Гранулированный корм для животных, содержащий кормовую добавку, способ его получения и применения - RU2749883C2

Чертежи

Показать все 30 чертежа(ей)

Описание

Перекрестная ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США, рег. номер 62/349,843, от 14 июня 2016, поданной Eric Nadeau. Содержание вышеуказанного документа полностью включено ссылкой.

Область техники

Настоящая заявка в широком смысле относится к области гранулированных кормов для животных, содержащих кормовую добавку, к способам их получения и их применению.

Уровень техники

Гранулированные корма для животных обычно определяют как агломерированные корма, образованные экструдированием отдельных ингредиентов или смесей путем прессования и проталкивания через отверстия в экструзионной головке любым механических способом. По существу, цель гранулирования состоит в том, чтобы взять тонкоизмельченный, иногда пылевидный, неприятный на вкус и сложный в обращении кормовой материал и, используя высокую температуру, влагу (кондиционирование паром) и давление, образовать из него более крупные частицы.

На промышленных установках для производства комбикормов используется широкий спектр комбинаций температуры кондиционирования и времени пребывания (McCracken, Poultry Feeds, Supply, Composition and Nutritive Value, CAB International, New York (2002), pp. 301-316), типично процесс гранулирования подразумевает жесткие условия по теплу, влажности и давлению, чтобы сдерживать распространение переносимых с кормом патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла и Escherichia coli (E.coli). Например, в современной промышленной практике температура на некоторых установках для производства комбикормов может достигать 90°C, причем кормовая промышленность движется в сторону еще более высоких и более жестких условий обработки кормов для борьбы патогенными микроорганизмами, переносимых с кормами.

Добавки пробиотиков в гранулированные корма для животных возможны, если штаммы бактерий являются термостабильными и стойкими при хранении, поскольку в противном случае нестабильность бактерий при гранулировании в жестких условиях по давлению, температуре и влажности может создавать проблемы с их использованием в гранулированных кормах.

Например, штаммы, которые могут существовать в форме спор, могут быть полезными для введения в гранулированные корма для животных. Споры бактерий представляют собой спящие формы жизни, которые помогают бактериям выжить, являясь стойкими к экстремальным изменениям среды обитания бактерий, включая экстремальные температуры, недостаток влаги/засуха, или к воздействию химикатов и радиации. Таким образом, споры бактерий могут быть полезными в попытках ввести пробиотики в гранулированные корма для животных. Большинство спорообразующих бактерий относятся к родам бацилл и клостридий.

Пробиотические штаммы, которые не образуют споры, обычно вводят не внутрь гранул, но наносят на гранулы, т.е., после воздействия на ингредиенты гранул вышеописанных жестких условий. Например, в документе WO 2011/094469 описано получение пробиотического корма для домашних питомцев и рыб, причем на кормовые гранулы сначала напыляют влагоизолирующий слой на основе жира, а затем приводят в контакт с сухой композицией, содержащей пробиотики и, наконец, напыляют дополнительное влагоизолирующее покрытие на основе жира, так что количество покрытия на поверхности кормовой гранулы составляет примерно 10-15 в/о %.

Сущность изобретения

Этот раздел предусмотрен, чтобы представить в упрощенной форме выбор концепций, которые подробнее описываются ниже в разделе "Подробное описание". Настоящее краткое описание не предназначено для идентификации ключевых или существенных аспектов заявленного объекта изобретения.

Как отражено и подробно описано в настоящем описании, настоящее изобретение относится к гранулированному корму для животных, включающему жизнеспособные непатогенные бактерии E.coli, введенные в гранулы. E.coli присутствуют в достаточном количестве, чтобы обеспечить полезный эффект животному, съевшему корм. E.coli представляют собой микроорганизмы, которые обычно не ассоциируются с едой; таким образом, намеренное включение E.coli в корм для животных не является рутинным и обычным.

Как обсуждалось выше, условия гранулирования, используемые в промышленности, предполагают воздействие на ингредиенты корма жестких условий, чтобы бороться (т.е. уничтожать) с патогенными микроорганизмами, такими как сальмонеллы и E.coli. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ смягчения эффектов необходимых жестких условий, чтобы позволить введение непатогенных бактерий E.coli в гранулы корма, одновременно контролируя патогены.

В одном варианте осуществления кормовая гранула для животных содержит по меньшей мере 1⋅10⁵ КОЕ/г жизнеспособных непатогенные бактерий E.coli, введенных в гранулы.

В одном варианте осуществления жизнеспособные непатогенные бактерии E.coli вводят в кормовую добавку. Затем кормовую добавку вводят в гранулированный корм для животных. На практике кормовую добавку можно вводить в корм в разных формах. Например, кормовую добавку можно соэктрудировать вместе с кормом, или инкапсулировать внутри корма и т.д. Специалист легко поймет, что в контексте настоящего изобретения можно использовать различные способы введения кормовой добавки в корм для животных.

Как отражено и подробно описано в настоящем описании, настоящее изобретение относится также к кормовой добавке для введения жизнеспособных непатогенных бактерий E.coli в гранулированный корм для животных, причем кормовая добавка содержит непатогенные E.coli, встроенные в матрицу, и до введения в гранулу матрица имеет водную активность (a_w) ≤ 0,3. Матрица содержит гидроколлоид-образующий полисахарид.

В одном неограничивающем варианте осуществления кормовая добавка дополнительно характеризуется одним или более из следующего набора признаков:

- матрица может содержать второй полисахарид, отличный от гидроколлоид-образующего полисахарида. Факультативно, матрица может включать дисахарид;

- матрица может иметь покрытие, располагающееся на по меньшей мере части ее поверхности;

- матрица может иметь поры;

- покрытие может содержать второй полисахарид, отличный от гидроколлоид-образующего полисахарида. Факультативно, покрытие может включать дисахарид;

- покрытие может содержать дисперсное кальцийсодержащее соединение;

- матрица может иметь поры, и покрытие может располагаться на по меньшей мере части поверхности, ограничивая поры.

Специалист легко поймет, что варианты осуществления кормовой добавки могут включать любые комбинации описанных выше признаков.

Специалист легко поймет, что в вышеупомянутых вариантах осуществления матрица может включать один или более элементов, подходящих для потребления животным и/или совместимых с непатогенными E.coli.

В одном неограничивающем варианте осуществления кормовая добавка содержит по меньшей мере 1⋅10⁶ КОЕ/г E.coli. Например, кормовая добавка может содержать по меньшей мере 1⋅10⁷ КОЕ/г, по меньшей мере 1⋅10⁸ КОЕ/г, по меньшей мере 1⋅10⁹ КОЕ/г, по меньшей мере 1⋅10¹⁰ КОЕ/г, по меньшей мере 1⋅10¹¹ КОЕ/г.

В одном неограничивающем варианте осуществления кормовая добавка находится в виде частиц. В одной практической реализации по меньшей мере часть частиц может образовывать агрегат частиц, удерживаемый вместе мостиком, содержащим вышеописанное покрытие.

В одном практическом неограничивающем варианте осуществления описываемое здесь дисперсное кальцийсодержащее соединение включает лактат кальция.

В одном неограничивающем варианте осуществления кормовая добавка может содержать один или более элементов, которые обеспечивают обычные условия хранения/поставки кормовой добавки как таковой и/или введенной в корм, без существенного негативного влияния на жизнеспособность бактериальных клеток и/или на функциональные характеристики. Другими словами, даже если в каком-то конкретном варианте осуществления непатогенные E.coli могут иметь естественный аналог, воздействия на него обычных условий хранения/поставки приведет к значительному снижению жизнеспособности бактериальных клеток и/или к ухудшению функциональных характеристик. Соответственно, описываемая здесь кормовая добавка может стабилизировать E.coli и сохранять их активность в течение длительного времени в обычных условиях хранения/поставки, таких, например, как температура и относительная влажность, равные или выше температуры и относительной влажности окружающей среды. Примеры таких элементов подробнее обсуждаются ниже в настоящем описании.

В одном дополнительном или альтернативном варианте осуществления кормовая добавка может содержать один или более таких элементов, чтобы E.coli имели заметно измененные свойства по сравнению с природными E.coli, например, но без ограничений, по меньшей мере один из следующих элементов:

- кормовая добавка может включать один или более криоконсервантов, которые облегчают применение сублимационной сушки или замораживания E.coli во время приготовления и/или хранения кормовой добавки без значительного снижения жизнеспособности бактериальных клеток и/или без ухудшения функциональных характеристик;

- кормовая добавка может включать один или более элементов, которые могут положительно влиять на органолептические свойства, чтобы после введения в корм для животных этот корм имел более приятный вкус по сравнению с природными непатогенными E.coli в композиции, не включающей таких, одного или более, элементов. Например, кормовая добавка, которая содержит непатогенные E.coli в смеси с культуральной жидкостью, будет иметь типичный неприятный запах/вкус, который может оттолкнуть животного и, таким образом, значительно затруднить прием корма, тогда как наличие одного или более элементов, положительно воздействующих на органолептические свойства, сможет закамуфлировать или нейтрализовать такой неприятный запах/вкус;

- кормовая добавка может включать один или более элементов, которые могут влиять на вид композиции E.coli (например, превратить ее в гелеподобную пастообразную консистенцию и/или в пористую твердую или полутвердую структуру и т.д.), что может облегчить введение E.coli в корм при гранулировании;

- кормовая добавка может находиться в виде частиц с регулируемым размером, причем устанавливаемый по требованию размер или диапазон размеров можно выбрать так, чтобы получить желаемый результат. Например, первая популяция частиц может быть выбрана так, чтобы иметь первый средний диаметр, а вторая популяция частиц так, чтобы иметь второй средний диаметр. Первый средний диаметр и второй средний диаметр могут быть разными, т.е., иметь отношение размеров (первый:второй) > 1. Специалист должен понимать, что такое распределение частиц по размерам может привести к скорости растворения, которую можно регулировать, чтобы получить желаемый результат.

Специалист в данной области техники поймет, что варианты осуществления кормовой добавки могут включать любые комбинации признаков, описанных выше.

Описанные выше варианты осуществления показывают неограничивающие примеры измененных свойств, они могут демонстрировать заметное отличие характеристик E.coli от характеристик природной E.coli, так как дают в результате гранулированный корм для животных, отличающийся от своих природных аналогов тем, что соответствует сущности настоящего изобретения.

В одном неограничивающем варианте осуществления регулируемый по требованию размер частиц может обеспечить получение повышенной и/или стабильной скорости растворения сухих E.coli, в отличие от соответственно медленной и нестабильной скорости растворения природных сухих E.coli. Действительно, регулируемую скорость растворения можно получить благодаря выбору подходящего соотношения между размерами первой и второй популяции частиц.

В одном неограничивающем варианте осуществления регулируемый размер частиц может обеспечить доставку непатогенного штамма с пролонгированным выделением, в отличие от взрывной доставки природных E.coli или E.coli, вводимых в других формах (например, с питьевой водой). Такую замедленную по времени доставку можно реализовать на основе регулирования соотношения между крупными и мелкими частицами так, чтобы в результате E.coli были защищены от агрессивной среды желудочно-кишечного тракта в течение заранее заданного периода времени. В свою очередь, контролируемое время доставки E.coli может обеспечить доставку в заранее выбранное место кишечного тракта. Другими словами, специалист может выбрать конкретное распределение частиц по размерам, чтобы обеспечить заданное время выделения E.coli так, чтобы при учете различных факторов, влияющих на прохождение содержимого через кишечник, E.coli могли доставляться преимущественно в заданные участки кишечного тракта.

Как отражено и подробно описано в настоящем описании, настоящее изобретение относится также к системе для введения описываемой здесь кормовой добавки в гранулированный корм для животных. Система может включать пользовательский интерфейс, чтобы позволить пользователю контролировать количество бактерий, вводимых в корм, или количество бактерий, которые должно присутствовать в каждой кормораздаточной тележке и/или в системе подачи корма. Этого можно достичь с помощью одной или более следующих неограничивающих практических реализаций:

- активация заданного количества живых, но спящих бактерий, содержащихся в кормовой добавке. Это можно сделать, например, путем добавления подходящего активирующего агента (такого, без ограничений, как влага, сахар и т.п.) к заданному количеству бактерий/кормовой добавки. Затем кормовую добавку можно ввести в корм, чтобы получить гранулу. Затем гранулу можно доставить в систему раздачи корма и/или на кормораздаточную тележку;

- выбор конкретных соотношений между частицами кормовой добавки для введения в кормовую гранулу. В такой практической реализации частицы могут включать первую популяцию частиц, имеющую первое количество (выраженное в колониеобразующих единицах, КОЕ) жизнеспособных непатогенных бактерий, и вторую популяцию частиц, имеющую второе количество КОЕ указанных жизнеспособных непатогенных бактерий.

Как отражено и подробно описано в настоящем описании, настоящее изобретение относится также к набору для получения описываемой здесь кормовой добавки. Набор содержит в первом флаконе описываемый здесь первый гидроколлоид-образующий полисахарид, в отдельном втором флаконе описываемые здесь E.coli, в отдельном третьем флаконе описываемый здесь второй полисахарид, отличающийся от первого полисахарида, и в отдельном четвертом флаконе описываемый здесь дисахарид. Факультативно, один из описываемых здесь второго, третьего и/или четвертого флаконов могут дополнительно включать соль кальция. В другой опции соль кальция может содержаться в отдельном пятом флаконе.

Специалист легко поймет, что в вышеописанном наборе один или более из перечисленных элементов могут находиться в одном и том же флаконе, при условии их совместимости для включения в таком виде.

В одном неограничивающем варианте осуществления описываемый здесь дисахарид включает сахарозу, трегалозу или их комбинацию.

В одном неограничивающем варианте осуществления описываемая здесь соль кальция может включать лактат кальция.

Как отражено и подробно описано в настоящем описании, настоящее изобретение относится также к способу получения гранулированного корма для животных, включающему: подготовку ингредиентов для получения гранулированного корма и кормовой добавки, причем кормовая добавка содержит жизнеспособные непатогенные бактерии E.coli; гранулирование ингредиентов и кормовой добавки для получения гранулированного корма.

В одном неограничивающем варианте осуществления стадия получения кормовой добавки включает приготовление кормовой добавки в виде частиц, причем частицы содержат первую популяцию частиц, имеющую первый средний диаметр, и вторую популяцию частиц, имеющую второй средний диаметр.

Как отражено и подробно описано в настоящем описании, настоящее изобретение относится также к способу получения описываемой здесь кормовой добавки. Способ включает получение частиц, которые содержат первый полисахарид, являющийся гидроколлоид-образующим полисахаридом, второй полисахарид, отличающийся от первого полисахарида, и дисахарид, который содержит сахарозу, трегалозу или их комбинацию, а также описываемые здесь E.coli. Способ включает также сушку частиц, чтобы получить водную активность (a_w), меньше или равную 0,3.

В одном неограничивающем варианте осуществления стадия получения частиц включает смешение E.coli с первым полисахаридом, чтобы получить смесь; формирование частиц из смеси и контактирование частиц с консервирующим раствором, содержащим сахарозу или трегалозу, и со вторым полисахаридом.

В другом неограничивающем варианте осуществления стадия получения частиц включает смешение E.coli с первым полисахаридом и консервирующим раствором, содержащим сахарозу или трегалозу, и со вторым полисахаридом с образованием смеси; и формирование частиц из смеси.

В одном варианте осуществления гранулированный корм для животных предназначен для потребления любым видом животных из домашней птицы, свиней и крупного рогатого скота.

Все отличительные признаки вариантов осуществления, которые описаны в настоящем описании и которые не являются взаимоисключающими, могут комбинироваться друг с другом. Элементы одного варианта осуществления могут использоваться в других вариантах осуществления без дополнительного упоминания. Другие аспекты и особенности настоящего изобретения станут очевидными для специалиста среднего уровня после ознакомления со следующим описанием частных вариантов осуществления в сочетании с прилагаемыми фигурами.

Краткое описание чертежей

Ниже приводится подробное описание конкретных вариантов осуществления со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:

- фигура 1 показывает неограничивающую блок-схему получения бактериальной культуры в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 2 показывает неограничивающую блок-схему сушки гранул с введенными E.coli в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 3 показывает неограничивающую схему системы дозирования кормовой добавки в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 4 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1, S2, S3 и S4 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 5 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1, S5, S6 и S7 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

фигура 6 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1, S0, S8 и S9 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 7 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1, S10, S11 и S12 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 8 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1, S13, S14 и S15 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 9 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1, S16, S17 и S18 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 10 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую эффект консервирующих растворов S1 и S19 на жизнеспособность бактерий после сушки на воздухе в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигуры 11A, 11B и 11C показывают необработанные данные, представленные на фигурах 4-10,

- фигура 12 показывает неограничивающее графическое представление стабильности КОЕ в сухих гранулах в течение 24 недель. Черные и белые кружки показывают результаты для двух разных произведенных серий, в которых использовался один и тот же способ получения,

- фигура 13 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую среднюю прибавку в весе (в кг) после 7 дней кормления свиней кормом, включающим кормовую добавку согласно настоящему изобретению (IP), и кормом без кормовой добавки ("CP"). Планка погрешностей показывает стандартную ошибку (p=0,044),

- фигура 14 показывает неограничивающую гистограмму, иллюстрирующую средний суточный привес (г/сут) в течение 7 дней кормления свиней с фигуры 13. Планка погрешностей показывает стандартную ошибку (p=0,044),

- фигура 15 показывает поперечное сечение частицы кормовой добавки в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения,

- фигура 16 показывает поперечное сечение варианта частицы кормовой добавки с фигуры 15, причем частица имеет поры,

- фигура 17 показывает, как читать следующие фигуры, которые включают необработанные данные, представленные в таблицах 29 и 30. Этими следующими фигурами являются фигуры с 17A по 17P.

На чертежах вариант осуществления проиллюстрированы на примерах. Следует четко понимать, что описание и чертежи предназначены только для иллюстрации некоторых вариантов осуществления и служат для облегчения понимания. Объем формулы изобретения не должен ограничиваться вариантами осуществления, изложенными в настоящем описании, но должен иметь самую широкую интерпретацию, согласующуюся с изобретением в целом.

Подробное описание вариантов осуществления

Настоящее описание в широком смысле относится к гранулированному корму для животных, включающему бактерии E.coli в количестве, достаточном, чтобы обеспечить благоприятный эффект на животное, потребившее этот корм.

В одном практическом варианте осуществления корм представляет собой кормовые гранулы, которые содержат жизнеспособные бактерии E.coli. В настоящем описании термин "жизнеспособный" относится к идее, что хотя бактерии в корме могут считаться находящимися в неактивном (спящем) состоянии, эти бактерии могут быть возвращены в активное состояние после воздействия на них определенных условий, например, достаточной температуры, влажности и/или кислорода.

Предпочтительно, введение такого гранулированного корма животным требует со стороны производителей животных минимальной обработки и/или может не требовать приготовления доз. Кроме того, длительное введение другими способами (например, с питьевой водой) может иметь значительное негативное влияние на сохранение жизнеспособности штамма по сравнению с описанным здесь кормом.

Escherichia coli (E.coli) являются неспорообразующими бактериями, и как таковые, они менее стойки к жестким условиям, чем спорообразующие бактерии. Кроме того, современная промышленная практика гранулирования кормов с точки зрения условий по давлению, температура и влажности стремится удерживать патогены, такие как E.coli и сальмонелла, на минимальном уровне, чтобы снизить риски загрязнения. Настоящая заявка относится к гранулированному корму для животных, включающему E.coli в неожиданно больших количествах и, тем не менее, подходящему для потребления животными. Другими словами, гранулированный корм, описанный в настоящем изобретении, включает непатогенные E.coli в достаточном количестве, чтобы обеспечить желаемую пользу животному, потребившему этот корм, и тем не менее корм все еще пригоден для потребления, имея контролируемый (минимальный) уровень патогенных E.coli.

Настоящее изобретение удивительно по меньшей мере в том, что хотя условия контроля патогенных микроорганизмов, обсуждавшиеся выше, все еще реализуются при получении гранулированного корма по настоящему изобретению, тем самым подавляя патогенные микроорганизмы, жизнеспособность непатогенных E.coli сохраняется в достаточной степени благодаря встраиванию штамма E.coli в подходящую кормовую добавку перед проведением стадии гранулирования.

Авторы настоящего изобретения к своему удивлению неожиданно заметили, что гранулированный корм для животных, включающий жизнеспособные непатогенные бактерии E.coli, введенные в описываемую здесь кормовую добавку, способен сохранять жизнеспособность и функциональность достаточного количества КОЕ бактерий в течение заданного продолжительного периода времени, более 26 недель при 25°C, что позволяет его коммерческое применение.

Введение E.coli в кормовую добавку

В данной области уже предлагались практические способы введения бактерий в кормовые добавки, правда, это были пробиотики.

Например, в документе WO 2011/094469 описаны композиции, которые включают смесь альгината натрия, олигосахаридов (инулин, мальтодекстрины, декстраны и т.д.) в весовом отношении альгинат натрия/олигосахарид 1:1-10, дисахарид и гидролизованный белок. В документе WO 2013/142792 описаны композиции, которые включают олигосахарид, дисахарид и полисахарид, а также белковый компонент, включающий гидролизованные животные или растительные белки. В каждом из этих документов описывается одинаковая процедура получения пробиотика, инкапсулированного в кормовой добавке в сухой форме:

- на первой стадии формируют замороженные гранулы, содержащие смесь композиций и пробиотика (причем пробиотик происходит или из замороженной жидкой культуры, или из коммерческой порошковой формы пробиотических бактерий). Замороженные гранулы получают, погружая капли смеси в жидкий азот и храня полученные гранулы при -80°C;

- на второй стадии замороженные гранулы сушат в вакууме до тех пор, показ водная активность гранул не снизиться до менее 0,3.

Таким образом, процедура капсулирования, описанная в этих документах, сочетает жесткие условия замораживания в жидком азоте и последующей сушки. Такие жесткие условия сказываются на жизнеспособности бактерий, что отражается снижением логарифма КОЕ на 0,73-0,90, несмотря на присутствие композиций, которые, как указывается в этих документах, якобы представляют собой композиции, обеспечивающими стабильность в сухом состоянии (смотри, например, фиг. 7 в WO 2011/094469 и фиг. 14 в WO 2013/142792). Таким образом, способ и композиция, описанные в этих документах, не оптимизированы для промышленного применения при использовании жидких бактериальных культур в качестве исходных материалов, где снижение log КОЕ может привести к снижению экономичности.

Ранее предлагались также и другие практические условия консервации и хранения бактерий, правда, пробиотиков.

Сублимационная сушка (называемая также лиофилизацией) часто применяется для консервации и хранения бактерий благодаря воздействию низкой температуры во время сушки (Rhodes, Exploitation of microorganisms, ed. Jones, DG, 1993, p. 411-439, London: Chapman&Hall). Однако она нежелательным образом отличается значительным снижением жизнеспособности, а также тем, что требует больших затрат времени и энергии. Предлагались защитные агенты, но защита, обеспечиваемая этой добавкой при сублимационной сушке, меняется в зависимости от вида микроорганизмов (Font de Valdez et al., Cryobiology, 1983, 20: 560-566).

Воздушная сушка, такая как десикация, также использовалась для консервации и хранения бактерий. Хотя вакуумная сушка похожа на процесс сублимационной сушки, она проводится при температурах 0-40°C в течение периода от 30 мин до нескольких часов. Преимущества этого способа состоят в том, что продукт не замораживается, так что расход энергии и связанное с этим экономическое воздействие снижаются. С точки зрения продукта, исключается повреждение от замораживания. Однако десикация при низкой или комнатной температуре является медленной, что требует дополнительных мер предосторожности, чтобы избежать загрязнения, и часто приводит к неудовлетворительной жизнеспособности (Lievense et al., Adv Biochem Eng Biotechnol., 1994, 51:71-89).

Капсулирование бактерий в матрице гидроколлоид-образующих полисахаридов, таких как гранулы альгината кальция (Ca-альгинат), также применяется для консервации и хранения бактерий во все более широком спектре различных применений (Islam et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 20:1367-1377). Чтобы сохранить бактерии в метаболически и физиологически устойчивом состоянии и, таким образом, получить желаемую пользу, было предложено добавлять в такие матрицы подходящую консервирующую композицию. Консервирующие композиции обычно содержат активные ингредиенты в подходящем носителе и добавки, которые помогают в стабилизации и защите микробных клеток при хранении, транспортировке и в целевой зоне.

Однако разработка новых композиций является сложной задачей, и не все композиции эффективны для заданных бактерий (Youg et al., Biotechnol Bioeng., 2006 Sep 5;95(1):76-83). Кроме того, с капсулированными бактериями возникает особая проблема, заключающаяся в том, что для обеспечения подходящего срока годности продукта необходимо свести к минимуму воздействие на бактерии влаги во время приготовления, хранения и/или транспортировки.

Описываемое в настоящем описании сочетание объектов и способов их получения приводит к кормовой добавке, которая помогает защитить жизнеспособные бактерии E.coli (в частности, полученные из жидкой культуры) от (1) условий сушки, применяемых при получении кормовой добавки, и (2) жестких условий по температуре, влажности и давлению, применяемых при гранулировании корма для животных. Действительно, результаты, полученные в настоящем изобретении, демонстрируют удивительное и неожиданное среднее снижение log КОЕ после стадии сушки, часто близкое к 0,30. Например, оно меньше 0,70, или меньше 0,60, или меньше 0,50, или меньше 0,40, или меньше 0,30, или меньше 0,25, или меньше 0,20, или меньше 0,15, или меньше 0,10.

Например, жизнеспособные E.coli могут испытывать относительное уменьшение a_w в частицах в процессе введения в кормовую добавку, составляющее по меньшей мере 0,4, или по меньшей мере 0,5, или по меньшей мере 0,6, или по меньшей мере 0,7 без существенного снижения числа КОЕ, как будет описано ниже в данном тексте.

Описываемый здесь способ получения кормовой добавки можно с успехом реализовать на промышленном масштабе без по меньшей мере некоторых из недостатков ранее известных процедур. Например, при промышленном применении часто имеет место ситуация, когда большие производственные партии производят в более или менее непрерывном режиме, когда бактерии типично подвергаются действию высокой температуры и/или влаги в течение длительного времени, например, от часов до дней. Описываемые в настоящем описании процедуры в достаточной мере защищают непатогенные E.coli от таких условий, обеспечивая достаточную выживаемость (т.е. достаточно число КОЕ) для предложенного желаемого результата, несмотря на продолжительное время, когда E.coli находятся в условиях по температуре/влажности, не являющихся идеальными для выживаемости в длительных сроках.

В практической реализации способ получения гранулированного корма для животных может включать подготовку ингредиентов для получения гранулированного корма и кормовой добавки, причем кормовая добавка содержит жизнеспособные непатогенные бактерии E.coli. Кроме того, способ включает гранулирование ингредиентов и кормовой добавки для получения гранулированного корма для животных. Процедуры гранулирования в данной области известны и не будут здесь обсуждаться подробнее.

В одном варианте осуществления способ может дополнительно включать получение кормовой добавки в форме частиц. Предпочтительно, частицы могут иметь неоднородную совокупность средних размеров частиц. Например, частицы могут включать первую популяцию частиц, имеющих первый средний диаметр, и вторую популяцию частиц, имеющих второй средний диаметр. Процедуры получения частиц с заданным средним диаметром, такие как просеивание или фильтрация, в данной области известны и не будут здесь обсуждаться подробнее. В одном частном варианте осуществления кормовая добавка может иметь некоторое количество первой популяции и некоторое количество второй популяция, которые выбраны так, чтобы отношение количества первой популяции к количеству второй популяции было больше 1. В одном неограничивающем варианте осуществления первый средний размер частиц составляет по меньшей мере 250 микрон, или по меньшей мере 500 микрон, или по меньшей мере 1 мм.

В одном неограничивающем варианте осуществления кормовая добавка может быть нарезана на любые формы и размеры, или раздроблена и размолота в сыпучий порошок. Кормовая добавка может быть дополнительно обработана с применением мокрой или сухой агломерации, грануляции, таблетирования, уплотнения, пеллетирования или любого другого типа способа выпуска, легко доступного специалисту. Способы дробления, размола, растирания или распыления хорошо известны в данной области. Например, можно использовать молотковую дробилку, воздухоструйную мельницу, ударную мельницу, вихревую мельницу, штифтовую мельницу, мельницу Уайли или аналогичные мельничные устройства.

Характеристики кормовой добавки

Фигура 15 показывает вид в сечении частицы 1600 кормовой добавки в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения.

В частном варианте осуществления, показанном на фигуре 15, частица 1600 содержит матрицу 1510, в которую встроены бактерии E.coli 1520. Матрица 1510 может иметь покрытие 1550, покрывающее по меньшей мере часть поверхности частицы 1600. Покрытие 1550 показано как имеющее колебания толщины, которые могут быть присущи некоторым способам нанесения покрытий.

Согласно фигуре 16, матрица 1510 может иметь поры. В некоторых вариантах осуществления частица может иметь поры, которые присущи материалу, используемому для получения матрицы. В других вариантах осуществления частицы могут иметь поры, которые образованы в результате нагнетания воздуха/газа в смесь при получении частиц. В других вариантах осуществления частицы могут содержать поры в результате комбинации этих двух вариантов. Выгодным является то, что наличие пор может потребовать меньше материала для получения матрицы благодаря наличию пустот 1530 и/или может повысить проникновение ингредиентов в частицы. Как показано на фигуре 16, покрытие 1550 может покрывать по меньшей мере часть поверхности частиц, ограничивая поры.

В некоторых частных вариантах осуществления покрытие 1550 может более или менее полностью покрывать поверхность частицы 1600 кормовой добавки.

Согласно изобретению, введение жизнеспособных E.coli в матрицу может с успехом минимизировать воздействие на бактерии кислорода, влажности воздуха и/или температуры в процессе производства корма для животных или кормовой добавки. Например, в производстве гранулированных кормов для животных с использованием экструдера ингредиенты корма, как правило, подвергаются воздействию довольно высоких давления, температуры и влажности, что приведет к снижению КОЕ, если бактерии каким-либо образом не защищены. Дополнительная защита не является обязательным требованием, когда бактерии являются спорообразующими, как, например, при использовании типичных пробиотиков. Однако в данном случае E.coli обычно чувствительны к таких жестким условиям экструзии и, соответственно, встраивание бактерий в описываемую здесь матрицу может помочь минимизировать повреждения, вызываемые воздействием таких жестких условий экструзии, тем самым снижая потери КОЕ.

Дополнительно или альтернативно, описываемое здесь встраивание бактерий в матрицу может способствовать стабильности бактерий при хранении/манипуляциях. Действительно, воздействие на бактерии влажности воздуха, кислорода и/или температуры при хранении/манипуляциях может заставить бактерии перейти из неактивного (спящего) состояния в активное состояние. Если это воздействие является неконтролируемым, такое переключение может привести к не поддающемуся количественному определению и неконтролируемому росту бактерий, что будет влиять на эффективную дозировку, которая доставляется животному, принимающему корм, содержащий такие бактерии, и, таким образом, влить на непротиворечивость ожидаемых результатов.

Дополнительно или альтернативно, описываемое здесь введение бактерий в матрицу может обеспечить контролируемое выделение бактерий из корма после поедания его животным, предоставляя тем самым систему доставки бактерий с контролируемым по времени или месту выделением.

Например, когда матрица включает материалы, которые преимущественно не перевариваются кишечными или желудочными соками, бактерии защищены от уничтожения в желудке, будучи экранированы матрицей. В одном неограничивающем варианте осуществления матрицу можно адаптировать к выделению бактерий по достижении подходящей среды, например, в кишечнике. В таком варианте осуществления матрица может включать в себя такое соединение как высокоамилозный крахмал и/или пектин, которые преимущественно не перевариваются кишечными или желудочными соками, но легко усваиваются кишечной микрофлорой, и как раз в этот момент доставленные живые бактерии высвобождаются в их неповрежденной форме. Таким образом, выбор подходящей концентрации компонентов матрицы может обеспечить контролируемое выделение бактерий из корма после поедания его животным. Другими словами, этот вариант осуществления может обеспечить контролируемое по времени или месту выделение бактерий.

В другом примере матрица может находиться в виде частиц, причем размер частиц может обеспечить контролируемое по времени или месту выделение бактерий из корма после поедания его животным. Другими словами, более крупная частица полностью распадется в данном желудочном соке и/или среде кишечника через большее время, чем частица меньшего размера. Таким образом, размер частиц матрицы можно выбрать/отрегулировать так, чтобы обеспечить контролируемое по времени или месту выделение бактерий из корма. В одном неограничивающем варианте осуществления частицы могут иметь средний диаметр, который меньше размера кормовой гранулы, в которую они включены, например, менее 2 мм, или менее 1 мм и т.п. В других вариантах осуществления матрица может находиться в виде частиц, содержащих по меньшей мере первую популяцию частиц, имеющую первый средний размер, и вторую популяцию частиц, имеющую второй средний размер, причем отношение первого среднего размера частиц ко второму среднему размеру больше 1. В одном неограничивающем варианте осуществления первый средний размер частиц составляет по меньшей мере 250 микрон, или по меньшей мере 500 микрон, или по меньшей мере 1 мм.

Предпочтительно, описываемый в настоящем описании гранулированный корм для животных может включать частицы кормовой добавки с неоднородными средними диаметрами, чтобы кормовая добавка могла выделять бактерии контролируемым заранее заданным образом. Например, гранулы могут включать кормовую добавку с неоднородными размерами частиц, чтобы каждая частица кормовой добавки эффективно переваривалась в заданное время и/или на заданной участке кишечника, что зависит от фактического среднего диаметра частиц. Например, гранулированный корм может включать кормовую добавку в виде частиц разного размера, как, например, 0,1 мм, 0,5 мм, 1 мм, 2 мм и т.п., при условии, что размер частиц меньше, чем размер кормовых гранул. Специалист легко поймет, что объем настоящего изобретения охватывает любую комбинацию подходящих размеров частиц кормовой добавки.

Дополнительно или альтернативно, введение кормовой добавки с кормом для животных, когда кормовая добавка имеет форму частиц с неоднородным распределением частиц по размерам, позволяет менять количество бактерий, достигающих кишечного тракта и, таким образом, контролировать выделение бактерий в животном. После поедания гранулированного корма, содержащего описываемую здесь кормовую добавку, гранулированный корм проходит через желудок, где гранулы разрушаются, по меньшей мере частично, и следовательно, могут по меньшей мере частично выделять кормовую добавку. Кормовая добавка предпочтительно может включать элементы, которые защищают бактерии от кислого pH желудка. Это может быть особенно выгодно в случае животных, которые могут потерять чувствительность к бактериям в кормовой добавке, так что может быть желательным ограничить "импульсную" доставку бактерий (т.е., когда все бактерии выделяются в течение короткого периода времени).

В одной практической реализации кормовая добавка по настоящему изобретению может применяться для регулирования количества бактерий, вводимых в заданный корм для животных.

Например, кормовую добавку, имеющую заданную контролируемую концентрацию жизнеспособных непатогенных бактерий, можно использовать в производстве гранулированных кормов для конкретных животных. Например, кормовая гранула, предназначенная для домашней птицы, не обязательно потребует такого же количества жизнеспособных непатогенных бактерий для достижения полезного эффекта, что сравнительная кормовая гранула, предназначенная для свиней и крупного рогатого скота. При желании специалист при получении корма для свиней вместо того, чтобы использовать другие пропорции кормовой добавки, чем при получении корма для птицы, может использовать близкие пропорции, но использовать при этом кормовую добавку, содержащую заданную контролируемую концентрацию непатогенных бактерий, специфическую для свиней.

Другими словами, кормовая добавка может производиться в соответствии со спецификациями, относящимися к конкретным целевым животным, и включать заданное количество КОЕ/г, подходящее для целевых животных, т.е. в соответствии с "сортом для свиней", "сортом для крупного рогатого скота", "сортом для птицы" и т.п.

Альтернативно, для получения гранулированного корма для животных в качестве исходного материала можно использовать один и тот же "сорт", но теперь адаптация к спецификациям животного может быть сделана на уровне производства гранулированного корма, используя разные пропорции кормовой добавки при получении корма для свиней и корма для птицы.

Дополнительно или альтернативно, кормовая добавка, имеющая заданную контролируемую концентрацию непатогенных бактерий, может использоваться для получения гранулированного корма для животных для конкретной фазы кривой развития конкретного животного. Например, гранулированный корм для свиней может содержать контролируемое количество жизнеспособных бактерий, которое является разным на стадии после отъема от груди и на совокупности последующих стадий откорма.

Например, в некоторых неограничивающих вариантах осуществления гранула корма для животных может иметь количество (КОЕ/г) жизнеспособных бактерий по меньшей мере 10⁴, или по меньшей мере 10⁵, или по меньшей мере 10⁶, или по меньшей мере 10⁷, или по меньшей мере 10⁸, или по меньшей мере 10⁹, или по меньшей мере 10¹¹. Например, кормовая гранула может включать от 1⋅10⁵ до 1⋅10¹¹ КОЕ/г или любое промежуточное значение. Таким разные количества КОЕ/г можно получить, например, вводя повышенные количества кормовой добавки, содержащей контролируемое количество жизнеспособных бактерий, или вводя разные сорта кормовой добавки при производстве гранулированного корма. Специалист легко поймет, что в этом контексте "сорта" кормовой добавки могут соответствовать кормовым добавкам, имеющим разные контролируемые количества жизнеспособных бактерий. Такая индивидуализация количества бактерий в заданном корме для животных может быть реализована в любом месте вдоль цепочки поставок, например, на участке производства частиц добавки, на участке производства корма, на участке конечного потребителя и т.д.

Соответственно, читатель легко поймет также, что кормовая добавка включает подходящее количество (КОЕ/г) штамма E.coli, чтобы достичь вышеописанного содержания КОЕ/г в кормовой грануле. Например, кормовая добавка может включать по меньшей мере 1⋅10⁶ КОЕ/г, или по меньшей мере 1⋅10⁷, или по меньшей мере 1⋅10⁸, или по меньшей мере 1⋅10⁹, или по меньшей мере 1⋅10¹⁰, или по меньшей мере 1⋅10¹¹ и т.д.

Описываемая в настоящем описании адаптация количества бактерий в заданном корме для животных может быть полезной в контексте животных, разводимых в целях производства мяса, например, в свиноводстве, где на фермах животных обычно откармливают, используя программу откорма с разными фазами откорма (например, 2-4 фазы), причем первый корм (т.е. первый корм после отъема от груди) может задаваться в течение периода примерно от одной до двух недель. В таких случаях возможность установки необходимого количества бактерий в заданном корме может быть полезной для получения разных уровней бактерий в корме на разных фазах откорма. Например, в случае, когда E.coli, включенные в кормовую добавку, предназначена обеспечить конкретную нагрузку на кишечник свиней, в промышленности может быть полезным адаптировать корм так, чтобы он включал конкретные уровни бактерий для первой фазы отъема и первой нажировочной фазы откорма, так как эти две фазы характеризуются двумя разными диапазонами нагрузки на кишечник свиней.

Бактерии E.coli

В одном неограничивающем варианте осуществления описываемые здесь непатогенные бактерии Escherichia coli (E.coli) содержат любой рекомбинантный или исходный штамм E.coli, или любую их смесь.

В одном неограничивающем варианте осуществления штамм E.coli является штаммом, внесенным в Международный депозитарий Канады (IDAC) 21 января 2005 под номером доступа IDAC 210105-01 и описанным в патенте US 7981411 (введенным в настоящий документ ссылкой во всей его полноте), или штаммом, внесенным в Международный депозитарий Канады (IDAC) 20 июня 2013 под номером доступа 200613-01 и описанным в патенте US 9453195 (введенным в настоящий документ ссылкой во всей его полноте), или их комбинацией.

IDAC является патентным депозитарием для микроорганизмов, который стал возможным благодаря присоединению Канады к Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры (Будапештский договор) 21 сентября 1996 г. Кроме того, 1 октября 1996 года вступили в силу поправки к Канадскому Закону о патентах и патентных правилах, обеспечивающие соответствие с Будапештским договором. Физический адрес IDAC: 1015 Arlington Street, Winnipeg, Canada, R3E 3R2.

Специалисту должно быть очевидным, что E.coli до введения в матрицу могут находиться в сухой, свежей или замороженной форме. Такую форму можно получить напрямую из культурной формы (т.е., штамм в присутствии культуральной среды), или же ее можно получить в результате одной или более стадий обработки, например, для удаления и замещения одного или более элементов культуральной среды другими, одним или более, элементами, например, подходящими для криоконсервации или для любой другой позднейшей стадии обработки.

Примеры одного или более элементов, подходящих для криоконсервации, могут отвечать по меньшей мере одной из следующих характеристик: быть хорошо растворимыми в воде, проникать внутрь клетки, иметь низкую токсичность, быть нереакционноспособными и не осаждаться при высоких концентрациях. Например, но без ограничений, один или несколько элементов, подходящих для криоконсервации, могут включать глицерин, сахарозу, трегалозу, бычий сывороточный альбумин (BSA).

Матрица

Матрица содержит гидроколлоид-образующий полисахарид. Для описываемого здесь применения подходят несколько гидроколлоид-образующих полисахаридов, которые могут использоваться по отдельности или в любой комбинации.

Одним примером подходящего гидроколлоид-образующего полисахарида является высокоамилозный крахмал, способный образовать прочный гель после гидратации гранул крахмала в кипящей воде, диспергирования гранул с помощью мешалки с большими сдвиговыми усилиями и затем охлаждения раствора до примерно 0-10°C. Твердость и прочность геля зависит от концентрации крахмала в растворе при максимальной рабочей концентрации до 10 в/о %.

Другим примером подходящего гидроколлоид-образующего полисахарида является пектин, который ведет себя очень похоже на высокоамилозный крахмал. Пектин имеет дополнительное преимущество в том, что прочность матрицы пектинового геля можно еще больше повысить добавлением двухвалентных катионов, таких как Ca²⁺, которые образуют мостики между карбоксильными группами сахарных полимеров.

Другим примером подходящего гидроколлоид-образующего полисахарида является альгинат, который может образовать прочную гелевую матрицу в результате сшивки двухвалентными катионами. Альгинат может затвердеть с образованием прочной гелевой матрицы в результате внутренней сшивки первого полисахарида альгината двухвалентным катионом, например, Ca²⁺, например, путем экструдирования альгината в виде тонких нитей, струн или по существу сферических гранул в ванну Ca²⁺. Альгинат твердеет при взаимодействии с Ca²⁺. Альтернативные способы получения матрицы, известные в данной области, включают струйное распыление смеси в ванну, содержащую Ca²⁺, метод на основе эмульсии, а также агломерацию в псевдоожиженном слое и покрытие.

В одном неограничивающем варианте осуществления гидроколлоид-образующий полисахарид присутствует в матрице в количестве, выраженном в весовых процентов в расчете на всю сухую массу, от 0,1% до 20%. В одном неограничивающем варианте осуществления гидроколлоид-образующий полисахарид присутствует в матрице в количестве (в весовых процентах от всей сухой массы) от 0,1% до 19%, или от 0,1% до 18%, или от 0,1% до 17%, или от 0,1% до 16%, или от 0,1% до 15%, или от 0,1% до 14%, или от 0,1% до 13%, или от 0,1% до 12%, или от 1% до 12%, включая любые промежуточные значения.

В одном варианте осуществления полисахарид является первым полисахаридом, и матрица дополнительно содержит второй полисахарид, отличающийся от первого полисахарида. Факультативно, матрица может содержать дисахарид.

Альтернативно или дополнительно, матрица может иметь покрытие, расположенное на по меньшей мере части поверхности матрицы. Покрытие может содержать второй полисахарид, отличающийся от первого полисахарида. Факультативно, покрытие может содержать дисахарид.

В одном неограничивающем варианте осуществления дисахарид и второй полисахарид находятся в покрытии и/или в матрице в весовом отношении дисахарид/второй полисахарид от 1:10 до 10:1. В другом неограничивающем варианте осуществления это отношение составляет 9:1, 9:2, 9:3, 9:4, 9:5, 9:6, 9:7, 9:8, 8:1, 8:2, 8:3, 8:4, 8:5, 8:6, 8:7, 7:1, 7:2, 7:3, 7:4, 7:5, 7:6, 6:1, 6:2, 6:3, 6:4, 6:5, 5:1, 5:2, 5:3, 5:4, 4:1, 4:2, 4:3, 3:1, 3:2, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 2:3, 2:4, 2:5, 2:6, 2:7, 2:8, 2:9, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 3:9, 4:5, 4:6, 4:7, 4:8, 4:9, 5:6, 5:7, 5:8, 5:9, 6:7, 6:8, 6:9, 7:8, 7:9, или 8:9, включая любые промежуточные значения отношения.

В другом неограничивающем варианте осуществления весовое отношение дисахарид/второй полисахарид составляет менее 10, или более предпочтительно менее 5. В одном неограничивающем варианте осуществления весовое отношение дисахарид/второй полисахарид составляет около 1.

В одном неограничивающем варианте осуществления дисахарид присутствует в покрытии и/или в матрице в количестве (в весовых процентов в расчете на все сухое вещество) от 0,1% до 90%, или от 0,1% до 75%, или от 0,1% до 50%, или от 0,1% до 35%, или от 0,1% до 20%, или от 0,1% до 15%, или от 0,1% до 10%, включая любые промежуточные значения.

В одном неограничивающем варианте осуществления дисахарид содержит сахарозу.

В одном неограничивающем варианте осуществления дисахарид содержит трегалозу.

В одном неограничивающем варианте осуществления дисахарид содержит сахарозу и трегалозу.

В одном неограничивающем варианте осуществления второй полисахарид содержит мальтодекстрин.

В одном неограничивающем варианте осуществления второй полисахарид содержит декстран.

В одном неограничивающем варианте осуществления второй полисахарид содержит мальтодекстрин и декстран.

В одном неограничивающем варианте осуществления декстран имеет молекулярный вес от 20 до 70 кДа.

В одном неограничивающем варианте осуществления кормовая добавка (т.е., матрица и/или покрытие) дополнительно содержит соль аминокислоты.

В одном неограничивающем варианте осуществления соль аминокислоты содержит соль L-глутаминовой кислоты.

В одном неограничивающем варианте осуществления соль является натриевой солью L-глутаминовой кислоты.

Матрица, описываемая в настоящем описании, после выхода со стадий сушки имеет водную активность ("a_w") такую, что a_w ≤0,3, например, 0,04 ≤a_w≤ 0,3, 0,04 ≤a_w≤ 2,5, 0,04 ≤a_w≤2,0, 0,04 ≤a_w≤ 1,5 и т.п. "Водная активность" или "a_w" в контексте настоящего изобретения относится к доступности воды и отражает энергетический статус воды в системе. Она обычно определяется как давление паров воды над образцом, деленное на давление паров чистой воды при той же температуре. Водную активность можно измерить в соответствии с материалами способами, известными в данной области, например, используя прибор для измерения водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Сушка может включать такие стадии, как распылительная сушка, сушка в псевдоожиженном слое, лиофилизация, вакуумная сушка и т.д. Неограничивающие практические реализации стадии сушки будут описаны позднее в данном тексте.

Слой покрытия гранул корма для животных

В другой практической реализации гранулы корма для животных могут дополнительно включать слой, который покрывает по меньшей мере часть поверхности гранулы, образуя покрытую кормовую гранулу, причем слой включает кормовую добавку. Нанесение покрытия на гранулы корма для животных можно осуществить способами, известными в данной области, такими как распылительная сушка, охлаждение разбрызгиванием, струйное распыление, агломерация в псевдоожиженном слое и методы на основе эмульсии. Полного распределения покрытия на кормовой грануле без покрытия можно достичь, если подвергнуть кормовую гранулу без покрытия обработке в барабане.

В некоторых вариантах осуществления присутствие дополнительного источника E.coli в грануле (т.е. первый источник в наружном слое и второй источник, введенный внутрь гранулы) может обеспечить пролонгированную или локализованную доставку E.coli. Действительно, наружный слой может иметь такой состав, чтобы растворяться с заданной скоростью или в заданном месте желудочно-кишечного тракта животного, эта скорость может отличаться от скорости доставки E.coli, введенной внутрь корма.

В некоторых вариантах осуществления покрытие гранул корма для животных может дополнительно усиливать защиту от влаги и порчи и повышать срок хранения гранулированного корма. Кроме того, покрытие гранулы корма для животных может усилить защиту от загрязнений.

В других вариантах осуществления покрытие гранул корма для животных может улучшить вкусовую привлекательность кормовых гранул, что дополнительно снижает потребность в добавлении усилителей вкуса в гранулу. Покрытие кормовой гранулы может также маскировать сильные запахи и ароматы, чтобы еще больше усилить поедание животными кормовых гранул с покрытием.

Упаковка

В одной практической реализации настоящее изобретение относится к упаковке, содержащей влагоизолирующий слой, достаточный для контроля воздействия на содержимое упаковки влажности окружающей среды. Другими словами, упаковка может ограничивать воздействие на жизнеспособные непатогенные бактерии согласно изобретению (т.е. в кормовой добавке и/или в грануле корма) влажности окружающей среды. Выгодным эффектом наличия такого влагоизолирующего слоя является то, что бактерии, содержащиеся внутри, могут в основном оставаться в неактивном состоянии, тем самым существенно увеличивая срок годности кормовой добавки и/или гранулированного корма.

В одной практической реализации упаковка может дополнительно иметь несколько отделений, предназначенных для вмещения кормовой добавки, введенной в кормовые гранулы, в по меньшей мере одном отделении, и элементы контроля влажности в по меньшей мере одном другом отделении.

В одном неограничивающем варианте осуществления упаковка может иметь внутреннюю отделку, содержащую полиэтилен, полиуретан или любой другой подходящий полимер, совместимый с пищевыми продуктами. Отделка может представлять собой однослойный или многослойный материал. Не связывая себя какой-либо теорией, можно полагать, что отделка может обеспечить защиту по меньшей мере от протечек, влаги, кислорода, загрязнений и ультрафиолетового излучения (УФ) и гарантирует подходящий срок годности кормовой добавки и/или гранулированного корма.

В одной практической реализации упаковка может быть герметично закрыта на верхнем конце посредством любого подходящего механизма герметизации. Вскрытие уплотнения на верхнем конце может обеспечить выпускной канал для дозировки кормовой добавки и/или гранулированного корма.

В другой практической реализации упаковка может содержать несколько отделений, предназначенных для хранения кормовой добавки в по меньшей мере одном отделении и ингредиентов гранулированного корма в по меньшей мере одном другом отделении.

В одном неограничивающем варианте осуществления указанное, по меньшей мере одно, отделение для хранения кормовой добавки и указанное, по меньшей мере одно, другое отделение для хранения ингредиентов кормовой гранулы могут быть выполнены так, чтобы предотвратить гидродинамическое сообщение между ними, т.е. так, чтобы они не были соединены. Отсутствие соединения может предотвратить преждевременное перемешивание ингредиентов кормовой гранулы и кормовой добавки.

В одном неограничивающем варианте осуществления по меньшей мере одно отделение для хранения кормовой добавки может быть предназначено для хранения количества кормовой добавки (т.е. эквивалент числа КОЕ жизнеспособных бактерий), подходящего для добавления во все содержимое по меньшей мере одного другого отделения для хранения ингредиентов гранулированного корма. В этом варианте осуществления приготовление гранулированного корма с кормовой добавкой облегчается, так как пользователю не нужно высчитывать количество кормовой добавки для добавления в гранулированный корм. Как обсуждалось выше, количество КОЕ в кормовой добавке можно устанавливать в соответствии с разными сортами, т.е. оно может меняться в зависимости от того, для каких животных оно предназначено. В таких случаях вместо того, чтобы рассчитывать количество кормовой добавки для добавления в гранулированный корм, пользователь может запросить особую "свиную" упаковку, уже содержащую подходящее количество КОЕ в кормовой добавке, чтобы получить "свиной" гранулированный корм гранулу. Как неограничивающий пример, упаковка с количеством λ кормовой добавки может подходить для получения гранулированного корма для поросят после отъема, тогда как упаковка с количеством β кормовой добавки может подходить для получения гранулированного корма для поросят в нажировочной фазе.

В других вариантах осуществления упаковка может также содержать дополнительные отделения, предназначенные для хранения других кормовых добавок или других количеств кормовых добавок.

Предпочтительно, упаковку можно снабдить маркировкой даты "использовать до" или "в продаже до", чтобы гарантировать желаемое минимальное количество КОЕ (т.е., желаемый КОЕ/г) на дату "использовать до" или "в продаже до". Действительно, специалист способен экстраполировать полезное количество КОЕ, которое остается после заданного периода времени, например, учитывая ожидаемое воздействие влаги/температуры/кислорода на кормовую добавку после указанного периода.

Система дозирования кормовой добавки

Фиг. 3 показывает систему 1000 для дозировки описываемой здесь кормовой добавки. Система 1000 содержит несколько отдельных компонентов, включая по меньшей мере один блок дистанционного управления 1100, бункер 1200, предназначенный для вмещения кормовой добавки 1200, стенд 1300, укупорочный механизм 1400 и дозатор 1500.

В одном неограничивающем варианте осуществления блок дистанционного управления 1100 содержит компьютер и может быть размещен в шкафу (не показано), который может надежно соединяться со стендом 1300 через сеть передачи данных (не показана). В практической реализации сеть передачи данных может быть любой подходящей сетью передачи данных, включая, без ограничений, сеть общего пользования (например, Интернет), ведомственную сеть (например, LAN или WAN), проводную сеть (например, сеть Ethernet), беспроводную сеть (например, сеть 802.11 или сеть Wi-Fi), сотовую сеть, например, сеть стандарта "Долгосрочное развитие" (LTE)), роутеры, хабы, переключатели, серверные компьютеры и/или любые их комбинации.

Бункер 1200 может быть открыт на верхнем конце для приема кормовой добавки. Бункер 1200 может быть соединен на нижнем конце с укупорочным механизмом 1400. Укупорочный механизм 1400 может перемещаться между закрытым положением (показанным на фигуре 3), когда внутренняя часть бункера 1200 не сообщается с дозатором 1500, и открытым положением (не показано), когда внутренняя часть бункера 1200 находится в сообщении с дозатором 1500.

В одном неограничивающем варианте осуществления дозатор 1500 может содержать съемную сетку с заданным размером ячеек. В предпочтительной реализации размер ячеек выбирают так, чтобы дозатор мог выдавать только гранулы кормовой добавки определенного диаметра. Например, но без ограничений, размер ячеек сетки может быть выбран так, чтобы дозатор мог выдавать только гранулы размером до 250 микрон, до 500 микрон, до 1 мм или до 2 мм. В зависимости от распределения по размерам частиц исходной кормовой добавки, дозатор может использоваться для дозированной выдачи гранул однородного или неоднородного размера.

В других вариантах осуществления дозатор 1500 может содержать несколько съемных сеток с разными размерами ячеек, расположенных друг на друге, так что дозатор можно с успехом использовать для раздачи гранул кормовой добавки однородного диаметра, используя в качестве источника кормовую добавку, имеющую неоднородное распределение частиц по размерам. То есть, чтобы получить в бункере 1200 кормовую добавку, имеющую неоднородное распределение частиц по размерам, можно смешать и загрузить в бункер 1200 несколько кормовых добавок, имеющих разные диаметры частиц. Используя подходящую последовательность удаления сеток, систему по настоящему изобретению удобно использовать для дозированной выдачи, исходя из неоднородного распределения частиц по размерам, первой порции кормовой добавки, имеющей первый диаметр частиц и, следовательно, первое КОЕ жизнеспособных непатогенных бактерий, в количестве X, и второй порции кормовой добавки, имеющей второй диаметр частиц и, следовательно, второе КОЕ жизнеспособных непатогенных бактерий, в количестве Y. Соответственно, систему 1000 можно использовать для получения разных "сортов" кормовой добавки/кормовых гранул, обсуждавшихся выше в тексте. Короче говоря, можно выбрать и обеспечить (т.е. подогнать к требованиям) определенное количество КОЕ для данного конкретного применения (например, для вида животных и/или фазы откорма), выбирая конкретные количественные соотношения между размерами частиц, которые затем будут выданы для получения гранулированного корма.

В одном неограничивающем варианте осуществления бункер 1200 предпочтительно выполнен из нержавеющей стали.

В одном неограничивающем варианте осуществления бункер 1200 может также включать в его внутренней части смесительное устройство (не показано), чтобы предотвратить забивку на нижнем конце бункера 1200. В других вариантах осуществления кормовая добавка может дозироваться вместе с жидкостью, такой как вода, чтобы предотвратить забивку системы.

Специалист легко поймет, что можно применять и другие дозирующие системы, не выходя за объем изобретения.

Примеры

В следующих примерах анализировали по три консервирующих раствора в сравнении с консервирующим раствором S1. Тесты повторяли трижды и рассчитывали среднеквадратичное отклонение по следующей формуле:

где n: число образцов и

В каждом из следующих примеров жизнеспособность бактерий оценивали путем измерения числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в соответствии с протоколами, известными в данной области.

Консервирующие растворы, использующиеся в следующих примерах, указаны в таблице 1.

Таблица 1

¹ x означает - отсутствует

² N/A означает - не применимо

1. Пример 1

Этот пример описывает получение кормовой добавки в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения. В данном примере бактерии инкапсулированы в матрице, состоящей из альгината кальция. Альгинатно-кальциевая матрица альгината имеет форму частиц (гранул), которые могут иметь однородный или неоднородный средний диаметр в зависимости от назначения. Так как гранулы готовят с жидкой бактериальной культурой в качестве исходного материала, специалист должен понимать, что конечный состав описываемых здесь сухих гранул с E.coli может включать компоненты среды бактериальной культуры.

a. Культура E.coli

В соответствии с фигурой 1, штамм E.coli культивировали на первой стадии 100 на триптиказо-соевом агаре неживотного происхождения. Затем шесть выделенных колоний использовали для культивирования штамма E.coli на второй стадии 200 в течение 2 часов при 37°C и при перемешивании на 200 об/мин в 30 мл триптиказо-соевого бульона (TSB) неживотного происхождения (на 1 л TSB: 20 г соевого пептона A3 SC (Organotechnie), 2,5 г безводный декстрозы USP (J.T. Baker), 5 г хлорида натрия (реагент фармацевтической чистоты согласно Фармакопее США) (J.T. Baker) и 2,5 г двухосновного фосфата калия (реагент фармацевтической чистоты согласно Фармакопее США) -(Fisher Chemical)).

Полученную культуру 1 разбавляли в 10 раз в TSB и затем использовали для культивирования штамма E.coli на третьей стадии 300 в течение 2 часов при 37°C и при перемешивании на 200 об/мин в 100 мл TSB неживотного происхождения. Полученную культуру 2 разбавляли в 10 раз в TSB и затем использовали для выращивания штамма E.coli на четвертой стадии 400 в течение 5 часов при 37°C и при перемешивании на 200 об/мин в 1 л TSB неживотного происхождения. Полученную культуру 3 использовали затем для встраивания E.coli в матрицу. Возможны варианты и уточнения описываемого здесь протокола культивирования, которые станут очевидными для специалистов в данной области в свете принципов настоящего изобретения. Например, непатогенные E.coli можно также культивировать в анаэробных условиях в соответствии с протоколами, известными в данной области (Son & Taylor, Curr. Protoc. Microbiol., 2012, 27:5A.4.1-5A.4.9). При получении гранул в последующих примерах использовали непатогенный штамм E.coli, депонированный в Международном депозитарии Канады (IDAC) 21 января 2005 под номером доступа IDAC 210105-01.

b. Приготовление матрицы

Бактопептон (1,5 г, BD, Миннисота, Канада) смешивали с 1,5 л горячей воды, получая смесь. К смеси медленно добавляли альгинат (30 г Grindsted^®, DuPont™ Danisco^®, Миннесота, Канада) при перемешивании магнитной мешалкой на 360 об/мин. Полная солюбилизация альгината достигалась через примерно 3 ч, давая раствор альгината 2 в/о%. Затем раствор автоклавировали вместе с магнитной мешалкой в стандартных условиях. Возможны варианты и уточнения описываемого здесь протокола приготовления матрицы, которые станут очевидными для специалистов в данной области в свете принципов настоящего изобретения.

c. Встраивание E.coli в матрицу

К раствору обработанной в автоклаве матрицы (1,5 л) для получения суспензии при перемешивании магнитной мешалкой добавляли следующие ингредиенты в указанном порядке: 1 л TSB неживотного происхождения и, согласно фигуре 1, 0,5 л полученной культуры 3 E.coli.

Суспензию (3л) экструдировали в полимеризационный раствор (300 мМ CaCl₂, 0,1 в/о % бактотриптона, 0,1 в/о % бактопептона и 0,05 вес. дрожжевого экстракта Bacto™ в воде), образуя гранулы, с использованием шприцевой системы с 9 выходами, на основе испарителей Thermo Scientific™ Reacti-Vap™. При впрыскивании суспензии раствор осторожно перемешивали. Гранулы матрицы оставляли сшиваться на примерно 30 минут, и затем собирали полученные отвердевшие гранулы. Возможны варианты и уточнения описываемого здесь протокола введения, которые станут очевидными для специалистов в данной области в свете принципов настоящего изобретения. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре примерно на 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы, и затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом, получая сухие гранулы.

К своему удивлению, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что инкубирование введенных E.coli в консервирующих растворах при осторожном перемешивании в течение примерно 20 мин перед сушкой значительно снижает потерю бактерий на стадиях сушки, приводящих к образованию сухих гранул.

d. Сушка и анализ введенных E.coli

Для каждого консервирующего раствора сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы с введенными в матрицу E.coli, помещали в консервирующий раствор S1, консервирующий раствор S2, консервирующий раствор S3 или консервирующий раствор S4, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 4. Консервирующий раствор S4 показал нормированную потерю средней жизнеспособности 0,32, одновременно сохраняя водную активность на уровне 0,142 ± 0,004.

Результаты примера 1 сведены в таблицах 2 и 3. Эти результаты демонстрируют, что компоненты консервирующих растворов S1 и S4 оказывают значительный эффект на жизнеспособность бактерий E.coli, введенных в сухую матрицу, и их стойкость к процессу сушки 700.

Таблица 2

Таблица 3

e. Введение сухих встроенных E.coli в корм для животных ("гранулирование")

Протокол введения сухой матрицы в корм для животных, например, в форме кормовой добавки, в данной области известен. Иллюстративный пример того, как это можно сделать, включает, например, введение от 500 г до 1000 г сухих гранул матрицы на тонну гранулированного корма. При желании корм может также содержать инактивированный дрожжевой продукт в подходящем количестве. Например, сухие частицы (гранулы) матрицы, содержащие встроенные E.coli (т.е. кормовая добавка) можно смешать в гомогенизаторе с по меньшей мере частью всех других ингредиентов. Предпочтительно, смесь постоянно перемешивается в процессе гранулирования. Затем смешанный материал перекачивают в экструдер.

Смешанный материал обрабатывают паром (т.н. кондиционирование паром) либо на его входе в экструдер, либо в отделении, находящемся внутри экструдера (таким образом, температура смеси на этой стадии повышается). Типичные значения температуры могут варьироваться в диапазоне от примерно 70°C до примерно 90°C. К смеси при ее прохождении через экструдер прикладывается подходящее давление. Типичные значения давления могут варьироваться в пределах от примерно 20 psig до примерно 80 psig (0,138-0,55 МПа). Затем образованные гранулы выбрасываются из экструдера в охладительный танк (быстрое падение температуры до 30-40°C с последующим другим охлаждением до достижения температуры окружающей среды). Гранулированный корм, содержащий кормовую добавку (матрица, содержащая встроенные E.coli), можно затем хранить, например, в мешках/контейнерах, как дополнительно описано ниже. Возможны варианты и уточнения описываемого здесь протокола гранулирования, которые станут очевидными для специалистов в данной области в свете принципов настоящего изобретения.

2. Пример 2

Для каждого анализируемого консервирующего раствора сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали в консервирующий раствор S1, в консервирующий раствор S5, консервирующий раствор S6 или консервирующий раствор S7, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 5. Консервирующий раствор S7 показал нормированную потерю средней жизнеспособности 0,38, одновременно сохраняя водную активность на уровне 0,298±0,013.

Результаты примера 2 сведены в таблицах 4 и 5. Эти результаты демонстрируют, что компоненты консервирующего раствора S7 обеспечивают значительный защитный эффект на жизнеспособность E.coli, встроенных в сухую матрицу, и их стойкость в процессу сушки 700.

Таблица 4

Таблица 5

3. Пример 3

Для каждого анализируемого консервирующего раствора сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S0, консервирующий раствор S8 или консервирующий раствор S9, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 6.

Результаты примера 3 сведены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6

Таблица 7

4. Пример 4

Для каждого анализируемого консервирующего раствора сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S10, консервирующий раствор S11 или консервирующий раствор S12, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 7. Консервирующий раствор S9 показал нормированную потерю средней жизнеспособности 0,58.

Результаты примера 4 сведены в таблицах 8 и 9.

Таблица 8

Таблица 9

5. Пример 5

Для каждого анализируемого консервирующего раствора сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S13, консервирующий раствор S14 или консервирующий раствор S15, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 8. Консервирующий раствор S15 показал нормированную потерю средней жизнеспособности 0,35.

Результаты примера 5 сведены в таблицах 10 и 11.

Таблица 10

Таблица 11

6. Пример 6

Для каждого консервирующего раствора сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S16, консервирующий раствор S17 или консервирующий раствор S18, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 9.

Результаты примера 6 сведены в таблицах 12 и 13.

Таблица 12

Таблица 13

7. Пример 7

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Согласно фигуре 2, на первой стадии 500 гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S19, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. В каждом случае после вымачивания в консервирующем растворе определяли 550 полное количество КОЕ. Затем на второй стадии 600 гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. В каждом случае измерение 650 водной активности a_w проводили на полусухих гранулах, используя измеритель водной активности Aqualab 4TE (Decagon Devices, Inc., США). Затем на третьей стадии 700 полусухие гранулы помещали на примерно 64ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, процесс сушки 800 включает по меньшей мере две стадии: стадию 600, на которой гранулы помещают в воздушную сушилку на 24 часа при комнатной температуре, получая полусухие гранулы, и стадию 700, на которой полусухие гранулы помещают в эксикатор на 64 часа, чтобы получить сухие гранулы. В каждом случае определение 750 полного количества КОЕ и измерение 760 водной активности a_w проводили на сухих гранулах. Получали сухие гранулы, имеющие водную активность a_w ≤ 0,3.

Согласно фигуре 2, в каждом случае рассчитывали относительное уменьшение a_w, используя следующую формулу:

относительное уменьшение a_w =

Согласно фигуре 2, для каждого случая рассчитывали потерю жизнеспособности (логарифм потери КОЕ), используя следующую формулу:

CFU loss=log₁₀(550) -log₁₀(750)

Для каждого случая рассчитывали среднюю потерю жизнеспособности и нормированную среднюю потерю жизнеспособности, отнесенную к результатам, полученным с консервирующим раствором S1.

Результаты показаны на фигуре 10.

Результаты примера 7 сведены в таблицах 14 и 15.

Таблица 14

Таблица 15

8. Пример 8

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S2, консервирующий раствор S3 и консервирующий раствор S4, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды, и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты для примера 8 показаны в таблице 16; все исследованные консервирующие растворы обеспечивали стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 16

9. Пример 9

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали в консервирующий раствор S1, в консервирующий раствор S5, консервирующий раствор S6 и консервирующий раствор S7 примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты для примера 9 приведены в таблице 17; все исследованные консервирующие растворы обеспечивают стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 17

10. Пример 10

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S0, консервирующий раствор S8 и консервирующий раствор S9, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды, и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты для примера 10 приведены в таблице 18; все исследованные консервирующие растворы обеспечивают стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 18

11. Пример 11

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S10, консервирующий раствор S11 и консервирующий раствор S12, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды, и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты для примера 11 приведены в таблице 19; все исследованные консервирующие растворы обеспечивают стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 19

12. Пример 12

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S13, консервирующий раствор S14 и консервирующий раствор S15, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды, и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты для примера 12 приведены в таблице 20; все исследованные консервирующие растворы обеспечивали стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 20

13. Пример 13

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S16, консервирующий раствор S17 и консервирующий раствор S18, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды, и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты для примера 13 приведены в таблице 21; все исследованные консервирующие растворы обеспечивают стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 21

14. Пример 14

Для каждого консервирующего раствора, анализируемого в данном примере, сушку и анализ повторяли по меньшей мере трижды. Гранулы, приготовленные как в примере 1, помещали либо в консервирующий раствор S1, либо в консервирующий раствор S19, примерно на 20 минут при осторожном перемешивании. Затем гранулы помещали на поддоне в воздушную сушилку при комнатной температуре на примерно 24 ч, чтобы получить полусухие гранулы. Затем полусухие гранулы помещали на примерно 64 ч в эксикатор, который продувался сухим отфильтрованным воздухом. Получали сухие гранулы с водной активностью a_w ≤ 0,3.

В каждом случае жизнеспособность штамма анализировали в течение периода четыре (4) недели в условиях хранения при 4°C, измеряя КОЕ/г в сухих гранулах. Тесты повторяли по меньшей мере трижды, и рассчитывали стандартное отклонение.

Результаты приведены в таблице 22; все исследованные консервирующие растворы обеспечивают стабильность штамма в кормовой добавке в течение по меньшей мере 4 недель в условиях хранения при 4°C.

Таблица 22

15. Пример 15

Этот пример описывает вариант способа получения кормовой добавки в соответствии с воплощением настоящего изобретения. В этом примере бактерии капсулированы в матрице, состоящей из альгината кальция, полученной двумя разными способами получения, а именно в 6-стадийном процессе, описанном в примере 1, или в 4-стадийном процессе, описываемом далее. Альгинатно-кальциевая матрица имеет форму частиц, которые могут иметь неоднородный или однородный средний диаметр в зависимости от применения. Так как гранулы выполнены из жидкой бактериальной культуры как исходного материала, специалисту должно быть понятно, что конечный состав описываемых здесь сухих гранул E.coli может включать компоненты бактериальной питательной среды.

6-стадийный процесс включает следующие стадии:

- стадия 1: получение культур E.coli

- стадия 2: приготовление суспензии бактерии/альгинат

- стадия 3: образование гранул и полимеризация

- стадия 4: промывка гранул

- стадия 5: контактирование с консервирующим раствором

- стадия 6: сушка.

4-стадийный процесс включает следующие стадии:

- стадия 1: получение культур E.coli

- стадия 2: приготовление суспензии бактерии/альгинат

- стадия 3: образование гранул и полимеризация

- стадия 4: сушка.

a. получение культуры E.coli

В этом примере штамм E.coli готовили как в примере 1.

Полученную культуру хранили затем при 4°C в течение 14-18 часов без перемешивания перед использованием для получения кормовой добавки или замораживали до -80°C. До замораживания одну часть культуры смешивали с одной частью консервирующего раствора и одной частью свежей культуральной среды (т.е., в отношении 1:1:1). Консервирующий раствор содержал 15 в/о% мальтодекстрина, 21 в/о% сахарозы и 3 в/о% мононатрий L-глутамата.

b. Встраивание E.coli в матрицу

В следующих абзацах описывается встраивание E.coli в матрицу, путем приготовления сначала альгинатно-бактериальной суспензии и последующего формирования из нее частиц. Описаны два варианта, а именно, 6-стадийный процесс и 4-стадийный процесс.

6-стадийный процесс

Одну часть бактериальной культуры (например, 500 мл) смешивали с 2 частями культуральной среды (например, 1 л) и 3 частями раствора альгината (2 в/о% Grindsted^® Alginate FD155, 0,1 в/о % бактопептон) (например, 1,5 л), чтобы получить суспензию.

Затем суспензию альгината и бактериальной культуры перекачивали через систему, содержащую 27 игл (20G, 0,5 дюйма), снабженную тремя 9-портовыми испарителями Thermo Scientific™ Reacti-Vap™, которая была установлена на скорость, позволяющую жидкости падать каплями в 18-литровую емкость, содержащую 12 литров полимеризационного раствора лактата кальция (300 мМ CaCl₂, 0,1 в/о% бактотриптона, 0,1 в/о% бактопептона и 0,05 в/о% дрожжевого экстракта Bacto™в воде), образуя гранулы. Полимеризационный раствор медленно перемешивали, чтобы гарантировать, что гранулы не разрушатся. После того как вся суспензия альгината и культуры была перенесена в полимеризационный раствор, гранулы дополнительно выдерживали в растворе еще 30 минут при медленном перемешивании, чтобы завершить процесс полимеризации.

После полимеризации, гранулы сцеживали из полимеризационного раствора и замачивали на 10 минут в промывочном растворе (50 мМ CaCl₂).

Гранулы высушивали, взвешивали и выдерживали 20 минут при перемешивании в консервирующем растворе (10 в/о % декстрана 40, 14 в/о % сахарозы, 2 в/о % мононатрий L-глутамата) в соотношении 1 мл раствора на грамм гранул. Наконец, гранулы дренировали и сушили.

Был проведен также дополнительный эксперимент с применением то же способа, но используя только 14 в/о % сахарозы в растворе для замачивания, были получены близкие результаты.

4-стадийный процесс

Одну часть бактериальной культуры (например, 500 мл) смешивали с 1 частью консервирующего раствора (15 в/о% мальтодекстрина, 21 в/о% сахарозы, 3 в/о% мононатрий L-глутамата) (например, 500 мл), 1 часть культуральной среды (например, 500 мл) и 3 части раствора альгината (2 в/о% Grindsted^® Alginate FD155, 0,1 в/о% бактопептона) (например, 1,5 л), чтобы получить суспензию.

Затем суспензию бактериальной культуры в альгинате перекачивали через систему, содержащую 27 игл (20G, 0,5 дюйма), снабженную тремя 9-портовыми испарителями Thermo Scientific™ Reacti-Vap™, которая была установлена на скорость, позволяющую жидкости падать каплями в 18-литровую емкость, содержащую 12 литров полимеризационного раствора лактата кальция (5 в/о % лактата кальция), образовывая гранулы. Полимеризационный раствор медленно перемешивали, чтобы гарантировать, что гранулы не разрушатся. После того как вся суспензия альгината и культуры была перенесена в полимеризационный раствор, гранулы дополнительно выдерживали в растворе от 30 минут до 4 часов при медленном перемешивании, чтобы завершить процесс полимеризации. Наблюдался порошкообразный остаток, содержащий кальций, образующий зернистое покрытие на по меньшей мере части поверхности гранул.

c. Сушка и анализ введенной E.coli

Гранулы помещали на алюминиевый лоток и распределяли так, чтобы получить слой гранул толщиной ≤1,5 см. Затем гранулы сушили на воздухе, как в примере 1. Для расчета потерь на сушку использовали вес гранул перед и после сушки.

Результаты примера 15 сведены в следующих таблицах. Эти результаты демонстрируют, что шестистадийный процесс и четырехстадийный процесс оказывают значительный эффект на жизнеспособность E.coli, введенных в сухую матрицу, и их устойчивость к процессу сушки.

Был разработан 4-стадийный процесс для оптимизации 6-стадийного процесса, позволяющий сэкономить на материалах и снизить продолжительность обработки. Главным требованием было обеспечить выживание бактерий на стадии сушки. Чтобы достичь этого, в 6-стадийном процессе частицы приводили в контакт с консервирующим раствором перед сушкой гранул.

Авторы настоящего изобретения протестировали первый модельный 4-стадийный процесс. В этом модельном 4-стадийном процессе авторы изобретения исследовали, можно ли отказаться от стадии контакта с консервирующим раствором, и вместо этого добавляли консервирующий раствор в суспензию бактерий с альгинатом до формирования гранул и полимеризации. Этот модельный 4-стадийный процесс исследовали с двумя разными консервирующими растворами: первый консервирующий раствор с декстраном 40 и второй консервирующий раствор с мальтодекстрином (вместо декстрана 40). Авторы исследовали также, можно ли отказаться от стадии промывки после полимеризации в хлориде кальция.

Результаты, представленные в таблице 23A, показывают, что в первом модельном 4-стадийном процессе отказ от стадии промывки влечет значительную потерю КОЕ в сухих гранулах.

Хотя сохранение стадии промывки дало лучшие результаты, количество КОЕ в сухих гранулах все еще было ниже, чем для 6-стадийного процесса, более чем на 1 log₁₀ (3,9⋅10⁸ против 5,9⋅10⁹ КОЕ/г в среднем). Первый модельный 4-стадийный процесс, протестированный с декстраном 40, дал результаты, близкие к полученным с мальтодекстрином. Одним из основных различий между гранулами, полученными в первом модельном 4-стадийном процессе, было продолжительность процесса сушки. Действительно, отказ от стадий промывки/контакта с консервантом перед стадией сушки привел к гранулам, которые теряли 92-95% своей массы после сушки. В отличие от этого, в случае, когда процесс включал стадии промывки/контакта с консервантом, полученные гранулы теряли 85% своей массы (таблица 23).

Таблица 23. Результаты по количеству живых E.coli (КОЕ/г сухих гранул) и потере веса гранул при сушке для гранул, полученных в 6-стадийном процессе, и гранул, полученных в 4-стадийном процессе, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Таблица 23A. Результаты по количеству живых E.coli (КОЕ/г сухих гранул) и потере веса гранул при сушке для гранул, полученных в 4-стадийном процессе, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, для оценки влияния выполнения стадии промывки перед стадией сушки

В промышленных условиях способ полимеризации и период времени, когда гранулы находятся в контакте с полимеризационным раствором, могут сильно различаться в процессе производства. Действительно, последовательность обработки может более или менее существенно меняться в зависимости от различных условий, таких как используемое промышленное оборудование и размер партии, влияя, таким образом, на продолжительность обработки, в том числе на продолжительность времени, когда гранулы находятся в контакте с полимеризационным раствором. В одной конкретной практической реализации такая изменчивость может влиять на период времени, требуемый между стадией получения суспензии и стадией выкапывания суспензии из иглы для образования гранул.

Во втором модельном 4-стадийном процессе авторы изобретения исследовали эффект использования разных полимеризационных растворов: первый полимеризационный раствор включал хлорид кальция, а второй полимеризационный раствор включал лактат кальция. Авторы изобретения исследовали также различные времена контакта с полимеризационными растворами, а именно, 1ч, 3ч или 4ч.

Результаты, приведенные в таблице 24, показывают, что во втором модельном 4-стадийном процессе лактат кальция дал лучшие результаты по сравнению с хлоридом кальция, что позволяет предположить, что первый является более подходящим, чем последний при уменьшении числа технологических стадий. Эта разница была более выраженной, когда время полимеризации увеличивали до 3ч, т.е., при увеличении времени контакта с полимеризационным раствором.

Таблица 24. Результаты по количеству живых E.coli (КОЕ/г сухих гранул) и потере веса гранул при сушке для оценки разных полимеризационных растворов (стадия 3) и периода времени, за которым следует или нет стадия вымачивания в растворе сахарозы (стадия 5).

Авторы изобретения исследовали также жизнеспособность бактерий в гранулах при увеличении времени контакта с полимеризационным раствором лактата кальция с 1ч до 4я. Результаты, приведенные в таблице 25, показывают, что на этой стадии не было снижения жизнеспособности, несмотря на увеличение времени контакта до 4ч.

Таблица 25. Результаты по количеству живых E.coli (КОЕ/г гранул) для оценки жизнеспособности бактерий в полимеризационном растворе лактата кальция в течение 4 часов при 25°C.

Авторы изобретения исследовали также жизнеспособность бактерий в суспензии (смесь, содержащая альгинат, бактериальную культуру и консервирующий раствор), чтобы определить, выживут ли бактерии в течение расширенного периода времени в комнатных условиях, если их привести в контакт с элементами суспензии. Было проведено два теста: в первом тесте суспензия включала консервирующий раствор, тогда как во втором тесте суспензия не содержала консервирующего раствора. Суспензию готовили, как описано выше, и выдерживали при перемешивании при 25°C в течение 48 часов. Результаты, приведенные в таблице 26, показывают отсутствие потери бактерий КОЕ через 48 часов контакта бактерий с консервирующим раствором в суспензии, в отличие от случая, когда консервирующего раствора в суспензии не было.

Таблица 26. Результаты по количеству живых E.coli (КОЕ/мл суспензии) для оценки жизнеспособности бактерий E.coli в бактериальных суспензиях в альгинате, одна из которых содержит консервант, приготовленный с мальтодекстрином, а другая является контролем, не содержащим такого консервирующего раствора, после выдерживания в течение 48 часов при 25°C.

Смешение бактериальной культуры с консервирующим раствором перед стадией полимеризации в предложенном 4-стадийном процессе приводит к уменьшению числа стадий по сравнению с предложенным 6-стадийным процессом, тем самым обеспечивая снижение времени промышленного производства, материальных затрат и/или ускоряя выход на рынок. Дополнительно или альтернативно, в некоторых случаях может быть также выгодным реализовать 4-стадийный процесс, когда требуется замораживать культуру E.coli (например, до -20°C или -80°C) в целях хранения и/или транспортировки, таким образом, предоставляя также удобное управление материально-техническими ресурсами по всей производственной цепочке.

Действительно, авторы изобретения проанализировали жизнеспособность бактерий после замораживания при -80°C, выдерживания при -20°C в течение 24 часов и последующего оттаивания и хранения при 4°C в течение 14-дней. Этот тип условий обычно ожидается для крупномасштабного промышленного процесса. Результаты представлены в таблице 28, они показывают, что процесс замораживания-оттаивания не оказывает существенного влияния на жизнеспособность бактерий, когда замораживающая среда содержит консервирующий раствор, т.е., жизнеспособность медленно снижается в течение 14-дневного периода при 4°C с конечной потерей, равной 0,35 log₁₀.

Таблица 28. Результаты по количеству живых E.coli (КОЕ/мл) для оценки жизнеспособности бактерий после смешения с консервантом (приготовленным с мальтодекстрином), замораживания до -80°C, выдерживания при -20°C в течение 24 часов и последующего оттаивания и хранения при 4°C в течение 14 дней.

¹ Этот момент времени соответствует анализу, проведенному с образцом непосредственно перед замораживанием до -80°C

Авторы изобретения исследовали также во времени стабильность бактерий в сухой кормовой добавке, как таковой или находящейся в гранулированном корме для животных (свиней) в условиях хранения при25°C. Фигура 12 показывает, что после 24 недель хранения сухие бактерии в кормовой добавке (гранулы) являются относительно стабильными.

16. Пример 16

В данном примере кормовую добавку вводили в корм для животных в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения. В данном примере авторы показывают, что такой корм можно получить с достаточным числом жизнеспособных непатогенных бактерий E.coli, чтобы получить желаемую пользу от этих E.coli.

В данном примере авторы заявки вводили штамм E.coli, внесенный в Международный депозитарий Канады (IDAC) 21 января 2005 под номером доступа IDAC 210105-01, описанный в патенте US 7981411 (введенном в настоящий документ ссылкой во всей его полноте). Известно, что этот штамм E.coli способствует прибавке в весе животного после интестинальной доставки. Таким образом, цель теста состояла в том, чтобы оценить, защищает ли кормовая добавка по настоящему изобретению в достаточной мере штамм E.coli в процессе грануляции, чтобы поедание гранулированного корма, содержащего кормовую добавку, приводило к введению животному достаточного количества жизнеспособных E.coli, чтобы проявился ожидаемый эффект стимуляции роста.

16.1 Животные

128 поросят с фирмы в Ист-Лотиан, Шотландия. Помесь "Крупной белой" и ландрасов возрастом 28 дней ±2 дня, самцы и самки. Поросята не получали никакой обработки от E.coli в течение последних трех дней перед введением первой диеты. Поросята были здоровыми по прибытии (день 0) и весили от 5,14 кг до 10,04 кг. Животные были пронумерованы индивидуально посредством особой ушной бирки.

16.2 Испытания

Исследование представляло собой контролируемое рандомизированное поисковое исследование с двумя параллельными группами, представляющими собой обработанную группу, получавшую предстартерную диету с исследуемым штаммом, которая сравнивается с контрольной группой, получавшей предстартерную диету без исследуемого штамма.

В день 0 128 поросят рандомизировано разбивали на 2 группы и загоны в соответствии с их весом при отъеме. Для каждой группы было по 16 загонов с 4 животными. Из-за природы активного ингредиента исследуемого штамма, т.е. живого штамма E.coli, группы помещали для обработки в 2 разные помещения (1 помещение на обработку) с одинаковыми внешними условиями. Исследуемый штамм вводили в начале испытания, т.е. в день 0.

16.3 Оцениваемые параметры

В настоящих испытаниях оцениваемыми параметрами были среднесуточный привес (ADG) и средняя прибавка в весе в дни 0 и 7.

Образцы корма собирали для анализа на питательную ценность и для оценки количества бактерий в кормовой добавке путем подсчета количества живых бактерий.

Здоровье поросят отслеживали ежедневно и регистрировали побочные явления и сопутствующие лекарственные препараты. Индивидуальный вес тела измеряли в заданные дни. Количество потребляемого корма и увеличение веса на единицу корма регистрировали по загонам. Ректальные мазки брали в дни 0 и 7 для подтверждения присутствия/отсутствия исследуемого штамма путем ПРЦ-анализа.

16.4 Корм для животных и кормовая добавка

Кормовую добавку получали, как описано в предыдущих примерах, она включала штамм E.coli на уровне 6,6⋅10⁹ КОЕ/г. Эту кормовую добавку хранили в холодильнике при температуре от 2°C до 8°C расфасованной в 250-граммовые упаковки в виде полиэтиленовых мешочков на молнии.

Корм для животных имел концентрацию штамма E.coli 5,4⋅10⁸ КОЕ/200 г. Этот тестируемый корм называется также предстартерной диетой. Контрольный продукт представлял собой предстартерную диету без кормовой добавки.

16.5 Введение

Штамм вводили посредством предстартерной диеты (первое кормление) в отношении 760 г/т. Предстартерную диету не дополняли альтернативными противомикробными препаратами и стимуляторами усиления противомикробных свойств (AGP) (органические кислоты/соли, высокие уровни Cu/Zn и т.д.).

Предстартерную диету задавали 7 дней (с 0 до 7 день исследования).

16.6 Результаты

Анализы подтвердили присутствие и установили количество активного ингредиента в животном корме в предстартерной диете. Исследуемый штамм был детектирован посредством ПЦР в экскрементах всех свиней обработанной группы и не был обнаружен ни у одной свиньи из контрольной группы.

Как видно из таблицы 29, во время испытания через 7 дней потребления корма, включающего штамм E.coli в кормовой добавке, обработанные свиньи имели прибавку в весе более 143 г (21 г в день) по сравнению с необработанными свиньями (p=0,044). Необработанные данные показаны на фигурах 17A-17P и должны быть прочитаны, как показано на фигуре 17.

Таблица 29. Прибавка в весе животных (в кг)

16.7 Анализ и выводы

Проводили исследование по методу Стьюдента, предполагая неравные отклонения между двумя популяциями. Расчетное t-значение было достаточно высоким, чтобы отвергнуть нулевую гипотезу (т.е., что не имеется существенной разницы между этими двумя популяциями), т.е. t_Stat > t_Critical для двустороннего критерия с p-значением=0,044. Затем рассчитывали стандартную ошибку для каждой популяции, одна стандартная ошибка показана на соответствующих диаграммах на фигурах 13 и 14.

Фигура 13 показывает неограничивающую гистограмму, показывающую среднюю прибавку в весе (кг) через 7 кормления свиней кормом, включающим кормовую добавку по одному варианту осуществления настоящего изобретения (IP), и кормом без кормовой добавки (CP). Планка погрешностей показывает стандартную ошибку (p=0,044). Фигура 14 показывает неограничивающую гистограмму, показывающую средний суточный привес (г/сут) в течение 7 дней для свиней с фигуры 13. Планка погрешностей показывает стандартную ошибку (p=0,044).

Этот эффект согласуется с эффектом, ожидаемым после введения этого штамма поросенку с питьевой водой, как описано в патенте US 7981411 (введен в настоящий документ ссылкой во всей его полноте). Другими словами, описанный здесь корм для животных, включающий E.coli в кормовой добавке, содержит достаточное количество жизнеспособных E.coli, которые, по-видимому, существенно не пострадали от жестких условий, применяемых при получении гранулированных кормов.

Отметим, что все заголовки или подзаголовки могут использоваться во всем настоящем описании для удобства читателя, но они никоим образом не должны ограничивать объем изобретения. Кроме того, некоторые теории, предлагавшиеся и описанные в настоящем описании, независимо от того, правильны они или ложны, никоим образом не должны ограничивать объем изобретения, поскольку изобретение осуществляется на практике согласно настоящему описанию безотносительно какой-либо конкретной теории или схемы действий.

Все ссылки, приведенные в описании, тем самым включены ссылкой во всей их полноте для любых целей.

Специалисту должно быть понятно, что во всем настоящем описании выражение, использующееся в единственном числе, охватывает варианты осуществления, содержащие одно или более значений, к которым относится данное выражение. Специалист должен также понимать, что во всем настоящем описании термин "содержащий", являющийся синонимом терминов "включающий", "имеющий" или "характеризующийся", является инклюзивным или незамкнутым и не исключает дополнительных, не перечисленных элементов или стадий способа.

Если не определено иное, все использовавшиеся в настоящем описании технические и научные термины имеют значение, общепринятое у специалистов среднего уровня в области, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта приоритет будет иметь настоящий документ, включая определения.

Использующиеся в настоящем описании выражения "около", "примерно" или "приблизительно" должны, как правило, пониматься как означающие "в пределах погрешности", обычно допустимой в данной области. Следовательно, приводимые здесь численные значения обычно включают такую допустимую погрешность, так что выражения "около", "примерно" или "приблизительно" могут подразумеваться, даже если они не утверждаются явно.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано на некоторых вариантах осуществления, возможны модификации и уточнения, которые должны стать очевидными для специалистов в данной области в свете принципов настоящего изобретения.

Реферат

Заявленная группа изобретений относится к кормопроизводству, в частности к кондиционированному паром экструдированному гранулированному корму для животных и способу его получения. Корм содержит агломерированные корма для животных и кормовую добавку. Причем кормовая добавка содержит жизнеспособные непатогенные бактерии E.coli, матрицу, где жизнеспособность бактерий E.coli поддерживается экструзией с кондиционированием паром. E.coli включены в поры матрицы. Матрица содержит гидроколлоид-образующий полисахарид, где гидроколлоид-образующий полисахарид является первым полисахаридом. Причем матрица дополнительно содержит второй полисахарид, отличающийся от первого полисахарида, где второй полисахарид включает мальтодекстрин, декстран или их комбинацию. Использование группы изобретений позволит увеличить привес массы тела животных. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 29 табл., 16 пр., 17 ил.

Формула