Дискретная микросфера и способ получения дискретных микросфер (варианты) - RU2096453C1

Чертежи

Показать все 7 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к процессу получения добавок к питательным кормам, содержащих благотворные микроорганизмы.

Известно, что некоторые микроорганизмы, например бактерии, являются потенциально благотворными, когда их добавляют в корм для животных. Бактерии благотворны в том смысле, что они поставляют естественную кишечную микрофлору. Некоторые фирмы предлагают на рынке микробиалы прямого кормления, содержащие желаемые бактерии. Однако микробиалы прямого кормления с трудом могут поддерживать стабильный продукт. Обычно микробиал прямого кормления используется на весьма малом уровне и добавляется в корм на уровне примерно 1% Неиспользованный корм, содержащий микробиал прямого кормления, или продукт, добавляемый в корма, часто хранится фермерами в течение длительного времени. В процессе хранения часто присутствует влага. Во многих случаях влаги достаточно для того, чтобы бактерии активизировались или начали расти. Однако влаги недостаточно для поддержания их жизнедеятельности, и они умирают. Таким образом, активность микробиала прямого кормления прекращается. В других случаях добавление антибиотиков в корм, содержащий микробиал прямого кормления, или в кормовую добавку приводит к неблагоприятному взаимодействию с бактериями, особенно если присутствует небольшое количество влаги, бактерии также умирают. Таким образом, в случае микробиалов прямого кормления имеется существенная проблема, связанная со стабильностью в процессе длительного хранения.

В другом применении, когда микробиал прямого кормления добавляется, например, в корм для кур, обычной практикой является окомковывать материал, причем микробиал прямого кормления добавляется до окомкования.

Влага, образующаяся из пара, который используется при окомковании, отчасти активизирует бактерии, однако из-за недостаточного количества влаги для поддержания их жизнедеятельности бактерии могут погибнуть. Кроме того, их может уничтожить тепло в процессе окомкования. Также существует проблема, связанная с кислотной средой желудка, которая потенциально инактивизирует бактерии прежде, чем они фактически достигнут кишечника. Таким образом, все время имеется необходимость в микробиалах прямого кормления, которые выпускают микроорганизмы в кишечник только в нужное время без преждевременного испускания из-за условий влажности или из-за неблагоприятного pH, которые существуют в пищеварительном тракте до достижения тонкой кишки.

Известны дискретные микросферы, полученные с использованием полимеров, в частности производных жирной кислоты, в том числе стеариновой с размером сфер в диаметре 25 150 мкм, используемые в фармацевтической промышленности (см. патент США N 4933105, B 01 J 13/00, 1990).

Известен также способ получения инкапсулированного продукта, предназначенного для применения в составе кормов для животных, предусматривающий заключение жизнеспособных бактерий вида Enterococcus (Streptococcus) faecium в капсулу из свободных жирных кислот, в частности пальмитиновой кислоты или моноглицерида стеариновой кислоты (см. патент Великобритании N 2016043, кл. C 12 N 1/20, 1979).

Кроме того, известен способ получения микрокапсул из дисперсии лиофилизированной биомассы микроорганизмов, предусматривающий стадии приготовления дисперсии лиофилизированной биомассы микроорганизмов в расплавленном жире, имеющем точку плавления выше температуры тела, и осуществления микрокапсуляции биомассы в расплаве с формированием сферических микрокапсул (см. патент США N 4332790, кл. A 61 K 39/02, 1982).

Для целей настоящего изобретения важно отметить, что свободная жирная кислота отдельно не инкапсулирует (герметизирует) и не образует микрокапсулы микроорганизмов. Вместо этого продукт, полученный в результате способа согласно настоящему изобретению, образует микросферы. Под микросферой понимается матрица жирной кислоты, в которую включен ряд микроорганизмов. Она отличается от микрокапсулы, в которую заключены отдельные организмы. В микросфере матрица жирной кислоты функционирует в отношении состава аналогично тому, как ведет себя матрица теста для домашнего печенья по отношению к кусочкам шоколада для печенья. Причем кусочки шоколада соответствует группе микроорганизмов, таких как бактерии или дрожжи. Микрокапсулы не смогут действовать в процессе согласно этому изобретению, тогда как микросферы вполне функционируют. Микросферы имеют то преимущество, что они стабильны и имеют более эффективную дозировку микроорганизмов по сравнению с отдельным микроинкапсулированием каждого микроорганизма.

Основной задачей настоящего изобретения является получение микробиалов прямого кормления, пригодных для добавления в рацион кормов для животных, который содержит микроорганизмы, находящиеся в микросферах, полученных методом специального вращательного процесса с использованием свободной жирной кислоты.

Другой задачей настоящего изобретения является получение микробиала прямого кормления, который обладает стабильностью в диапазоне от 3 месяцев до 6 месяцев без какого-либо значительного снижения количества организмов.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа вращательного производства микросфер высушенных бактерий, создающих матрицу свободной жирной кислоты, в которой содержится ряд организмов.

Другой задачей настоящего изобретения является получение вращающихся микросфер путем вращения на диске высушенных бактерий, которые легко поддаются обработке в рационах кормов для животных.

Еще одной задачей настоящего изобретения является получение микросфер Enterococcus faceium, Lactobacilli и дрожжей.

На фиг. 1, 2 и 3 наглядно показана стабильность микросфер штаммов при использовании стеариновой кислоты в качестве свободной жирной кислоты.

На фиг. 4, 5 и 6 показано в виде блока-схемы практическое применение настоящего изобретения.

На фиг. 7 показано схематическое выполнение другой системы непрерывной подачи кормов для использования в этом изобретении.

Имеются частицы микросферы матрицы жирной кислоты, содержащие такие организмы, как бактерии, предпочтительно инкапсулированные в стеариновой кислоте Enterococcus faceium. Этот процесс позволяет получать, например, засушенную при заморозке культуру бактерий в микросферах, что достигается путем смешивания высушенных при заморозке бактерий, составляющих от 50% до более 90% по весу от раствора стеариновой кислоты, с последующей вращательной дисковой обработкой. Как будет объяснено ниже, процесс предназначен для того, чтобы свести к минимуму риск нагрева организмов в ходе производства.

Это изобретение относится к высушенным при замораживании, вращающимся дисковым микросферам микроорганизмов, включая грибки, например дрожжи, и также бактерии. Предпочтительно, чтобы организмы были бактериями. Имеются три основных аспекта этого изобретения, которые отличают его от всех предыдущих патентов, относящихся к инкапсулированным бактериям. В первом случае это природа продукта, т. е. микросфер, а во втором случае это свободная жирная кислота. В третьем случае это процесс с вращающимся диском. В обычных процессах используется традиционный метод сушки с распылением, а не метод получения микросфер с вращающимся диском.

Именно совместное действие трех этих отличных друг от друга характеристик обеспечивает получение в высшей степени стабильного микробиала прямого кормления согласно настоящему изобретению. Если эти характеристики не используются, преимущества, проиллюстрированные на примерах, могут быть не достигнуты.

Предпочтительная матрица для образования микросфер это свободная жирная кислота от C₁₂ до C₂₂. Хотя можно применять смеси жирных кислот, предпочтительно использовать одну чистую свободную жирную кислоту. Также предпочтительно, чтобы свободная жирная кислота была насыщенной жирной кислотой, и более предпочтительно, чтобы это была стеариновая кислота.

Важно, чтобы жирная кислота имела температуру таяния менее 75^oC, предпочтительно в диапазоне от 40^oC до 75^oC. Конечно, для того, чтобы быть эффективной матрицей, она должна быть при комнатной температуре твердой. Все свободные жирные кислоты, соответствующие вышеприведенному химическому описанию, будут отвечать этим требованиям.

Конкретный тип микроорганизма для использования в микросферах не является принципиальным. Однако конкретный выбранный тип будет зависеть от образуемого микробиала прямого кормления. Для использования в этом изобретении предпочтительные бактерии это Enterococcus faceium, хотя можно применять и другие виды бактерий, например Lactobacillus, Bacillus и др. Можно использовать как смеси штаммов, так и отдельные штаммы. Можно также использовать дрожжи и грибки.

Для того, чтобы повысить стабильность продукта в отношении бактерий, их обычно высушивают при замораживании и помещают в продукт. Таким образом, их можно снова оживить добавлением влаги.

В микросферах, полученных в соответствии с описанным ниже процессом, частицы в общем случае составляют от около 50 вес. до более чем 90 вес. от компонента жирной кислоты, причем балансом являются микроорганизмы, обычно культура бактерий. Предпочтительный диапазон составляет от около 60% до около 75% жирной кислоты. Если используется слишком мало жирной кислоты, покрытие будет неадекватным для защиты. С другой стороны, если ее используется слишком много, покрытие будет слишком толстым и приведет к неадекватному высвобождению в кишечнике.

Способ получения микросфер, используемый в этом изобретении, связан с вращающимся диком. В этой технологии взвесь микроорганизмов, часто бактерии и компоненты жирной кислоты, тщательно смешиваются со смесью, которая добавляется с равномерной скоростью в центральную часть вращающегося диска из нержавеющей стали. Там под действием центробежных сил эта смесь отбрасывается на периферию. Затем она собирается в охлаждающую камеру, которая поддерживается в условиях окружающей среды или при немного более низкой температуре, сортируется по размерам и готовится для упаковки.

Хотя обработка с помощью вращающегося диска сама по себе известна, неизвестно ее применение в отношении микроорганизмов для приготовления микросфер.

Описание процесса инкапсулирования материалов с помощью вращающегося диска можно найти в статье Джонсонса и др. из Юго-западного исследовательского института в Сан-Антонио, напечатанной в журнале "Journal of Gas Chromotography", октябрь 1965 г. с. 345 347. Кроме того, обрабатывающее устройство с вращающимся диском, пригодное для использования в этом изобретении, подробно описано в патенте Соединенных Штатов, Спаркса, 4.675.140, выданном 23 июня 1987 г. и носящем название "Способ покрытия частиц или капелек жидкости".

Важно отметить, что обработка для получения микросфер с использованием вращающегося диска дает продукт, совершенно отличный от того, который дает обычная сушка распылением в башне. При традиционной сушке распылением частицы имеют тенденцию группироваться, покрытие становится неровным, и стабильность продукта значительно ухудшается возможно в течение нескольких дней или недель. В случае вращательной обработки микросфер, особенно если используются вещества жирные кислоты согласно этому изобретению, стабильность получающихся микроорганизмов, даже если они подвергаются воздействию некоторого количества влаги или антибиотиков, будет составлять от трех до шести месяцев.

При использовании матрицы микросфер материала свободной жирной кислоты согласно настоящему изобретению в указанных выше диапазонах процесс, в котором обычно используется вращающийся диск в 4 дюйма, может протекать со скоростью от 2000 оборотов в 1 мин до 4000 оборотов в 1 мин, предпочтительно от около 2500 до 3200 оборотов в 1 мин со скоростью подачи от 50 г до 200 г в 1 мин.

Предпочтительные условия, которые известны в настоящее время, предполагают использование стеариновой кислоты, использование Enterococcus faceium, вращающегося диска в четыре дюйма, скорость вращения 3000 оборотов в 1 мин и скорость подачи 100 г в 1 мин со взвесью бактерии/стеариновая кислота, состоящей из 35% бактерий и 65% стеариновой кислоты. Когда все это сделано, можно получить продукт, имеющий размер частиц от 75 мкм до 300 мкм, причем предпочтительный уровень составляет менее чем 250 мкм.

Фиг. 1, 2 и 3 будут описаны в связи с примерами 1 4.

Фиг. 4 6 описывают в схематическом выполнении предпочтительные аспекты процесса согласно настоящему изобретению. В частности, основной процесс аналогичен тому, который описан в родственной заявке, посвященной получению микросфер. Однако в высшей степени предпочтительным вариантом является отдельная подача культуры и растаявшей свободной жирной кислоты, что приводит к тому, что тепло воздействует на культуру только очень короткие периоды времени.

Фиг. 7 показывает еще один способ отдельной непрерывной подачи, пригодной для настоящего изобретения.

Еще одна модификация системы включает в себя добавление абсорбирующей влагу колонны для растаявшей свободной жирной кислоты и осушителя для камеры для культуры бактерий. Эти модификации повысят степень извлечения жизнеспособных микросферистых организмов из процесса, что, возможно, снизит себестоимость производства.

На фиг. 4 показан основной процесс. Стеариновая кислота помещается в емкость 10 для таяния стеариновой кислоты в количествах, достаточных для того, чтобы процесс мог протекать в течение нескольких часов. Там кислота растаивает. Затем растаявший материал закачивается под давлением в смеситель меньших размеров 12, где стеариновая кислота 10 смешивается с концентратом культуры, как показано в емкостях для культуры 14 и 16. Емкость для культуры 12 содержит только столько смеси, сколько достаточно для работы в течение приблизительно 20 мин, что ограничивает время, в течение которого бактерии подвергаются воздействию более высокой температуры (60^oC), необходимой для поддержания матрицы в растаявшем состоянии. Вторая емкость 16 работает одновременно, так что когда содержание емкости 14 начинает понижаться, другая загрузка начинает перемещаться в емкости 16. Обе емкости 14 и 16 содержат мешалки (не изображены), чтобы культура распределялась равномерно. При работе с таким типом мешалки периодического действия на диск 16 можно подавать непрерывный поток. Обе емкости смесителя содержатся в масляной ванне при постоянной температуре, чтобы обеспечить поддержание материала матрицы в растаявшем состоянии в ходе производства.

Насос 20 закачивает смесь по линии 22 в камеру коллектора 24. Нижний участок 26 камеры коллектора 24 имеет наклон, чтобы микросферы могли скатываться вниз по краям в коллекторную трубу 28, где они переносятся движением воздуха в циклонный коллектор 30. Микросферы улавливаются в циклонном коллекторе 30 и переносятся к сортировальным ситам 32, где частицы слишком больших и слишком малых размеров удаляются, чтобы в повторном цикле поступить в сосуд для таяния 12.

На фиг. 5 показана модификация основного процесса фиг. 4, где емкости для культуры 14 и 16 в масляной ванне замещены питателем культуры непрерывного действия 34, размещенным таким образом, чтобы культура добавлялась к потоку материала растаявшей матрицы через линию 36 и, также как и линия 38 питателя культуры, она проходит непосредственно вверх по потоку от диска 18. Таким образом, время воздействия на культуру растаявшей матрицы ограничено секундами, а не минутами, как в случае ванны с постоянной температурой при наличии емкости для культуры 14 и 16. Это ограничит температурные повреждения, причиняемые клетками бактерий.

На фиг. 6 показана еще одна модификация системы, в которой добавлена абсорбирующая влагу колонна 40 между сосудом 10 для таяния стеариновой кислоты и местом, в котором вводится культура в питатель 34 твердой культуры непрерывного действия. Осушитель 42 также устанавливается для подачи сухого воздуха в бункер с культурой или в камеру коллектора 24. Как показано на фиг. 6, эти модификации позволяет удалять избыток влаги до обработки микросфер. И снова процесс согласно фиг. 6, аналогичный процессу на фиг. 5, имеет то преимущество, что заранее расправляет свободную жирную кислоту и соединяет ее с культурой непосредственно перед их размещением на вращающемся диске 18 в попытке свести к минимуму время воздействия повышенных температур. Каждый из процессов, представленных на фиг. 4, 5 и 6, имеет особые от других преимущества, а использование процессов, показанных на фиг. 5 и 6, особенно предпочтительно для теплочувствительных материалов.

На фиг. 7 показан другой способ успешного образования микросфер, помогающий избегать опасность повреждения бактерий от высоких температур. Твердые вещества подаются через внутреннюю трубку 44, а жидкая жирная кислота подается через внешнюю трубку 46. Между двумя потоками остается зазор 48 для предотвращения контакта между ними до того момента, когда они не выйдут на поверхность диска 18. Когда диск 18 вращается, твердые вещества отбрасываются к периферии и входят в соприкосновение с жирной кислотой, являющейся материалом покрытия, и они покрываются этим материалом, двигаясь к краю вращающегося диска 18.

Эта система особенно пригодна для получения микросфер из теплочувствительного материала в материалах с расплавленной оболочкой, поскольку время контакта с оболочкой в расплавленном состоянии очень малое.

Для дальнейшей иллюстрации процесса согласно настоящему изобретению, но отнюдь не для его ограничения, предлагаются следующие примеры.

Пример 1
Пример 1 согласуется с фиг. 1. В нем показана стабильность продукта в отношении двух разных штаммов Enterococcus faceium при температурах 4^oC и 27^oC. Фиг. 1 демонстрирует стабильность микросфер штаммов Enterococcus faceium, причем процесс осуществляется с помощью вращающегося диска с использованием стеариновой кислоты с весовым отношением культуры 35% Это тот способ, который наглядно показан на фиг. 4. Условия протекания процесса были теми же самыми, что описаны выше, а именно взвесь стеариновой кислоты с содержанием бактерий 35/65 при температуре 60^oC с использованием вращающегося диска в четыре дюйма, скорость вращения 3000 оборотов в 1 мин, скорость подачи 100 г в 1 мин. Культура покрывалась матрицей с образованием микросфер, которые помещались в теплозащитные паровые мешочки, и еженедельно производились выборки с уничтожением микросфер для определения CFU. Можно видеть, что продукт согласно этому изобретению сохранял чудесную единицу образования колонии организмов (CFU) со временем хранения до 70 дней.

Пример 2
Пример 2 нужно интерпретировать в связи с фиг. 2. На фигуре показана стабильность отдельных инкапсулированных штаммов при их смешивании с обычным рационом кормов в присутствии трех антибиотиков, взятых от домашних птиц. Рацион состоял из следующих ингредиентов:
54% тонко расщепленное зерно,
26% мука для соевых бобов,
2% рыба, перемолотая в муку,
1,5% фосфат двуокиси кальция,
1% известняк,
5,5% соевое масло,
12% содержание влаги.

Добавлялись три антибиотика со следующими весовыми включениями: Deccox 6% (451 частиц на миллион), Salinomycin (50 частиц на миллион) и монензин натрия (120 частиц на миллион).

Культура добавлялась к смеси на таком уровне, чтобы получить приблизительно 1•10⁶ CFU/г питания. Питание упаковывалось в герметизированные при нагревании мешочки и выдерживалось при комнатной температуре. Еженедельно производились выборки для определения CFU. График на фиг. 2 показывает исключительную стабильность.

Пример 3
Пример 3 нужно интерпретировать в связи с фиг. 3. Он представляет стабильность инкапсулированной смеси Enterococcus faceium в кормах в присутствии разных антибиотиков. Соотношение было такое: 60% тонко расщепленного зерна, 38% муки из соевых бобов и 2% извести с содержанием влаги приблизительно 140. Культура добавлялась на уровне приблизительно 10⁶ CFU/г корма и перемешивалась.

Десять кратных фунтов хранились в герметизированных мешках при температуре 20^oC и выборочно брались на проверку еженедельно в течение 16 недель. Антибиотики включались в рацион на таких уровнях:
Бацитрацин метилен дизалицилат 50 г/т
Карбадокс 50 г/т
Хлортетрациклин 200 г/т
Лазолоцид 30 г/т
Линкомицин 100 г/т
Неомицин 140 г/т
Окситетрациклин 150 г/т
Сульфаметазин 100 г/т
Тилозин 100 г/т
Виргиниамицин 20 г/т
ASP 250 100 г/т
Табл. 1 представляет собой список минимальных интервалов времени с одной потерей в логарифме для единицы, образующей колонию (CFU).

Пример 4
В примере 4 была определена стабильность продукта после окомкования при его использовании в качестве корма для кур. Условия микроинкапсуляции были теми же самыми, что и описаны выше. Условия, которые были использованы в этом исследовании, были следующими:
Необработанный белок, не менее 18,0%
Необработанный жир, не менее 5,0%
Необработанное волокно, не менее 6,0%
Гранулы с антибиотиком и без антибиотика (CTC 50 г/т) были приготовлены со следующими ингредиентами и при следующих условиях.

Зерно, SBM, сыворотка, соевое масло, фосфат двуокиси кальция, известь, заранее приготовленная смесь с дающим след минералом, заранее приготовленная смесь с витаминами, селен, сернокислая медь. Культура добавлялась в количестве приблизительно 5•10⁵ CFU/г корма (100 150 г/т).

Температура приведения продукта в норму составляла 70^oC, а гранулы, выходящие из сушилки, были при температуре 78^oC.

Гранулы хранились в негерметизированных мешках и еженедельно брались для выборки на определение CFU.

В каждом случае проверяемый состав сохранял стабильность в условиях окомкования. В частности, окомкованный продукт показал такую же стабильность, как и неокомкованный продукт.

Пример 5
Пример 5 показывает течение процесса, описанного в примере 1, за исключением того, что штамм Enterococcus faceium был удален, а также микросферы, содержащие стеариновую кислоту в качестве свободной жирной кислоты, покрывающей дрожжи.

Микросферы, полученные в ходе этого процесса, содержали дрожжи с жизнеспособным количеством клеток. Они сохранялись при температуре окружающей среды в течение 84 дней. В конце периода хранения жизнеспособные клетки дрожжей подвергались анализу. Спустя 84 дня количество жизнеспособных дрожжей в микросферах составляло 1,3•10⁸ CFU на 1 г. Более высокий уровень регенерации произошел благодаря обычным изменениям в процессе выборки и анализа микросфер. Проба дрожжей, содержащих микросферы (0,841 г), смешивалась с 2270 г обычного рациона для домашних птиц и хранилась при температуре окружающей среды. Рацион для домашних птиц включал в себя 17% влаги и приготавливался таким образом, как было описано выше в примере 2.

По сравнению с начальным количеством микросфер, составляющим 5,3•10⁸ CFU на 1 г, рассчитанный уровень разбавления составлял 1,96•10⁶ CFU на 1 г. После хранения в течение 84 дней корм был исследован на содержание жизнеспособных клеток дрожжей. На 84 день содержание клеток дрожжей составляло 7•10⁴ CFU на 1 г корма.

Пример 6
Процесс получения микросфер, показанный в примере 1, проводился со следующими модификациями.

1. Штаммы из вида Lactobacillus и из особей L. Plantarum или L. Caseii.

2. Бактериальные культуры приготовлялись с уровнем включения от 2 до 40% предпочтительно около 30%
3. Культура бактерий вводилась в растаявшую стеариновую кислоту до контакта с вращающимся диском, как показано на фиг. 4.

4. Нужно быть очень осторожным, чтобы предохранить культуру от повышенной влажности, например выше 40% в течение хранения и обработки с использованием модификации, показанной на фиг. 5.

5. Нужно быть очень осторожным, чтобы поддерживать температуру на уровне около 80^o по Фаренгейту или ниже, а влажность в области сбора микросфер на уровне приблизительно 60% или ниже. Дальнейшие эксперименты, подобные тем, которые были представлены в примере 2, могут проводиться с микросферированием вида Lactobacillus и разновидности L. Plantarum, L. Acidophiluc или L. Caseii. При такой обработке ожидается, что организмы микросфер будут выживать при потере жизнеспособности менее чем на один логарифм единиц образования колоний (CFU) в отношении времени хранения, до 70 дней. Также ожидается, что микросферические организмы, будучи смешаны с обычным рационом для домашних птиц, будут хорошо выживать с потерями жизнеспособности менее одного логарифма от CFU относительно времени ранения до 45 дней.

Реферат

Использование: кормопроизводство, касается процесса получения добавок к питательным кормам, содержащих благотворные микроорганизмы. Сущность изобретения: дискретная микросфера выполнена в виде матрицы из жирной кислоты C₁₂-C₂₄ с включенными в нее культурами микроорганизма и получена вращением на диске инкапсулятора. Сущность объекта изобретения "способ": заключается в приготовлении лиофилизированной биомассы высушенных микроорганизмов и смешивании указанной высушенной культуры с расплавленной жирной кислотой C₁₂-C₂₄ в пропорции от 50 мас.% до приблизительно 90 мас.% посредством вращающегося диска инкапсулятора с получением дискретных микросфер, выполненных в виде матрицы жирной кислоты с включенными в нее микроорганизмами. 3 с. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

Формула