Композиция и способы для разделения клеток - RU2292555C2

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к композициям и способам для разделения клеток.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие общепринятые процедуры выделения клеток крови включают в себя предварительное разделение большого количества крови на эритроцитарные и гранулоцитарные компоненты седиментацией с использованием градиента плотности. Разделение с использованием градиента плотности основано на небольших различиях в плотности различных типов клеток, заставляющих их сегрегировать на различных уровнях в жидкой среде вариабельной плотности. Различия в плотности между типами клеток могут быть небольшими, а индивидуальные типы клеток могут быть гетерогенными по размеру и плотности. В результате этого конкретные типы клеток могут становиться распределенными по среде градиента плотности, а не сегрегированными точно в дискретной зоне в среде градиента плотности. Этот феномен может приводить к плохому выходу желательных клеток и/или загрязнению нежелательными типами клеток. В процедурах, которые производят обогащение в отношении редких типов клеток крови, таких как кроветворные (гемопоэтические) клетки-предшественники, седиментация в градиенте плотности обычно приводит к низким выходам. Например, сообщается, что использование общепринятых способов с использованием градиента плотности для выделения клеток-предшественников (например, гемопоэтических стволовых клеток CD34+) из крови пуповины приводит к существенной потере желательных стволовых клеток. См., например, Wagner, J.E., Am. J., Ped. Hematol. Oncol. 15:169 (1993). В качестве другого примера, использование общепринятых способов с градиентом плотности для выделения лимфоцитов приводит, как сообщается, к селективной потере конкретных субпопуляций лимфоцитов. См., например, Collins, D.P., J. Immunol. Methods 243:125 (2000).

Увеличение выхода редких типов клеток из ткани донора могло бы разительно улучшить успех трансплантационной терапии и различных видов иммунотерапии (например, трансплантации костного мозга, генотерапии на основе стволовых клеток и использующей иммунные клетки терапии), успешность которых явно связана с фактическим количеством клеток, используемых для терапии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение обеспечивает композиции и способы для разделения клеток. Описанные композиции и способы могут быть использованы, например, для эффективного получения клеток для культуры ткани, иммунофенотипической характеристики, другого диагностического тестирования, дополнительной очистки и терапевтического введения.

Способы данного изобретения включают контактирование содержащей клетки крови пробы (например, пробы периферической крови, пробы пуповины и пробы костного мозга) с композицией для разделения клеток. Без связывания с конкретным механизмом композиции данного изобретения могут селективно агглютинировать клетки посредством взаимодействия с антигенами клеточной поверхности и/или посредством стимуляции межклеточной адгезии (например, через увеличенную экспрессию факторов адгезии клеточной поверхности). Агглютинированные клетки отделяются от неагглютинированных клеток, которые остаются в растворе. Клетки могут быть извлечены либо из фазы агглютината, либо из фазы супернатанта, или из обеих фаз.

Описанные композиции и способы могут быть использованы для выделения и обогащения различных типов клеток, в том числе, например, Т-лимфоцитов, Т-клеток-хелперов, супрессорных Т-клеток, В-клеток, гемопоэтических стволовых клеток, циркулирующих в кровотоке стволовых клеток, циркулирующих фетальных клеток в кровотоке матери и циркулирующих метастатических опухолевых клеток. Описанные композиции и способы могут быть использованы в контексте аллотрансплантации и аутотрансплантации. В контексте аутотрансплантации, описанные композиции и способы могут быть использованы, например, для удаления нежелательных клеток, таких как метастатические раковые клетки, из крови или костного мозга пациента. Затем желательные клетки (например, гемопоэтические стволовые клетки) могут быть возвращены пациенту без, или по существу без, угрожающих жизни опухолевых клеток. Описанные композиции и способы могут быть применены к клеткам любого млекопитающего, в том числе к клеткам людей, приматов, не являющихся людьми, грызунов, свиней, коров и лошадей.

Композиции для разделения клеток могут содержать декстран, антитело против гликофорина А, а также антитела против антигенов клеточной поверхности, таких как CD9, CD15, CD2, CD3, CD4, CD8, CD72, CD16, CD41а, HLA Класса I, HLA-DR, CD29, CD11а, CD11b, CD11с, CD19, CD20, CD23, CD39, CD40, CD43, CD44, CDw49d, CD53, CD54, CD62L, CD63, CD66, CD67, CD81, CD82, CD99, CD100, Leu-13, TPA-1 или поверхностный Ig, и их комбинации. Композиции для разделения клеток могут содержать антитела против поверхностных антигенов других типов клеток (например, белков клеточной поверхности опухолевых клеток).

Антитела против антигенов клеточной поверхности могут быть включены в композицию для разделения клеток либо в растворимой, либо в связанной с субстратом форме, либо в обеих формах. Антитела могут быть связаны с субстратами, такими как латексные микрочастицы, частицы из обработанного кислотой (матового) стекла, агрегированные полипептиды, полисахариды, частицы авидина или биотинилированные частицы агарозного геля. Антитела в композициях для разделения клеток могут быть моноклональными и могут быть IgM- или IgG-антителами. В некоторых вариантах композиция для разделения клеток содержит антитело против антитела человека. Концентрация растворимого антитела в композиции для разделения клеток может быть около 0,1 мг/л - около 15 мг/л. Связанные с субстратом антитела могут быть включены в композиции для разделения клеток в концентрации между приблизительно 0,1 и приблизительно 50,0×10⁹ частиц/л.

Композиции для разделения клеток могут также содержать гепарин, двухвалентные катионы (например, Ca⁺², Mg⁺²) и забуференный фосфатом солевой раствор. В некоторых вариантах композиции имеют рН между 6,8 и 7,8 (например, между 7,2 и 7,4).

Данное изобретение обеспечивает также наборы, содержащие компоненты композиции для разделения клеток и упаковочный материал. Наборы могут включать сосуд для сбора крови, такой как контейнер в виде мешка для крови или вакуумная пробирка.

Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое специалистом с квалификацией в области, к которой относится данное изобретение. Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные с описанными здесь материалами, могут быть использованы для применения на практике данного изобретения, удобные способы и подходящие материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие работы, цитируемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде. В случае противоречия контролем является данное описание, в том числе приведенные в нем определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения изобретения.

Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из нижеследующего подробного описания и из формулы изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Данное изобретение описывает композиции и способы для разделения клеток. Композиции данного изобретения могут быть использованы для селективной агглютинации клеток из содержащих клетки крови проб. Без связывания конкретным механизмом композиции данного изобретения могут агглютинировать клетки посредством взаимодействия с антигенами клеточной поверхности и/или посредством стимуляции экспрессии факторов адгезии клеточной поверхности, таких как LFA-1 (связанный с функцией лимфоцитов антиген-1, CD11а/CD18) и ICAM-1 (молекула-1 или фактор-1 межклеточной адгезии CD54). Агглютинированные клетки отделяют от неагглютинированных клеток, которые остаются в растворе. Клетки могут быть выделены из супернатанта или из агглютината.

Композиции для разделения клеток

Композиция для разделения клеток в соответствии с данным изобретением может содержать декстран и одно или несколько антител против антигена клеточной поверхности (т.е. антител, которые имеют специфическую аффинность связывания в отношении этого антигена).

Декстран является полисахаридом, состоящим из звеньев глюкозы, связанных преимущественно по типу альфа (1-6). Декстран может вызывать комплектование стопки эритроцитов (т.е. образование "монетных столбиков") и тем самым облегчать удаление эритроидных клеток из раствора. Антитела против поверхностных антигенов клеток могут облегчать удаление клеток крови из раствора посредством гомотипической агглютинации (т.е. агглютинации клеток одного и того же клеточного типа) и/или гетеротипической агглютинации (т.е. агглютинации клеток различных клеточных типов).

Композиции для разделения клеток могут содержать антитела против антигенов поверхности клеток крови, например, гликофорина А, CD15, CD9, CD2, CD3, CD4, CD8, CD72, CD16, CD41а, HLA Класса I, HLA-DR, CD29, CD11а, CD11b, CD11с, CD19, CD20, CD23, CD39, CD40, CD43, CD44, CDw49d, CD53, CD54, CD62L, CD63, CD66, CD67, CD81, CD82, CD99, CD100, Leu-13, TPA-1 или поверхностного Ig, и их комбинации. Таким образом, композиции для разделения клеток могут быть приготовлены для селективной агглютинации конкретных типов клеток крови.

В некоторых вариантах композиция для разделения клеток включает антитела против гликофорина А. Антитела против гликофорина А могут облегчать удаление эритроцитов из раствора по меньшей мере посредством двух механизмов. Во-первых, антитела против гликофорина А могут вызывать гомотипическую агглютинацию эритроцитов, так как гликофорин А является основным поверхностным гликопротеином на эритроцитах. Кроме того, антитела против гликофорина А могут также стабилизировать опосредуемое декстраном образование "монетных столбиков". Примеры моноклональных антител против гликофорина А включают без ограничения, 107FMN (мышиный изотип IgG1), YTH89.1 (крысиный изотип IgG2b) и Е4 (мышиный изотип IgM). См., например, Vanderlaan et al., Molecular Immunology 20:1353 (1982); Telen M.J. and Bolk, T.A., Transfusion 27:309 (1987) и Outram S. et al., Leukocyte Research, 12:651 (1988).

В некоторых вариантах композиция для разделения клеток включает антитела против CD15. Анти-CD15-антитела могут вызывать гомотипическую агглютинацию гранулоцитов сшиванием молекул CD15, которые присутствуют на поверхности гранулоцитов. Анти-CD15-антитела могут также вызывать гомотипическую и гетеротипическую агглютинацию гранулоцитов с моноцитами, NK-клетками и В-клетками стимуляцией экспрессии молекул адгезии (например, L-селектина и бета-2-интегрина) на поверхности гранулоцитов, которые взаимодействуют с молекулами адгезии на моноцитах, NK-клетках и В-клетках. Гетеротипическая агглютинация этих клеточных типов может облегчать удаление этих клеток из раствора вместе с компонентами эритроцитов. Примеры моноклональных анти-CD15-антител включают, без ограничения, AHN1.1 (мышиный изотип IgM), FMC-10 (мышиный изотип IgM), BU-28 (мышиный изотип IgM), МЕМ-157 (мышиный изотип IgM), МЕМ-158 (мышиный изотип IgM), МЕМ-167 (мышиный изотип IgM). См. также Leukocyte typing IV (1989); Leukocyte typing II (1984); Leukocyte typing VI (1995); Solter D. et al., Proceedings National Academy of Sciences USA 75:5565 (1978); Kannagi R. et al., Journal of Biological Chemistry 257:14865 (1982); Magnani, J.L. et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 233:501 (1984); Eggens I. et al., Journal of Biological Chemistry 264:9476 (1989).

В некоторых вариантах композиция для разделения клеток включает антитела против CD9. Анти-CD9-антитела могут вызывать гомотипическую агглютинацию тромбоцитов. Анти-CD9-антитела могут также вызывать гетеротипическую агглютинацию гранулоцитов и моноцитов посредством тромбоцитов, которые прикрепились к поверхности гранулоцитов и моноцитов. Анти-CD9-антитела могут стимулировать экспрессию L-селектина тромбоцитов, который облегчает связывание тромбоцитов с клеточными поверхностями лейкоцитов. Таким образом, анти-CD9-антитела могут стимулировать связывание множественных клеток друг с другом, облегчая тем самым агглютинацию и удаление из раствора. Примеры моноклональных анти-CD9-антител включают, без ограничения, МЕМ-61 (мышиный изотип IgG1), МЕМ-62 (мышиный изотип IgG1), МЕМ-192 (мышиный изотип IgM), FMC-8 (мышиный изотип IgG2а), SN4 (мышиный изотип IgG1), BU-16 (мышиный изотип IgG2а). См. также Leukocyte typing VI (1995); Leukocyte typing II (1984); Von dem Bourne A.E.G. Kr. and Moderman P.N. (1989) In Leukocyte typing IV (ed. W. Knapp et al.), pp. 989-92, Oxford University Press, Oxford; Jennings, L.K., et al. In Leukocyte typing V, ed. S.F. Schlossmann et al., pp. 1249-51. Oxford University Press, Oxford (1995); Lanza F. et al., Journal of Biological Chemistry 266:10638 (1991); Wright et al., Immunology Today 15:588 (1994); Rubinstein E. et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 21:10 (1995).

В некоторых вариантах композиция для разделения клеток содержит антитела против CD41, которые могут селективно агглютинировать тромбоциты. В некоторых вариантах композиция для разделения клеток содержит антитела против CD3, которые могут селективно агглютинировать Т-клетки. В некоторых вариантах композиция для разделения клеток содержит антитела против CD2, которые могут селективно агглютинировать Т-клетки и NK-клетки. В некоторых вариантах композиция для разделения клеток содержит антитела против CD72, которые могут селективно агглютинировать В-клетки. В некоторых вариантах композиция для разделения клеток содержит антитела против CD16, которые могут селективно агглютинировать NK-клетки и нейтрофильные гранулоциты.

Как упоминалось выше, композиции для разделения клеток могут быть приготовлены для селективной агглютинации конкретных клеток крови. В качестве примера композиция для разделения клеток, содержащая антитела против гликофорина А, CD15 и CD9, может облегчать агглютинацию эритроцитов, гранулоцитов, NK-клеток, В-клеток и тромбоцитов. Затем Т-клетки, NK-клетки и редкие клетки-предшественники могут быть извлечены из раствора. Если эта форма содержала бы также антитело против CD3, могли бы агглютинироваться также Т-клетки, а NK-клетки и редкие предшественники могли бы извлекаться из раствора.

Композиции для разделения клеток могут содержать антитела против поверхностных антигенов других типов клеток (например, поверхностных белков опухолевых клеток). Специалисты с квалификацией в данной области могут использовать рутинные способы для получения антител против антигенов клеточной поверхности клеток крови и других клеток людей и других млекопитающих, в том числе, например, приматов, не являющихся человеком, грызунов (например, мышей, крыс, хомячков, кроликов и морских свинок), свиней, коров и лошадей.

Обычно антитела, используемые в этой композиции, являются моноклональными антителами, которые являются гомогенными популяциями антител к конкретному эпитопу, содержащемуся в антигене. Подходящие моноклональные антитела являются коммерчески доступными или могут быть получены с использованием стандартной гибридомной технологии. В частности, моноклональные антитела могут быть получены способами, которые обеспечивают продуцирование молекул антител непрерывными клеточными линиями в культуре, в том числе способом, описанным Kohler, G. et al., Nature, 1975, 256:495, способом В-клеточной гибридомы человека (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026 (1983)) и способом EBV-гибридомы (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1983)).

Антитела могут быть антителами любого класса иммуноглобулинов, в том числе IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, и любого их подкласса. Антитела изотипов IgG и IgM являются особенно применимыми в композициях для разделения клеток данного изобретения. Пентамерные антитела IgM содержат больше сайтов связывания антигена, чем антитела IgG, и могут, в некоторых случаях (например, антитела против гликофорина А и анти-CD15-антитела), быть особенно применимыми для реагентов для разделения клеток. В других случаях (например, анти-CD9-антитела), антитела изотипа IgG являются особенно применимыми для стимуляции гомотипической и/или гетеротипической агглютинации.

Антитела против антигенов клеточной поверхности могут быть обеспечены в жидкой фазе (т.е. быть растворимыми). Антитела жидкой фазы обычно обеспечивают в композиции для разделения клеток в концентрации между приблизительно 0,1 и приблизительно 15 мг/л (например, 0,25-10, 0,25-1, 0,5-2, 1-2, 4-8, 5-10 мг/л).

Антитела против антигенов клеточной поверхности могут быть также обеспечены в ассоциации с твердой фазой (т.е. могут быть связанными с субстратом). Антитела против различных антигенов клеточной поверхности могут быть ковалентно связаны с твердой фазой для усиления сшивания молекул клеточной поверхности и активации молекул адгезии клеточной поверхности. Применение связанных с субстратом антител может облегчать разделение клеток (например, благодаря массе, которую эти частицы придают агглютинированным клеткам, или благодаря свойствам, применимым для очистки).

В некоторых вариантах твердая фаза, с которой связано связанное с субстратом антитело, является состоящей из частиц. В некоторых вариантах антитело связано с микрочастицей из латекса, такой как парамагнитная гранула (например, через связь биотин-авидин, ковалентную связь с группами СОО на полистироловых гранулах или ковалентную связь с NH₂-группами на модифицированных гранулах). В некоторых вариантах антитело связано с частицей из обработанного кислотой (матового) стекла (например, через связь биотин-авидин). В некоторых вариантах антитело связано с агрегированным полипептидом, таким как агрегированный бычий сывороточный альбумин (например, через связь биотин-авидин или ковалентную связь с группами СОО или группами NH₂ полипептида). В некоторых вариантах антитело ковалентно связано с полисахаридом, таким как высокомолекулярный (например, > 1000000 M_r) декстрансульфат. В некоторых вариантах биотинилированные антитела связаны с частицами авидина с образованием тетрамерных комплексов, имеющих четыре молекулы антитела на одну молекулу авидина. В некоторых вариантах антитела связаны с биотинилированными частицами агарозного геля (One Cell Systems, Cambridge, MA, U.S.A.) через связи биотин-авидин-биотинилированное антитело. Такие частицы обычно имеют размер приблизительно 300-500 микрон и могут быть образованы в водяной бане для обработки ультразвуком или в быстро перемешиваемой водяной бане.

Частицы клетка-субстрат (т.е. частицы, включающие в себя клетки и связанные с субстратом антитела) могут осаждаться из раствора в виде агглютината. Частицы клетка-субстрат могут быть также удалены из раствора, например, посредством наложенного магнитного поля, как в случае, когда эта частица является парамагнитной гранулой. Связанные с субстратом антитела обычно обеспечены в композиции для разделения клеток в концентрации приблизительно 0,1 - приблизительно 50,0×10⁹ частиц на литр (например, (0,25-10,0)×10⁹, (1-20,0)×10⁹, (2-10,0)×10⁹, (0,5-2)×10⁹, (2-5)×10⁹, (5-10)×10⁹ и (10-30)×10⁹ частиц на литр), где частицами называют частицы твердой фазы, имеющие связанные с ними антитела.

Композиции для разделения клеток могут также содержать двухвалентные катионы (например, Ca⁺², Mg⁺²). Двухвалентные катионы могут быть обеспечены, например, сбалансированным солевым раствором (например, сбалансированным солевым раствором Хенкса). Сообщалось, что ионы Са⁺² являются важными для опосредованной селектином и опосредованной интегрином межклеточной адгезии.

Композиции для разделения клеток данного изобретения могут также содержать антикоагулянт, такой как гепарин. Гепарин может предотвращать свертывание и неспецифическую потерю клеток, связанную со свертыванием, в среде с высоким содержанием кальция. Гепарин также стимулирует агрегацию тромбоцитов. Агрегированные тромбоциты могут прикрепляться к гранулоцитам и моноцитам и тем самым усиливать гетеротипическую агглютинацию в большей степени, чем отдельные тромбоциты. Гепарин может предоставляться в виде соли гепарина (например, натрий-гепарина, литий-гепарина или калий-гепарина).

Способы разделения клеток

Описанные композиции могут быть использованы, например, для эффективного приготовления клеток для культуры ткани, иммунофенотипической характеристики, другого диагностического тестирования, дополнительной очистки и терапевтического введения. Без связывания с каким-либо конкретным механизмом композиции данного изобретения могут селективно агглютинировать клетки посредством взаимодействия с антигенами клеточной поверхности и/или посредством стимуляции межклеточной адгезии (например, через увеличенную экспрессию факторов адгезии клеточной поверхности). Агглютинированные клетки отделяются от неагглютинированных клеток, которые остаются в растворе.

После агглютинации неагглютинированные клетки могут быть извлечены из фазы раствора. Клетки могут быть также извлечены из агглютината. Агглютинированные клетки могут быть диссоциированы, например, перенесением этих клеток в буферы, которые содержат хелаторы двухвалентных катионов, такие как ЭДТА или ЭГТА. Клетки, извлеченные из агглютината, могут быть дополнительно разделены с использованием антител против антигенов клеточной поверхности. Клетки могут быть извлечены из агглютината микрочастица геля-антитело-клетка нагреванием агглютината до температуры немного более высокой, чем точка плавления.

Описанные композиции могут быть использованы для разделения клеток из разнообразных проб, в том числе периферической крови (например, полученной венопункцией), крови пуповины (например, полученной после беременности), и костного мозга (например, из аспирата). Пробы, содержащие клетки крови (гемоциты), могут быть контактированы с композицией для разделения клеток для индукции агглютинации конкретных типов клеток. Например, эритроциты и дифференцированные компоненты миелоидной крови могут быть селективно агглютинированы с использованием композиций для разделения клеток, содержащих антитела к поверхностным антигенам этих клеток. Описанные композиции и способы могут быть использованы для выделения и обогащения в отношении различных типов клеток, в том числе, например, Т-лимфоцитов, Т-клеток-хелперов, супрессорных Т-клеток, В-клеток, гемопоэтических стволовых клеток, циркулирующих в кровотоке эмбриональных стволовых клеток, циркулирующих фетальных клеток в кровотоке матери и циркулирующих метастатических опухолевых клеток. Описанные композиции могут быть использованы для агглютинации клеток любого млекопитающего, в том числе людей, приматов, не являющихся людьми, грызунов, свиней, коров и лошадей.

Описанные композиции и способы могут быть использованы в контексте аллотрансплантации и аутотрансплантации. В контексте аутотрансплантации описанные композиции и способы могут быть использованы, например, для удаления нежелательных клеток, таких как метастатические раковые клетки, из крови или костного мозга пациента. Затем желательные клетки (например, гемопоэтические стволовые клетки) могут быть возвращены пациенту без, или по существу без, угрожающих жизни опухолевых клеток.

Композиции для разделения клеток, содержащие антитела против белков клеточной поверхности опухолевых клеток, могут быть использованы для очищения от опухолевых клеток крови или костного мозга пациента. Такие композиции могут быть также использованы для диагностических процедур, например, для получения и обнаружения опухолевых клеток в агглютинате, где они являются сконцентрированными и, следовательно, являются более легко детектируемыми, чем в циркулирующей крови или в костном мозге. Композиция для разделения клеток, содержащая антитела против рецептора эпителиального фактора роста, может быть использована для агглютинации опухолевых клеток, происходящих из эпителиальных опухолей (например, опухолей головы и шеи). Композиция для разделения клеток, содержащая антитела против рецепторов эстрогена, может быть использована для агглютинации опухолевых клеток, происходящих из опухолей молочной железы и яичников. Композиция для разделения клеток, содержащая антитела против поверхностных иммуноглобулинов, может быть использована для агглютинации опухолевых клеток, связанных с хроническим лимфоцитарным лейкозом, плазмацитомой и множественной миеломой. Клетки рака молочной железы экспрессируют CD15 на поверхности их клеток и могут быть выведены из костного мозга с использованием композиции для разделения клеток, которая содержит антитела против CD15. Другие рецепты могут быть сделаны на основе типа клеток и белков клеточной поверхности для получения или истощения метастатических опухолевых клеток, происходящих из других карцином (например, эритролейкоза, эндотелиальной карциномы и желудочно-кишечной карциномы) из крови или костного мозга пациента.

Наборы для разделения клеток

Композиция для разделения клеток может комбинироваться с упаковочным материалом и продаваться в виде набора. Компоненты композиции для разделения клеток могут быть упакованы по отдельности или в комбинации друг с другом. В некоторых вариантах упаковочный материал включает в себя сосуд для сбора крови (например, мешок для крови, вакуумную пробирку). Упаковочный материал, включенный в набор, обычно содержит инструкции или этикетку, описывающие, каким образом данная композиция для разделения клеток может быть использована для агглютинации конкретных типов клеток. Компоненты и способы для приготовления подобных наборов являются хорошо известными.

Данное изобретение описывается дополнительно в следующих примерах, которые не ограничивают объем данного изобретения, приведенный в формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Разделение клеток крови

Этот пример описывает общий способ, при помощи которого клетки разделяли с использованием описанных ниже реагентов для разделения клеток. Равный объем реагента для разделения клеток (т.е. 25 мл) объединяли с равным объемом обработанной ЭДТА и гепарином (против свертывания) пробы периферической крови (т.е. 25 мл) в конической пробирке на 50 мл. Пробы, содержащие количества лейкоцитов более 20×10⁶ клеток/мл, объединяли с реагентом для разделения клеток в соотношении одна часть крови на две части реагента. Пробирки осторожно перемешивали на качающейся платформе в течение 30-45 минут при комнатной температуре. Пробирки стояли вертикально в держателе в течение 30-50 минут для обеспечения возможности агглютинированным клеткам отделиться от неагглютинированных клеток, которые оставались в растворе. Без нарушения агглютината использовали пипетку для извлечения неагглютинированных клеток из супернатанта. Извлеченные клетки промывали в 25 мл ФСБ и центрифугировали при 500×g в течение 7 минут. Осадок клеток ресуспендировали в 4 мл ФСБ.

Клетки извлекали также из агглютината с использованием гипотонического лизирующего раствора, содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (ЭГТА). Агглютинированные клетки обрабатывали 25 мл VitaLyse™ (BioErgonomics, St. Paul, MN) и встряхивали на вортексе (вихревом смесителе). Спустя 10 минут клетки либо подвергали действию приложенного магнитного поля для извлечения клеток, связанных с антителами, прикрепленными к парамагнитным гранулам, либо центрифугировали при 500×g в течение 7 минут и супернатант удаляли. В этом случае клетки ресуспендировали в 4 мл ФСБ.

Выходы эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, Т-клеток, В-клеток и NK-клеток определяли проточной цитометрией и иммунофенотипированием. Перед проточной цитометрией выход лейкоцитов (т.е. количество лейкоцитов) определяли с использованием гематологического анализатора Coulter Onyx Hematology, и пробы доводили с использованием ФСБ до количества клеток 1×10⁷ клеток/мл. Аликвоты 100 мкл доведенной до нужного объема пробы окрашивали при комнатной температуре в темноте в течение 15-30 минут FITC-меченными анти-CD3-антителами (реактивными с Т-клетками), РЕ-меченными анти-CD19-антителами (реактивными с В-клетками) или РЕ-меченными анти-CD16-антителами (реактивными с NK-клетками). К каждой пробе добавляли 2 мл ФСБ и затем эту пробу встряхивали на вортексе и центрифугировали для осаждения клеток. Супернатанты выбрасывали, а осадки клеток встряхивали на вортексе и ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ. Окрашенные и неокрашенные клетки анализировали проточной цитометрией с использованием проточного цитометра Coulter XL. Эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, моноциты, гранулоциты и тромбоциты идентифицировали на основе диагностических свойств прямого и бокового светорассеяния. В-клетки, Т-клетки и NK-клетки идентифицировали на основе светорассеяния и окрашивания мечеными антителами.

Пример 2: Агглютинация эритроцитов

Реагент, описанный в таблице 1, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1.

Результаты разделения показаны в таблице 2. Эритроциты истощались на 99,7% из супернатанта. Лимфоциты (Т-клетки, В-клетки и NK-клетки) были обогащенными в супернатанте относительно моноцитов и гранулоцитов.

Пример 3: Агглютинация эритроцитов и (CD2+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 3, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1.

Результаты разделения показаны в таблице 4. В супернатанте эритроциты истощались на 99,7%, Т-клетки истощались на 95,1% и NK-клетки истощались на 69,1%. В-клетки обогащались в супернатанте относительно других клеток.

Пример 4: Агглютинация эритроцитов и (CD72+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 5, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1.

Результаты разделения показаны в таблице 6. В супернатанте эритроциты истощались на 99,5% и В-клетки истощались на 81,6%.

Пример 5: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток и (CD9+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 7, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1.

Результаты разделения показаны в Таблице 8. В супернатанте эритроциты истощались на 99,9%, моноциты и гранулоциты истощались на 99,8%, В-клетки истощались на 74% и NK-клетки истощались на 64,9%. Кроме того, тромбоциты, присутствующие в супернатанте в количестве 226×10⁶ на мл перед разделением, истощались до 1,4×10⁶ на мл, т.е. на 99,4%.

Пример 6: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток и (CD2+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 9, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1.

Результаты разделения показаны в таблице 10. В супернатанте эритроциты истощались на 99,9%, моноциты и гранулоциты истощались на 99,9%, В-клетки истощались на 16,8%, NK-клетки истощались на 29% и Т-клетки истощались на 91,5%. Кроме того, тромбоциты, присутствующие в супернатанте при 226×10⁶ на мл перед разделением, истощались до 0,3×10⁶ на мл, т.е. на 99,9%.

Пример 7: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток и (CD72+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 11, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1.

Результаты разделения показаны в таблице 12. В супернатанте эритроциты истощались на 99,9%, моноциты до степени невозможности детектирования, гранулоциты истощались на 99,97%, В-клетки истощались на 97,2%, NK-клетки истощались на 54,9%%. Кроме того, тромбоциты, присутствующие в супернатанте при 226×10⁶ на мл перед разделением, истощались до 0,1×10⁶ на мл, т.е. на 99,96%.

Пример 8: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток, (CD19+)-клеток и (CD16+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 13, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1. Т-клетки и (CD3+)-клетки извлекали из супернатанта. В-клетки и гранулоциты извлекали из агглютината.

Пример 9: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток, (CD19+)-клеток, (CD16+)-клеток и (CD4+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 14, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1. (CD8+)-клетки извлекали из супернатанта.

Пример 10: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток, (CD19+)-клеток, (CD16+)-клеток и (CD8+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 15, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1. (CD4+)-клетки извлекали из супернатанта.

Пример 11: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток, (CD19+)-клеток и (CD2+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 16, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1. (CD34+)-клетки извлекали из супернатанта при чистоте >50% и с выходом >80%.

Пример 12: Агглютинация эритроцитов, (CD15+)-клеток, (CD9+)-клеток, (CD2+)-клеток и (CD16+)-клеток

Реагент, описанный в таблице 17, использовали для разделения клеток согласно способу, описанному в примере 1. В-клетки извлекали из супернатанта.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ

Хотя данное изобретение было описано вместе с предыдущим подробным описанием и примерами, предыдущие описание и примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения рамок данного изобретения, которые определяются рамками формулы изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области медицины и касается композиции и способов для разделения клеток на основе агглютинации. Эти реагенты включают раствор декстрана, анти-гликофорин А-антитело, анти-СD15-антитело, анти-СD9-антитело и антитела, выбранные из группы, включающей анти-СD3-антитело, анти-СD72-антитело, анти-СD16-антитело, анти-СD4-антитело, анти-СD8-антитело и анти-СD2-антитело. Преимущество изобретения заключается в разработке композиции для выделения клеток крови даже редких клеточных типов с высоким выходом. 3 н. и 31 з.п. ф-лы, 17 табл.

Формула