россия), разведенный нормальной человеческой сывороткой (Кардиологический научный центр АМН РФ, Россия) в разных пропорциях;
в качестве исследуемого раствора с неизвестным содержанием макромолекул - образцы сывороток крови, взятых у лиц, больных различными формами гепатита B.

3.2. Использовали следующее оборудование:
для изготовления электрода для потенциометрических измерений - установка вакуумного напыления типа УВН (Россия), установка нанесения фоторезиста ПНФ-6Ц (Россия), установка нанесения фоторезиста ПНФ-6Ц (Россия), фотошаблон, установка фотоэкспонирования СТП-300 (Россия), сухожаровой шкаф EU 18 (Jouan, Франция), ячейка, аналогичная использующейся для электрохимического синтеза, потенциостат ПИ-50.1 (Россия);
для проведения электрохимического синтеза - см. п.1.1;
для контроля pH рабочего раствора - см. п.1.1;
для измерения и регистрации напряжения на электрохимической ячейке - см. п.2.2;
3.3. Заготавливали подложки из лавсановой пленки размером 60 x 48 мм, отмывали последние в горячем изопропаноле (Merck, ФРГ) и высушивали в парах изопропанола. Методом магнетронного распыления наносили на подложки слой хрома толщиной 0,05 мкм. На слой хрома наносили фоторезист методом центрифугирования и высушивали при температуре +80^oC в течение 20 мин. Экспонировали слой фоторезиста ультрафиолетом через фотошаблон с определенным рисунком. Проявляли слой фоторезиста в растворе KOH с последующим высушиванием при температуре +100^oC в течение 20 мин. Получали рисунок из хрома методом травления в растворе сернокислого церия. Удаляли фоторезист диметилформамидом (Merck, ФРГ) с последующими отмывкой и высушиванием в парах изопропанола. Высаживали слой золота толщиной 0,50 мкм на рисунок из хрома методом гальванического осаждения из раствора хлорного золота с последующими отмывкой и сушкой в парах изопропанола.

Таким образом получали электрод для потенциометрических измерений.

3.4. Проводили электрохимический синтез мембраны на электроде из водного раствора пиррола в присутствии фонового электролита и специфических рецепторов. Концентрации пиррола, фонового электролита и специфических рецепторов при этом составляли 0,15 М, 0,10 М и 5 мг/л соответственно. Синтез и последующую обработку электрода с мембраной проводили аналогично описанному в п. 2.3.

3.5. Готовили рабочий раствор со значением pH 7,4.

3.6. Готовили серию образцов исследуемого раствора с содержанием HBsAg в диапазоне 0 - 1,00 мкг/мл.

3.7. Составляли электрохимическую ячейку аналогично описанному в п.3.6.

3.8. В течение 100 с регистрировали величину напряжения на электрохимической ячейке - получали значение фонового напряжения на ячейке.

3.9. В лунку микротитрационного планшета, предварительно отобрав из него 10 мкл рабочего раствора, добавляли образец исследуемого раствора в количестве 10 мкл с наименьшим содержанием HBsAg.

3.10. Регистрировали в течение 300 с изменение напряжения на ячейке.

3.11. По завершении выполнения п. 3.10 переносили иммуночувствительный сенсор и электрод сравнения в лунку с чистым рабочим раствором и регистрировали в течение 300 с величину напряжения на ячейке - получали значение конечного напряжения на ячейке.

3.12. Последовательно выполняли пп.3.8 - 3.11, используя каждый раз образец исследуемого раствора с более высоким содержанием HBsAg.

3.13. Характер смещения потенциала на ячейке численно оценивали по величине (в условных единицах) площади под кривой изменения во времени напряжения на ячейке, полученной в выполнения п. 3.10, и по величине начальной скорости (мВ/с) изменения величины напряжения.

3.14. Строили калибровочные графики зависимости величины площади под кривой изменения напряжения во времени и величины начальной скорости изменения напряжения от содержания HBsAg в исследуемом растворе.

3.15. Полученные калибровочные графики использовали затем для определения содержания HBsAg в образцах сыворотки крови лиц, больных гепатитом B. Ыв

Реферат

Использование изобретения: в медицине, фармакологии, биотехнологии, сельском хозяйстве. Технический результат: упрощение и удешевление способа, уменьшение времени проведения анализа, увеличение чувствительности анализа, повышение достоверности получаемых результатов. Сущность изобретения: способ электрохимической индикации иммунохимически активных макромолекул в исследуемых растворах, предусматривающий формирование иммуночувствительного сенсора с мембраной с иммобилизованными в нее специфическими рецепторами, составление электрохимической измерительной ячейки из связанных измерительным прибором иммуночувствительного сенсора и электрода сравнения, помещение последних в рабочий раствор и определение смещения значения изоэлектрической точки мембраны в зависимости от содержания определяемых макромолекул в исследуемом растворе путем измерения напряжения на ячейке при ступенчатом изменении ионной силы рабочего раствора, в котором мембрану формируют из электропроводящего полимера путем электрохимического синтеза из раствора мономера с помещенными в последний специфическими рецепторами на поверхности электрода для потенциометрических измерений, при этом для определения смещения изоэлектрической точки мембраны добавляют в рабочий раствор исследуемый раствор с большей, чем у рабочего раствора, ионной силой при постоянном значении рН рабочего раствора. 10 з.п.ф-лы, 4 ил.

Формула