Способы обнаружения изменений количества геномных копий в образцах днк - RU2019108294A
Код документа: RU2019108294A
Формула
1. Способ проведения генетического анализа целевой области ДНК из тестируемого образца, включающий
(a) создание библиотеки геномной ДНК, содержащей множество фрагментов библиотеки ДНК, причем каждый из фрагментов указанной библиотеки ДНК содержит фрагмент геномной ДНК из указанного тестируемого образца и адаптер;
(b) приведение в контакт указанной библиотеки геномной ДНК с множеством зондов захвата, которые
к указанному фрагменту геномной ДНК; и
при этом указанный генетический анализ выполняют для обнаружения генетического изменения, указывающего на состояние патологии (заболевания).
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что генетическое изменение, указывающее на состояние патологии, выбирают из однонуклеотидной вариации (ОНВ/SNV), инсерции длиной менее 40 нуклеотидов, делеции участка ДНК длиной менее 40 нуклеотидов и/или изменения количества копий.
3. Способ специфически связываются с целевой областью ДНК, таким образм формируя комплексы между указанными зондами захвата и фрагментами библиотеки ДНК, содержащими целевую область ДНК; и
(c) проведение количественного генетического анализа указанных фрагментов геномной ДНК, содержащих целевую область ДНК;
причем указанный адаптер представляет собой полинуклеотид ДНК, который содержит область амплификации, область тэга образца и якорную область;
при этом указанная область амплификации содержит полинуклеотидную последовательность, способную служить в качестве сайта узнавания праймера для ПЦР амплификации;
при этом тэг образца содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует идентичность уникального фрагмента библиотеки ДНК и кодирует идентичность тестируемого образца;
при этом указанная якорная область содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует идентичность тестируемого образца, и при этом указанная якорная область способна присоединяться по п. 1, отличающийся тем, что генетическое изменение, указывающее на состояние патологии, представляет собой изменение количества копий.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что тестируемый образец представляет собой биопсию ткани.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что биопсию ткани берут из опухоли или ткани, предположительно являющейся опухолью.
6. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что геномная ДНК представляет собой внеклеточную ДНК (вкДНК) или клеточную ДНК.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что геномная ДНК представляет собой вкДНК, выделенную из указанного тестируемого образца; и при этом указанный тестируемый образец представляет собой биологический образец, выбранный из группы, состоящей из амниотической жидкости, крови, плазмы, сыворотки, спермы, лимфатической жидкости, церебральной спинномозговой жидкости, глазной жидкости, мочи, слюны, стула, секрета слизистой и пота.
8. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что фрагменты геномной ДНК получают с помощью стадий, включающих
(i) выделение клеточной ДНК из тестируемого образца;
(ii) фрагментирование клеточной ДНК для получения фрагментов геномной ДНК.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что стадию (ii) осуществляют путем контактирования клеточной ДНК по меньшей мере с одним расщепляющим ферментом.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что стадию (ii) выполняют путем приложения механического усилия (стресса) к клеточной ДНК.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что механическое усилие прикладывают путем обработки ультразвуком клеточной ДНК.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что тэг образца дополнительно содержит уникальный идентификатор молекулы (UMI), который облегчает идентификацию уникального фрагмента геномной ДНК.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная область амплификации имеет длину от 10 до 50 нуклеотидов.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная область амплификации имеет длину от 20 до 30 нуклеотидов.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная область амплификации имеет длину 25 нуклеотидов.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что тэг образца имеет длину от 5 до 50 нуклеотидов.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что тэг образца имеет длину от 5 до 15 нуклеотидов.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что тэг образца имеет длину 8 нуклеотидов.
19. Способ по любому из пп. 12-18, отличающийся тем, что UMI мультипликатор примыкает к/или содержится в области тэга образца.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что UMI мультипликатор имеет длину от 1 до 5 нуклеотидов.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что UMI мультипликатор имеет длину 3 нуклеотида и включает одну из 64 возможных нуклеотидных последовательностей.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что якорная область имеет длину от 1 до 50 нуклеотидов.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что якорная область имеет длину от 5 до 25 нуклеотидов.
24. Способ по п. 22 или 23, отличающийся тем, что якорная область имеет длину 10 нуклеотидов.
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (а) включает присоединение фрагментов геномной ДНК к множеству адаптеров.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что фрагменты геномной ДНК восстанавливают на концах перед присоединением указанных фрагментов геномной ДНК с множеством адаптеров.
27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанные области амплификации каждого адаптера из множества адаптеров содержат идентичную нуклеотидную последовательность.
28. Способ по п. 26 или 27, отличающийся тем, что область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из от 2 до 1000 нуклеотидных последовательностей.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из от 50 до 500 нуклеотидных последовательностей.
30. Способ по п. 28, отличающийся тем, что область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из от 100 до 400 нуклеотидных последовательностей.
31. Способ по п. 28, отличающийся тем, что область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из от 200 до 300 нуклеотидных последовательностей.
32. Способ по п. 28, отличающийся тем, что область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину 8 нуклеотидов.
33. Способ по любому из пп. 28-32, отличающийся тем, что каждая последовательность из указанных нуклеотидных последовательностей является отличной от любой другой последовательности из 240 нуклеотидных последовательностей на расстояние Хэмминга, равное по меньшей мере двум.
34. Способ по любому из пп. 26-33, отличающийся тем, что каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к или содержится в области тэга образца.
35. Способ по любому из пп. 26-34, отличающийся тем, что каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к области тэга образца.
36. Способ по п. 34 или 35, отличающийся тем, что UMI мультипликатор каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину от 1 до 5 нуклеотидов.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что UMI мультипликатор каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину три нуклеотида.
38. Способ по пп. 26-37, отличающийся тем, что область якорного тэга каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из четырех нуклеотидных последовательностей, и при этом каждая область образца определенной последовательности сопряжена только с одной из четырех якорных областей определенной последовательности.
39. Способ по п. 25 или 26, отличающийся тем, что области амплификации каждого адаптера из множества адаптеров содержат идентичную нуклеотидную последовательность;
причем область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину 8 нуклеотидов, при этом нуклеотидная последовательность каждого тэга образца является отличной от любой другой нуклеотидной последовательности тэгов образца из множества адаптеров на расстояние Хэмминга, равное по меньшей мере двум,
при этом каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к или содержится в пределах области тэга образца, при этом UMI мультипликатор каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину три нуклеотида, и при этом UMI мультипликатор каждой из возможных нуклеотидных последовательностей спарен с каждой областью тэга образца из множества адаптеров,
при этом область якорного тэга каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из четырех нуклеотидных последовательностей, и при этом каждая область образца определенной последовательности сопряжена только с одной из четырех якорных областей определенной последовательности.
40. Способ по любому из пп. 25-39, отличающийся тем, что стадия присоединения фрагментов геномной ДНК к множеству адаптеров включает
(i) присоединение олигонуклеотида, содержащего, по меньшей мере, часть якорной области, к каждому фрагменту геномной ДНК, причем олигонуклеотид, содержащий, по меньшей мере, часть якорной области, представляет собой ДНК дуплекс, содержащий 5'-фосфорилированную цепь присоединения, спаренную с партнерской цепью, причем партнерская цепь является заблокированной от присоединения посредством химической модификации на ее 3'-конце, и при этом указанная цепь присоединения прикреплена к указанному фрагменту геномной ДНК;
(ii) приведение в контакт указанных фрагментов геномной ДНК, прикрепленных к олигонуклеотидам, содержащим, по меньшей мере, часть указанной якорной области, с олигонуклеотидами ДНК, кодирующими полноразмерные адаптерные последовательности для каждой нуклеотидной последовательности адаптера из множества адаптеров; и
(iii) приведение в контакт указанных фрагментов геномной ДНК и олигонуклеотидов ДНК, кодирующих полноразмерную адаптерную последовательность, с полинуклеотидкиназой Т4, Taq ДНК-лигазой и полноразмерной Bst-полимеразой в условиях, подходящих для лигирования ДНК;
тем самым осуществляя прикрепление множества адаптеров к фрагментам геномной ДНК.
41. Способ по любому из пп. 25-40, отличающийся тем, что фрагменты геномной ДНК представляют собой вкДНК.
42. Способ по любому из пп. 25-41, отличающийся тем, что целевую область ДНК анализируют на предмет изменения количества копий.
43. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (с) включает очистку комплексов, образованных между зондами захвата и фрагментами библиотеки ДНК, содержащими целевую область ДНК.
44. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (с) включает очистку комплексов, образованных между зондами захвата и фрагментами библиотеки ДНК, содержащими целевую область ДНК, осуществление удлинения праймера и/или амплификации фрагментов библиотеки ДНК, содержащих область, представляющую интерес, из библиотеки геномной ДНК.
45. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (с) включает очистку комплексов, образованных между зондами захвата и фрагментами библиотеки ДНК, содержащими целевую область ДНК, осуществление удлинения праймера и амплификации фрагментов библиотеки ДНК, содержащих область, представляющую интерес, из библиотеки геномной ДНК.
46. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия (с) включает сиквенирование ДНК фрагментов библиотеки ДНК, содержащих целевую область ДНК, для создания множества ридов (прочтений) сиквенирования.
47. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что геномный анализ включает определение изменения количества копий в интересующей области ДНК, при этом стадия (с) включает
(i) определение количества копий интересующей области, присутствующей в библиотеке геномной ДНК, полученной из тестируемого образца, и
(ii) сравнение количества копий, определенного на стадии (i), с количеством копий интересующей области, присутствующей в библиотеке геномной ДНК, полученной из контрольного образца, причем контрольный образец содержит известное количество копий целевой области ДНК.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что определение количества копий в интересующей области включает сиквенирование ДНК фрагментов библиотеки ДНК, содержащих целевую область ДНК, для создания множества ридов сиквенирования, причем каждый рид сиквенирования содержит уникальный элемент молекулярной идентификации (UMIE).
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что UMIE содержит информацию о последовательности из адаптера и, по меньшей мере, часть последовательности геномной ДНК.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что риды сиквенирования, содержащие идентичные UMIE, идентифицируются как уникальная геномная последовательность (УГП/UGS).
51. Способ по любому из пп. 47-50, дополнительно включающий определение необработанного покрытия генома (RGD - raw genomic depth) для каждого из зондов захвата, контактирующего с библиотекой геномной ДНК.
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что определение RGD включает определение среднего количества УГП, связанных с каждой последовательностью зондов захвата в группе повторов образца.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что зонды захвата, связанные с сильно изменяющимся количеством УГП, идентифицируются как зонды с шумом и удаляются из дальнейших расчетов.
54. Способ по п. 52, дополнительно включающий вычисление RGD для образца, включающее вычисление среднего числового значения всех RGD для всех зондов захвата в образце.
55. Способ по п. 52, отличающийся тем, что значения RGD для зондов с шумом не включены в расчет RGD для образца.
56. Способ по любому из пп. 51-55, отличающийся тем, что RGD для зондов захвата нормализуют по всем образцам в экспериментальной группе путем преобразования RGD для каждого зонда захвата в зонд-специфичное нормализованное количество ридов, включающий
(i) умножение каждого RGD зонда захвата в образце на константу нормализации, причем константа нормализации включает любое действительное число; и
(ii). деление результата (i) на RGD, рассчитанного для соответствующего образца; или
(iii) деление результата (i) на среднюю RGD, рассчитанного для подгруппы зондов.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что подгруппа зондов представляет собой набор контрольных зондов.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что зонд-специфическое нормализованное количество ридов преобразуют в значение количества копий, включающий
(i) умножение зонд-специфического нормализованного количества ридов зондов, направленных на аутосомные и/или X-связанные области, на 2 в образцах, полученных от особей женского пола;
(ii) умножение зонд-специфических нормированных ридов зондов, направленных на Y-связанные и/или X-связанные области, на 1 в образцах, полученных от особей мужского пола;
(iii) усреднение продуктов (i) и/или (ii) по всем образцам в эксперименте; и
(iv). деление произведения (i) и/или (ii) на среднее значение (iii).
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что приблизительные значения количества копий для всех зондов, которые нацелены на конкретный ген, усредняются.
60. Способ высокочувствительного обнаружения увеличения количества копий и уменьшения количества копий, включающий
(i) определение RGD для зонда захвата;
(ii) нормализацию RGD для зонда захвата по всем образцам в экспериментальной группе путем преобразования RGD для зонда захвата в зонд-специфическое нормированное количество ридов;
(iii) вычисление приблизительного значения количества копий для каждого зонд-специфического нормированного количества ридов; и
(iv) усреднение приблизительных значений количества копий для всех зондов, нацеленных на конкретный ген.
61. Способ измерения стабильности хромосом, включающий
(i) разработку и валидацию набора из одного или более зондов хромосомной стабильности, причем зонды хромосомной стабильности равномерно распределены по хромосомам человека;
(ii) выполнение целевого сиквенирования на образцах пациентов с использованием одного или более зондов хромосомной стабильности;
(iii) определение приблизительного значения количества копий для каждого хромосомного зонда;
(iv) определение геномного фенотипа образца пациента, причем колебания значений количества копий для одного или более хромосомных зондов в образце пациента указывают на нестабильность генома.
62. Способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, в котором субъект был идентифицирован как имеющий дестабилизированный геном согласно способу по п. 61, в котором указанный способ лечения рака включает введение фармацевтически эффективного количества ингибитора PARP.
63. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что область, представляющая интерес, представляет собой ген или часть гена.
64. Способ по п. 63, отличающийся тем, что ген является ассоциированным с заболеванием.
65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что заболевание представляет собой рак.
66. Способ по п. 63, отличающийся тем, что указанный ген представляет собой BRCA2, ATM, BRCA1, BRIP1, CHEK2, FANCA, HDAC2 и/или PALB2.
67. Библиотека геномной ДНК, содержащая множество фрагментов библиотеки ДНК, причем каждый из фрагментов библиотеки ДНК содержит адаптер и фрагмент геномной ДНК;
при этом указанный адаптер представляет собой полинуклеотид ДНК, который содержит область амплификации, область тэга образца и якорную область;
при этом указанная область амплификации содержит полинуклеотидную последовательность, способную служить в качестве сайта узнавания праймера для ПЦР амплификации;
при этом указанный тэг образца содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует идентичность уникального фрагмента библиотеки ДНК и кодирует идентичность тестируемого образца; и
при этом указанная якорная область содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует идентичность тестируемого образца, и при этом указанная якорная область способна присоединяться к фрагменту геномной ДНК.
68. Библиотека геномной ДНК по п. 67, отличающаяся тем, что тэг образца дополнительно содержит уникальный идентификатор молекулы (UMI), причем UMI облегчает идентификацию уникального фрагмента геномной ДНК.
69. Библиотека геномной ДНК по п. 67 или 68, отличающаяся тем, что указанная область амплификации имеет длину от 10 до 50 нуклеотидов.
70. Библиотека геномной ДНК по п. 69, отличающаяся тем, что указанная область амплификации имеет длину 25 нуклеотидов.
71. Библиотека геномной ДНК по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанный тэг образца имеет длину от 5 до 50 нуклеотидов.
72. Библиотека геномной ДНК по п. 71, отличающаяся тем, что указанный тэг образца имеет длину 8 нуклеотидов.
73. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-72, отличающаяся тем, что UMI мультипликатор примыкает к или содержится в области тэга образца.
74. Библиотека геномной ДНК по п. 73, отличающаяся тем, что UMI мультипликатор имеет длину от 1 до 5 нуклеотидов.
75. Библиотека геномной ДНК по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что якорная область имеет длину от 1 до 50 нуклеотидов.
76. Библиотека геномной ДНК по п.75, отличающаяся тем, что якорная область имеет длину 10 нуклеотидов.
77. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-76, отличающаяся тем, что области амплификации каждого адаптера из множества адаптеров содержат идентичную нуклеотидную последовательность.
78. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-77, отличающаяся тем, что каждая нуклеотидная последовательность тэгов образца является отличной от любой другой последовательности нуклеотидных последовательностей образца на расстояние Хэмминга, равное по меньшей мере двум.
79. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-78, отличающаяся тем, что каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к или содержится в области тэга образца.
80. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-78, отличающаяся тем, что каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к области тэга образца.
81. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-78, отличающаяся тем, что область якорного тэга каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из четырех нуклеотидных последовательностей, и при этом каждая область образца определенной последовательности сопряжена только с одной из четырех якорных областей определенной последовательности.
82. Библиотека геномной ДНК по п. 67, отличающаяся тем, что области амплификации каждого адаптера из множества адаптеров содержат идентичную нуклеотидную последовательность,
причем указанная область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину 8 нуклеотидов, при этом указанная область тэга образца каждого адаптера из множества адаптеров содержит нуклеотидную последовательность, которая является отличной от любой другой нуклеотидной последовательности тэгов образца из множества адаптеров на расстояние Хэмминга, равное по меньшей мере двум;
при этом каждый из указанного множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к или содержится в пределах указанной области тэга образца, при этом указанний UMI мультипликатор каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину три нуклеотида, и при этом указанный UMI мультипликатор каждой из возможных нуклеотидных последовательностей спарен с каждой областью тэга образца из множества адаптеров,
при этом указанная область якорного тэга каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из четырех нуклеотидных последовательностей; и при этом каждая область образца определенной последовательности сопряжена только с одной из четырех якорных областей определенной последовательности.
83. Библиотека геномной ДНК по любому из пп. 67-82, отличающаяся тем, что указанный фрагмент геномной ДНК представляет собой вкДНК.
84. Множество библиотек геномной ДНК, содержащее более одной геномной библиотеки по любому из пп. 67-83.
85. Множество библиотек геномной ДНК по п. 84, отличающееся тем, что последовательности нуклеиновых кислот областей тэгов образцов библиотеки геномной ДНК, принадлежащих множеству библиотек геномной ДНК, отличаются от последовательностей нуклеиновых кислот областей тэгов образцов других библиотек геномной ДНК, принадлежащих множеству геномных ДНК библиотек.
86. Множество библиотек геномной ДНК по п. 84 или 85, отличающееся тем, что последовательности нуклеиновых кислот указанных областей амплификации библиотеки геномной ДНК, принадлежащих указанному множеству библиотек геномной ДНК, идентичны последовательностям нуклеиновых кислот указанных областей амплификации других библиотек геномной ДНК, принадлежащих указанному множеству библиотек геномной ДНК.
87. Способ генетического анализа целевой области ДНК внеклеточной ДНК (вкДНК), включающий
(a) создание библиотеки ДНК по любому из пп. 67-86;
(b) приведение в контакт указанной библиотеки вкДНК с множеством зондов захвата, которые специфически связываются с целевой областью ДНК, таким образм формируя комплексы между указанными зондами захвата и фрагментами библиотеки ДНК, содержащими указанную целевую область ДНК; и
(c) проведение количественного генетического анализа указанных фрагментов вкДНК, содержащих указанную целевую область ДНК;
тем самым осуществляя генетический анализ указанной целевой области ДНК.
88. Способ прогнозирования, диагностики или мониторинга генетического заболевания у субъекта, включающий
(a) получение тестового образца от субъекта;
(b) выделение геномной ДНК из указанного тестируемого образца;
(c) создание библиотеки ДНК, содержащей множество фрагментов библиотеки ДНК, причем каждый из указанных фрагментов библиотеки ДНК содержит фрагмент геномной ДНК из указанного тестируемого образца и адаптер;
(d) приведение в контакт указанной библиотеки вкДНК с множеством зондов захвата, которые специфически связываются с целевой областью ДНК, таким образм формируя комплексы между указанными зондами захвата и фрагментами библиотеки ДНК, содержащими указанную целевую область ДНК; и
(e) проведение количественного генетического анализа одного или более целевых генетических локусов, ассоциированных с генетическим заболеванием, в библиотеке клонов вкДНК, при этом идентификация или обнаружение одного или более генетических повреждений в одном или более целевых генетических локусах является прогностической для, диагностической для или позволяет отслеживать прогрессирование генетического заболевания.
89. Способ по п. 87 или 88, отличающийся тем, что количественный генетический анализ включает сиквенирование ДНК для создания множества ридов секвенирования.
90. Набор адаптеров, которые кодируют идентичность уникального фрагмента геномной ДНК и идентичность тестового образца, для использования при создании библиотеки геномной ДНК, причем каждый адаптер в указанном наборе адаптеров представляет собой полинуклеотид ДНК, который содержит область амплификации, область тэга образца и якорную область;
при этом указанная область амплификации содержит полинуклеотидную последовательность, способную служить в качестве сайта узнавания праймера для ПЦР амплификации;
при этом указанный тэг образца содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует идентичность уникального фрагмента библиотеки ДНК и кодирует идентичность тестируемого образца; и
при этом указанная якорная область содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует идентичность тестируемого образца, и при этом указанная якорная область способна присоединяться к фрагменту геномной ДНК.
91. Набор адаптеров по п. 90, отличающийся тем, что тэг образца дополнительно содержит уникальный идентификатор молекулы (UMI), причем указанный UMI облегчает идентификацию указанного уникального фрагмента геномной ДНК.
92. Набор адаптеров по п. 90 или 91, отличающийся тем, что указанная область амплификации имеет длину от 10 до 50 нуклеотидов.
93. Набор адаптеров по любому из пп. 90-92, отличающийся тем, что указанная область амплификации имеет длину 25 нуклеотидов.
94. Набор адаптеров по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный тэг образца имеет длину от 5 до 50 нуклеотидов.
95. Набор адаптеров по п. 94, отличающийся тем, что указанный тэг образца имеет длину 8 нуклеотидов.
96. Набор адаптеров по любому из пп. 90-95, отличающийся тем, что указанный UMI мультипликатор примыкает к или содержится в области указанного тэга образца.
97. Набор адаптеров по п. 96, отличающийся тем, что указанный UMI мультипликатор имеет длину от 1 до 5 нуклеотидов.
98. Набор адаптеров по пп. 90-97, отличающийся тем, что указанная якорная область имеет длину от 1 до 50 нуклеотидов.
99. Набор адаптеров по п. 98, отличающийся тем, что указанная якорная область имеет длину 10 нуклеотидов.
100. Набор адаптеров по любому из пп. 90-99, отличающийся тем, что области амплификации каждого адаптера из множества адаптеров содержат идентичную нуклеотидную последовательность.
101. Набор адаптеров по п. 100, отличающийся тем, что каждая нуклеотидная последовательность тэгов образца является отличной от любой другой нуклеотидной последовательности тэгов образца набора адаптеров на расстояние Хэмминга, равное по меньшей мере двум.
102. Набор адаптеров по любому из пп. 90-101, отличающийся тем, что каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к или содержится в области тэга образца.
103. Набор адаптеров по любому из пп. 90-101, отличающийся тем, что каждый из множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к области тэга образца.
104. Набор адаптеров по п. 103, отличающийся тем, что указанная область якорного тэга каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из четырех нуклеотидных последовательностей, и при этом каждая область образца определенной последовательности сопряжена только с одной из четырех якорных областей определенной последовательности.
105. Набор адаптеров по любому из пп. 90-104, отличающийся тем, что указанные области амплификации каждого адаптера из множества адаптеров содержат идентичную нуклеотидную последовательность;
причем указанная область тэга образца каждого адаптера имеет длину 8 нуклеотидов, при этом каждая нуклеотидная последовательность тэгов образца является отличной от любой другой нуклеотидной последовательности тэгов образца из набора адаптеров на расстояние Хэмминга, равное по меньшей мере двум,
при этом каждый из указанного множества адаптеров содержит UMI мультипликатор, который примыкает к или содержится в пределах области тэга образца, при этом UMI мультипликатор каждого адаптера из множества адаптеров имеет длину три нуклеотида, при этом UMI мультипликатор содержит одну из 64 возможных нуклеотидных последовательностей, и при этом UMI мультипликатор каждой из 64 возможных нуклеотидных последовательностей спарен с каждой областью тэга образца из множества адаптеров,
при этом указанная область якорного тэга каждого адаптера из множества адаптеров содержит одну из четырех нуклеотидных последовательностей; и при этом каждая область образца определенной последовательности сопряжена только с одной из четырех якорных областей определенной последовательности.
