Секвенирование днк с повторным использованием реагентов на проволочной сетке - RU2611207C2

Чертежи

Показать все 9 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к определению последовательности нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение относится к устройству для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты, способу оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты, программному элементу, машиночитаемому носителю, на котором сохраняется программный элемент, и применению соединения в качестве блокатора в секвенировании ДНК.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Секвенирование ДНК является быстроразвивающейся областью с такими ключевыми игроками, как компании Illumina (с использованием технологии Solexa), Life (с использованием технологии SOLiD) и Roche Diagnostics (с использованием технологии 454). Недостаток методов секвенирования, которые применяют эти компании, состоит в том, что информацию о последовательности получают повторением нескольких стадий, которые предусматривают замену реагентов и промывание. Этот подход является весьма затруднительным и занимающим много времени и отправляет в отходы много дорогостоящих реагентов. Число повторений равно числу нуклеотидов, которые опрашиваются, то есть длине прочтения. При стремлении увеличить длину прочтения эта проблема будет становиться все более серьезной в будущем. В настоящее время это компенсируется высоким уровнем параллелизма на больших планшетах. Однако для применения в клинической практике это является менее желательным. Скорее хотелось бы наличия быстрого ответа и меньшей сложности. В то же время затраты в расчете на пару оснований должны значительно снизиться. Поскольку после каждой стадии, то есть после инкорпорации нуклеотида, вся поверхность должна быть полностью промыта, все реагенты отправляются в отходы. Общее расходование реагентов пропорционально длине прочтения и в настоящее время представляет собой преобладающий фактор расходов на секвенирование.

Процесс секвенирования конкретной мишени, например такой как ДНК, становится более сложным, поскольку после реакции инкорпорации должна следовать реакция активации, и между ними требуются стадии тщательного промывания.

Альтернативные подходы, такие как от фирмы Pacific Biosciences, являются более эффективными, так как в них прослеживается инкорпорация нуклеотидов в режиме реального времени для каждой молекулы отдельно. В этом случае промывание не требуется. С другой стороны, оптические требования для такой системы являются очень жесткими, так как необходима чувствительность к одиночному флуорофору с 4 различными цветами в реальном времени. Это может быть достигнуто только для ограниченной области, так как поле зрения линз объективов с большим увеличением ограничено для практических систем и источника мощного лазерного излучения. При ограниченной области может быть упорядочена только малая выборка образцов, и высок риск ошибок вследствие пропущенных прочтений. Флуоресцентные сигналы от меченых нуклеотидов, в то время как они встраиваются полимеразой, необходимо отличать от сигналов того же типа молекул, которые случайно оказались в том же месте. Это делается анализом длительности импульса флуоресцентного сигнала.

Патентный документ WO 2006/007207 А2 раскрывает способы определения последовательности нуклеиновых кислот, в котором нуклеиновые кислоты присоединяют к поверхности и последовательно подвергают воздействию дезоксинуклеотидтрифосфатов, имеющих присоединенную оптически детектируемую метку. После детектирования метка может быть удалена из ее нуклеотида путем фотоотщепления. В определенных вариантах исполнения детектирование проводят с использованием облучения нераспространяющейся волной.

Патентный документ WO 2006/044078 А2 представляет примеры обратимых блокирующих групп, которые являются фотоотщепляемыми. Патентные документы WO 2009/060360 А2, ЕР 2 221 605 А1 и WO 2009/107041 А1 раскрывают различные варианты применения сенсоров с проволочной сеткой.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Может существовать потребность в предоставлении улучшенного подхода к определению последовательности нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение отвечает этой потребности.

Цель настоящего изобретения можно увидеть в предоставлении усовершенствованного подхода к определению последовательности нуклеиновой кислоты.

Цель настоящего изобретения достигается предметом независимых пунктов формулы изобретения. Дополнительные варианты осуществления и преимущества изобретения входят в зависимые пункты патентной формулы.

Следует отметить, что описываемые здесь варианты осуществления подобным образом имеют отношение к способу оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты, устройству для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты, компьютерному программному элементу, машиночитаемому носителю и применению соединения в качестве блокатора в секвенировании ДНК. В различных комбинациях вариантов осуществления могут проявляться синергические эффекты, хотя они могли бы быть не описаны подробно.

Кроме того, следует отметить, что все варианты осуществления настоящего изобретения, касающиеся способа, могли бы быть реализованы в порядке следования стадий, как описано, тем не менее он не должен быть единственным и исключительным порядком следования стадий способа. Настоящим описываются все различные порядки и комбинации стадий способа.

В контексте настоящего изобретения термин «блокатор» следует понимать как фрагмент, который блокирует синтетическую активность фермента в случае, где блокатор введен в молекулу, на которой фермент производит процесс синтеза. Блокатор может представлять собой, например, молекулу-блокатор.

В контексте настоящего изобретения термин «отщепляемый» следует понимать как обеспечивающий возможность отщепления при поглощении расщепляющего излучения с длиной волны λ_CL.

В контексте настоящего изобретения должно быть понятно, что каждый вариант осуществления раскрытой здесь оптической схемы может быть конфигурирован на испускание поляризованного возбуждающего излучения и поляризованного расщепляющего излучения. Таким образом, могут быть использованы поляризатор или источники уже поляризованного излучения. Подробности будут описаны позже.

Кроме того, термин «возбуждающее излучение» в контексте настоящего изобретения применим к излучению с длинами волн λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 соответственно.

Согласно одному примерному варианту осуществления изобретения, представлено устройство для оптического контроля последовательности ДНК. В частности, устройство конфигурировано для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. В альтернативном варианте, вместо секвенирования синтезом, следует полагать входящим в область настоящего изобретения также синтез лигированием. Представляемое устройство включает подложку для иммобилизации по меньшей мере одной молекулы на первой поверхности подложки. Кроме того, устройство включает оптическую схему, которая конфигурирована для направления возбуждающего излучения с по меньшей мере первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения на подложку для возбуждения флуоресцентной метки первого нуклеотида, который инкорпорирован в молекулу, которая иммобилизована на первой поверхности подложки. Оптическая схема дополнительно конфигурирована для приема и детектирования излучения флуоресценции, испускаемого флуоресцентной меткой первого нуклеотида, который инкорпорирован в иммобилизованную молекулу. Кроме того, оптическая схема конфигурирована для направления расщепляющего излучения с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучения, на подложку для оптического индуцирования реакции фотохимического расщепления на первом инкорпорированном нуклеотиде для отщепления блокатора и флуоресцентной метки от первого инкорпорированного нуклеотида. Кроме того, подложка конфигурирована для ограничения возбуждающего излучения и конфигурирована для обеспечения тем самым нераспространяющейся волны возбуждающего излучения на первой поверхности подложки. Кроме того, подложка конфигурирована для ограничения расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучения, и дополнительно конфигурирована для обеспечения тем самым нераспространяющейся волны расщепляющего излучения на первой поверхности подложки.

Здесь предлагается устройство, которое способно объединить достоинства известных устройств для секвенирования. Устройства обеспечивают возможность простого в совокупности считывания, но без необходимости вообще в стадиях промывания или при сокращении их числа, что означает однократную загрузку реагента для всех прочтений.

Другими словами, в настоящем изобретении представлено устройство для секвенирования, которое позволяет проводить секвенирование в единственной текучей среде и в котором не требуются или нужны в меньшем количестве стадии промывания. Необходимый объем реагента, то есть расходы, снижается на величину, равную длине прочтения (50-100). На основе строгого ограничения возбуждающего излучения на подложке, то есть нанофотонной поверхностной структуре типа проволочной сетки, реакция секвенирования может быть считана без промывания поверхности. Для создания нераспространяющейся волны также может быть использовано полное внутреннее отражение.

Постадийное секвенирование достигается применением нуклеотидов с оптически отщепляемыми блокирующими группами. После считывания встроенный нуклеотид деблокируется посредством расщепляющего излучения, например такого как УФ-излучение, через ту же нанофотонную подложку. Этим обеспечивается то, что будут деблокированы только связанные нуклеотиды. Стоимость и скорость секвенирования ДНК строго соотносятся с расходованием реагента. Скорость и сложность оборудования, инструментов и картриджей для секвенирования в большой степени определяются необходимостью в действиях с текучей средой для повторяющихся реакционных стадий и стадий промывания. Оба эти аспекта улучшаются настоящим изобретением, приводя к значительному упрощению и снижению стоимости секвенирования.

Как будет подробно разъяснено в дальнейшем, оптическая схема может быть также конфигурирована для направления возбуждающего излучения с первой, и второй, и третьей, и четвертой длиной λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волны возбуждения на подложку для возбуждения флуоресцентной метки первого нуклеотида, инкорпорированного в молекулу, иммобилизованную на первой поверхности подложки. Тем самым может быть обеспечено то, что, например, четыре различных нуклеотида, например, таких как аденин (А), и гуанин (G), и тимин (Т), и цитозин (С), можно различить, когда для соответственных нуклеотидов используют специфические и различающиеся флуоресцентные метки. Однако, если желательно, также излучение только одной, или двух, или трех из четырех описанных выше длин λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3, и λ_Ex4 волн возбуждения может быть направлено устройством на подложку для возбуждения молекулы, то есть на флуоресцентную метку нуклеотида, который инкорпорирован в иммобилизованную молекулу. Подробности касательно четырех цветовых систем, в которых используются четыре различные флуоресцентные метки для вышеописанных нуклеотидов А, G, С и Т, будут разъяснены далее более подробно с привлечением нижеследующих фиг. 1 и 2. Иммобилизованная молекула могла бы представлять собой фрагмент ДНК и может пониматься как нуклеиновая кислота, последовательность нуклеотидов которой определяется в настоящем изобретении.

Кроме того, квалифицированный специалист в области технологии секвенирования или секвенирования ДНК осведомлен о том факте, что излучение с длинами λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 волн выбирают в комбинации с четырьмя флуоресцентными метками, используемыми, например, для нуклеотидов А, G, С и Т. Другими словами, длины волн выбирают таким образом, что применяемые флуоресцентные метки могут быть оптически возбуждены соответствующим возбуждающим излучением. Кроме того, длину λ_CL волны выбирают так, чтобы желательная реакция отщепления применяемых нуклеотидов могла быть оптически инициирована путем облучения указанным расщепляющим излучением.

В качестве одного примерного варианта осуществления может быть применена следующая длина волны, хотя квалифицированный специалист в этой области технологии может использовать отличную от конкретно раскрытой длину волны.

Длины волн возбуждения могли бы быть выбраны на основе следующего: оптимальное разнесение длин волн возбуждения в пределах видимой области спектра и в соответствии со спектрами поглощения наиболее часто применяемых красителей, например, FAM, HEX, Cy3, Cy5, Alexa Fluor 700 или Atto700, или подобных. Длины волн возбуждения также могут быть скорректированы сообразно доступности источников излучения, например, таких как твердотельные лазерные источники света с излучением, например, на длинах волн 405, 532, 633 и 780 нм. Однако изобретение не ограничивается указанными длинами волн возбуждения. Максимум эмиссии соответствующего красителя может быть выбран таким образом, чтобы не происходило перекрывание с длиной волны возбуждения соседнего окружения. Кроме того, расщепляющее излучение, предпочтительно УФ-излучение, может быть в диапазоне 250-400 нм, предпочтительно 300-370 нм. Однако изобретение не ограничивается указанными длинами волн возбуждения.

Следует отметить, что молекула, которая иммобилизована на первой поверхности подложки, может представлять собой, например, фрагмент ДНК, ДНК, РНК, мРНК, или еще одну нуклеиновую кислоту. Кроме того, с первой поверхностью подложки может быть связан также фермент, который будет описан здесь позже. В контексте настоящего изобретения термин «связанный» следует понимать как состояние, в котором элемент иммобилизован на первой поверхности подложки.

В дополнение, подложка предусматривает участки, которые могут быть покрыты клонами идентичных молекул, чтобы усилить оптический сигнал, который принимается при детектировании флуоресценции. Поэтому подложка может быть обеспечена как матрица таких участков с соответственно различными клонами, чтобы повысить производительность секвенирования.

Другими словами, представленное выше устройство согласно настоящему изобретению позволяет проводить основанный на сборке процесс оптического секвенирования без стадий промывания, чтобы весь процесс определения последовательности нуклеиновой кислоты мог быть проведен в единственном растворе на подложке. Стадии процесса могут контролироваться оптически. Процесс деблокирования, который в настоящем изобретении следует понимать как активацию, инкорпорированного нуклеотида может быть проведен путем облучения поверхности селективным нераспространяющимся излучением расщепляющего излучения. Такое облучение предпочтительно выполняют с использованием УФ-излучения. Процесс описывается как направление расщепляющего излучения с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения на подложку для оптического инициирования реакции фотохимического расщепления у первого инкорпорированного нуклеотида. Поэтому представляемое устройство конфигурировано для отщепления только флуоресцентной метки от первого инкорпорированного нуклеотида путем облучения подложки нераспространяющейся волной расщепляющего излучения. Таким образом, только инкорпорированные нуклеотиды будут деблокированы, активированы или отщеплены благодаря локализации нераспространяющегося поля расщепляющего излучения. То же самое нераспространяющееся поле облучения используется представляемым устройством для считывания флуоресценции инкорпорированных оснований или нуклеотидов относительно фона флуоресцентных меток в растворе. Локализация оптического поля возбуждающего излучения, которое включает по меньшей мере первую длину λ_Ex1 волны возбуждения, достигается нераспространяющимся полем указанного возбуждающего излучения.

Например, нераспространяющаяся волна расщепляющего излучения и нераспространяющаяся волна возбуждающего излучения могут быть генерированы подложкой представляемого устройства, оснащенного проволочной сеткой. Это может позволить использование фокусированного луча с высокой интенсивностью так, чтобы фотооптическая реакция проходила с высокой скоростью на весьма ограниченной площади очень близко к поверхности. Оптическая схема может включать соответствующие оптические элементы для возбуждения и детектирования флуоресценции, то есть считывания, и соответствующие оптические элементы для деблокирования, то есть активации, в едином блоке оптического устройства, или также может быть включена в физически различающиеся элементы.

Кроме того, в оптической схеме может быть предусмотрен соответствующий источник возбуждающего излучения. Кроме того, в конфигурацию оптической схемы может входить источник излучения для эмиссии расщепляющего излучения. Облучение для расщепления, то есть деблокирования и считывания, то есть возбуждения и детектирования флуоресценции, необязательно может проходить через одни и те же линзы. Однако, если желательно, могут быть предусмотрены также две различные оптические системы для деблокирования и считывания.

Поле нераспространяющейся волны, используемое в настоящем изобретении, экспоненциально затухает по мере удаления от первой поверхности с длиной затухания, зависящей от комплексного показателя преломления материала, например металла, проволочной сетки, и комплексного показателя преломления среды между проволоками, при условии, что величина просвета (апертура) между металлическими проволоками является меньшей, чем оптическое разрешение при данной длине волны. Например, апертура может составлять 70 нм, что является гораздо ниже, чем предельная также для УФ-излучения. Длина затухания оценивается как 16,8 нм (см. ниже), которая означает, что поле сокращается до 1/е интенсивности облучения на этом расстоянии от поверхности раздела между металлической проволокой и подложкой. Оно могло бы слегка отличаться от первой поверхности вследствие подтравливания первой поверхности между проволоками.

Другими словами, представляемое устройство создает поверхность селективного облучения расщепляющим излучением и поверхность облучения возбуждающим излучением. Подложка может быть конфигурирована как нанофотонная поверхностная структура таким образом, что генерируются описанные выше оптические ограничения возбуждающего излучения и расщепляющего излучения и дополнительно нераспространяющиеся волны расщепляющего излучения и возбуждающего излучения. Помимо прочего, комбинация возбуждающего излучения, то есть считывающей оптики, и расщепляющего излучения позволяет проводить итерационную постадийную реакцию для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. Это дает то преимущество, что могут быть исключены стадии промывания. Таким образом, описанные выше стадии и циклы, которые выполняются с помощью представляемого устройства, могут быть повторены многократно для обеспечения постадийной инкорпорации одного или более дополнительных нуклеотидов в иммобилизованную молекулу, и после этого считывание того, был ли указанный нуклеотид инкорпорирован или нет, как было описано выше.

Кроме того, устройство может быть конфигурировано для получения данных, которые описывают различия нуклеиновых кислот, которые были инкорпорированы в иммобилизованную молекулу, основываясь на постадийном оптическом воздействии, которое оптически контролируется устройством.

Кроме того, подложка может быть выполнена из полимера, например полициклоолефина, поликарбоната, сложного полиэфира или РММА (полиметилметакрилата). Могут быть также применены металл и полупроводники.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления изобретения, устройство дополнительно включает молекулу, которая иммобилизована на первой поверхности подложки. Кроме того, устройство включает раствор с многочисленными нуклеотидами и ферментом. Нуклеотиды в нем соответственно включают блокатор. Блокатор конфигурирован для блокирования синтетической активности фермента, когда соответствующий фрагмент инкорпорирован в молекулу, иммобилизованную на первой поверхности устройства.

Если желательно, блокатор включает флуоресцентную метку. Однако блокатор и флуоресцентная метка могут быть инкорпорированы или позиционированы на первом нуклеотиде в различных положениях. Они могут быть отщеплены в одном едином процессе расщепления или в различных процессах расщепления. Это справедливо для каждого варианта осуществления настоящего изобретения.

Представляемый здесь вариант осуществления обеспечивает то преимущество, что реакция инкорпорирования останавливается сама по себе вследствие присутствия блокатора. Например, для блокирования синтетической активности фермента может быть использован блокатор, действующий на основе стерического затруднения. Это позволяет проводить локальное считывание реакции, которая протекает на многих участках одновременно. В прототипе действие применяемых ферментов в образце в устройстве не может быть синхронизировано. Однако настоящее изобретение обеспечивает возможность инкорпорации нуклеотидов, которая преимущественно может быть выполнена шаг за шагом вместе со считыванием после каждой стадии. Преимущество достигается применением вышеописанных блокаторов, которые могут представлять собой блокированные нуклеотиды, которые блокируют активность фермента после того, как нуклеотид был инкорпорирован. Для продолжения инкорпорации следующего нуклеотида требуется активное деблокирование, которое настоящее изобретение обеспечивает с помощью оптической схемы, которая конфигурирована для направления расщепляющего излучения для отщепления блокатора. Блокатор может включать флуоресцентную метку.

В качестве примерных вариантов осуществления блокаторы могут быть выполнены как 3'-блокированный обратимый терминатор или как 3'-неблокированный обратимый терминатор, как описано и определено в статье автора Michael L. Metzker «Sequencing technologies, the next generation» («Технологии секвенирования, новое поколение») в издании Nature Review Genetics, том 11 (2010), стр. 31-46. В ней, также называемые «неблокированными», указанные блокаторы, такие как 3'-неблокированный обратимый терминатор, могут быть использованы как блокирующие активность фермента. Обратимые терминаторы можно понимать как лиганды, присоединенные к нуклеотид/рибозному фрагменту, которые останавливают инкорпорацию любого последующего нуклеотида после инкорпорации. Они являются обратимыми, когда при отщеплении химическим или фотохимическим путем этот процесс может быть незавершенным, и полимераза может встраивать следующий нуклеотид. Кроме того, 3'-блокированный обратимый терминатор, согласно авторам Metzker и др., может быть изменен, например, химически, чтобы сделать его пригодным к фотоотщеплению. Тогда фотоотщепление действием расщепляющего излучения может быть выполнено с помощью настоящего изобретения. В дополнение, в качестве блокаторов могут быть применены другие комплексы в комбинации с соответствующим ферментом, как будет описано позже. Квалифицированный специалист знает, какая комбинация фермента и блокатора приводит к желательному эффекту блокирования синтетической активности фермента.

Применяемая здесь терминология относительно указанных блокаторов согласуется с содержанием указанной статьи и приспособлена к ней. Указанный второй класс соединений дает дополнительное преимущество, так как представляет ситуацию с неблокированным 3'-положением рибозного фрагмента, и инкорпорация следующего нуклеотида предотвращается объемистой группой, которая также содержит флуоресцентную метку, присоединенную к фрагменту пары оснований в 5'-положении рибозного фрагмента. Вывод об этом также может быть сделан из следующей фиг. 6 и ее описания. Удлинение нуклеотидного олигомера предотвращается, пока эта группа присоединена. Однако инкорпорация следующего нуклеотида становится возможной после удаления объемистой группы. Настоящее изобретение обеспечивает такое удаление инициированием реакции фотохимического отщепления. Более благоприятно то, что в настоящем изобретении такая реакция отщепления используется только очень близко к поверхности, на которой иммобилизована молекула, благодаря тому обстоятельству, что генерируется нераспространяющаяся волна расщепляющего излучения.

В дополнение к нижеследующему описанию, должны приниматься во внимание подробности фиг. 6, 8 и 10, на которых представлены блокаторы с включенной флуоресцентной меткой.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления настоящего изобретения, блокатор представляет собой фотоотщепляемый 3'-неблокированный обратимый терминатор.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления, блокатор выбирают из группы, состоящей из нитрофенилэтильных производных аналогов 5-метил-(2-(2-нитрофенил)пропил)карбоната-dUTP, аналога 5-метил-(2-оксо-1,2-дифенилэтил)карбоната-dUTP и любых их комбинаций.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления, подложка конфигурирована как проволочная сетка для возбуждающего излучения и для расщепляющего излучения.

Проволочная сетка может включать структуру из металлических проволок, например, на стеклянной подложке. Промежуток между проволоками действует как плакированный пластинчатый волновод, в котором главную роль играют два основополагающих принципа. Например, для поперечной электрической (TE) волны поляризованного возбуждающего излучения, падающего на проволоки подложки согласно настоящему изобретению, создаваемой модой между проволоками, является мода нераспространяющейся волны, имеющей, например, длину затухания 16,8 нм для λ=630 нанометров. При этом предполагается, что проволоки подложки заполнены средой, имеющей показатель преломления воды, n=1,33. Для поперечной магнитной (TM) волны поляризованного излучения создаваемая мода для проволочной сетки называется модой распространяющейся волны, имеющей длину затухания 1,2 мкм в этом примере. Например, в одном примере высота проволоки может составлять 60 нанометров. В этом случае TM-поляризованная мода пропускается с потерей излучения порядка 10% или менее, тогда как ТЕ-поляризованная мода скоротечно затухает.

Иной путь к пониманию проволочной сетки состоит в представлении, например, алюминиевых проволок в качестве металла, который отражает возбуждающее излучение с поляризацией параллельно проволокам (ТЕ-поляризация) и который пропускает поляризацию ортогонально проволокам (TM-поляризация). Максимальное пропускание TM-поляризованного излучения может быть выше 95%. Нераспространяющееся поле в случае падающего возбуждающего ТЕ-излучения изображено на обеих фиг. 3а и 3b. Возбуждающее излучение и расщепляющее излучение, испускаемые оптической схемой согласно настоящему изобретению, могут иметь такую картину поляризации в этом и каждом другом варианте осуществления настоящего изобретения.

Квалифицированный специалист в этой области техники сделает из представленного выше описания однозначный вывод, что геометрические параметры применяемой проволочной сетки должны быть приспособлены к возбуждающему излучению и к расщепляющему излучению, которые испускаются оптической схемой. Например, такое условие, что апертура проволочной сетки между проволоками должна быть меньше оптического разрешения данной длины волны, то есть апертура << оптическое разрешение ~λ/2 NA (числовой апертуры). В контексте нижеследующих фигур апертуры обозначены щелевидными проемами.

Применение подложки с проволочной сеткой в представляемом устройстве обеспечивает предельное оптическое ограничение. Указанные преимущества реализуются в комбинации с быстрым фотохимическим расщеплением, которое используют для отъединения так называемого блокатора на нуклеотиде, чтобы предотвратить продолжение инкорпорации следующего нуклеотида. Применение проволочной сетки имеет дополнительное преимущество в высокой независимости от угла падения. Поэтому она может быть применена в сочетании с фокусированными пучками для достижения высокой локальной интенсивности, в то же время удерживая остальные части без освещения. Другими словами, проволочная сетка позволяет возбуждать и делать чувствительными только те молекулы, например фрагменты ДНК, которые находятся очень близко к поверхности в поле нераспространяющейся волны, и тем самым не детектировать или не воздействовать на любой меченый нуклеотид вне поля нераспространяющейся волны. Например, поле нераспространяющейся волны может быть протяженным на примерно 20 нанометров от первой поверхности подложки. Это может быть действительным как для возбуждающего излучения, так и для расщепляющего излучения.

Подложка из проволочной сетки включает вторую поверхность, противоположную первой поверхности, и оптическая схема конфигурирована для облучения второй поверхности подложки возбуждающим излучением и расщепляющим излучением. Другими словами, подложки в оптической схеме позиционированы относительно друг друга таким образом, что расщепляющее излучение и возбуждающее излучение направляются непосредственно на вторую поверхность подложки. Это можно рассматривать как облучение подложки сзади. На передней поверхности, первой поверхности, регулярная проволочная структура представлена проволочной сеткой. Между регулярной металлической проволокой, то есть в промежутках между проволоками сетки, находится связанная, или иммобилизованная, молекула, например фрагмент ДНК.

Термин «возбуждающее излучение» в контексте настоящего изобретения имеет отношение к излучению с длинами λ_Ex1, λ_Ex2, λ_Ex3 и λ_Ex4 соответственно. Следовательно, для всех четырех длин волн возбуждения подложка обеспечивает то, что достигаются такое ограничение и создание нераспространяющейся волны соответствующего излучения. Если желательно, большее или меньшее число источников излучения и/или флуоресцентных меток могут быть применены без выхода за пределы настоящего изобретения.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления изобретения, реакция расщепления имеет продолжительность t_cleavage, которая зависит от интенсивности облучения расщепляющим излучением. Кроме того, инкорпорация второго нуклеотида в иммобилизованную молекулу занимает время t_{incorporation}. Представляемое здесь устройство включает оптическую схему, которая конфигурирована и настроена для создания облучения расщепляющим излучением с такой интенсивностью, что t_cleavageincorporation.

Фоторасщепление должно происходить только в тех молекулах, которые уже инкорпорированы и иммобилизованы на поверхности. Реакция в массе приводила бы к деблокированным реагентам, которые могли бы встраиваться без видимого проявления и тем самым обусловливать ошибки в результатах секвенирования. Поэтому важно проводить облучение только локально в течение короткого периода времени, чтобы сделать реакцию расщепления быстрой по сравнению со скоростью инкорпорации нуклеотидов ферментом. Принципы действия фермента и блокатора уже были описаны выше. Настоящее изобретение применимо в пределах описываемого здесь примерного варианта осуществления. Представляемые варианты осуществления позволяют синхронизировать инкорпорацию следующих нуклеотидов и обеспечивают то, что детектированный сигнал флуоресценции является высоконадежным.

Тот факт, что расщепляющее излучение находится в нераспространяющейся моде относительно подложки, обеспечивает то преимущество, что повторяющееся экспонирование не ведет к появлению в растворе флуоресцентных меток, которые обесцвечены и которые утрачивают свою функцию. Другими словами, представляемый вариант осуществления предотвращает такое обесцвечивание и утрату функциональности флуоресцентных меток в растворе.

Для улучшенной синхронизации инкорпорации нескольких нуклеотидов на нескольких иммобилизованных молекулах стадия деблокирования расщепляющим излучением должна проводиться настолько быстро, насколько возможно, то есть при самой высокой возможной интенсивности расщепляющего излучения. Это может быть достигнуто фокусированием расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучения, с помощью линзы и сканированием поверхности путем перемещения линзы или подложки. Стадия деблокирования может быть проведена после прочтения стадии секвенирования. Это прочтение может быть проведено сканированием фокусированным пучком или пошаговым сканированием с облучением поля. Также может быть возможным применение расщепляющего излучения в виде однократной вспышки, например УФ-излучения, на всей поверхности в целом. Принимая во внимание скорость реакции инкорпорации основания для реакции секвенирования, продолжительность локального облучения расщепляющим излучением должна составлять, например, менее 1 минуты.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления, подложка включает несколько смежных положений связывания для иммобилизации молекул на первой поверхности вдоль первого направления. Кроме того, устройство конфигурировано для выполнения оптического сканирования путем перемещения подложки и оптической схемы относительно друг друга вдоль первого направления. Кроме того, устройство конфигурировано для выполнения оптического сканирования таким образом, что каждое положение связывания сначала облучается возбуждающим излучением по меньшей мере с первой длиной λ_Ex1 волны, и впоследствии, во-вторых, облучается расщепляющим излучением с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения при перемещении вдоль первого направления.

Другими словами, представлено сочетание расщепляющего излучения и возбуждающего излучения, которое обеспечивает дополнительное преимущество в одновременном считывании флуоресцентных сигналов и использовании реакции расщепления, так что могут быть инкорпорированы следующие нуклеотиды. Это делается в режиме сканирования, который может обеспечивать высокую локальную интенсивность применяемого электромагнитного излучения без необходимости в высокомощном источнике излучения. В этой конфигурации могут быть применены сфокусированные световые пучки расщепляющего излучения и возбуждающего излучения. В этом случае стадия деблокирования может быть проведена после считывания стадии секвенирования. В одном предпочтительном варианте осуществления сканирование для прочтения может сочетаться с деблокирующим сканированием объединением обоих световых пучков в едином исполнительном механизме. Кроме того, если желательно, даже могла бы быть применена единственная линза для согласования двух световых пучков. В альтернативном варианте, могут быть объединены две линзы в одной стадии или же две отдельные стадии могут действовать синхронно. Это может быть реализовано в подходе с пошаговым сканированием для прочтения, в котором стадия расщепления также проводится в режиме пошагового сканирования путем облучения того же участка, как источником возбуждающего излучения.

Если желательно, представляемое устройство конфигурировано для выполнения такого оптического сканирования в одном непрерывном перемещении вдоль подложки. При этом допускается повторяющееся непрерывное сканирование. Таким образом, устройство конфигурировано, во-первых, для считывания того, инкорпорирован ли первый нуклеотид в молекулу, например фрагмент ДНК, или нет, и, во-вторых, конфигурировано для инициирования реакции фотохимического расщепления на ранее считанном нуклеотиде в случае, если он инкорпорирован в молекулу.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления изобретения, представлен способ оптического контроля секвенирования ДНК, в частности оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. Способ включает стадии, на которых обеспечивают подложку с молекулой, иммобилизованной на первой поверхности подложки, облучают подложку возбуждающим излучением по меньшей мере с первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения с помощью оптической схемы и тем самым оптически возбуждают флуоресцентную метку первого нуклеотида, который инкорпорирован в иммобилизованную молекулу на подложке. Способ дополнительно включает стадию, на которой ограничивают возбуждающее излучение с помощью подложки, обеспечивая тем самым нераспространяющуюся волну расщепляющего излучения с помощью подложки на первой поверхности подложки. В качестве последующей стадии, способ обеспечивает прием и детектирование флуоресценции возбужденной флуоресцентной метки первого инкорпорированного нуклеотида с помощью оптической схемы. Кроме того, дополнительно предусматривается облучение подложки расщепляющим излучением с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучением, с помощью оптической схемы, тем самым с оптическим инициированием реакции фотохимического расщепления на первом инкорпорированном нуклеотиде. Кроме того, способ предусматривает стадию, на которой ограничивают расщепляющее излучение с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения с помощью подложки, тем самым обеспечивая нераспространяющуюся волну расщепляющего излучения подложкой на первой поверхности подложки.

Блокатор и флуоресцентные метки могут отщепляться одновременно, например, в случае, когда блокатор включает флуоресцентную метку, или могут также отщепляться на различных стадиях.

Другими словами, представляемый способ предусматривает селективное облучение поверхности возбуждающим излучением и селективное облучение поверхности расщепляющим излучением. Следовательно, представляемый способ обеспечивает то, что только флуоресцентная метка, введенная в нуклеотиды, которые инкорпорированы в молекулы, иммобилизованные на первой поверхности подложки, оптически возбуждается для испускания флуоресцентного сигнала. Такой флуоресцентный сигнал только от флуоресцентной метки, близкой к первой поверхности, затем детектируется оптической схемой. Это повышает качество принимаемого и детектируемого флуоресцентного сигнала. Дополнительно, представляемый способ обеспечивает то, что от нуклеотидов отщепляются только флуоресцентные метки, которые введены в молекулы, иммобилизованные на первой поверхности подложки. Здесь может быть предотвращена деградация раствора, или содержащихся в нем веществ, каковой раствор содержится в устройстве. Другими словами, не происходит непреднамеренное снижение эффективной концентрации нуклеотидов, которые могут быть использованы для процесса синтеза.

Таким образом, в представляемом способе предотвращается то, что флуоресцентные метки в растворе будут обесцвечиваться и утрачивать свою функциональность. Это может дополнительно снизить стоимость процесса определения последовательности нуклеиновой кислоты, например такой как последовательность ДНК.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления изобретения, представлен программный элемент для оптического контроля секвенирования ДНК, в частности для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза, который, будучи исполняемым процессором, приспособлен для проведения облучения подложки возбуждающим излучением по меньшей мере с первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения с помощью оптической схемы и тем самым для оптического возбуждения флуоресцентной метки первого нуклеотида, который инкорпорирован в молекулу, иммобилизованную на первой поверхности подложки, ограничения возбуждающего излучения с помощью подложки, тем самым обеспечивая нераспространяющуюся волну возбуждающего излучения с помощью подложки на первой поверхности подложки, приема и детектирования флуоресценции от возбужденной флуоресцентной метки первого инкорпорированного нуклеотида с помощью оптической схемы, облучения подложки расщепляющим излучением с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучением, с помощью оптической схемы, и тем самым оптического инициирования реакции фотохимического расщепления на первом инкорпорированном нуклеотиде и ограничения расщепляющего излучения с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения с помощью подложки, тем самым обеспечивая нераспространяющуюся волну расщепляющего излучения с помощью подложки на первой поверхности подложки.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления изобретения, представлен машиночитаемый носитель, на котором сохраняется компьютерная программа для оптического контроля секвенирования ДНК, в частности для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза, которая, будучи исполняемой процессором, приспособлена для проведения облучения подложки возбуждающим излучением по меньшей мере с первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения с помощью оптической схемы и тем самым для оптического возбуждения флуоресцентной метки первого нуклеотида, который инкорпорирован в молекулу, иммобилизованную на первой поверхности подложки, ограничения возбуждающего излучения с помощью подложки, тем самым обеспечивая нераспространяющуюся волну возбуждающего излучения с помощью подложки на первой поверхности подложки, приема и детектирования флуоресценции от возбужденной флуоресцентной метки первого инкорпорированного нуклеотида с помощью оптической схемы, облучения подложки расщепляющим излучением с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучением, с помощью оптической схемы, и тем самым оптического инициирования реакции фотохимического расщепления на первом инкорпорированном нуклеотиде, и ограничения расщепляющего излучения с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения с помощью подложки, тем самым обеспечивая нераспространяющуюся волну расщепляющего излучения с помощью подложки на первой поверхности подложки.

Компьютерный программный элемент может быть частью компьютерной программы, но также может представлять собой самостоятельную программу. Например, компьютерный программный элемент может быть использован для обновления уже существующей компьютерной программы для нужд настоящего изобретения. Машиночитаемый носитель можно рассматривать как носитель информации, например, такой как USB-флеш-накопитель, компакт-диск (CD), универсальный цифровой диск (DVD), лазерный диск формата Blue-ray, устройство для хранения данных, жесткий диск, или любой другой носитель, на котором может быть сохранен программный элемент, как описанный выше.

Можно видеть, что суть изобретения состоит в создании нового подхода к определению последовательности нуклеиновой кислоты. Это секвенирование может быть проведено в единственной текучей среде и при проведении которого не требуется стадия промывания. На основе строгого ограничения, во-первых, возбуждающего излучения и, во-вторых, расщепляющего излучения посредством соответствующим образом конфигурированной подложки, например такой как проволочная сетка, реакция секвенирования может быть считана без промывания поверхности. Постадийное секвенирование достигается с использованием нуклеотидов с оптически отщепляемыми блокаторами, которые присоединяются к нуклеотидам в растворе, которые должны быть инкорпорированы в молекулы, которые иммобилизованы на поверхности подложки. После считывания с помощью возбуждающего излучения, для чего используется флуоресценция, встроенные или инкорпорированные нуклеотиды деблокируются путем облучения расщепляющим излучением посредством той же подложки. Этим обеспечивается то, что деблокируются только связанные нуклеотиды. Другими словами, способ и устройство согласно настоящему изобретению конфигурированы для постадийной и оптически индуцируемой инкорпорации нуклеотидов с последовательностью, которая соответствует последовательности нуклеотидов в иммобилизованной молекуле. Кроме того, способ и устройство конфигурированы для постадийного и оптически считываемого определения последовательности нуклеотидов, которые инкорпорированы в иммобилизованные молекулы. Кроме того, способ и устройство согласно настоящему изобретению конфигурированы для определения оснований в последовательности инкорпорированных нуклеотидов по принимаемому и регистрируемому излучению флуоресценции, испускаемому флуоресцентной меткой соответствующих инкорпорированных нуклеотидов.

Согласно еще одному примерному варианту осуществления, представлено применение соединения в качестве блокатора в последовательности ДНК, причем соединение выбирают из группы, состоящей из нитрофенилэтильных производных аналогов 5-метил-(2-(2-нитрофенил)пропил)карбоната-dUTP, аналога 5-метил-(2-оксо-1,2-дифенилэтил)карбоната-dUTP и любой их комбинации.

Применение аналогов 5-метил-(2-(2-нитрофенил)пропил)карбоната-dUTP в качестве блокатора в устройстве для секвенирования ДНК имеет два преимущества. Во-первых, они дают определенные, менее реакционно-способные остатки после фотохимического расщепления, обеспечивая более чистый процесс. Во-вторых, они имеют высокую скорость реакции. По сравнению с другими фотоотщепляемыми молекулами, новые молекулы представляют собой производные нитрофенилэтильных соединений, приводящих к фотопродуктам в форме производных нитробензола, которые гораздо более стабильны, чем нитросоединения, образуемые фотохимическими превращениями молекул нитрофенилметильных производных. Более того, образование СО₂ является движущей силой и открывает путь эффективного повышения скорости фотохимической реакции. Еще одно преимущество применения указанных блокаторов в секвенировании ДНК демонстрируется тем обстоятельством, что реакция выполняется при очень низкой интенсивности расщепляющего излучения. Это значит, что количество энергии, необходимое в расчете на площадь участка, может быть снижено в устройстве для секвенирования ДНК. Численные примеры будут приведены позже в контексте фиг. 7 и фиг. 9.

Эти и прочие признаки изобретения станут очевидными из разъяснения со ссылкой на описываемые далее варианты осуществления.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Примерные варианты осуществления изобретения будут продемонстрированы на нижеследующих чертежах.

Фиг. 1 схематически показывает устройство согласно одному примерному варианту осуществления изобретения.

Фиг. 2 схематически показывает устройство согласно одному примерному варианту осуществления изобретения.

Фиг. 3а и 3b схематически показывают создание подложкой нераспространяющейся волны в области иммобилизованной молекулы в одном примерном варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 4 схематически показывает устройство согласно одному примерному варианту осуществления изобретения.

Фиг. 5 показывает блок-схему способа согласно одному примерному варианту осуществления изобретения.

Фиг. 6 схематически показывает два блокатора.

Фиг. 7 схематически показывает график скоростей фотохимического расщепления во времени.

Фиг. 8 схематически показывает процесс фотохимического расщепления.

Фиг. 9 схематически показывает графики фотопревращения.

Фиг. 10 показывает процесс фотохимического отщепления аналогов 5-метил-(2-оксо-1,2-дифенилэтил)карбоната-dUTP, используемых в одном примерном варианте осуществления настоящего изобретения.

В принципе, идентичные или сходные части приведены на фигурах с одинаковыми кодовыми номерами позиций.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

На фиг. 1 показано устройство 100 для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. Устройство включает подложку 101 для иммобилизации по меньшей мере одной молекулы 102 на первой поверхности 103 подложки. Молекула 102, которая иммобилизована на первой, или передней, поверхности 103 подложки 101, может представлять собой, например, фрагмент ДНК. Кроме того, на фиг. 1 показана оптическая схема 104. На фиг. 1 схематически показано, что оптическая схема конфигурирована для направления на подложку возбуждающего излучения 110, например, с первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения. Кроме того, схематически показаны и обозначены ссылочными номерами 109, 116, 117 и 118 позиций четыре различных нуклеотида. Например, первый нуклеотид 109 показан как Тимин, Т. Нуклеотид 109 содержит блокатор 119. Кроме того, блокатор 119 содержит флуоресцентную метку 105. Аналогичным образом, второй нуклеотид 116 схематически изображен на фиг. 1, согласно которой можно сделать вывод, что он также содержит блокатор 119 и вторую флуоресцентную метку 106. Третий нуклеотид 117 также содержит блокатор и третью флуоресцентную метку 107. Дополнительно, четвертый нуклеотид 118 схематически изображен также содержащим блокатор и четвертую флуоресцентную метку 108. Однако образец 114 может содержать гораздо большее количество таких нуклеотидов, и нуклеотиды 109, 116, 117 и 118 показаны здесь только в виде символического изображения. Кроме того, на фиг. 1 показан раствор 114, в котором содержатся нуклеотиды и фермент 115. В случае, когда один из показанных четырех нуклеотидов инкорпорируется в иммобилизованную молекулу 102, представляемое устройство 100 обеспечивает следующие преимущества. Оптическая схема конфигурирована для приема и детектирования флуоресцентного излучения, испускаемого флуоресцентной меткой первого нуклеотида, инкорпорированного в иммобилизованную молекулу 102.

Как можно дополнительно заключить из фиг. 1, оптическая схема конфигурирована для направления расщепляющего излучения 112 с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения на подложку. Это позволяет оптическим путем инициировать реакцию фотохимического расщепления на первом инкорпорированном нуклеотиде для отщепления соответствующей флуоресцентной метки от первого инкорпорированного нуклеотида. Кроме того, подложка 101 конфигурирована для ограничения возбуждающего излучения таким образом, чтобы на первой поверхности подложки создавалась нераспространяющаяся волна возбуждающего излучения. Более того, подложка конфигурирована для ограничения также расщепляющего излучения таким образом, чтобы на первой поверхности подложки создавалась нераспространяющаяся волна расщепляющего излучения. Это также можно видеть на фиг. 3а и 3b. В варианте осуществления согласно фиг. 1 подложка конфигурирована в виде проволочной сетки 113 для возбуждающего излучения 110 и для расщепляющего излучения 112. Поэтому проволочная сетка 113 создает регулярную картину, например, такую как структура регулярной металлической сетки. Как можно сделать вывод из фиг. 1, между регулярными структурами предусмотрены щелевидные проемы, в каковых проемах связанные молекулы 102 иммобилизованы на первой поверхности 103 подложки 101. Кроме того, фиг. 1 изображает процессорный блок 120, который включает машиночитаемый носитель 121, на котором сохраняется компьютерный программный элемент 122. Указанный программный элемент 122 приспособлен для выдачи команд процессорному блоку 120 для дальнейшего управления устройством 100, чтобы выполнять выше и ниже описываемый способ оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. Устройство 100 согласно фиг. 1 конфигурировано для постадийного и оптического индуцирования инкорпорации нуклеотидов 109, 116, 117, 119 с последовательностью, которая является комплементарной последовательности нуклеотидов в иммобилизованной молекуле 102. В случае, если молекула 102 представляет собой фрагмент ДНК, содержащиеся в образце 114 нуклеотиды инкорпорируются в молекулу 102 в последовательности, которая соответствует нуклеотидной последовательности молекулы 102.

Устройство дополнительно конфигурировано для определения оснований в последовательности инкорпорированных нуклеотидов по принятому и детектированному отклику в виде флуоресцентного излучения, испускаемого флуоресцентной меткой соответствующего инкорпорированного нуклеотида. Поэтому представляемое устройство 100 согласно фиг. 1, во-первых, обеспечивает то, что с помощью возбуждающего излучения 110 считываются только те нуклеотиды, которые инкорпорированы в иммобилизованную молекулу 102, с использованием нераспространяющейся волны возбуждающего излучения. Во-вторых, устройство 100 согласно фиг. 1 обеспечивает то, что расщепляющим излучением будут деблокироваться только связанные нуклеотиды, чем предотвращается деблокирование нуклеотидов, которые еще не содержатся, то есть не инкорпорированы, в молекуле 102. Следовательно, детектированный флуоресцентный сигнал 100 может быть зарегистрирован как излучение 111, высоконадежное для определения последовательности нуклеиновых кислот.

Таким образом, улучшаются как стоимость, так и скорость секвенирования ДНК, выполняемого с использованием устройства 100 согласно фиг. 1. Требуется меньшее количество текучей среды, так как нет необходимости в стадии промывания. Устройство согласно фиг. 1 показывает упрощение и снижение стоимости секвенирования. Представляемое устройство 100 согласно фиг. 1 создает новую комбинацию технологических стадий, обеспечивая возможность основанного на сборке простого считывания без какой-нибудь стадии промывания, что значит однократную загрузку реагента для всех прочтений. Блокаторы, используемые в примерных нуклеотидах 109, 116, 117, 118, могут представлять собой, например, фотоотщепляемый 3'-неблокированный обратимый терминатор. Однако также другие блокаторы, с использованием, например, стерических затруднений, могут быть применены для достижения желательных и описанных выше эффектов.

Кроме того, оптическая схема 104, как показано на фиг. 1, может быть конфигурирована для создания облучения расщепляющим излучением с такой интенсивностью, чтобы продолжительность t_cleavage реакции расщепления была меньшей, чем время, затрачиваемое на инкорпорацию второго нуклеотида в молекулу 102. Поскольку продолжительность t_cleavage реакции расщепления зависит от интенсивности облучения расщепляющим излучением, фиг. 1 может предусматривать выбранную комбинацию нуклеотидов с конкретным блокатором и конфигурацию оптической схемы в отношении интенсивности расщепляющего излучения. Другими словами, интенсивность расщепляющего излучения устройства согласно фиг. 1 подбирается таким образом, чтобы для применяемой комбинации нуклеотидов и блокаторов продолжительность t_cleavage реакции расщепления была меньше, чем t_{incorporation}.

Если желательно, то дополнительно или альтернативно пользователем может быть предусмотрена следующая конструкция устройства 100. Пребывание можно рассматривать как среднее время пребывания и в пятне расщепляющего излучения неинкорпорированного нуклеотида. Оптическая схема может быть дополнительно конфигурирована для выполнения облучения расщепляющим излучением с такой интенсивностью, что t_cleavage является меньшим, чем t_residence. Следовательно, не происходит никакой деградации свободных и несвязанных нуклеотидов вследствие нежелательной реакции расщепления. Таким образом, путем конфигурирования устройства таким образом, что t_cleavage является меньшим, чем t_residence, снижается или устраняется вероятность того, что неинкорпорированный нуклеотид будет подвергнут расщеплению. Другими словами, во избежание реакций расщепления в массе среднее время пребывания молекул в нераспространяющемся поле проволочной сетки должно быть меньшим или гораздо меньшим, чем продолжительность реакции, необходимая для расщепления при данной интенсивности. При глубине нераспространяющегося поля порядка 25 нм или менее и коэффициенте диффузии нуклеотида порядка 1×10^-10 м²/с время, затрачиваемое молекулой на диффузию в нераспространяющееся поле и из него, может быть оценено как: (5×10^-8 м)²/1×10^-10=25 микросекунд. Вероятность повреждения может быть выведена в зависимости от продолжительности облучения, необходимой для деблокирования связанных молекул. Если принять продолжительность облучения равной 0,1 с, то она составляла бы 1:4000, при продолжительности облучения 10 мс она была бы 1:400, и т.д.

Подобным образом, общее повреждение пропорционально объемной доле в нераспространяющемся поле в расчете на общий объем раствора реагента. При высоте камеры 100 мкм отношение составляет 1:4000. Это значит, что в наихудшем случае повреждения всех молекул в нераспространяющемся поле будет повреждено только 0,025% молекул. При длине прочтения 100 нуклеотидов в конечном итоге были бы повреждены 2,5% молекул в растворе (наихудшая ситуация), что все еще является приемлемым с позиции секвенирования.

Далее приведена информация о применении устройства согласно фиг. 1, а также об устройствах 100 согласно фиг. 2 и 4. Для улучшения синхронизации стадия деблокирования должна проводиться настолько быстро, насколько возможно, то есть с наибольшей возможной интенсивностью. Это может быть достигнуто фокусированием УФ-излучения линзой и сканирования поверхности путем перемещения линзы или подложки. Стадия деблокирования проводится после прочтения на стадии секвенирования. Это прочтение может быть проведено сканированием фокусированного пучка или в режиме «шаг-и-сканирование» в поле облучения. В одном предпочтительном варианте осуществления сканирование для прочтения может быть связано со сканированием для деблокирования при объединении обоих световых пучков в едином исполнительном механизме, возможно, даже в одной линзе при согласовании световых пучков. В альтернативном варианте, могут быть объединены две линзы в одной стадии, или же две отдельные стадии могут действовать синхронно. Это может быть также реализовано в подходе с пошаговым сканированием для прочтения, в котором стадия УФ-облучения также проводится в режиме пошагового сканирования путем облучения того же поля, как для прочтения. Предпочтительный вариант осуществления будет зависеть от доступного источника УФ-излучения и его мощности. Также можно предвидеть одиночную вспышку УФ-излучения на всей поверхности, если доступна достаточная мощность и/или площадь поверхности секвенирования ограничена. С учетом скорости реакции для инкорпорации основания в реакции секвенирования время локального УФ-облучения должно составлять гораздо меньше 1 минуты.

Фиг. 2 показывает устройство 100, которое конфигурировано для оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. Подобно фиг. 1, показана подложка 113 в виде проволочной сетки, на которой иммобилизованы, то есть связаны, многочисленные молекулы 102. Как можно видеть из фиг. 2, регулярная картина 214 предусматривает щелевидные проемы 215, в которых молекулы 202 иммобилизованы на первой поверхности 203. Подложка включает несколько смежных положений 209, 210, 211 и 212 связывания для иммобилизованных молекул на первой поверхности вдоль первого направления 213. Указанные положения связывания могут выглядеть как пятна, которые могут быть покрыты клонами идентичных молекул таким образом, что оптический сигнал, который генерируется, мог быть усилен. Тогда подложка 101 образует матрицу из таких пятен, то есть таких положений связывания, с соответствующими различными клонами. Это может повышать производительность. Оба устройства 100 с фиг. 1 и 2 позволяют проводить секвенирование ДНК только в одной жидкости, тем самым избегая необходимости в выполнении стадий промывания, на которых заменяется жидкий раствор. Кроме того, оптическая схема 104 включает пять различных источников 201-205 излучения. Источники 201-204 излучения могут рассматриваться как источники возбуждающего излучения, чтобы создавать излучение с четырьмя различными длинами λ_Ex1-λ_Ex4 волн возбуждения, как было описано ранее. Источник 205 излучения предусмотрен для расщепляющего излучения с длиной λ_CL волны. Например, источник 205 излучения может испускать УФ-излучение. Кодовым номером 206 позиции символично обозначено переключающее устройство, которое позволяет переключать оптическую схему 104 между длинами λ_Ex1-λ_Ex4 и λ_CL волн. Кроме того, излучение, испускаемое по меньшей мере одним из указанных источников 201-205, направляется в сторону поляризационного фильтра 200. Кроме того, показано дихроичное зеркало 207, которое пропускает испускаемое излучение от источников 201-205 излучения в сторону подложки 101. После того, как флуоресцентная метка была возбуждена нераспространяющейся волной возбуждающего излучения (по меньшей мере с одной из длин λ_Ex1-λ_Ex4 волн), фотоны флуоресценции, излученные флуоресцентной меткой или метками, направляются в сторону дихроичного зеркала 207 и направляются на детектор 208 флуоресценции. Как можно видеть из фиг. 2, оптическая схема 104 может проводить сканирование вдоль направления 213. Следовательно, устройство 100 согласно фиг. 2 конфигурировано для выполнения оптического сканирования путем перемещения подложки 101 и оптической схемы 104 относительно друг друга вдоль первого направления 213. Следовательно, устройство позволяет выполнять оптическое сканирование таким образом, что каждое положение связывания сначала облучается возбуждающим излучением, и затем, во-вторых, облучается расщепляющим излучением с длиной волны расщепляющего излучения при перемещении вдоль первого направления 213. Таким образом, стадия деблокирования, с использованием расщепляющего излучения, может быть проведена после прочтения флуоресценции возбужденных инкорпорированных нуклеотидов.

Фиг. 3а и 3b показывают подложку 101, которая выполнена в виде проволочной сетки 113. Регулярная картина 214, которая может быть исполнена как структура регулярной металлической сетки, образует четыре щелевидных проема 215, в которых иммобилизованы молекулы 112. Как символически показано стрелкой, возбуждающее излучение 110 и расщепляющее излучение 112 направляются на подложку в сторону второй поверхности подложки. Вторая поверхность противоположна первой поверхности 103, на которой иммобилизованы молекулы. Следовательно, проволочная сетка облучается сзади. Кроме того, фиг. 3а и 3b показывают, что в растворе присутствуют несколько несвязанных нуклеотидов 109, которые могут быть позже инкорпорированы в молекулу 102, иммобилизованную на первой поверхности. Фиг. 3а и 3b изображают нераспространяющуюся волну 300 между металлическими структурами с меньшими размерами, чем оптическое разрешение на длине волны светового пучка. Нераспространяющаяся волна изображена на фиг. 3b градацией яркости, которая соответствует профилю интенсивности поля. Фиг. 3b показывает напряженность электромагнитного поля для проволочной сетки, облучаемой ТЕ-поляризованным излучением. Высокая яркость обозначает высокую интенсивность, и низкая яркость обозначает низкую интенсивность. Представленная здесь подложка может быть, например, применена в устройствах согласно фиг. 1 и 2, а также в устройстве согласно фиг. 4. Однако следует отметить, что поверхностное ограничение нераспространяющейся волны может быть достигнуто другими путями, которые известны квалифицированному специалисту в этой области технологии.

Для создания нераспространяющейся волны в этом или в любом другом варианте осуществления изобретения также может быть использовано полное внутреннее отражение.

Фиг. 4 показывает устройство 100 для непрерывного сканирования подложки 101. Устройство 100 предусматривает оптическую схему 104 с источником 400 излучения для эмиссии возбуждающего излучения. С помощью цветового фильтра 401, который может вращаться, может быть создано излучение с различными длинами волн возбуждения. Дополнительно, предусматривается источник 402 расщепляющего излучения. Представлены световодные элементы 403, 404, чтобы направлять излучение на соответствующие оптические элементы 405, 406. Как можно видеть, для возбуждающего излучения и для расщепляющего излучения используются отдельные линзы и оптические каналы. Однако, если желательно, они также могут быть объединены с оптическими путями от обоих источников излучения. Оптическая схема 104, показанная на фиг. 4, обеспечивает возможность относительного перемещения между подложкой 101 и оптической схемой 104 по направлению 407.

Фиг. 4 также может включать дихроичное зеркало, конфигурированное для пропускания возбуждающего излучения и конфигурированное для отражения излучения флуоресценции, испускаемого используемыми флуоресцентными метками. Кроме того, подложка может быть конфигурирована для пропускания только излучения с первой поляризацией и конфигурирована для отражения излучения со второй поляризацией, которое поляризовано перпендикулярно первой поляризации. Поляризационный фильтр конфигурирован для пропускания только излучения с первой поляризацией. Устройство согласно фиг. 4 конфигурировано для генерирования данных, которые описывают последовательности нуклеиновых кислот, которые были инкорпорированы в иммобилизованную молекулу, на основе оптического пошагового воздействия, которое оптически контролируется устройством.

Фиг. 5 показывает блок-схему способа оптического контроля итерационной постадийной реакции для определения последовательности нуклеиновой кислоты путем синтеза. Способ включает стадию, на которой создают подложку с молекулой, иммобилизованной на первой поверхности подложки, на стадии S1. Проводят облучение подложки возбуждающим излучением по меньшей мере с первой длиной λ_Ex1 волны возбуждения с помощью оптической схемы и тем самым с оптическим возбуждением флуоресцентной метки первого нуклеотида, который инкорпорирован в иммобилизованную молекулу на подложке, как показано на стадии S2. Далее, стадия S3 изображает стадию ограничения возбуждающего излучения подложкой, тем самым создавая нераспространяющуюся волну расщепляющего излучения подложкой на первой поверхности подложки. Прием и детектирование флуоресценции возбужденной флуоресцентной метки первого инкорпорированного нуклеотида оптической схемой представлены стадией S4. Стадия S5, на которой проводят облучение подложки расщепляющим излучением с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения, предпочтительно УФ-излучением, оптической схемой и тем самым оптическое инициирование реакции фотохимического расщепления на первом инкорпорированном нуклеотиде, изображена стадией S5. Кроме того, на стадии S6 представлено ограничение расщепляющего излучения с длиной λ_CL волны расщепляющего излучения подложкой, тем самым с обеспечением нераспространяющейся волны расщепляющего излучения подложкой на первой поверхности подложки.

Повторением стадий S1-S6 представленного способа пользователь может определить последовательность нуклеиновой кислоты, которая была инкорпорирована в молекулу, иммобилизованную на первой поверхности подложки. Таким образом, после стадий S1-S6 пользователь может выполнять, при желании, следующие стадии. Проводят инкорпорацию второго нуклеотида в молекулу, иммобилизованную на первой поверхности подложки; затем блокирование активности фермента вторым нуклеотидом после его инкорпорации в молекулу. Также может быть выполнено облучение подложки возбуждающим излучением с помощью оптической схемы и тем самым оптическое возбуждение флуоресцентной метки второго инкорпорированного нуклеотида. Следующей стадией этого вторичного цикла является ограничение возбуждающего излучения подложкой с обеспечением тем самым нераспространяющейся волны возбуждающего излучения подложкой на первой поверхности подложки. Затем может быть выполнена стадия приема и детектирования флуоресценции возбужденной флуоресцентной метки второго инкорпорированного нуклеотида. Также могут быть проведены облучение подложки расщепляющим излучением, предпочтительно УФ-излучением, с помощью оптической схемы и тем самым оптическое инициирование реакции фотохимического расщепления на втором инкорпорированном нуклеотиде. В качестве еще одной стадии представлено ограничение расщепляющего излучения подложкой с обеспечением тем самым нераспространяющейся волны расщепляющего излучения подложкой на первой поверхности подложки.

На фиг. 6 показаны блокаторы согласно статье автора Michael L. Metzker «Sequencing technologies, the next generation» («Технологии секвенирования, новое поколение») в издании Nature Review Genetics, том 11 (2010), стр. 31. Во-первых, с использованием 3'-блокированных обратимых терминаторов, во-вторых, с использованием 3'-неблокированных обратимых терминаторов. Второй класс является очень интересным, так как в этом случае 3'-положение рибозного фрагмента не блокировано, и инкорпорация следующего нуклеотида предотвращается объемистой группой, которая также содержит флуоресцентную метку, присоединенную к фрагменту спаренных оснований в 5'-положении рибозного фрагмента, как можно видеть на фиг. 6.

В настоящем изобретении может быть использована технология проволочной сетки, и стадию деблокирования выполняют, например, с помощью поляризованного УФ-излучения с длиной волны 365 нм. Таким образом, после этой стадии деблокирования следующий меченый нуклеотид встраивается и детектируется сканированием проволочной сетки с использованием поляризованного излучения так, что регистрируются только меченые нуклеотиды на фрагменте ДНК на поверхности. После того, как это сделано, опять проведением стадии деблокирования с использованием УФ-излучения следующий меченый нуклеотид может быть встроен и детектирован, и т.д. Для этого порядка работы могут потребоваться:

1. Фотоотщепляемый 3'-неблокированный обратимый терминатор, так как в случае 3'-блокированных вариантов должно быть синхронно проведено удаление 3-блокирующих групп (-N3 или -СН2).

2. Реакция фоторасщепления должна быть быстрее, чем инкорпорация новых нуклеотидов полимеразой. Так называемые 3'-ОН-неблокированные терминаторы, изобретенные авторами Metzker и др., а именно 2-нитробензилалкилированные HOMedU-трифосфаты, могли бы быть медленными для этой цели, сравнительно с блокаторами, которые авторы настоящего изобретения представляют позже, см. фиг. 8-10.

На фиг. 7 показан график зависимости от времени скоростей фотохимического расщепления dU.1-dU.V, инкорпорированных в меченный флуорогенным субстратом трипсина (BODIPY-FL) комплекс «primer-1/oligoTemplate-4» с использованием Terminator-полимеразы. Фиг. 7 заимствована из статьи авторов V.A. Litosh, W. Wu, B.P. Stupi, J. Wang, S.E. Morris, M.N. Hersh, и M.L. Metzker, «Improved nucleotide selectivity and termination of 3'-OH unblocked terminators by molecular tuning of 2-nitrobenzyl alkylated HOMedU triphosphates» («Повышенная нуклеотидная селективность и терминация 3'-ОН-неблокированных терминаторов молекулярной подстройкой 2-нитробензилалкилированных HOMedU-трифосфатов»), Nucl. Acids Res., том 36, выпуск 6, 2011, стр. E39. Как можно ясно видеть из этой фиг. 7, временная шкала, в пределах которой происходит эффект фоторасщепления, составляет величину порядка 10 с. Или же, как заключают эти авторы: «Все 5-(2-нитробензилокси)метил-dUTP-аналоги были подвергнуты фотохимическому расщеплению со 100% эффективностью в пределах 60 с воздействием УФ-излучения с длиной волны 365 нм при интенсивности ~0,7 Вт/см² в азидном растворе». Важно, что эти авторы также нашли, что Terminator-полимераза продолжает проявлять хорошую активность даже после экспонирования УФ-излучением с длиной волны 365 нм в течение 150 минут при интенсивностях вплоть до 1 Вт/см².

Однако эти характеристики фотохимического расщепления являются более медленными, чем те, которые авторы настоящего изобретения нашли при применении ими различных блокаторов. Подход авторов настоящего изобретения мог бы улучшить нециклическую реакцию, которую они предлагают. Следует отметить, что интенсивности излучения, необходимые для химических соединений согласно авторам Metzker и др., составляют величину 1 Вт/см², преобразование которой дает 10 нВт/(мкм)². Авторы настоящего изобретения применили химический подход с использованием соединения в качестве блокатора при секвенировании ДНК, в котором соединение представляет собой нитрофенилэтильное производное. Например, аналоги 5-метил-(2-(2-нитрофенил)пропил)карбоната-dUTP, которые имеют два преимущества. Во-первых, они дают определенные, менее реакционно-способные остатки после фотохимического расщепления, обеспечивая более чистый процесс. Во-вторых, они имеют более высокую скорость реакции, что авторы настоящего изобретения определили независимо (см. фиг. 9).

По сравнению с фотоотщепляемыми молекулами, описанными автором Metzker, новые молекулы представляют собой производные нитрофенилэтильных соединений, приводящие к фотопродуктам в форме производных нитробензола, которые гораздо более стабильны, чем нитросоединения, образуемые фотохимическими превращениями молекул нитрофенилметильных производных согласно Metzker. Более того, образование СО₂ является движущей силой и открывает путь эффективного повышения скорости фотохимической реакции. Еще одно преимущество применения указанных блокаторов в секвенировании ДНК демонстрируется тем обстоятельством, что реакция фотохимического расщепления соединения 101, которое с фотохимической точки зрения весьма похоже на молекулу с фиг. 8, протекает в течение 30 минут с использованием лампы PL10 на расстоянии 10 см, которая выдает мощность 4 мВт/см². Соединение 101 изображено внизу на фиг. 9. Кроме того, в отношении данных см. фиг. 9. Таким образом, реакция протекает медленнее, чем пример соединений из цитированного выше литературного источника, но при интенсивности, в 250 раз меньшей. Это значит, что количество энергии, необходимой на пятно, является в 50 раз меньшим.

Фиг. 9 показывает эффективность фотопревращения соединения 101 под действием излучения с длиной волны 365 нм (данные авторов настоящего изобретения). Следует отметить, что спектральные характеристики изменяются после 1-часового УФ-поглощения от синего до розового спектра. График В) развития фотохимической реакции с возрастанием спектрального пика при 319 нм как функция возбуждения при 365 нм. Следует отметить, что эти данные в этаноле показывают, что развитие завершается через 30 минут (и при 80% завершении через 20 минут) при возбуждении светом от лампы PL10 на расстоянии 10 см, что эквивалентно энергии 4 мВт/см².

Возможной альтернативой нитросоединениям являются «аналоги 5-метил-(2-оксо-1,2-дифенилэтил)карбоната-dUTP», показанные на фиг. 10, которые также проявляют эффективное фотохимическое расщепление. При желании они также могли бы быть использованы в качестве блокатора в любом варианте осуществления настоящего изобретения.

Кроме того, в качестве блокатора согласно настоящему изобретению может быть применено приведенное ниже соединение:

Также могут быть использованы следующие варианты в качестве блокаторов согласно настоящему изобретению: Соединение 1 с: Х=O(CH₂)_nZ с n = целое число от 1 до 18, или Х=O(C₂H₄O)_nCH₂Z с n = целое число от 1 до 20, при Z=Н или линкер, соединенный с флуоресцентным фрагментом, и Y=(CH₂)_nA с n = целое число от 0 до 18, или Y=O(CH₂)_nA с n = целое число от 1 до 18, или O(C₂H₄O)_nCH₂A с n = целое число от 1 до 20, и А=Н или линкер, соединенный с флуоресцентным фрагментом, в такой комбинации, что по меньшей мере одна из групп А или Z имеют линкер, соединенный с флуоресцентным фрагментом.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, следующее соединение может быть использовано в качестве блокатора:

При Х и Y независимо (CH₂)_nZ с n = целое число от 1 до 18, или (C₂H₄O)_nCH₂Z с n = целое число от 1 до 20, при Z=Н или линкер, соединенный с флуоресцентным фрагментом, в такой комбинации, что по меньшей мере одна из групп Х или Y имеют группу Z, которая имеет линкер, соединенный с флуоресцентным фрагментом.

Прочие вариации раскрытых вариантов осуществления могут быть понятны и выполнены квалифицированными специалистами в данной области техники при практической реализации заявленного изобретения, после изучения чертежей, описания изобретения и пунктов прилагаемой патентной формулы. В пунктах патентной формулы слово «содержащий» не исключает других элементов или стадий, и неопределенный артикль «a» или «an» не исключает множественного числа. Одиночный процессор или другой блок может исполнять функции нескольких объектов или стадий, указанных в пунктах патентной формулы. Всего лишь тот факт, что определенные меры указаны во взаимно по-разному зависимых пунктах патентной формулы, не показывает, что комбинация этих мер не может быть использована с пользой. Компьютерная программа может сохраняться/распределяться на подходящем носителе, таком как оптический носитель информации или твердотельный носитель, поставляемый совместно или как часть другого компьютерного оборудования, но также может распределяться в других формах, таких как через интернет, или посредством других проводных или беспроводных телекоммуникационных систем. Любые символы в пунктах патентной формулы не должны толковаться как ограничивающие область пунктов формулы изобретения.

Реферат

Изобретения относятся к области определения последовательности нуклеиновой кислоты. Предложена группа изобретений, включающая устройство и способ для оптического контроля секвенирования нуклеиновой кислоты, машиночитаемый носитель с компьютерной программой и программный элемент, используемые в вышеуказанном способе, а также применение 5-метил-(2-(2-нитрофенил)пропил)карбонат-dUTP, 5-метил-(2-оксо-1,2-дифенилэтил)карбонат-dUTP в качестве блокатора в секвенировании ДНК в вышеуказанном способе. Устройство включает подложку в виде проволочной сетки для связывания молекулы на поверхности; оптическую схему, выполненную с возможностью направления возбуждающего излучения на подложку, приема, детектирования излучения и направления расщепляющего излучения на подложку; раствор с нуклеотидами и ферментом, где нуклеотиды содержат блокатор. Способ включает обеспечение подложки с молекулой, облучение подложки возбуждающим излучением, ограничение возбуждающего излучения с помощью подложки, прием и детектирование флуоресценции возбужденной флуоресцентной метки нуклеотида, выполнение облучения подложки расщепляющим излучением, ограничение расщепляющего излучения и обеспечение раствора с многочисленными нуклеотидами и ферментом. Изобретения обеспечивают усовершенствование способа определения последовательности нуклеиновой кислоты. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 11 ил.

Формула