Способы инкапсулирования одиночных клеток, инкапсулированные клетки и способы их применения - RU2019144343A

1. Полая гранула, инкапсулирующая одиночную клетку, содержащая: полимерную оболочку; и одиночную клетку, расположенную внутри полимерной оболочки, где полимерная оболочка содержит поры, которые обеспечивают диффузию реагента через полимерную оболочку с одновременным удержанием одиночной клетки.

2. Полая гранула по п. 1, где внутренняя часть полимерной оболочки содержит водную среду.

3. Полая гранула по п. 1, где одиночная клетка, расположенная внутри полимерной оболочки, свободна от взаимодействия с полимерной оболочкой и/или не находится в контакте с полимерной оболочкой.

4. Полая гранула по п. 1, где полая гранула имеет диаметр приблизительно от 20 мкм до приблизительно 200 мкм.

5. Полая гранула по п. 1, содержащая, по меньшей мере, один из:

a) где полимерная оболочка содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ) с четырьмя функциональными концами,

b) где полимер содержит ПЭГ, ПЭГ-акрилат, ПЭГ-амин, ПЭГ-карбоксилат, ПЭГ-дитиол, ПЭГ-эпоксид, ПЭГ-изоцианат, ПЭГ-малеинимид, полиакриловую кислоту (PAA), поли(метил метакрилат) (PMMA), альгинат, полистирол (PS), полистирол сульфонат (PSS), поливинилпирролидон (PVPON), акриламид, N, N’-бис(акрилоил)цистамин, полипропиленоксид (PPO), поли(гидроксиэтил метакрилат) (PHEMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочная кислота) (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую кислоту) (PVSA), поли(L-аспарагиновую кислоту), поли(L-глутаминовую кислоту), полилизин, агар, агарозу, гепарин, альгината сульфат, декстрансульфат, гиалуроновую кислоту, пектин, каррагенан, желатин, хитозан, целлюлозу, коллаген, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллильный эфир диэтиленгликоля, этиленгликоля диакрилат, полиметиленгликоля диакрилат, полиэтиленгликоля диакрилат, триметилопропоан триметакрилат, этоксилированный триметилoл триакрилат, или этоксилированный пентаэритритол тетраакрилат, или их сочетания и смеси,

с) где полимерная оболочка содержит ПЭГ-малеинимид/дитиоловое масло, ПЭГ-эпоксид/аминовое масло, ПЭГ-эпоксид/ПЭГ-амин, или ПЭГ-дитиол/ПЭГ-акрилат,

d) где одиночная клетка представляет собой клетку млекопитающего,

e) где реагент включает в себя ферменты, химические вещества и праймеры с размером менее чем 50 пар оснований, где необязательно реагент включает в себя лизоцим, протеиназу K, случайные гексамеры, полимеразу (ДНК-полимеразу Φ29, Taq-полимеразу, Bsu-полимеразу), транспозазу (Tn5), праймеры (адаптерные последовательности P5 и P7, лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотид трифосфаты, буферы, или двухвалентные катионы.

6. Способ инкапсулирования одиночной клетки в полой грануле, включающий: смешивание одиночной клетки с полимером в разделительном масле для образования смеси (a); перемешивание смеси (a) с маслом для перекрестного сшивания для образования полимерной оболочки, инкапсулирующей одиночную клетку, где полимерная оболочка содержит поры, которые обеспечивают диффузию реагента через полимерную оболочку с одновременным удержанием одиночной клетки.

7. Способ по п. 6, где полая гранула имеет диаметр приблизительно от 20 мкм до приблизительно 200 мкм.

8. Способ по п. 6, i) где полимер содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ) с четырьмя функциональными концами,

ii) где полиэтиленгликоль (ПЭГ) с четырьмя функциональными концами выбран из группы, состоящей из ПЭГ-акрилата, ПЭГ-амина, ПЭГ-карбоксилата, ПЭГ-дитиола, ПЭГ-эпоксида, ПЭГ-изоцианата и ПЭГ-малеинимида,

iii) где разделительное масло содержит минеральное масло или фторуглеродное масло,

iv) где масло для перекрестного сшивания содержит дитиол или амин, растворенный в масле,

v) где одиночная клетка представляет собой клетку млекопитающего,

vi) где реагент включает в себя ферменты, химические вещества и праймеры с размером менее чем 50 пар оснований,

vii) где реагент включает в себя лизоцим, протеиназу K, случайные гексамеры, полимеразу (ДНК-полимеразу Φ29, Taq-полимеразу, Bsu-полимеразу), транспозазу (Tn5), праймеры (адаптерные последовательности P5 и P7, лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотид трифосфаты, буферы, или двухвалентные катионы.

9. Способ по п. 6, где смешивание включает в себя помещение одиночной клетки, полимера, разделительного масла и масло для перекрестного сшивания в генератор капель, где необязательно генератор капель представляет собой микрофлюидный чип.

10. Способ по п. 6, где одиночную клетку фиксируют перед смешиванием путем контакта с фиксатором, где необязательно фиксатор содержит спирт, такой как метанол или этанол, или альдегид, такой как пара-формальдегид.

11. Способ проведения множественных последовательных совместных анализов на одиночной клетке, инкапсулированной в полой грануле, включающий: получение полой гранулы, инкапсулирующей одиночную клетку по любому из пп. 1-5; и последовательный контакт одиночной клетки с реагентами для проведения множественных последовательных совместных анализов.

12. Способ по п. 11, где множественные последовательные совместные анализы включают лизис, анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки ДНК, анализ для оценки хроматина, доступного для транспозазы, с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию, сохраняющую смежность (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq), или амплификацию генома одиночной клетки, или любое их сочетание, проводимое последовательно.

13. Способ по п. 11, где полую гранулу, инкапсулирующую одиночную клетку, высевают на твердую подложку.

14. Способ по п. 11, где твердая подложка представляет собой травленную поверхность, лунку, устройство с проточными ячейками, микрофлюидный канал, гранулу или колонку.