Синбиотическая композиция для детей - RU2373769C2

Чертежи

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим пробиотик и пребиотик, для младенцев, в особенности не получающих грудного кормления.

Предшествующий уровень техники

Младенцы не имеют кишечной флоры при рождении. В результате контакта с матерью при рождении и последующего грудного кормления происходит быстрое развитие и разрастание кишечной флоры. В ходе развития кишечная флора остается незрелой, находящейся в хрупком равновесии с окружающей средой, предрасположенной к быстрым изменениям и, следовательно, к заболеваниям, и поражению в присутствии патогенов. Известно, что младенцы, вскармливаемые грудью, в меньшей мере подвержены инфекциям или болезням, чем дети, получающие искусственное питание. Следовательно, младенцы, вскормленные грудью, менее подвержены желудочно-кишечным инфекциям в том, что касается как заболеваемости, так и длительности болезни, у них реже наблюдаются такие атопические заболевания, как аллергия, экзема, аллергическая астма, и они реже подвержены запорам, чем младенцы, получающие негрудное питание. Обычно кишечная флора младенцев, получающих грудное питание, главным образом, состоит из бифидобактерий и молочнокислых бактерий. Грудное молоко содержит олигосахариды материнского молока (НМО), являющиеся фактором роста для бифидобактерий в кишечнике младенцев. Флора младенцев, питающихся молочной смесью, более разнообразна и содержит обычно большее число видов Bacteroides, Clostridium и Enterobacteriaceae. В организме младенцев, получающих молочную смесь, содержится от одной десятой до двух третей от количества бифидобактерий в организме младенцев, получающих грудное питание. Считается, что бифидобактерии являются важными микроорганизмами, способствующими поддержанию хорошо сбалансированной кишечной микрофлоры, и постулируется, что бифидобактерии оказывают оздоровляющее действие, включающее профилактику и/или лечение диареи и кишечных инфекций. Кроме того, показано, что бифидобактерии играют определенную роль в иммунной системе хозяина.

Кишечная флора детей может быть модифицирована изменением состава питания путем потребления пробиотиков или пребиотиков. В качестве примера пробиотического подхода в EP-A-0904784 описано применение смеси штаммов микроорганизмов, включающей штаммы Bifidobacterium. Однако связанная с этим проблема состоит в том, что смесь микробов, обеспечивая некоторое полезное воздействие на здоровье, также может оказывать вредное действие на все еще незрелую кишечную флору младенцев, получающих искусственное питание, что связано с широким спектром действия такой смеси. Кроме того, многие пробиотические добавки имеют короткий срок годности и содержат слишком мало живых микроорганизмов, в результате чего они не способны оказывать ожидаемое пробиотическое действие.

Пребиотики определяются как неусваиваемые пищевые ингредиенты, которые селективно стимулируют рост и/или активность одной или более бактерий, находящихся в толстой кишке и в результате этого оказывают благоприятное влияние на хозяина (Gibson and Roberfroid, J. Nutr. 125:1401-1412, 1995). Предпочтительный путь улучшения кишечной флоры искусственно вскормленных детей заключается в стимуляции бифидобактерий, уже присутствующих в кишечнике детей, получающих искусственное питание, специфическими неперевариваемыми олигосахаридами, т.е. пребиотиками. Также в качестве пребиотиков была предложена смесь олигосахаридов и полисахаридов, например, согласно WO 00/08948. Примером такой смеси может служить комбинация галактоолигосахаридов с фруктополисахаридами. Было показано, что уровень содержания бифидобактерий в организме младенцев, питающихся молочной смесью, содержащей эти пребиотики, оказался выше, чем в случае питания стандартной молочной смесью (см. Moro et al., J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34:291-295, 2002).

Существующий до настоящего времени подход состоял в общей стимуляции бифидобактерий, т.е. на уровне рода. Род Bifidobacterium состоит из множества различных видов, отличающихся по метаболизму, ферментной активности, утилизации олиго- и полисахаридов, составу клеточной оболочки и взаимодействию с иммунной системой хозяина. В связи с этим можно ожидать, что не каждый вид Bifidobacterium оказывает одинаковое функциональное действие на ребенка. Примерами различных видов Bifidobacterium могут служить B. longum, B. breve, B. infantis, B. adolescentis, B. bifidum, B. animalis и B. dentium. Вид B.adolescentis превалирует во флоре взрослых людей и редко встречается в кале здоровых младенцев и детей. B. animalis и B. lactis не встречаются у людей, и B. dentium представляет собой патогенную бактерию. У здоровых младенцев бифидобактериальная флора в основном состоит из Bifidobacteriuminfantis, B. breve и B. longum. Kalliomaki et al. (Cur Opin Allergy Clin Immunol. 2003 Feb; 3(1):15-20 и цитированные там ссылки) сообщили, что страдающие аллергией младенцы имеют Bifidobacterium флору, подобную взрослым, тогда как типично детская Bifidobacterium флора была обнаружена у здоровых детей, что указывает на корреляцию между наличием некоторых видов Bifidobacterium и вероятностью развития аллергии. Эти результаты указывают на то, что стимуляция рода Bifidobacterium в толстой кишке ребенка может оказаться недостаточной. Целью изобретения является обеспечение у младенцев, получающих искусственное питание, флоры, напоминающей флору детей, вскормленных грудью, на уровне вида.

В настоящем изобретении термин «ребенок, вскормленный грудью», относится к младенцам, получающим исключительно материнское молоко. Термин «ребенок, не вскормленный или частично вскормленный грудью», относится к младенцам, не получающим или не исключительно получающим материнское молоко. Такое определение относится к младенцам, которые получают, по меньшей мере, содержимое бутылочки искусственного питания в день, т.е., по меньшей мере, 80 мл молочной смеси в день, остальное питание, если оно имеется, обеспечивается твердой пищей или жидкой пищей, такой как материнское молоко, т.е. определение относится к младенцам, частично питающимся материнским молоком.

Сущность изобретения

Обнаружено, что повышение уровня содержания Bifidobacterium при использовании смесей неусваиваемых углеводов также регулирует популяцию Bifidobacterium в сторону популяции, более подобной детской, т.е. обедненной B. catenulatum, B. pseudocatenulatum и B. adolescentis, тогда как младенцы, питающиеся стандартной молочной смесью, имеют флору, в большей мере подобную взрослым, в которой доминируют B. catenulatum, B. pseudocatenulatum и B. adolescentis. Также обнаружено, что популяция Bifidobacterium у младенцев, питание которых включает пребиотики, содержит недостаточное количество одного конкретного микроорганизма, а именно Bifidobacterium breve.

В соответствии с одним аспектом изобретение предусматривает препарат, содержащий Bifidobacterium breve и смесь неусваиваемых углеводных пребиотиков. Обнаружено, что такой препарат полезен и очень подходит для регулирования популяции Bifidobacterium на уровне видов в желудочно-кишечном тракте детей. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что добавление других видов Bifidobacterium, помимо B. breve, не является обязательным, поскольку уже проведена достаточная регуляция самим препаратом.

Согласно другому аспекту изобретение предусматривает препарат, содержащий Bifidobacterium breve и смесь неусваиваемых углеводных пребиотиков, которая содержит, по меньшей мере, два различных, достаточно растворимых углеводных компонентов А и В.

Другой аспект изобретения предусматривает применение препарата для детей, не получающих полностью или частично грудное питание.

Согласно еще одному аспекту изобретение предусматривает применение препарата для производства композиции, предназначенной для регулирования популяции видов Bifidobacterium в желудочно-кишечном тракте детей, не получающих полностью или частично грудное питание.

Согласно еще одному аспекту изобретение предусматривает применение препарата для производства композиции, предназначенной для профилактики или лечения состояния иммунной системы.

Согласно другому аспекту изобретение предусматривает применение смеси углеводов для регулирования популяции Bifidobacteriumcatenulatum, B. pseudocatenulatum и/или Bifidobacterium adolescentis в желудочно-кишечном тракте детей, не получающих полностью или частично грудное питание.

Согласно еще одному аспекту изобретение предусматривает способ видоспецифичного детектирования и количественного определения видов рода Bifidobacterium, обнаруженных в организме человека, в особенности детей, а также диагностический набор для обнаружения и количественного определения видов Bifidobacterium.

Подробное описание изобретения

Препарат

1) Bifidobacterium breve

Bifidobacterium breve является необходимым ингредиентом изобретения. Методом определения, предложенным авторами, было обнаружено, что эта бактерия присутствует в ограниченных количествах у младенцев, получающих искусственное питание. Соответственно, введение этой бактерии совместно со смесью углеводов позволяет нормализовать популяцию видов Bifidobacterium до уровня, эквивалентного тому, который имеется в желудочно-кишечном тракте ребенка, вскармливаемого грудью.

Предпочтительные штаммы Bifidobacterium breve могут быть выбраны из изолятов кала здоровых младенцев, вскармливаемых грудью. Обычно эти штаммы коммерчески доступны от производителей молочнокислых бактерий, но они могут быть непосредственно выделены из кала, идентифицированы, охарактеризованы и продуцированы. Примерами коммерчески доступного B. breve может служить B. breve Bb-03 от Rhodia, B. breve MV-16 от Morinaga и B. breve от Institut Rossel, Lallemad, но B. breve также может быть получен из таких коллекций культур, как DSM 20091 и LMG 11613.

Количество B. breve в препарате изобретения основывается на общем количестве растворимых неусваиваемых углеводов и предпочтительно составляет 10⁷-10¹¹, более предпочтительно 10⁸-10¹⁰ cfu (колониеобразующих единиц) бактерий на г общего количества углеводов. В том случае, когда препарат применяют в качестве добавки, предпочтительно, чтобы Bifidobacterium breve присутствовал в количестве 1·10⁶-1,5·10¹¹ cfu/г, предпочтительно 3·10⁷-5·10¹⁰ cfu/г, более предпочтительно 5·10⁸-1·10¹⁰ cfu/г. В случае применения препарата в качестве (полного) детского питания, наиболее предпочтительно, чтобы количество B. breve в пище составляло 1·10⁴-1·10¹⁰ cfu/г, предпочтительно 5·10⁶-3·10⁹ cfu/г, более предпочтительно 1·10⁷-5·10⁸ cfu/г детского питания. Эту концентрацию выбирают таким образом, чтобы суточная доза составляла 1·10⁶-1,5·10¹¹ cfu/г, предпочтительно 3·10⁷-5·10¹⁰ cfu/г, более предпочтительно 5·10⁸-1·10¹⁰ cfu/г.

2) Смесь неусваиваемых углеводных пребиотиков

Смесь неусваиваемых углеводных пребиотиков также является существенным элементом изобретения. Термин «неусваиваемые» означает, что углеводы в желудочно-кишечном тракте остаются непереваренными и попадают в толстую кишку в нересорбированной форме.

Согласно изобретению смесь неперевариваемых углеводов содержит, по меньшей мере, два различных, достаточно растворимых углеводных компонента А и В, которые не перевариваются в желудочно-кишечном тракте и попадают в толстую кишку в нересорбированном виде. Смесь углеводов согласно изобретению также может состоять исключительно из этих двух углеводных компонентов А и В.

В смеси, по меньшей мере, из двух неусваиваемых растворимых углеводных компонентов А и В углеводный компонент А присутствует в количестве 5-95% мас. от суммы углеводных компонентов А и В. Более того, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 75% от общего количества неусваиваемых растворимых углеводов компонентов А и В выбирают из дисахаридов вплоть до эйкозасахаридов (полисахариды, содержащие 20 моносахаридных звеньев); оставшееся количество может относиться к неусваиваемым моносахаридам и неусваиваемым полисахаридам, содержащим более 20 звеньев. Также предпочтительно, чтобы более 95%, предпочтительно более 98% от общего количества растворимых неусваиваемых углеводов имели длину цепи не более 100 звеньев. При указании в описании процентных и средних значений подразумеваются массовые проценты и средние значения, кроме очевидного использования другого базиса или особо оговоренных случаев.

Углеводы в компонентах могут различаться в трех аспектах:

(i) по (среднему) числу моносахаридных звеньев в углеводе, причем средняя длина цепи компонента А, по меньшей мере, на 5 моносахаридных звеньев короче, чем средняя длина цепи компонента В; это означает, что если углеводы А и В содержат одинаковые структурные звенья, т.е. образуют смесь гомологов, отличающихся только длиной цепи, то распределение гомологов должно иметь два максимума, один из которых соответствует значению менее 7, а другой более 7, причем два таких максимума расположены на расстоянии, по меньшей мере, 5 звеньев друг от друга; в этом случае углеводы, содержащие до 6 звеньев (гексасахариды) составляют часть компонента А, а углеводы из 7 звеньев (гептасахариды) являются частью компонента В;

(ii) по структуре моносахаридных звеньев углевода, причем компонент А построен из различных структурных звеньев компонента В; в том случае, когда А и/или В построены из повторяющихся комбинаций различных моносахаридных звеньев, например, в случае галактоманнанов и арабиногалактанов, по меньшей мере, 50% моносахаридных звеньев указанных двух компонентов должны отличаться друг от друга (в приведенном выше примере или один, или оба компонента должны содержать менее 50% ангидрогалактозных звеньев);

(iii) оба компонента А и В отличаются друг от друга по (средней) длине цепи и структуре; такое воплощение является предпочтительным.

Предпочтительно, компонент А выбирают из неусваиваемых моносахаридов вплоть до гексасахаридов одинаковой углеводной структуры, а компонент В выбирают из гептасахаридов и высших полисахаридов с одинаковой углеводной структурой. Таким образом, углеводный компонент А состоит, по меньшей мере, из одного неусваиваемого моносахарида или, по меньшей мере, одного неусваиваемого олигосахарида. Под термином «олигосахариды» понимают углеводы, содержащие от 2 до 6 моносахаридных звеньев включительно. Предпочтительно, углеводный компонент А также может быть образован смесью двух или более указанных сахаридов. Следовательно, он может состоять из любого числа моносахаридов и/или олигосахаридов такого типа, т.е. одинаковой структуры.

Согласно такому предпочтительному варианту осуществления углеводный компонент В состоит, по меньшей мере, из одного полисахарида, включающего 7 или более моносахаридных звеньев. Под термином «полисахариды» понимают углеводы, начиная от гептасахарида (например, гептасахарид, октасахарид, нонасахарид, декасахарид и т.д.). Верхний предел длины цепи полисахаридов специально не оговаривается, и они могут иметь длину в несколько сотен и даже несколько тысяч моносахаридных звеньев. Однако согласно изобретению цепи длиной более 100 (около 16 кДа), особенно более 700 (около 100 кДа) менее предпочтительны. Предпочтительно, компонент В содержит не более 5% или даже не более 2% гомологов, состоящих из более чем 100 моносахаридных звеньев. Углеводный компонент В также должен состоять лишь из одного полисахарида такого типа или, предпочтительно, из двух или более полисахаридов указанного типа с различной длиной цепи, т.е. имеющих одинаковую структуру.

Углеводный компонент А составляет до 95% мас. от суммарного количества углеводного компонента А и углеводного компонента В (А+В=100% мас.). Углеводный компонент В составляет 5-95% мас. от суммарного количества углеводного компонента А и углеводного компонента В. Согласно предпочтительному варианту осуществления количество компонента А составляет 95-60% мас., предпочтительно 95-80% мас. и особенно предпочтительно 95-90% мас., и количество компонента В составляет 5-40% мас., предпочтительно 5-20% мас. и особенно предпочтительно 5-10% мас. от суммарного количества углеводов, при условии, что А+В=100% мас.

Термин «растворимый углевод» в контексте изобретения относится к углеводам с растворимостью, по меньшей мере, 50% согласно методу, описанному L.Prosky et al., J.Assoc. Anal. Chem. 71:1017-1023, 1988.

По меньшей мере, 80% углеводов или сахаридов из суммы углеводных компонентов А и В обладают пребиотическим действием. Предпочтительно, по меньшей мере, 80% углеводов, входящих в состав углеводного компонента А, а также, по меньшей мере, 80% углеводов, относящихся к углеводу В, проявляют пребиотический эффект. Другими словами, предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, 80% мас. каждого углевода или сахарида из углеводных компонентов А и В достигали толстой кишки в неусваиваемом (следовательно, не способном к поглощению в тонких кишках) состоянии. Таким образом, рассматриваемые углеводы или сахариды углеводных компонентов А и В, находящиеся в желудочно-кишечном тракте, не поглощаются и не перевариваются в желудке или тонких кишках, и попадают в толстую кишку в неизмененном виде.

Согласно изобретению термин «пребиотически активный углевод» относится к углеводу, который попадает в толстую кишку в непереваренном виде (и, следовательно, не поглощается в тонких кишках), и селективно стимулирует рост и/или активность одного или ограниченного числа бактериальных видов, присутствующих в кишечнике, и, таким образом, способствует сохранению здоровья. Рассматриваемый пребиотический эффект таких углеводов и специфические механизмы их действия подробно описаны в работе “G.F. Gibson & M.B. Roberfroid, J. Nutr. 1995; 125: 1401-1412”, на которую специально сделана ссылка и содержание которой включено в настоящее описание.

Максимальное количество пребиотически неактивных углеводов или сахаридов в углеводных компонентах А и В составляет 20%. Такие углеводы или сахариды относятся к растворимым веществам, которые могут быть выделены в непереваренной форме. Такие углеводы способны производить физический эффект, состоящий, например, в увеличении объема фекалий или ускоренном поглощении воды.

Для оценки соотношения углеводных компонентов А и В в диетическом или фармацевтическом продукте осуществляли следующие стадии. На первой стадии растворимые углеводы экстрагировали из продукта водой. Жиры и белки удаляли из экстракта. На второй стадии растворимые углеводы или экстракт, соответственно, отрабатывали человеческими ферментами, например человеческой амилазой, соком поджелудочной железы или препаратами реснитчатого края клеток тонких кишок. В результате получали неусваиваемые углеводы (за исключением in vivo поглощаемых моносахаридов, полученных в эксперименте in vitro), представляющие собой два углеводных компонента А и В. Предполагается, что 80% от их количества обладает пребиотической активностью.

Таким образом, смеси углеводов, предназначенные для применения в препарате изобретения, представляют собой смеси, в которых углеводы, растворимые и неусваиваемые в описанном выше смысле, удовлетворяют указанному выше критерию и составляют компоненты А и В.

Углеводный компонент А может состоять, например, из одного или нескольких следующих углеводов: β-галактоолигосахаридов,

α-галактоолигосахаридов, фруктоолигосахаридов,

инулоолигосахаридов, фукоолигосахаридов, манноолигосахаридов,

ксилоолигосахаридов, сиалилолигосахаридов,

N-гликопротеинолигосахаридов, О-гликопротеинолигосахаридов,

гликолипидолигосахаридов, целоолигосахаридов,

хитозанолигосахаридов, хитинолигосахаридов,

галактуронолигосахаридов, глюкуроноолигосахаридов,

β-глюкан (например, 1,3-) олигосахаридов,

арабиноксилоолигосахаридов, арабиногалактоолигосахаридов,

ксилоглюкоолигосахаридов, галактоманноолигосахаридов,

рамноолигосахаридов,

соевых олигосахаридов (стахиоза, раффиноза, вербаскоза) и

лакто-N-неотетраоз, и углеводный компонент В может, например, включать один или более следующих углеводов или сахаридов, таких как фрукт(оз)аны, включая инулины, галактаны, фукоиданы, арабинаны, ксиланы, ксантаны, β-глюканы, неусваиваемая полидекстроза, неусваиваемый мальтодекстрин, галактуронаны, N-гликаны, О-гликаны, гиалуроновая кислота, хондроитины, ксилоглюканы, арабиногалактаны, гуммиарабик, альгинаты, каррагенаны, галактоманнаны, глюкоманнаны, арабиноксиланы, гликолипидгликаны, гликопротеингликаны, протеогликаны, соевые полисахариды. Следует отметить, что усваиваемые углеводы не являются частью компонентов А и В. Так, глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, лактоза, мальтоза и мальтодекстрины не входят в состав указанных компонентов даже в том случае, если они являются низшими гомологами галактоолигосахаридов, фруктоолигосахаридов, (инулин) и т.п. Неусваиваемые углеводы изобретения, как правило, не содержат значительных количеств глюкозных звеньев, связанных по альфа 1,4 и/или альфа 1,6 положениям, как в производных крахмала, поскольку такие углеводы являются усваиваемыми. Однако некоторые полисахариды и мальтодекстрины крахмального типа могут стать неусваиваемыми или «устойчивыми» с помощью физических и ферментативных способов; такие олиго- и полисахариды охватываются настоящим изобретением до тех пор, пока они обладают существенной растворимостью.

В результате селективной комбинации олигосахаридов и полисахаридов и одновременного присутствия углеводных компонентов А и В в толстой кишке могут стимулироваться положительно влияющие на здоровье микроорганизмы и/или могут подавляться патогенные микроорганизмы, причем такие воздействия осуществляются значительно более эффективно, чем при применении только одного из указанных углеводных компонентов. При введении углеводной комбинации можно обеспечить очень быструю нормализацию флоры толстой кишки с целью ее поддержания или профилактики изменения кишечной флоры при различных стрессовых ситуациях и, таким образом, влиять на колонии бактерий в толстой кишке таким способом, который более эффективен, чем при использовании ранее известных углеводов.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, по меньшей мере, 80% мас. углеводного компонента А, а также углеводного компонента В, входят в состав углеводов, которые являются бифидогенными и/или стимулируют молочнокислые бактерии. Как было неожиданно обнаружено, в результате использования комбинации олигосахаридов и полисахаридов, обладающей указанными выше свойствами, может стимулироваться более сильное воздействие на рост молочнокислых бактерий, чем в случае олигосахаридов или полисахаридов в отдельности. В результате стимулируются не только те молочнокислые бактерии, которые естественно присутствуют в кишечнике, но также оказывается стимулирующее, иногда селективное, воздействие на рост экзогенно вводимых бактерий.

Помимо рассматриваемого непрямого воздействия через сами бактерии и их метаболиты, такие как органические кислоты (ацетаты, лактаты и т.п.), изменение рН и стимулирование колонизатов, также оказывается непосредственное положительное физическое действие на перистальтику, содержание воды, количество фекалий и механическое воздействие на слизистую оболочку кишечника.

Таким образом, углеводные смеси характеризуются не только питательным действием, но также широким спектром активности. Помимо описанных выше биологических эффектов, с помощью смесей настоящего изобретения могут достигаться следующие эффекты: стабилизация естественной микрофлоры, профилактика срастания патогенных веществ/организмов, таких как токсины, вирусы, бактерии, грибки, трансформированные клетки и паразиты, растворение комплексов токсинов, вирусов, бактерий, грибков и других патогенов, содержащих эндогенные клетки, а также их удаление из организма и ускорение заживления ран.

Таким образом, рассматриваемые смеси могут применяться для профилактики и/или лечения симптомов или заболеваний, связанных с нарушением кишечной флоры, например, являющейся следствием ассоциации или адгезии указанных веществ и организмов с эпителием или другими эндогенными клетками.

Обнаружено, что углеводные смеси особенно эффективны в том случае, когда углеводный компонент А имеет структуру, отличающуюся от структуры компонента В. Такая различная структура может быть связана, например, с составом моносахаридов, когда, с одной стороны, используют фруктаны, а с другой - галактаны. Кроме того, структурные отличия могут быть связаны с характером гликозидной связи (например, отличия между связями в α-галактоолигасахаридах и β-галактоолигасахаридах, или в α-глюканах (крахмал) и β-глюканах (целлюлоза)). Состав мономеров, а также характер гликозидной связи могут оказывать влияние на химические свойства (например, растворимость) или физиологические характеристики (например, перевариваемость).

Следует иметь в виду, что углеводы одинакового строения являются гомологами, которые могут отличаться длиной цепи, но состоят из одинаковых моносахаридных звеньев или их комбинаций. Как правило, последующий гомолог отличается от предыдущего добавлением одного моносахаридного звена, присутствующего в предыдущем гомологе. Тем не менее, одно звено, обычно концевое, может быть другим, как это имеет место в некоторых фруктанах, содержащих цепь из (ангидро)фруктозных звеньев с концевым глюкозным звеном.

Предпочтительно, чтобы длина полисахаридной цепи компонента В или средневзвешенная длина цепи в случае смеси полисахаридов была, по меньшей мере, на три, предпочтительно, по меньшей мере, на пять звеньев больше длины олигосахаридной цепи компонента А или средневзвешенной длины цепи смеси олигосахаридов. Предпочтительно, чтобы средняя длина цепи олигосахаридов А составляла 2-6 звеньев, а средняя длина цепи полисахаридов В составляла 7-30 звеньев, более предпочтительно 8-20 звеньев. В случае присутствия как олигосахаридов, так и полисахаридов одинакового строения, углеводы такой структуры рассматриваются как компонент А в том случае, когда средневзвешенная длина цепи имеет значение менее 6,5, и индивидуальные элементы с длиной цепи 7 и выше не относятся к компоненту А; с другой стороны, они рассматриваются как компонент В в том случае, когда средневзвешенная длина цепи имеет значение около 6,5 и в этом случае индивидуальные компоненты с длиной цепи 6 и ниже не относятся к компоненту В. В случае наличия олигосахаридов и полисахаридов одинакового строения в отсутствие сахаридов иной структуры должно существовать два максимума с каждой стороны от 7 звеньев, или иначе, как разъяснялось выше, не удовлетворяется условие наличия двух различных углеводных компонентов.

В таких углеводах inter alia может наблюдаться существенная часть смесей. При введении смесей углеводов различного размера и/или различных «классов», либо «структур» может наблюдаться синергетический эффект, по сравнению с пребиотическим действием веществ группы А и В в отдельности.

Углеводы компонента А могут принадлежать к одному классу соединений, но также могут состоять из нескольких классов (например, А может представлять собой смесь галактоолигосахаридов и фукоолигосахаридов), тогда как углеводы компонента В в равной степени могут происходить из соединений одного или нескольких классов (например, В может представлять собой смесь инулина с ксиланами).

Предпочтительная углеводная смесь состоит из галактоолигосахаридов и инулина.

Особенно эффективные смеси содержат, по меньшей мере, 60% мас., предпочтительно 80-100% мас. углеводных компонентов А, принадлежащих к группе галактоолигосахаридов. Предпочтительные смеси также могут содержать, по меньшей мере, 60% мас., предпочтительно 80-100% мас. углеводных компонентов В, принадлежащих к группе фруктополисахаридов. Для получения углеводных смесей могут использоваться известные углеводы и их смеси, применяемые для производства пищи или пищевых продуктов. Также можно использовать сырье, предварительно модифицированное специальными методами. Получение смесей может реализоваться в результате простого смешивания соответствующим образом выбранных углеводов или олигосахаридов с полисахаридами или смесями углеводов. Исходные компоненты должны смешиваться друг с другом таким образом, чтобы соответствовать параметрам готовых смесей. В качестве сырья могут использоваться резервные углеводы (фруктаны, галактоолигосахариды бобовых культур, фукоидан, α-глюкан, ламинарин, каррагенан, мананны, галактоманнаны, агар), природная смола, углеводы гликопротеинов с N-гликозидной связью, углеводы гликопротеинов с О-гликозидной связью, гликаны гликолипидов, углеводы, полученные ферментацией (галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды, фруктоолигосахариды, ксилоолигосахариды), бактериальные углеводы (такие как ксантаны), а также олигосахариды (галактоолигосахариды, глюкоолигосахариды (с α 1-2 и α 1-3 глюкозными остатками), ксилоолигосахариды), а также скелетные углеводы, такие как целлюлоза, гемицеллюлоза (арабинаны, галактаны), пектины и хитины. Предпочтительно, чтобы такие вещества были пищевой степени чистоты (Complex Carbohydrates in Foods, British Nutrition Foundation; Chapman & Hall, London 1990).

Также возможно проведение ферментативной модификации сырья и продуктов с помощью гидролаз (например, глюкозидаз, трансгликозидаз и липаз), трансфераз, изомераз (например, альдолаз и кетолаз), оксидоредуктаз (например, оксидаз) и редуктаз (например, глюкозагидрогеназ), лиаз (например, полисахаридных лиаз) и лигаз. Кроме того, можно осуществлять технологическую модификацию сырья и продуктов посредством воздействия давления (например, при экструзии), температуры (например, при карамелизации), с помощью органических синтезов, органической модификации (например, карбоксиметилирование и перацетилирование), кислотного и/или основного гидролиза и фракционирования (например, по размеру и/или физико-химическим параметрам, таким как заряд и гидрофобность) или используя комбинацию модификаций.

Таким образом, углеводные смеси состоят, по существу, из следующих ниже моносахаридов и состоящих из них олигосахаридов и полисахаридов: D-глюкоза, D-фруктоза, D-галактоза, D-манноза, L-фукоза, D-N-ацетилглюкозамин, D-N-ацетилгалактозамин, D-ксилоза, L-рамноза, D-арабиноза, D-аллоза, D-талоза, L-идоза, D-рибоза, а также моносахариды, содержащие карбоксильные группы, такие как D-галакторуновая кислота, D-глюкуроновая кислота, D-маннуроновая кислота и/или их метилированные формы, такие как N-ацетилнейраминовая кислота, N-гликолилнейраминовая кислота и/или их О-ацетилированные производные. Кроме того, рассматриваемые мономеры и высшие звенья на их основе могут быть модифицированы группами -OSO₃H и/или OPO₃H.

Неусваиваемые углеводы согласно изобретению обычно применяют с суточной дозой 0,5-30 г, предпочтительно 2-15 г, более предпочтительно 3-9 г. Предпочтительно вводить препарат в виде добавки. Такая добавка подходит для приема детьми, получающими искусственное питание или частично грудное питание, включая недоношенных и доношенных детей, получающих искусственное или частично грудное питание.

Рассматриваемый препарат также может использоваться в качестве детского питания. В этом случае детское питание согласно изобретению дополнительно включает один или несколько ингредиентов, выбранных из усваиваемого углевода, источника липидов, источника белков и их смесей.

3) Прочие компоненты

Помимо углеводных компонентов А и В также могут присутствовать другие углеводы. К ним относятся 1) перевариваемые углеводы, которые усваиваются, как описано выше, и 2) нерастворимые углеводы, способные поглощаться/усваиваться, и даже те, которые не способны к ресорбции/перевариванию. Типичные нерастворимые, неперевариваемые углеводы, предназначенные для использования в качестве добавок к детскому питанию, представляют собой соевые полисахариды, а также устойчивый крахмал, целлюлозу и гемицеллюлозу; наиболее предпочтительные материалы выбирают из полисахаридов и устойчивого крахмала.

Типичные растворимые и усваиваемые углеводы, предназначенные для применения в качестве добавок к детскому питанию, выбирают из мальтодекстринов, крахмала, лактозы, мальтозы, глюкозы, фруктозы и сахарозы, и других моно- и дисахаридов, более предпочтительно из мальтодекстрина, лактозы, мальтозы, глюкозы, фруктозы, сахарозы и их смесей.

Помимо углеводных компонентов А и В, такие углеводы, пронумерованные как подпункты 1) и 2), могут присутствовать в смеси, как таковые, в любом произвольном количестве, причем в каждом случае в зависимости от желаемого конечного продукта. Предпочтительно, чтобы нерастворимые углеводы составляли 0-10% мас. от количества углеводных смесей.

Типичные ингредиенты, используемые в качестве источника липидов в пищевых добавках к детскому питанию, могут представлять собой любой липид или жир, подходящий для применения в детском питании. Предпочтительные источники липидов включают молочные жиры, подсолнечное масло, липид яичного желтка, масло канолы, оливковое масло, кокосовое масло, пальмовое масло, косточковое пальмовое масло, пальмовый олеин, соевое масло, подсолнечное масло, рыбий жир и масло, полученное микробной ферментацией, содержащее полиненасыщенные длинноцепочечные жирные кислоты. Такие масла могут быть в виде высших олеинов, как, например, в высоко олеиновом подсолнечном масле и высоко олеиновом саффлоровом масле. Кроме того, источник липидов может представлять собой фракции таких масел, как пальмовый олеин, триглицериды со средней длиной цепи (МСТ), и сложных эфиров жирных кислот, таких как арахидоновая кислота, линолевая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, докозагексаеновая кислота, линоленовая кислота, олеиновая кислота, лауриновая кислота, каприновая кислота, каприловая кислота, капроновая кислота и т.п.

Предпочтительный источник липидов для молочных смесей длительного хранения содержит триглериды со средней длиной цепи, предпочтительно в количестве 15-35% мас. от массы источника липидов.

Предпочтительно, источник липидов имеет молярное соотношение между n-6 и n-3 жирными кислотами в интервале 5:1-15:1, предпочтительно 8:1-10:1.

При наличии, предпочтительно, чтобы липид присутствовал в количестве 20-40% мас. от массы композиции или в количестве 0,8-1,5 г/100 кДж в детском питании.

Белки, которые могут использоваться в пищевых продуктах изобретения, включают любой белок или источник азота, подходящий для потребления человеком. Примеры подходящих источников белка для детского питания обычно включают казеин, сыворотку, сгущенное снятое молоко, обезжиренное молоко, сою, горох, рис, кукурузу, белковый гидролизат, свободные аминокислоты, источники белка, содержащие кальций в коллоидной суспензии белка или их смеси. Согласно изобретению предпочтительно использовать белок в виде гидролизата, что снижает вероятность развития аллергии у детей. Коммерческие источники белка являются легкодоступными и известны в данной области.

Гидролизаты детского питания на основе молока обычно содержат 100% сывороточный белок коровьего молока. В других молочных смесях для детского питания соотношение между казеином и сывороткой обычно составляет 1,8:0,3-3,0.

При наличии предпочтительно, чтобы источник белка присутствовал в количестве 9-19% мас. от массы композиции. Предпочтительное количество источника белка, используемого в детском питании, составляет 0,45-1,0 г/100 кДж.

Предпочтительная полноценная питательная смесь содержит диетологически значимые количества всех витаминов и минералов, необходимых для суточного рациона. К некоторым витаминам и минералам предъявляются минимальные требования. Примерами необязательных минералов, витаминов и других питательных веществ, присутствующих в детском питании, могут служить витамин А, витамин В, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевая кислота, инозит, ниацин, биотин, пантотеновая кислота, холин, кальций, фосфористый йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минералы обычно добавляют в виде солей. Присутствие и количество конкретных минералов и других витаминов в значительной степени зависит от вида детской популяции, для которой предназначено питание.

При необходимости, детское питание может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соевый лецитин, лимонная кислота, сложные эфиры моно- и диглицеридов и т.п. Эти компоненты особенно полезны для жидких смесей.

Детское питание может необязательно содержать другие вещества, оказывающие полезное действие, такие как (неуглеводные) волокна, лактоферин, иммуноглобулины, нуклеотиды, нуклеозиды и т.п.

Применение

Обнаружено, что препараты согласно изобретению особенно полезны для нормализации популяции Bifidobacterium в соответствии с видовым распределением у детей, получающих грудное кормление, считающегося «стандартом», в желудочно-кишечном тракте детей, получающих искусственное питание или частично вскармливаемых материнским молоком, в особенности у недоношенных детей, доношенных детей, а также детей в период адаптации к приему твердой пищи. Препараты изобретения также подходят для детей в период перехода от кормления грудью к искусственному вскармливанию.

Соответственно, предусматривается применение препарата или композиции согласно изобретению для производства композиции, предназначенной для нормализации популяции видов Bifidobacterium в желудочно-кишечном тракте детей, получающих искусственное питание или частично вскармливаемых материнским молоком. Также обнаружено, что препараты согласно изобретению особенно полезны для профилактики или лечения состояния иммунной системы. Предполагается, что иммунное состояние является следствием различия в составе видов Bifidobacterium в желудочно-кишечном тракте детей, получающих искусственное питание или частично вскармливаемых материнским молоком, по сравнению с детьми, питающимися материнским молоком. Обычно такие иммунные состояния включают состояния, выбранные из аллергии, атопического дерматита, экземы, астмы, атопии, аллергического ринита, пищевой аллергии, раздражения кожи от пеленок, диареи и комбинации указанных состояний.

Соответственно, изобретение предусматривает применение препарата для профилактики или лечения одного или нескольких состояний иммунной системы, предпочтительно выбранных из аллергии, атопического дерматита, экземы, астмы и раздражения кожи от пеленок. Кроме того, препарат изобретения может применяться для лечения (бактериальной) диареи и особенно вирусной диареи. Также предусматривается применение препарата согласно изобретению для профилактики и/или лечения нарушения поглощения энергии. Обнаружено, что препарат согласно изобретению может успешно применяться для ингибирования инфильтрации эозинофилов, нейтрофилов и одноядерных клеток при аллергических поражениях и/или ингибирования иммунной реакции Th2 типа, и/или стимуляции Th1 опосредованной иммунной реакции. Преимущественно предусматривается применение препарата или композиции согласно изобретению для производства композиции, предназначенной для ингибирования инфильтрации эозинофилов, нейтрофилов и одноядерных клеток при аллергических поражениях, ингибирования иммунной реакции Th2 типа и/или стимуляции Th1 опосредованной иммунной реакции.

Изобретение также предусматривает применение описанной выше углеводной смеси для регулирования популяции некоторых видов Bifidobacterium, отличных от B. breve, в особенности для уменьшения относительных количеств Bifidobacterium catenulatum, B. pseudocatenulatum и/или B. adolescentis.

Разработка зонда и диагностический набор

Изобретение также предусматривает способ количественного определения видов Bifidobacterium, в особенности обнаруженных у людей, т.е. Bifidobacterium catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. adolescentis, B. breve, B. longum, B. bifidum, B. angulatum, B. infantis и B. dentium, с использованием видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Такие праймеры и зонды могут использоваться для идентификации бифидобактерий и бифидобактериальных видов с применением таких методов, как FISH, PCR, DGGE, TGGE, гибридизация методом дот-блоттинга и PCR в реальном времени. Общим во всех перечисленных методах является стадия гибридизации с использованием нуклеотидов. Особой целью является определение числа видов бифидобактерий с помощью PCR (полимеразная цепная реакция) в реальном времени

При функционировании в качестве зонда каждая из описанных ниже последовательностей может содержать дополнительные основания, связанные их 5'- или 3'-концами.

Такие олигонуклеотиды могут быть получены традиционными методами химического синтеза, например с использованием автоматического синтезатора ДНК. Фрагменты ДНК, содержащие указанные выше последовательности, могут быть получены ферментативным расщеплением генов соответствующих видов Bifidobacterium.

Согласно изобретению создание праймеров и зондов, специфичных к видам Bifidobacterium, для применения в 5'-нуклеазном анализе проводят следующим образом.

Были разработаны дуплексные 5'-нуклеазные анализы для Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum, B. dentium, B. longum и B. infantis , в отношении ко всем бифидобактериям. Авторами было разработано 5'- нуклеазных анализов на межгенный спейсер 16S-23S rДНК вместо гена 16S rДНК, который обычно используют для филогенетического анализа и специфического определения бактерий. Выбор межгенного спейсера в значительной степени определяется тем фактом, что результаты, касающиеся загрязнений и чувствительности, были описаны для PCR в реальном времени при использовании 16S rДНК. Кроме того, описано большое сходство между последовательностями 16S rДНК различных видов Bifidobacterium (Leblond-Bourget et al. 1996), что делает практически невозможным создание серий праймеров и зондов, специфичных к различным видам Bifidobacterium. Неожиданно эти проблемы удалось решить с использованием межгенной спейсерной области.

Для создания праймеров и зондов отличающиеся последовательности 16S-23S межгенной спейсерной области различных видов Bifidobacterium (B. adolescentis [U09511 U09512 (1), U09513 (1) и U09514 (1)]^a, B. angulatum [U09515 (1)]^a, B. animalis [AY225132 (2), L26967 (1) и UO9858 (1)]^a, B. asteroides [UO9516 (1)]^a, B. breve [AJ245850 (3), UO9518 (1), UO9519 (1), UO9520 (1) и UO9521 (1)]^a, B. bifidum [U09517 (1), UO9831 (1)]^a, B. catenalatum [UO9522]^a, B. choerinum [L36968]^a, B. coryneforme [UO9523]^a, B. cuniculi [UO9790]^a, B. dentium [UO10434]^a, B. indicum [UO9791]^a, B. infantis [AJ245851 (3), UO9525 (1), UO9527 (1) и UO9792 (1)]^a, B. longum [AJ245849 (3), UO9832 (1)]^a, B. pseudolongum [UO9524 (1), UO9879 (1)]^a, B. magnum [UO9878] (1)]^a, B. thermophilum [UO9528 (1)]^a) получали из Genbank, на основе баз данных EMBL и DDBJ. Все полученные последовательности выравнивали с использованием DNASIS для Windows V2,5 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Wembly, UK) (^a=код доступа, 1=Leblond-Bouget, N., H. Philippe, I. Mangin, B. Decaris. 1996.) В результате анализа 16S РНК и 16S-23S внутренних транскрибированных спейсерных последовательностей была установлена интер- и интраспецифическая филогенность относительно Bifidobacterium. См. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:102-11, 2=Ventura, M. and R. Zink. 2002. “Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis”. Appl. Environ. Microbiol, 68: 6429-6434., 3=Brigidi, P., B. Vitali, E. Swennen, L. Altomare, M. Rossi, D. Matteuzzi. 2000. “Specific detection of Bifidobacterium strains in pharmaceutical probiotic product and in human faces by polymerase chain reaction.” Syst. Appl. Microbiol. 23:391-399). Полные консервативные области последовательностей использовали для создания праймеров и зондов для всех видов Bifidobacterium. Консервативные области последовательностей подвидов различных типов, показавших низкую гомологию с другими видами, использовали для конструирования праймеров и зондов с целью определения B. adolescentis, B. angulatum, B. breve, B. bifidum, B. catenulatum, (включая B. pseudocatenulatum), B. dentium, B. infatis и B. longum (включая B. pseudolongum, что связано с высокой гомологией последовательности между этими двумя видами).

Праймеры и TagMan MGB зонды конструировали с помощью Primer Express 1,5a (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, NL). Применяли следующие критерии: праймеры и зонды должны иметь содержание GC 30-80% и должны быть исключены эксперименты с использованием более 3 идентичных нуклеотидов (особенно для гуанидина (G)). Температура плавления зондов должна составлять 68-70°С, тогда как праймеры должны иметь температуру плавления на 10°С ниже. Кроме того, на 5'-конце зонда не должен присутствовать G и при этом отбирают цепь, содержащую большее количество цитозина (С), чем количество G. Пять последних нуклеотидов на 3'-конце праймеров должны содержать не более двух G и/или С оснований. Наконец, длина ампликона должна быть не более 150 пар оснований. Сконструированные праймеры и TagMan MGB зонды представлены в таблице 1 и тестированы на специфичность с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).

Зонд, сконструированный для обнаружения всех видов Bifidobacterium, состоит из олигонуклеотида с репортерным красителем VIC^TM в положении 5' (Applied Biosystem, NL) и гасителем NFQ-MGB^TM в положении 3' (Applied Biosystem, NL), а также зондами для различных видов Bifidobacterium олигонуклеотидов с 5' репортерным красителем, 6-карбоксифлуоресцином (FAM^TM) и 3' гасителем - NFQ-MGB^TM (Applied Biosystem, NL). Для определения общей бактериальной нагрузки использовали (универсальный) зонд широкого назначения и набор праймеров, который описан Nadkarmi, M.A., F.E. Martin, N.A. Jacques и N. Hunter в “Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primer set”. Microbiology 148: 257-266 (2002). Универсальный зонд состоит из олигонуклеотидов с 5' репортерным красителем, 6-карбоксифлуоресцином (FAM^TM), и 3' гасителем красителя, 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA^TM). Сконструированные зонды представлены в таблице 1.

Меченые препараты получали традиционными способами путем маркировки олигонуклеотида способным к обнаружению маркером. Для маркировки можно использовать маркеры, включающие радиоизотопы, флуоресцентные вещества, ферменты, биотин и гаптены.

Гибридизацию между меченым препаратом и образцом можно осуществлять известными методами, такими как дот-блоттинг и нозерн-блоттинг. Образование гибрида может быть подтверждено обнаружением меченого препарата с помощью известных методов, например, таких как авторадиография с использованием радиоизотопов, применение антител, меченных ферментом, где используют фермент или биотин и т.п.

Фрагменты ДНК из этих олигонулеотидов, представленные, как SEQ ID, выбранные из SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, соответственно, могут использоваться в качестве праймера в методе PCR, предназначенном для идентификации видов. Более конкретно, микробные клетки, подлежащие идентификации, подвергают бактериолизу и любой из ДНК фрагментов SEQ ID, выбранный из SEQ ID No 1, SEQ ID No 4, SEQ ID No 7, SEQ ID No 10, SEQ ID No 13, SEQ ID No 16, SEQ ID No 19, SEQ ID No 22, SEQ ID No 25, а также SEQ ID, выбранной из SEQ ID No 2, SEQ ID No 5, SEQ ID No 8, SEQ ID No 11, SEQ ID No 14, SEQ ID No 17, SEQ ID No 20, SEQ ID No 23, SEQ ID No 26, добавляют в качестве праймера, затем проводят обработку ДНК полимеразой. Если с помощью электрофореза и т.п. наблюдалась амплификация ДНК, это означало, что клетки обладают частью гена, соответствующей используемому фрагменту ДНК, т.е. клетки идентифицируют как принадлежащие к тому же виду, что и праймер из фрагмента ДНК.

Таким образом, предусматриваются олигонуклеотиды, содержащие SEQ ID, выбранную из SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, и соответствующие комплементарные последовательности.

Согласно изобретению также предусматривается олинуклеотидный зонд для обнаружения целевой последовательности нуклеиновых кислот, которая является характеристикой видов рода Bifidobacterium, где указанный зонд выбирают из:

1) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium adolescentis ДНК, представленной SEQ ID No 3, или соответствующей комплементарной последовательностью;

2) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium angulatum ДНК, представленной SEQ ID No 6, или соответствующей комплементарной последовательностью;

3) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium bifidum ДНК, представленной SEQ ID No 9, или соответствующей комплементарной последовательностью;

4) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium breve ДНК, представленной SEQ ID No 12, или соответствующей комплементарной последовательностью;

5) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium catenulatum ДНК, представленной SEQ ID No 15, или соответствующей комплементарной последовательностью;

6) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium dentium ДНК, представленной SEQ ID No 18, или соответствующей комплементарной последовательностью;

7) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium infantis ДНК, представленной SEQ ID No 21, или соответствующей комплементарной последовательностью;

8) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium longum ДНК, представленной SEQ ID No 24, или соответствующей комплементарной последовательностью;

9) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован со всеми Bifidobacterium ДНК, представленной SEQ ID No 27, или соответствующей комплементарной последовательностью.

Кроме того, изобретение предусматривает способ видоспецифичной детекции видов рода Bifidobacterium, обнаруженного у людей, в особенности у детей, включающий следующие стадии:

(А) контактирование образца с олигонуклеотидным зондом в растворе для гибридизации, где указанный зонд выбирают из группы, состоящей из:

1) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium adolescentis ДНК, представленной SEQ ID No 3, или соответствующей комплементарной последовательностью;

2) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium angulatum ДНК, представленной SEQ ID No 6, или соответствующей комплементарной последовательностью;

3) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium bifidum ДНК, представленной SEQ ID No 9, или соответствующей комплементарной последовательностью;

4) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium breve ДНК, представленной SEQ ID No 12, или соответствующей комплементарной последовательностью;

5) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium catenulatum ДНК, представленной SEQ ID No 15, или соответствующей комплементарной последовательностью;

6) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium dentium ДНК, представленной SEQ ID No 18, или соответствующей комплементарной последовательностью;

7) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Вifidobacterium infantis ДНК, представленной SEQ ID No 21, или соответствующей комплементарной последовательностью;

8) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован с Bifidobacterium longum ДНК, представленной SEQ ID No 24, или соответствующей комплементарной последовательностью;

9) меченого олигонуклеотида, который специфически гибридизован со всеми Bifidobacterium ДНК, представленной SEQ ID No 27, или соответствующей комплементарной последовательностью, и

(В) установление факта гибридизации зонда с нуклеиновыми кислотами в указанном образце с целью обнаружения наличия в образце указанных видов рода.

Изобретение также включает способ видоспецифичной детекции видов рода Bifidobacterium, обнаруженного у людей, в особенности у детей, включающий следующие стадии:

а) амплификацию последовательности нуклеиновых кислот с использованием набора праймеров, включающего олигонуклеотидный праймер SEQ ID No, выбранной из SEQ ID No 1, SEQ ID No 4, SEQ ID No 7, SEQ ID No 10, SEQ ID No 13, SEQ ID No 16, SEQ ID No 19, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 25, а также нуклеотидный праймер SEQ ID, выбранной из SEQ ID No 2, SEQ ID No 5, SEQ ID No 8, SEQ ID No 11, SEQ ID No 14, SEQ ID No 17, SEQ ID No 20, SEQ ID No 23, SEQ ID No 26; и

b) установление факта гибридизации указанного выше олигонуклеотидного зонда с целевой последовательностью нуклеиновых кислот.

Описанный способ удобен для производства диагностического набора. Соответственно, изобретение предусматривает диагностический набор для детекции в образце видов Bifidobacterium, выбранных из Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum, B. dentium,B. infantis и B. longum с помощью гибридизационного анализа, который содержит, по меньшей мере, упомянутый выше ДНК зонд, а также один или несколько дополнительных средств, требующихся для гибридизационного анализа, таких как денатурированная жидкость, среда гибридизации, промывная жидкость, твердый носитель, сосуд для гибридизации и меченые средства обнаружения.

Также предусматривается диагностический набор для обнаружения в образце указанных выше видов Bifidobacterium с помощью PCR анализа, включающий набор указанных выше ДНК праймеров, а также один или более дополнительных средств, требующихся для PCR анализа, таких как полимераза, полимеризационная среда, верхний масляный слой, реакционный сосуд и средства для обнаружения амплифицированной ДНК.

Пример 1. Аттестация разработанных зондов и праймеров для определения бифидобактерий

Бактериальные штаммы, используемые для подтверждения анализа, представляющего относительное количественное определение различных видов Bifidobacterium, перечислены в таблице 2.

Все штаммы бифидобактерий культивировали в Mann Rogosa Sharp (MRS) бульонной (Oxoid Basingstoke, UK) среде при 37°С в течение 24 часов в анаэробных условиях. Ночные культуры хранили при -20°С до последующего использования.

ДНК экстрагировали из бактериальных культур размораживанием 5 мл замороженных ночных культур в смеси воды со льдом. Затем культуры центрифугировали в течение 20 минут при 4000 об/мин при 4°С (Sorvlall RT7, Du Pont, Stevenage, UK) для осаждения бактериальных клеток. Полученный осадок промывали 1 мл TES (50 мМ трис-HCl [pH 8,0], 5мМ EDTA; 50 мМ NaCl), с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Супернатант удаляли и осадок повторно суспендировали в 1 мл THMS (30 мМ трис-HCl [pH 8,0], 3 мМ MgCl₂, 25% (мас./об.) сахароза). После переноса суспензии в 2 мл пробирку Эппендорфа добавляли 200 мкл лизозима (0,1 г/мл; Sigma Aldrich Chemie, Stainheim; DE) и 40 мкл мутанолизина (1 мг/мл; Sigma Aldrich Chemie,; DE), и полученную смесь инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем раствор центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин при 4°С (Sigma 1-15, Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, DE). Супернатант удаляли и осадок повторно суспендировали в 100 мкл THMS, затем добавляли 400 мкл TES (включая 0,5% SDS) и 7,5 мкл Proteinase K (20 мг/мл); Boehringer Mannhein GmbH, Mannhein, DE). Смесь встряхивали и инкубировали при 65°С в течение 30 минут. Затем проводили стандартную экстракцию смесью фенол/хлороформ с последующей обработкой 2,5 мкл RNase A (1 мг/мл; Roche Diagnostics, Mannhein, DE) в течение 30 минут при 37°С. После чего ДНК осаждали выдерживанием при -20°C в течение, по меньшей мере, 30 минут после добавления 2 объемов охлажденного льдом этанола (96%) и 0,1 объемом 0,3М раствора ацетата натрия (рН 5,2). Растворы, в которых образовался осадок, центрифугировали при 13000 об/мин в течение 20 минут при 4°С и супернатанты промывали 500 мкл 70% этанола с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 5 минут при 4°С. Супернатанты отбрасывали и осадок после центрифугирования сушили при комнатной температуре. ДНК ресуспендировали в 100 мкл стерильной милли-Q и хранили при -20°С.

Сначала тестировали специфичность каждого парного 5'-нуклеазного анализа, осуществляя амплификацию 25 мкл различных штаммов (см. таблицу 2). PCR реакции в объеме 25 мкл проводили с использованием 2,5 мкл матричной ДНК, 12,5 мкл TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystem), 900 нМ каждого из праймеров и 200 нМ каждого зонда с последующим осуществлением TaqMan Universal Temperature Profile, который состоял в нагревании при 50°С в течение 2 минут, выдерживании образца в течение 10 минут при 95°С с последующими 45 циклами продолжительностью в 15 секунд при 90°С и 60°С длительностью в 1 минуту с использованием ABI Prism 7700 (Applied Biosystem, Nieuwerker a/d IJssel, NL). Все 5'-нуклеазных анализов оказались специфичными относительно видов Bifidobacterium, для которых они были разработаны, и 5'-нуклеазного анализа, предназначенного для определения общего количества испытуемых видов Bifidobacterium, но не для других штаммов, таких как Propioni bacterium или Lactobacillus. Следует отметить, что 5'-нуклеазный анализ на B. catenulatum также позволяет детектировать B. pseudocatenulatum. Кроме того, образцы, обработанные ДНКазой и РНКазой, тестировали для подтверждения того, что в ходе анализа не детектировали загрязненную РНК. Также готовили смесь монокультур Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum, B. breve,B. bifidum, B. catenulatum, B. dentium, B. infantis и B. longum с целью подтверждения того, что рассматриваемая смесь составляет примерно 100%. В этом случае можно исключить конкуренцию между различными видами Bifidobacterium, используемыми в качестве матрицы. Это соответствует случаю, представленному на фиг.1, который отображает установленные количества в смеси каждого из видов Bifidobacterium, а также общее количество видов Bifidobacterium, содержащихся в смеси.

В таблице 3 приведены значения CV для воспроизводимости и повторяемости различных 5'-нуклеазных анализов.

Разработанные 5'-нуклеазные анализы сравнивали с традиционной качественной видоспецифической PCR (проводимой с использованием праймеров, описанных Matsuki, T., K. Watanabe, R. Tanaka, M. Fukuda and H. Oyazu. 1999. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with rRNA-gene-tergeted species-specific primers. Appl. Environ. Microbiol. 65:4506-4512) для определения чувствительности различных анализов, а также проверки на ложные положительные или отрицательные результаты. Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что чувствительность 5'-нуклеазных анализов отличается от чувствительности традиционной видоспецифичной PCR. В таблице 4 приведены оптимальные концентрации праймера и зонда, используемых в дуплексных 5'-нуклеазных анализах.

Пример 2. Клинические испытания

Исследование проводили двойным слепым, многоцентровым испытанием с контролем плацебо при использовании двух лечебных групп. Младенцев, получающих полноценное питание, в возрасте от 28 до 90 дней выбирали из четырех больниц в Германии. Дети участвовали в экспериментах в том случае, если их вес при рождении составлял 2600-4500 г и они питались полноценными молочными смесями в течение, по меньшей мере, четырех недель перед началом терапевтического воздействия. Из эксперимента исключались дети с пороками развития или с доказанной или подозреваемой аллергией на коровье молоко, дети, появившиеся в результате многоплодовых родов, дети, получавшие антибиотики менее чем за две недели до начала исследования, а также дети, питавшиеся смесями, содержащими про- или пребиотик, менее чем за месяц до начала исследования. После регистрации детей в произвольном порядке определяли в одну из двух экспериментальных групп: группу, получающую питание, дополненное 0,8 г/100 мл галактоолигосахаридов и фруктополисахаридов (GFSE-группа), и группу, получающую стандартное детское питание (SF-группа). Состав основных питательных компонентов в молочной смеси представлен в таблице 5.

Группу младенцев грудного вскармливания использовали в качестве эталонной группы (BF группа). Образцы кала собирали в течение трех дней после начала исследования, через 4 недели и в конце испытательного периода (6 недель). Проведение исследования было утверждено комитетом по медицинской этике четырех больниц. До начала исследования было получено письменное согласие от родителей.

Нуклеиновые кислоты выделяли из фекалий оттаиванием образцов в ледяной воде с последующим 10× (мас./об.) разбавлением в PBS (0,37 М NaCl, 2,7 мM KCl, 8,1 мM Na₂HPO₄ [pH 7,4]) и 10-минутной гомогенизацией с использованием устройства stomacher (IUL Instruments, Barcelona, Spain). Гомогенизированный кал хранили при -20°С до выделения ДНК. Экстракцию начинали оттаиванием 1 мл образца гомогенизированных фекалий в ледяной воде с последующим центрифугированием в течение 1 минуты при 1100 об/мин для удаления инородных веществ и крупных частиц. Супернатанты переносили в новую пробирку и центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин. Осадки после центрифугирования ресуспендировали в 1 мл TN150 (10 мM Трис-HCl [pH 8,0], 10 мM RDTA) и переносили в стерильные пробирки, содержащие 0,3 г циркониевых шариков (диаметр 0,1 мм, BioSpec Products, Bartlesville, US). В полученные суспензии добавляли 150 мкл ТЕ-забуференного фенола (рН±7,5) и образцы на 3 минуты помещали в битер с мини-шариками при 5000 об/мин (BioSpec Products, Bartlesville, US). После измельчения дробью образцы немедленно охлаждали на льду до добавления 150 мкл хлороформа. Образцы кратковременно встряхивали и центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин, верхней фазы переносили в чистые пробирки Эппендорфа емкостью 2 мл и приступали к экстракции смесью фенол/хлороформ. После фенол-хлороформной экстракции проводили осаждение ДНК охлаждением образцов при -20°С в течение, по меньшей мере, 30 минут после добавления 1 мл охлажденного льдом этанола (96%) и 50 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2). Затем образцы центрифугировали в течение 20 минут при 13000 об/мин и промывали 150 мкл 70% этанола. После центрифугирования в течение 5 минут при 13000 об/мин супернатанты отбрасывали и осадки сушили на воздухе при комнатной температуре. ДНК ресуспендировали в 100 мкл стерильной милли-Q и хранили при -20°С.

Относительное определение различных видов Bifidobacterium в образцах кала проводили с помощью дуплексного 5'-нуклеазного анализа. Относительное количество каждого вида рассчитывали согласно Liu et al., 2002. Эффективность каждой кривой амплификации рассчитывали по отдельности по формуле Е=(пороговая величина_А/пороговая величина_В)^{-(Сt1A-Ct1B)}-1. С помощью рассчитанных значений эффективности рассчитывали начальное содержание ДНК (R_o) по формуле R_o=пороговое значение/(1+Е)^Ct. Затем исходное количество ДНК вида Bifidobacterium может быть разделено на исходное количество ДНК во всех видах Bifidobacterium. Далее полученное соотношение может быть нормализовано на 100% с учетом количества монокультуры.

Общее количество Bifidobacterium также может быть определено с помощью указанного выше метода FISH (Langendijk, F. Shut, G.J. Jansen, G.R. Raangs, G.R. Kamphuis, M.H. Wilkison and G.W. Welling “Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium spp. with genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in fecal samples” Appl. Environ. Microbiol. 61 (8): 3069-75. (1995)).

Процентное содержание рода Bifidobacterium в расчете на общее содержание бактерий составило 75, 47 и 68% в BF, SF и GFCF группе, соответственно, которое демонстрирует, что GFCF группа, получающая смесь неусваиваемых углеводов, обладает более бифидогенной флорой, как и в случае BF группы, по сравнению с SF группой.

В таблице 6 представлены данные, демонстрирующие преобладание каждого вида в различных группах в начале, а также в конце испытания. В таблице 7 приведены количества в процентах отдельных видов Bifidobacteria относительно общего количества Bifidobacteria.

В трех различных группах присутствует большое число различных видов Bifidobacterium. Значительное уменьшение преобладания и количества B. adolescentis наблюдается у детей, получающих грудное кормление, и детей, получающих GFSF, в отличие от детей, питающихся стандартной смесью. Через 6 недель кормления превалирование и количество B. adolescentis значительно выше у детей, получающих SF, чем у детей, получающих GFSF или вскармливаемых грудью. Анализ образцов кала детей, получающих GFSF, обнаружил большое разнообразие в бифидобактериальной флоре, аналогично флоре детей, получающих грудное кормление, при этом не наблюдалась стимуляция только одного или нескольких видов. Помимо влияния на B. adolescentis профили детей, вскармливаемых грудью, и детей, получающих GFSF, также демонстрируют меньшее содержание B. сatenulatum (+B. pseudocatenulatum), чем профиль детей, питающихся стандартной смесью. B. infantis и B. longum, как оказалось, доминируют у детей, получающих грудное кормление, а также у детей, питающихся стандартными молочными смесями (SF) или стандартной смесью, дополненной пребиотиками (GFSF). B. breve доминируют во всех трех группах, однако в группе грудного вскармливания процент B. breve от общего количества бифидобактерий выше (11,7%), чем в SF (4,9%) и GFSF (5,4%) группе.

Пример 3. Эксперименты на аллергию у животных

Самцов BALB/c мышей, не содержащих специфических патогенов, получали от Charles River (Maastrict, the Nederlands). Пища и вода давались без ограничений и использовали мышей в возрасте 6-9 недель. Все эксперименты были одобрены комитетом по этике обращения с животными из University of Utrecht, the Netherlands.

Яичный альбумин (сорт V) и ацетил-β-метилхолинхлорид (метахолин) приобретали у Sigma Chemical Co. (St. Lois, MO. USA). Гидроксид алюминия (AlumImject) приобретали у Pierce (Rockford, IL, USA).

Мышей сенсибилизировали двумя i.p. инъекциями, содержащими 10 мкг яичного альбумина, нанесенного на 2,25 мг гидроксида алюминия в 100 мкл физиологического раствора, или только физиологическим раствором в день 0 и 7, от начала испытания. Мышей заражали на 35, 38 и 41 день путем вдыхания аэрозолей яичного альбумина при нахождении в плексигласовой камере в течение 20 минут. Аэрозоли получали распылением раствора яичного альбумина (10 мг/мл) в физиологическом растворе с использованием устройства Pari LC Star (Pari respiratory Equipment, Richmond, VA, USA).

Начиная с 28 дня и до конца эксперимента (т.е. 42 день) мышей ежедневно обрабатывали пероральным введением 1·10⁹ (CFU) Bifidobacterium breve и 25 мг смеси галактоолигосахаридов и фруктополисахаридов (9:1) через зонд (0,2 мл, физиологический солевой раствор). В качестве контроля через зонд вводили 0,2 мл физиологического солевого раствора.

Дыхательную восприимчивость к распыленному метахолину определяли через 24 часа после заражения аэрозолем находящихся в сознании и свободном состоянии мышей с использованием плетизмографии всего организма (BUXCO, EMKA, Paris, France). Дыхательную реакцию выражали в виде увеличенной паузы (PenH).

Статистический анализ. Кривые дыхательной реакции на метахолин статистически анализировали с использованием общей линейной модели или повторных измерений с последующим post-hoc сравнением между группами. Подсчет клеток статистически анализировали с использованием Mann-Whitney теста (Siegel, S., Castellan Jr. N J, 1988 “Nonparametric statistics for the behavioral sciences” 2^nd ed. McGrow Hill Book Company, New York, USA). Все другие анализы проводили с использованием критерия Стьюдента (Abramowitz, M., Stegun, I.A., 1972, “Handbook of mathematical functions” Dover publications, Inc. New York, USA). Статистически значимой считалось значение вероятности р<0,05.

Результаты дыхательной гиперчувствительности. Результаты измерения дыхательной гиперчувствительности показали, что, по сравнению с контрольной группой, мыши, получающие B. breve+смесь галактоолигосахаридов и фруктополисахаридов, демонстрируют статистически значимое понижение дыхательной гиперчувствительности, что указывает на понижение астматической реакции.

На фиг.2 гиперчувствительность отображена графиком зависимости относительного значения PenH (увеличенная пауза) от концентрации метахолина для мышей, получающих комбинацию B. breve+смесь GOS/FOS, и контрольной группы мышей, получающих физиологический раствор. Представленные на графике относительные значения PenH получали вычитанием контрольных значений, полученных для мышей, несенсибилизированных яичным альбумином, и нормализацией значения, полученного для контрольной группы при самой высокой концентрации метахолина.

Как известно в данной области и из международных директив, композиции всех следующих примеров могут дополнительно содержать минералы, микроэлементы и витамины, холин, таурин, карнитин, и/или миоинозит или их смеси. Кроме того, в композиции могут необязательно присутствовать органические кислоты, вкусовые добавки и красители.

Пример 4

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 13,1 г порошка):

Пример 5

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 14 г порошка):

Пример 6

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 16,1 г порошка):

Пример 7

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 13 г порошка):

Пример 8

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15 г порошка):

Пример 9

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15,1 г порошка):

Пример 10

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15,2 г порошка):

Пример 11

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15,8 г порошка):

Пример 12

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15 г порошка):

Пример 13

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15,9 г порошка):

Пример 14

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 13,5 г порошка):

Пример 15

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 13,7 г порошка):

Пример 16

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 13,5 г порошка):

Пример 17

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 15,1 г порошка):

Пример 18

Детская молочная смесь, содержащая в расчете на 100 мл конечного продукта (и на 16,5 г порошка):

Пример 19

Продукт на основе молока, содержащий в расчете на 100 мл:

Пример 20

Детская молочная смесь, содержащий в расчете на 100 мл (и на 15,4 г порошка):

Пример 21

Добавка: 3 г продукта, добавляемого в 100 мл молока, содержащая:

Пример 22

Добавка, содержащая: 0,4-0,8 г материала, добавляемого в 100 мл молока, в расчете на грамм:

Пример 23

Добавка, содержащая в расчете на 100 мл:

Пример 24

Детское питание, содержащее в расчете на 100 г (85 г добавлено в 240 мл молока)

Пример 25

Детское питание в тюбиках в расчете на 100 мл

Пример 26

Детское питание, содержащее в расчете на 100 мл продукта

Пример 27

Детское питание, состоящее из рисовой муки, содержащей в расчете на 100 г сухого продукта (4-7 ложек добавляют в 200 мл теплой детской молочной смеси, содержащей молоко для ребенка, начинающего ходить, или коровье молоко)

Пример 28

Детское питание, состоящее из предварительно сваренных хлопьев (пшеница, рожь, рис, ячмень, овес, гречка), содержащее в расчете на 100 г сухого продукта (5-7 ложек добавляют в 250 мл теплой детской молочной смеси, содержащей молоко для начинающего ходить ребенка, или коровье молоко)

Пример 29

Детское питание, состоящее из гомогенизированных овощей или фруктов, содержащее в расчете на 100 мл

Реферат

Препарат для применения в качестве питания содержит Bifidobacterium breve в количестве 1×104-1×1010 cfu/г и смесь неусваиваемых углеводов. Углеводы выбирают из неусваиваемых моносахаридов вплоть до гексасахаридов одинаковой углеводной структуры и из неусваиваемых гептасахаридов и высших полисахаридов одинаковой структуры, включающей инулин. Предложены добавка в питание детей и детское питание, содержащие вышеописанный препарат, а также его применения для лечения или профилактики иммунных нарушений у детей, и для детей, получающих искусственное или частично грудное питание. Применение препарата для изготовления композиции для профилактики и лечения недостаточного поглощения энергии. Применение препарата для изготовления композиции для ингибирования инфильтрации эозинофилов при аллергических заболеваниях. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 табл., 2 ил.

Формула