Способ индентификации клеток, проявляющих восприимчивость к модуляции передачи сигнала, опосредованной рецептором фактора роста фибробластов или его вариантом - RU2519223C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к способу определения in vivo активации или ингибирования рецептора FGF или его варианта и/или к способу идентификации клеток, таких как опухолевые клетки (например, опухолевые образцы), проявляющих чувствительность к модуляции (например, к ингибированию или активации) передачи сигналов, в которых участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, к применению агентов биоспецифического распознавания для указанной цели, к содержащим их наборам, к реагентам для их обнаружения, используемым для выявления клеток, которые восприимчивы к модуляции, в особенности к ингибированию, передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, а также к применению вышеперечисленного для производства таких наборов, а также к другим указанным применениям, способам и вариантам осуществления изобретения.

Факторы роста фибробластов (FGF) представляют собой семейство, заключающее свыше двадцати структурно соотносящихся полипептидов, экспрессия которых обнаружена и рост которых регулируется в самых различных тканях или органах. Факторы роста фибробластов стимулируют пролиферацию, миграцию клеток и дифференцировку клеток и играют важную роль в формировании скелетной структуры и развитии конечностей, в заживлении ран, восстановлении тканей, гомепоэзе, ангиогенезе и онкогенезе (см. Ornitz, Novartis Found Svmp 232, 2001, cc.63-76; обсуждение cc.76-80, 272-282).

Биологическое действие фактора роста фибробластов опосредовано конкретными рецепторами клеточной поверхности, тирозинкиназными рецепторами из семейства протеинкиназ. Эти белки состоят из внеклеточного лиганд-связывающего домена, одного трансмембранного домена и внутриклеточного тирозинкиназного домена, который подвергается фосфорилированию при связывании FGF. На сегодняшний день известны четыре рецептора FGF: рецептор FGF-R1 (также называемый Flg, fms-подобный ген, flt-2, bFGF-R, N-bFGF-R или Cekl), рецептор FGF-R2 (также называемый -ВЕК-Bacterial Expressed Kinase-, KGFR, Ksam, Ksami и Cek3), рецептор FGF-R3 (также называемый Cek2) и рецептор FGF-R4. Все зрелые рецепторы FGF-R имеют общую структуру, состоящую из амино-концевого сигнального пептида, трех внеклеточных иммуноглобулин-подобных доменов (Ig домен I, Ig домен II, Ig домен III), с кислотной областью между Ig доменами ("кислотная ячейка" {англ. - "acidic box") домен), трансмембранного домена и внутриклеточных киназных доменов (Ullrich and Schlessinger, Cell, 61, 1990, с.203; Johnson and Williams, Adv. Cancer Res. 60, 1992, cc.1-41). Различные изоформы рецептора FGF имеют разную аффинность связывания с различными лигандами FGF, таким образом, отмечается повышение избирательности FGF8 (фактора роста, индуцируемого андрогеном) и FGF9 (глиального фактора активации) по отношению к рецептору FGF-R3 (Chellaiah et al., J Biol. Chem, 269, 1994, с.11620).

Последние исследования показали, что растущее число скелетных аномалий, в том числе ахондроплазии, наиболее распространенной формы человеческого дварфизма, происходит в результате мутации в рецепторах FGF. Специфичные точечные мутации, происходящие в различных доменах рецепторов FGF-R1, FGF-R2 и FGF-R3, связаны со скелетными дисплазиями человека аутосомно-доминантого типа наследования, классифицированными как синдромальный краниосиностоз и дварфизм. (Coumoul and Deng, Birth Defects Research 69, 2003, cc.286-304). Скелетные дисплазии, связанные с мутацией рецептора FGF-R3, включают гипохондроплазию, тяжелую ахондроплазию с задержкой развития и акантокератодермией (от англ. - SADDAN - severe achondroplasia with developmental delay and acanthosis nigricans) и танатоформную дисплазию (ТД) (Webster et al., Trends Genetics 13 (5), 1997, cc.178-182; Tavormina et al., Am. J. Hum. Genet., 64, 1999, cc.722-731). Мутации рецептора FGF-R3 также были описаны в двух фенотипах краниосиностоза: краниосиностоз венечного шва (синдром Муенке (Muenke)) (Bellus et al., Nature Genetics, 14, 1996, cc.174-176; Muenke et al., Am. J. Hum. Genet., 60, 1997, cc.555-564) и синдром Крузона с акантокератодермией (Meyers et al., Nature Genetics, 11, 1995, cc.462-464). Синдром Крузона связан со специфическими точечными мутациями в рецепторе FGF-R2, а наследственная и спонтанная формы синдрома Пфайфера связаны с мутациями в рецепторах FGF-R1 и FGF-R2 (Galvin et al., PNAS USA, 93, 1996, cc.7894-7899; Schell et al., Hum Mol Gen, 4, 1995, cc.323-328). Мутации в рецепторах FGF вызывают конститутивную активацию мутированных рецепторов и повышенную активность рецепторной протеинтирозинкиназы, приводя клетки и ткани в состояние, неспособное к видоизменению.

В частности, такая мутация, как ахондроплазия, приводит к повышенной стабильности мутированного рецептора, разрушая активацию рецептора по типу обратной связи, что приводит к сдерживанию созревания хондроцитов и замедлению роста костей (см. Vajo et al., Endocrine Reviews, 21(1), 2000, cc.23-39).

Существует множество подтверждений мутаций, обуславливающих активацию рецептора FGF-R3 при различных типах рака.

Конститутивно активированный рецептор FGF-R3 в двух широко распространенных видах эпителиального рака мочевого пузыря и шейки матки, а также во множественной миеломе в первую очередь доказывает онкогенную роль рецептора FGF-R3 в карциномах. Кроме того, согласно самым последним исследованиям мутации, вызывающие активацию рецептора FGF-R3, присутствует в значительной части доброкачественных опухолей кожи (Logie et al., Hum Mol Genet, 2005). В настоящее время рецептор FGF-R3 является наиболее часто мутировавшим онкогеном при раке мочевого пузыря, где он мутирует почти в 50% случаев от общего числа случаев заболевания раком мочевого пузыря и примерно в 70% случаев при поверхностной форме опухоли мочевого пузыря (Cappellen, et al., Nature Genetics, 23, 1999, cc.19-20; van Rhijn, et al., Cancer Research, 61, 2001, cc.1265-1268; Billerey, et al, Am. J. Pathol., 158, 2001, cc.1955-1959, WO 2004/085676). Кроме того, имеются сведения о сверхэкспрессии рецептора FGF-R3 при раке мочевого пузыря (поверхностном и инвазивном) (Gomez-Roman et al., Clinical Cancer Research, 2005). Аберрантная сверхэкспрессия рецептора FGF-R3 вследствие хромосомной транслокации t(4,14) зафиксирована в 10-25% случаев множественной миеломы (Chesi et al., Nature Genetics, 16, 1997, cc.260-264; Richelda et al., Blood, 90, 1997, cc.4061-4070; Sibley et al., BJH, 118, 2002, cc.514-520; Santra et al., Blood, 101, 2003, cc.2374-2476). Мутации, вызывающие активацию рецептора FGF-R3, наблюдаются в 5-10% случаях множественной миеломы с хромосомной транслокацией t(4,14) и связаны с прогрессией опухоли (Chesi et al., Nature Genetics, 16, 1997, cc.260-264; Chesi et al., Blood, 97(3), 2001, cc.729-736; Intini, et al., BJH, 114, 2001, cc.362-364). В данном контексте, последствия передачи сигнала через рецептор FGF-R3 зачастую зависят от типа клеток. В хондроцитах гиперактивация рецептора FGF-R3 приводит к росту ингибирования (см. Omitz, 2001), тогда как в миеломной клетке она способствует прогрессии опухоли (Chesi et. al., 2001).

Согласно данным исследований ингибирование активности рецептора FGF-R3 представляет собой средство для лечения Т-клеточно-опосредованных воспалительных или аутоиммунных заболеваний, например для лечения Т-клеточно-опосредованных воспалительных или аутоиммунных заболеваний, включая, но, не ограничиваясь, ревматоидным артритом (РА), артритом, индуцированным коллагеном II типа, рассеянным склерозом (PC), системной красной волчанкой (СКВ), псориазом, юношеским диабетом, болезнью Шегрена, заболеванием щитовидной железы, саркоидозом, аутоиммуннымувеитом, воспалительным заболеванием кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), целиакией и миастенией (см. WO 2004/110487). Заболевания, вызванные мутациями рецептора FGF-R3, описаны также в WO 03/023004 и WO 02/102972.

Среди заболеваний, возникновению которых способствует рецептор FGF-R3, а также другие рецепторы FGF-R (главным образом, в связи с, например, аберрантным уровнем FGF23 в сыворотке) кроме того, следует упомянуть аутосомно-доминантный гипофосфатемический фахит (англ. - ADHR), гипофосфатемический рахит, сцепленный с Х-хромосомой, остеомаляцию, вызванную опухолью, а также фиброзную дисплазию костей (см. также X.Yu et al., Cytokine & Growth Factor Reviews, 16, 2005, cc.221-232; X.Yu et al., Therapeutic Apheresis and Dialysis 9(4), 2005, cc.308-312).

При раке молочной железы имели место амплификация и/или сверхэкспрессия рецепторов FGF-R1, FGF-R2 и FGF-R4 (Penault-Llorca et al., Int J Cancer, 1995; Theillet et al., Genes Chrom. Cancer, 1993; Adnane et al., Oncogene, 1991; Jaakola et al., Int J Cancer, 1993; Yamada et al., Neuro Res, 2002). Сверхэкспрессия рецепторов FGF-R1 и FGF-R4 также вызывает аденокарциному поджелудочной железы и астроцитомой (Kobrin et al., Cancer Research, 1993; Yamanaka et al., Cancer Research, 1993; Shah et al., Oncogene, 2002; Yamaguchi et al., PNAS, 1994; Yamada et al., Neuro Res, 2002). Заболевание раком предстательной железы также обусловлено сверхэкспрессией рецептора FGF-R1 (Giri et al., Clin Cancer Res, 1999).

Факторы роста фибробластов и рецепторы фактора роста фибробластов также участвуют в ангиогенезе. Поэтому антиангиогенная терапия для лечения первичной опухоли и метастазов также предусматривает нацеленность на рецептор FGF-R (см., например, Presta et al., Cytokine & Growth Factors Reviews, 16, 2005, cc.159-178).

Согласно представленным данным мутации, в особенности в рецепторе FGF-R3 (например, FGF-R3b), также ответственны за конститутивную активацию данных рецепторов в случае эпидермоидного рака слизистой оболочки рта и губ (см., например, Y.Zhang et al., Int. J. Cancer, 117, 2005, cc.166-168).

Имеются сведения о том, что усиление (в особенности, в бронхах) экспрессии рецептора FGF-R, в особенности экспрессии FGF-R1, связано с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) (см., например, А. Kranenburg et al., J. Pathol., 206, 2005, cc.28-38).

Приводятся данные о пользе методов противодействия рецепторам FGF-R, в особенности рецепторам FGF-R1 или FGF-R4, при лечении ожирения, диабета и/или связанных с ним заболеваний, такими как метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, гипертония, отклонение содержания холестерина и триглицеридов от нормы, дерматологические заболевания (например, инфекция, варикозное расширение вен, акантокератодермия, экзема, непереносимость физических нагрузок, сахарный диабет типа 2, невосприимчивость к инсулину, гиперхолестеринемия, желчно-каменная болезнь, ортопедические травмы, тромбоэмболические заболевания, сердечно-сосудистая недостаточность (например, атеросклероз), дневная сонливость, апноэ сна, терминальная стадия почечной недостаточности, болезни желчного пузыря, подагра, повышение температуры, нарушения иммунного ответа, нарушения функции внешнего дыхания, раневые инфекции, бесплодие, заболевания печени, боли в пояснице, акушерские и гинекологические осложнения, панкреатит, инсульт, хирургические осложнения, стрессовое недержание мочи и/или желудочно-кишечные расстройства (см., например, WO 2005/037235 А2).

По приведенным данным, кислотный фактор роста фибробластов (в особенности FGF-1) и рецептор FGF-R1 при связывании FGF-1 принимают участие в изменении передачи сигнала при ретинобластоме и приводят к пролиферации (см., например, S.Siffroi-Fernandez et al., Arch. Ophthalmology, 123, 2005, cc.368-376).

Подавление роста синовиальной саркомы зафиксировано в результате разрушения пути передачи сигнала фактора роста фибробластов (см., например, Т.Ishibe et al., Clin. Cancer Res., 11(7), 2005, cc.2702-2712).

Кроме того, имеются доказательства участия рецептора FGF-R в случае рака щитовидной железы.

Во всех вышеупомянутых случаях целесообразно применение модуляции изменяющейся активности передачи сигнала через рецептор FGF-R (в особенности, ингибирование активности киназы) при лечении указанных заболеваний.

Однако желательно иметь свидетельства ожидаемой пользы лечения лекарственными средствами, которые модулируют, например замедляют или активизируют, передачу сигнала через рецептор FGF-R, и в дальнейшем иметь возможность опираться на показатель, позволяющий контролировать модуляцию рецептора FGF-R, и оценивать, является ли лечение эффективным или нет при использовании таких модулирующих соединений.

В особенности предпочтительно иметь показания при лечении препаратами, которые подавляют передачу сигнала через рецептор FGF-R.

Белок FRS-2, который также называется SNT1, представляет собой липид-связывающий адаптерный белок, который служит главным связующим звеном между активацией рецептора FGF-R и внутриклеточными сигнальными путями (Lin et al., Mol. Cell Biol., 18, 1998, cc.3762-3770; Xu et al., J. Biol. Chem., 273, 1998, cc.17987-17990; Dhalluin et al., Mol. Cell, 6, 2000, cc.921-929; Ong et al., Mol. Cell Biol., 20, 2000, cc.979-989). Белок FRS-2 содержит последовательность фосфотирозин-связывающего домена (РТВ) рецептора распознавания, которая конститутивно схожа с околомембранной областью рецепторов FGF-R, и эффекторный домен с несколькими сайтами фосфорилирования по тирозину и серину. Активация рецептора FGF-R приводит к фосфорилированию белка FRS-2 по остаткам тирозина, в котором Grb2 и тирозин фосфатаза Shp2 впоследствии инициируют передачу сигнала через МАРК и PI3K (Xu et al., 1998, loc.cit.; Ong et al., 2000, loc. cit.; Hadari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, cc.8578-8583). Значимость белка FRS-2 в передаче сигнала через рецептор FGF-R отражена в эмбриональном летальном фенотипе, наблюдаемом в период развития мыши после распада гена FRS-2. Кроме того, фибробласты эмбриона мыши с дефицитом FRS-2 показывают ухудшение вызванной рецептором FGF-R активации миграции, пролиферации и МАК активации (Hadari et al., 2001).

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что статус фосфорилирования FRS-2 (в особенности, по тирозину) может служить биомаркером для определения эффективности подобных модулирующих соединений в борьбе против вышеуказанных (в особенности, пролиферативных) заболеваний и расстройств. Полученные данные наглядно показывают, что белок FRS-2 отлично фосфорилируется по тирозину именно в тех клетках, которые восприимчивы к ингибированию передачи сигнала через рецептор FGF-R, но не в тех цепочках, в которых рецепторы FGF-R не зависят от пролиферации.

Таким образом, настоящее изобретение основано на обнаружении того, что ингибирование рецептора FGFR посредством модуляторов рецептора FGFR приводит к снижению уровня фосфорилирования белка FRS-2. В пролиферирующих (например, опухолевых) клетках, реагирующих на ингибирование передачи сигнала через рецептор FGF-R, степень фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 уменьшается в присутствии ингибиторов передачи сигнала через рецептор FGF-R, тогда как в клетках, которые не реагируют на ингибирование передачи сигнала, уровень фосфорилирования по тирозину невозможно определить, так как он близок к нулю, или вообще отсутствует восприимчивость к изменениям после добавления модулятора, в особенности ингибитора, поэтому восприимчивость к ингибированию передачи сигнала через рецептор FGF-R можно ожидать только от клеток, которые показывают фосфорилирование по тирозину белка FRS-2.

В качестве альтернативы, когда желательна активация передачи сигнала через рецептор FGF-R (например, в случае заживления ран), можно рассмотреть способность любого из активаторов (таких, как производные от FGF или подобные им) приводить к увеличению фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего фосфотирозин, и, таким образом, получить желаемый результат, определив активацию передачи сигнала через рецептор FGF-R.

Следовательно, уровень фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 (в особенности, в присутствии фосфорилирования по тирозину) в пролиферирующих клетках может быть использован для возможности различения клеток, которые восприимчивы к лечению посредством модуляции передачи сигнала через рецептор FGF-R (в особенности, ингибирование) и клеток, которые не проявляют реакции при подобном лечении. Таким образом, статус фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 в клетках является биомаркером для определения возможности модуляции, в особенности ингибирования (например, нежелательной) пролиферации клеток с помощью ингибиторов передачи сигнала через рецептор FGF-R. Уровни фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 также могут быть использованы для ex vivo определения активности модуляторов рецепторов FGF-R и его вариантов.

Кроме того, определение фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 (или, в качестве синонима, фосфорилированных форм белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащих тирозин), в частности, успешно используется для определения соединений или лекарственных средств, модулирующих активность рецептора FGF-R (в особенности, относительно его активности), и может также находить применение в диагностическом методе выявления пациентов, которым может принести пользу лечение посредством модуляторов, в особенности, ингибиторов, рецептора FGF-R, а также для контроля эффективности лечения.

Подробное описание изобретения

Первый вариант осуществления изобретение относится к способу идентификации (предпочтительно выделенных, например, в культуре клеток или в клеточной суспензии) клеток (в том числе выделенных клеток или клеток из выделенных тканей и/или органов, как правило, из биологических образцов, наиболее предпочтительно от пациента), которые проявляют восприимчивость к модуляции, в особенности к ингибированию, передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, заключающемуся в определении статуса фосфорилирования по тирозину субстрата 2 (FRS-2) рецептора FGF-R, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, в качестве биомаркера такой восприимчивости к ингибированию.

В другом своем варианте осуществления изобретение относится к способу или применению определения фосфорилирования (в особенности, по фосфотирозину) в белке FRS-2, его варианте или его фрагменте, содержащем тирозин, в качестве биомаркера клеток или тканей или органов, в особенности из биологических образцов пациентов, которые проявляют гиперактивную, главным образом конститутивно активированную, передачу сигнала через рецептор FGF-R, и которые, в особенности, поддаются действию ингибиторов рецептора FGF-R или его варианта, и которые реагируют на такие ингибиторы, где указанные способ или применение включают определение наличия фосфотирозина в белке FRS-2, в его варианте, или в его фрагменте, содержащем тирозин, из биологического образца с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфотирозин в белке FRS-2, успешное обнаружение фосфорилирования в белке FRS-2, указывающего на гиперактивную, в особенности конститутивно активированную передачу сигнала через рецептор FGF-R, и, предпочтительно, с целью различения восприимчивых клеток, тканей или органов от клеток, тканей или органов, которые не восприимчивы к ингибиторам передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) либо его вариант, сравнение статуса фосфорилирования в отсутствие и в присутствии ингибитора передачи сигнала, опосредованного рецептором FGF-R или его вариантом, снижение фосфорилирования в присутствии ингибитора указывает на такую восприимчивость.

Настоящее изобретение также относится к способу определения (предпочтительно выделенных, например, в культуре клеток или в клеточной суспензии) клеток (в том числе выделенных клеток или клеток из выделенных тканей и/или органов, как правило, из биологических образцов, в особенности от пациента), проявляющих восприимчивость к модуляции, в особенности к ингибированию, передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, включающему:

а) взаимодействие биологического образца с реагентом биоспецифического распознавания, способным распознавать белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, и

б) определение статуса фосфорилирования тирозина в указанном FRS-2, его варианте или его фрагменте, содержащем тирозин, с биоспецифическим реагентом распознавания, способным распознавать указанный статус фосфорилирования, и

в) корреляцию статуса фосфорилирования по отношению к восприимчивости ингибирования передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант (в особенности, гиперактивная, например конститутивно активная, форма) и/или к состоянию и/или к эффективности лечения.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение также относится к набору, используемому для определения биологического образца, в частности от пациента, чувствительного к модуляции, в особенности, к ингибированию, передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R или его вариант, в особенности для применения с целью выявления пациентов, лечение которых эффективно посредством ингибитора рецептора FGF-R, содержащему средства определения статуса фосфорилирования белка FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, в особенности средства выявления фосфорилированных, наиболее предпочтительно фосфорилированных по тирозину, форм белка FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, в биологических образцах, предпочтительно от пациентов, в качестве биомаркера такой чувствительности к модуляции, в особенности к ингибированию, где предпочтительно, если набор позволяет обнаружить фосфорилирование при отсутствии модуляции, более предпочтительно в отсутствие стимуляции FGF, то есть еще более предпочтительно в случае с конститутивной активацией передачи сигнала через рецептор FGF-R, то это свидетельствует о восприимчивости к ингибированию, в особенности, если фосфорилирование понижается в образце, обработанном ингибитором, по сравнению с образцом, не обработанным ингибитором.

В следующем своем варианте осуществления изобретения относится к применению реагента биоспецифического распознавания (в особенности, в виде антитела против фосфотирозина), способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин (в особенности распознающий в нем фосфотирозин), или к указанному реагенту биоспецифического распознавания как таковому, применяемому для идентификации клеток, в особенности в биологических образцах, в особенности от пациентов, которые проявляют чувствительность к модуляции, в особенности к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант (наиболее предпочтительно, применяемый для выявления больных, лечение которых посредством ингибитора рецептора FGF-R эффективно), где указанное применение предпочтительно включает определение статуса фосфорилирования указанного белка FRS-2, его варианта или его фрагмента; где обнаружение фосфорилирования в отсутствие модуляции предпочтительно означает вероятность восприимчивости к указанному ингибированию; предпочтительно применяемому для идентификации гиперактивности, в особенности, FGF-независимой активации, главным образом, конститутивной активации передачи сигнала через рецептор FGF-R. Предпочтительным является применение реагента биоспецифического распознавания для определения состояния пациента, который восприимчив к лечению ингибитором передачи сигнала через рецептор FGF-R, предусматривающему определение фосфорилирования, в особенности фосфорилирования по тирозину, в белке FRS-2, в его варианте или в его фрагменте, содержащем фосфотирозин, в биологическом образце указанного пациента.

В другом своем варианте осуществления изобретение относится к способу определения фосфорилирования белка FRS-2 (или, в качестве синонима, фосфорилированных форм белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин), применяемому для идентификации модулятора (соединение или лекарственное средство, модулирующее активность) передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, заключающемуся в определении статуса фосфорилирования белка FRS-2 в отсутствие и в присутствии такого модулятора, и если при добавлении указанного (возможного) модулятора обнаружено снижение указанного фосфорилирования, то модулятор относят к классу ингибиторов, и, соответственно, если при добавлении модулятора обнаружено увеличение указанного фосфорилирования, то модулятор относят к классу активаторов передачи сигнала; в особенности для идентификации клеток, проявляющих гиперактивность, в особенности FGF-независимую активацию, более предпочтительно конститутивную активацию передачи сигнала через рецептор FGF-R.

В следующем своем варианте осуществления изобретение относится к способу диагностики или к применению реагента биоспецифического распознавания (в особенности, в виде антитела против фосфотирозина), способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, или к указанному реагенту биоспецифического распознавания, применяемому для идентификации пациентов, которым принесет пользу лечение посредством модуляторов, особенно ингибиторов, рецепторов FGF-R, в особенности, заключающемуся в определении фосфорилирования без ингибитора (в особенности, успешное выявление такого фосфорилирования, указывающее на вероятную пользу лечения пациента посредством такого ингибитора), и, предпочтительно, в определении снижения фосфорилирования в присутствии ингибитора в биологическом образце от такого пациента; или для контроля эффективности лечения посредством таких модуляторов рецептора FGF-R, в особенности ингибиторов, заключающегося в определении изменения фосфорилирования при успешном его выявлении без такого лечения, в особенности его снижения в присутствии модулятора, в особенности ингибитора, в биологическом образце от такого пациента; предпочтительно применяемому для определения гиперактивности, в особенности, FGF-независимой активации, в особой степени, конститутивной активации передачи сигнала через рецептор FGF-R, в биологическом образце такого пациента.

Еще в одном своем варианте осуществления изобретение относится к способу диагностики (в частности, пролиферативного) заболевания (или пациента) восприимчивого к лечению посредством ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, заключающемуся в определении фосфорилированной формы (желательно по тирозину) белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце от пациента, предпочтительно с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, или к указанному реагенту биоспецифического распознавания, применяемому в указанном способе диагностики, предпочтительно, применяемому в определении гиперактивности, в особенности в определении FGF-независимой активации, в особой степени в конститутивной активации передачи сигнала через рецептор FGF-R.

В другом своем варианте осуществления изобретение относится к способу диагностики пролиферативного заболевания, не поддающегося лечению посредством ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, заключающемуся в определении отсутствия фосфорилированной формы белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, предпочтительно с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, или к указанному реагенту биоспецифического распознавания, применяемому в указанном способе диагностики.

В другом своем варианте осуществления изобретение относится к способу контроля реакции на воздействие лечения расстройства, зависящего от передачи сигнала через рецептор FGF-R у пациента, заключающемуся в получении биологического образца от указанного пациента до начала проведения указанного лечения, в определении наличия фосфорилированной формы белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в особенности соответствующей степени фосфорилирования, и в получении одного или более биологических образцов в дальнейшем после начала указанного лечения и в определении изменения, в особенности уменьшения, степени фосфорилирования указанного белка FRS-2, его указанного варианта или его указанного фрагмента, содержащего тирозин, где уменьшение степени фосфорилирования указывает на успешное лечение.

В еще одном своем варианте осуществления изобретение относится к применению реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, в разработке способа диагностики для идентификации таких клеток из числа клеток или тканей биологического образца, которые восприимчивы к модуляции передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, где указанная идентификация заключается в определении статуса фосфорилирования субстрата 2 (FRS-2) рецептора FGF-R, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин.

В еще одном своем варианте осуществления, изобретение относится к применению реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент для выявления клеток, способствующих идентификации соединений, модулирующих передачу сигнала через рецептор FGF-R.

В еще одном своем варианте осуществления изобретение относится к способу идентификации клеток, пролиферация которых требует активации, в частности конститутивной активации рецептора FGF-R, и которые реагируют на ингибирование передачи сигнала через рецептор FGF-R, включающему:

а) испытание образца выделенных клеток и тканей в среде без ингибитора рецептора FGF-R и параллельного испытания образца в среде с ингибитором рецептора FGF-R при отсутствии FGF,

б) по меньшей мере частичную очистку белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, из указанных образцов;

в) определение статуса фосфорилирования белка FRS-2 в указанных образцах; и

д) сравнения статуса фосфорилирования образца, обработанного ингибитором, со статусом фосфорилирования образца, не обработанного ингибитором, при этом снижение фосфорилирования в присутствии ингибитора определяет клетки, подходящие для идентификации ингибиторов, которые пригодны для лечения заболевания, включающего в себя гиперактивность передачи сигнала через рецептор FGF-R.

Данный способ эффективен для выявления клеток, которые пролиферируют при FGF-зависимой или FGF-независимой, в частности конститутивной, активации рецептора FGF для пролиферации.

В еще одном своем варианте осуществления изобретение относится к применению реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, для выявления потенциальных ингибиторов передачи сигнала посредством рецептора FGF-R, заключающемуся в определении с помощью указанного реагента статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологических образцах, и, в случае обнаружения фосфорилирования, в сравнении степени фосфорилирования в присутствии и в отсутствие данного соединения, уменьшение фосфорилирования указывает на пригодность тестируемого соединения в качестве ингибитора передачи сигнала посредством рецептора FGF-R.

Все предыдущие способы, применения, реагенты, наборы и другие варианты осуществления настоящего изобретения предпочтительно позволяют выявить у пациента состояние, в частности расстройство или болезнь, которое, возможно, будет поддаваться лечению посредством модуляторов передачи сигнала через рецептор FGF-R, особенно в случае успешного определения фосфотирозина в белке FRS-2, его варианте или его фрагменте, содержащем тирозин.

Основные выше и ниже обозначенные термины, используемые в контексте настоящего описания изобретения, имеют следующее значение, если не указано иное - любое одно или несколько более общих выражений, используемых в контексте настоящего описания, в особенности в формуле, могут быть заменены, независимо от других терминов, более конкретным определением, приведенным ниже, таким образом, обозначая предпочтительный вариант осуществления изобретения:

Под клетками, проявляющими "восприимчивость к модуляции передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант", предпочтительно подразумеваются клетки, которые поддаются лечению посредством модулятора, в особенности ингибитора, указанной передачи сигнала, и которые содержатся в биологическом образце от пациента. В данных клетках обнаружено изменение фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в присутствии модулятора рецептора FGF-R по сравнению с фосфорилированием в отсутствие модулятора - в особенности в том случае, когда модулятор является ингибитором, увеличивающим фосфорилирование, или более предпочтительно в случае, когда модулятор является ингибитором, снижающим фосфорилирование. Модулятор, предпочтительно ингибитор, предпочтительно является молекулой, связывающейся с рецептором FGF-R или ее вариантами и, предпочтительно, ингибирующей его (предпочтительно тирозин-специфическую) протеинкиназную активность в отношении белка FRS-2 или его варианта.

"Статус фосфорилирования" (или "степень фосфорилирования") относится к отсутствию или же к частичному или к полному присутствию фосфорилированных молекул серина, треонина и/или (предпочтительно и только) тирозина в первичной аминокислотной последовательности белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин. Статус фосфорилирования, в соответствии с настоящим изобретением, является средством различения биологических образцов, например, взятых от пациентов, которые страдают заболеванием, например болезнью или расстройством, зависящим от (например, конститутивной) передачи сигнала через рецептор FGF-R (где может быть обнаружено присутствие фосфорилирования) от образцов, где отсутствует такая зависимость (где отмечается отсутствие фосфорилирования или только незначительное фосфорилирование).

В особенности с помощью сравнения статуса фосфорилирования биологических образцов после инкубации в присутствии и в отсутствие модулятора (в особенности, ингибитора) передачи сигнала через рецептор FGF-R можно отличить биологические образцы, в которых возможно модулирование (в особенности, ингибирование) передачи сигнала через рецептор FGF-R (и которые, таким образом, реагируют на лечение посредством данных модуляторов, в особенности, ингибиторов, и в которых, в случае с ингибиторами, при отсутствии ингибитора фосфорилирования обнаруживается фосфорилирование, уменьшающееся или исчезающее в присутствии ингибитора) от биологических образцов, где такая модуляция, в особенности ингибирование, не влияет на статус фосфорилирования), есть в случае с ингибиторами, где нет фосфорилирования как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора или где не наблюдается никаких изменений в данном фосфорилировании по сравнению с образцами с участием или без участия ингибитора).

Наиболее предпочтительной является возможность настоящего изобретения идентифицировать клетки, которые, особенно вследствие гиперактивности и в особой степени конститутивной активации передачи сигнала через рецептор FGF-R, чрезмерно пролиферирируют, и, таким образом, в которых отмечается фосфорилирование по тирозину в белке FRS-2 или его варианте, и которые поэтому (исходя из наблюдения за статусом фосфорилирования в дальнейшем, как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R), и которые, возможно, будут реагировать на лечение посредством ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, что позволяет отличать их от клеток, в которых отсутствует такое фосфорилирование и в которых представляется маловероятной успешность лечения посредством ингибиторов передачи сигнала через рецептор FGF-R.

Следовательно, как правило, обнаружение фосфорилирования (в особенности фосфорилирования по тирозину) белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, которое также присутствует без стимуляции FGF или биологического образца, является весьма предпочтительным биомаркером в соответствии с изобретением, и все воплощения изобретения наиболее предпочтительно относятся к обнаружению клеток, проявляющих такую гиперактивность, в особенности конститутивную активность, рецептора FGF-R или его вариантов.

Если биологические образцы взяты от пациента, то статус фосфорилирования (здесь этот термин может быть заменен термином "степень фосфорилирования") и присутствие или отсутствие фосфорилирования в присутствии или в отсутствие модулятора (в особенности, ингибитора), таким образом, позволяет определить ожидаемую пользу лечения пациента посредством модулятора, в особенности ингибитора (выявленное уменьшение фосфорилирования или его отсутствие в присутствии ингибитора, а также выявленное повышение фосфорилирования в отсутствие ингибитора может свидетельствовать о целесообразности лечения таким ингибитором).

Термин "фосфорилирование" во всех случаях его употребления в контексте настоящего описания изобретения предпочтительно относится к фосфорилированию по тирозину.

Пациенты - предпочтительно теплокровные животные, более предпочтительно млекопитающие, наиболее предпочтительно люди, склонные к или страдающие от заболевания или расстройства, которое (по меньшей мере, частично) зависит от чрезмерной активности передачи сигнала через рецептор FGF-R, в особенности ввиду гиперактивности, в особенности, ввиду конститутивной активации, или по другим причинам (например, повышенная восприимчивость к факторам роста фибробластов и/или повышенные уровни FGF, усиленный биосинтез рецептора FGF-R и т.п.).

Наиболее существенны состояния, в особенности заболевания и расстройства, выбранные из числа следующих:

Скелетные аномалии, в том числе ахондроплазия, наиболее распространенная форма человеческого дварфизма, скелетные дисплазии, классифицированные как синдромы краниосиностоз и дварфизм, например гипохондроплазия, тяжелая ахондроплазия с задержкой развития и акантокератодермией (SAADDAN) и танатоформная дисплазия, краниосиностоз венечного шва (синдром Муенке (Muenke)), синдром Крузона с акантокератодермией, аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит, сцепленный с Х-хромосомой гипофосфатемический рахит, остеомаляция, вызванная опухолью, фиброзная дисплазия костей.

Аутоиммунные заболевания, например ревматоидный артрит, артрит, индуцированный коллагеном II типа, рассеянный склероз, системная красная волчанка, псориаз, юношеский диабет, болезнь Шегрена, заболевания щитовидной железы, саркоидоз, аутоиммунный увеит, воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), целиакия и миастения, плоскоклеточный рак ротовой полости.

Хроническая обструктивная болезнь легких, ожирение, диабет и/или связанные с ним заболевания, такие как метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, гипертония, отклонение содержания холестерина и триглицеридов от нормы, дерматологические заболевания (например, инфекции, варикозное расширение вен, акантокератодермия, экзема, непереносимость физических нагрузок, диабет типа 2, невосприимчивость к инсулину, гиперхолестеринемия, желчно-каменная болезнь, ортопедические травмы, тромбоэмболические заболевания, сердечно-сосудистая недостаточность (например, атеросклероз), дневная сонливость, апноэ сна, терминальная стадия почечной недостаточности, болезни желчного пузыря, подагра, повышение температуры, нарушения иммунного ответа, нарушения функции внешнего дыхания, раневые инфекции, бесплодие, заболевания печени, боли в пояснице, акушерские и гинекологические осложнения, панкреатит, инсульт, хирургические осложнения, стрессовое недержание мочи и/или желудочно-кишечные расстройства.

В особенности важны пролиферативные расстройства, главным образом, рак и опухолевые заболевания тканей, органов или клеток крови, такие как эпителиальный рак мочевого пузыря или шейки матки, множественная миелома, опухоли кожи, молочной железы, аденокарцинома поджелудочной железы, астроцитома, рак простаты, солидные опухоли, связанные с ангиогенезом, ретинобластома, синовиальная саркома, рак щитовидной железы, дальнейшая меланома, злокачественная лимфома, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак пищевода, рак печени, рак яичников, рак матки, рак предстательной железы, опухоль головного мозга, саркома Капоши, ангиома, остеосаркома, саркома мягких тканей, глиобластома, иммунопролиферативное расстройство, локализующееся на коротком плече 8-й хромосомы в области 8р11, лейкемия, или т.п.

Рецепторы FGF-R обладают высокой аффинностью к факторам роста фибробластов (которыми также являются его варианты, например, более 20 генов и некоторые изоформы), которые можно найти в различных вариантах.

Используемый здесь термин "рецептор FGF-R", в особенности рецепторы FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 и FGF-R4, включает в себя все те варианты, в особенности те, которые, тем не менее, являясь конститутивно активными или активными вследствие связывания (предпочтительно с константой диссоциации от 10^-3 и более, предпочтительно от 10^-5 и более, еще более предпочтительно от 10^-7 и более) одного или нескольких из 22 известных факторов роста фибробластов (FGF), они способны фосфорилировать белок FRS2 с высвобождением из них фосфотирозина, как показано на примере с антителом против фосфотирозина (например, 4G10) и, в особенности, в примерах, приведенных в анализах, или которые проявляют активность (фосфорилирование по тирозину) в соответствующих анализах, упомянутых в WO 2006/000420 (который включен здесь в качестве ссылки относительно данного анализа) как рецептор FGF-R3 (в клеточном анализе) или рецептор FGF-R3 (в ферментативном анализе).

Предпочтительно варианты содержат (предпочтительно, состоят из) последовательность, которая (по аминокислотной основе) почти (выражение, где оно использовалось в основном ±10 процентов от соответствующего численного значения, к которому "почти" прилагается, или предпочтительно в точности равно этому значению) на 70% или более идентична, более предпочтительно по меньшей мере почти на 85% и более идентична, еще более предпочтительно почти на 90% и более идентична, намного более предпочтительно почти на 95% и более идентична и наиболее предпочтительно почти на 98% или более идентична. Процент идентичности последовательности, также называемый гомологией, между рецептором FGF-R, в частности FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 или FGF-R4, и их вариантами, предпочтительно определяется компьютерной программой. Обычно для этой цели применяются такие программы, как Gap program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Cmputer Group, University Reseach Park, Madison Wisconsin, USA), использующая алгоритм Смита-Ватермана (Adv. Appl. Math., 2, 1981, cc.482-489), в частности, с использованием системы поиска сходных пропусков со штрафом за обнаруженный пропуск делеции 12 в последовательности и штрафом за удлинение делеции 1.

Предпочтительной основой, помимо оригинальных последовательностей рецепторов FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 и FGF-R4, для определения идентичности всех вариантов последовательности, приведенных выше, является:

- для рецептора FGF-R1, последовательность белка которого представлена в:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=M34185: (Accession №М34185);

- для FGF-R2, последовательность белка которого представлена в:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=108773 805 (Accession №NM_022970 NM_022969);

- для FGF-R3, последовательность белка которого представлена в:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=13112047 (Accession №NM_022965);

- для FGF-R4, последовательность белка которого представлена в:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val=47524176 (Accession №NM_022963).

Термин "варианты" включает в себя различные формы, такие, как, в особенности изоформы, мутанты (в результате неконсервативной или, в особенности консервативной, например, замены, делеции и/или инсерции одной или более, например до десяти, аминокислот, в том числе и инверсии), аллельные варианты, варианты полиморфизма оснований, слитые белки, процессированные формы (например, отсутствуют от 10 до 50 аминокислот по сравнению с полной последовательностью) и т.п. Особенно предпочтительны мутанты, изоформы, транслокационные варианты и, подобные им, указанные, в частности в следующем абзаце:

Существует четыре общих гена для рецептора FGF-R, а именно для рецепторов FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 и FGF-R4, каждый из которых включает несколько изоформ (например, FGF-R1: а, b, с; FGF-R2: b, с; FGF-R3: b, с; FGF-R4: процессированные формы). При наличии полиморфизма существуют и мутанты (например, FGF-R3: R248C (#), S249C (#), P250R, N3281, G370/372C (#), S371/373C, Y373/375C (#), G375/377C, G380/382R (#), А391/393Е (#), I538/540V*, N540/542K,T,S or V, К650/652Е (#), К650/652М (#), K650/652Q (#), K650/652N, К650/652Т (#), X807/809C,G,L,R,W и т.п., многие из которых встречаются при таких заболеваниях, как формирование рака, например, те, которые отмечены знаком «#», могут быть обнаружены, например, при раке мочевого пузыря и/или при скелетных дисплазиях, сопоставимые мутации также присутствуют в FGF-R1 и FGF-R2; слитые белки встречаются вследствие транслокации, например, FGF-R1: Bcr-FGF-R1, ZNF198-FGF-R1, CEP110-FGF-R1, FOP-FGF-R1, Trim-FGF-R1, MY018A-FGF-R1, TIF1-FGF-R1; FGF-R2: Tel-FGF-R3 (см., например, Eswarakumat et al., J. Cytokine & Growth Factor Reviews, 16, 2005, cc.139-149).

Таким образом, как правило, также мутанты (с заменами, делениями, инсерциями), изоформы, варианты, основанные на полиморфизме, и слитые белки находятся, например, в одной или более из последующих частей белков рецептора FGF-R: Ig-домен I, кислотная ячейка, Ig-домен II, Ig-домен III, трансмембранный домен, киназа 1, вставка киназы и/или киназы 2.

Кроме того, найдены различные типы белка FRS-2, также именуемые SNT (Suc-ассоциированные, индуцированные нейротрофическим фактором белки-мишени, фосфорилированные по тирозину). Семейство белков FRS-2 состоит в основном из FRS-2α (SNT1) и FRS-2β (SNT2), которые представляют собой липид-связывающие адаптерные молекулы, взаимодействующие с белком Grb1, содержащим SH2-домен, и протеиновой тирозин-фосфатазой SHP-2, содержащей домен SHP-2. Фосфорилирование по тирозину FRS-2α имеет решающее значение для начала передачи сигнала через рецептор FGF-R. Термин FRS-2, употребляемый в контексте настоящего описания изобретения, также относится к вариантам FRS-2-α (SNT1) и FRS-2β (SNT2), которые, тем не менее, способны прикрепляться к FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 и/или FGF-R4, то есть, в особенности FRS-2 варианты подобного рода, которые на 70% или более идентичны, более предпочтительно по меньшей мере почти на 85% и более идентичны, еще более предпочтительно почти на 90% и более идентичны, намного более предпочтительно почти на 95% и более идентичны, наиболее предпочтительно на 98% и более идентичны, FRS-2α или FRS-2β. Процент идентичности последовательности, называемый также гомологией, между FRS-2α или FRS-2β и их вариантом предпочтительно определяется компьютерной программой. Обычно для этих цели используются такие программы, как Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версии 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin, USA), использующей алгоритм Смита-Ватермана (Adv. Appl. Math., 2, 1981, cc.482-489), в частности, с использованием системы поиска сходных пропусков со штрафом за обнаруженный пропуск делеции 12 в последовательности и со штрафом за удлинение делеции 1.

Таким образом, варианты белка FRS-2 (FRS-2α или FRS-2β) включают, в особенности, изоформы, мутанты (в результате неконсервативной или, в особенности консервативной, например, замены, делеции и/или инсерции одной или более, например до десяти, аминокислот, в том числе и инверсии), аллельные варианты, варианты полиморфизма оснований, слитые белки, процессированные формы (например, с отсутствием от 10 до 50 аминокислот по сравнению с полной последовательностью) и т.п. Особенно предпочтительными являются FRS-2α и FRS-2β; любые варианты должны включать в себя, по крайней мере, один сайт, используемый для фосфорилирования, в частности по тирозину.

Фрагменты белка FRS-2 или его варианта, содержащие тирозин, представляют собой такие пептиды, которые (например, сайт-специфический протеолитический фермент, расщепленный протеазами, такими как Submaxillarus протеаза, Staphylococcus aureus V8 протеаза, пепсин, Asp-N-протеаза, химотрипсин или трипсин, или посредством химического расщепления, например, бромцианом, предпочтительно каждый получен путем протеолитического или химического расщепления FRS-2 или его варианта, полученного из биологического образца, предпочтительно из клеток, тканей или органов, наиболее предпочтительно из опухолей) содержат один или несколько частиц, содержащих тирозин, которые могут быть фосфорилированы в их цепи и при этом быть распознаны биоспецифическим реагентом распознавания, способным различать фосфорилированную и нефосфорилированную формы этих пептидов, в особенности также и от других пептидов, например от других белков. Предпочтительным является содержание во фрагментах 5 или более непрерывных аминокислот, более предпочтительно 10 или более непрерывных аминокислот, еще более предпочтительно 20 или более непрерывных аминокислот, наиболее предпочтительно 50 или более непрерывных аминокислот, исходной последовательности расщепленного белка FRS-2.

"Фосфорилированная форма" белка FRS-2, его варианта его или его фрагмента, содержащего тирозин, предпочтительно представляет собой один или более из сериновых, треониновых и (главным образом) тирозиновых фосфорилированных остатков в основном аминокислотном составе указанного белка FRS-2, его варианте или фрагменте.

Термин "биологические образцы" может, например, относиться к жидкостям организма, таким как мокрота, кровь, плазма крови, сыворотка крови, синовиальная жидкость, внутрибрюшинная жидкость, внутрилегочная жидкость или моча, или более предпочтительно к клеткам, клеточным компонентам, или к образцам тканей или органов (включая образцы из органов и, в особенности из опухолей), или их смеси из двух или более, например, образцы ткани, органа или клетки и клеточные лизаты из клеток, органов и тканей для исследований (например, из клеток, опухолей или других пораженных или предполагаемо пораженных тканей и органов). Предпочтительными являются изолированные биологические образцы. Они могут быть получены из культур или предпочтительно могут быть взяты от пациентов. В соответствии с настоящим изобретением, в способах и применениях, как правило, используются биологические образцы, то есть способы и применения желательно проводить в отсутствие пациентов, например в отдельной лаборатории или т.п. Таким образом, этапы получения биологического образца и его изучения могут быть и, предпочтительно, являются самостоятельными, в этом случае, а также способы и применения в соответствии с настоящим изобретением являются, в данном случае, независимыми от типа отбора проб или образцов. Термин "клетка", употребляемый в контексте настоящего описания изобретения, относится к клеткам, клеточным фрагментам или лизатам клеток из биологических образцов, как описано выше.

Способы и применения в соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения не включают этап получения образца от пациента, который представляет собой исключительно in vitro способ или применение, осуществляемый вне и в отсутствие организма пациента. С другой стороны, другие варианты осуществления изобретения, при которых также осуществляется такое получение образца, являются предпочтительным вариантом осуществления изобретения, где это допустимо.

Термин "реагент биоспецифического распознавания" может относиться к антителу, в отдельных случаях (особенно вторично или третично меченые молекулы биоспецифического распознавания), может относиться к антителу, связывающему белок (например, белок А или белок G бактерий), или может быть отнесен к аптамерам (включающим двухцепочечную молекулу ДНК или одноцепочечную молекулу РНК, которые связаны с конкретными молекулярными мишенями) или аффителам (белок-связывающие полипептиды, от которых может быть отделен желаемый белок и которые могут, например, быть выделены из от комбинаторной библиотеки белков).

Под общим термином "антитела" в рамках настоящего описания, и если не указано иное, предполагается включать поликлональные или моноклональные антитела, биспецифические антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела или фрагменты одного или нескольких из этих форм, которые, тем не менее, распознают, в особенности проявляют (существенно или полностью селективную) связывающую аффинность по отношению к (предпочтительно с константой диссоциации К от 10^-4 или ниже, более предпочтительно от 10^-6 или ниже, еще более предпочтительно от 10^-8 или ниже) белку FRS-2 и/или его вариантам и/или его фрагментам, содержащим тирозин, в том числе один или оба эпитопа конформационной или (предпочтительно) первичной структуры (например, содержащие фосфотирозин). Таким образом, термин "антитело" в особенности относится к белку, функционально определяемому как связывающий белок (молекула, способная связываться с конкретным эпитопом (с конформационной и/или первичной структурой) на антигене) и структурно определяемому как включающий в себя последовательность аминокислот, которая распознаваема компетентным специалистом в данной области техники, в качестве полученной из каркасного участка гена, кодирующего иммуноглобулин. В конструктивном отношении наипростейшее природное антитело (например, IgG) состоит из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, все они ковалентно связаны дисульфидными мостиками. Специфичность связывания с эпитопом обнаруживается в вариабельной (V) области Н и L цепей. Области антитела, которые в основном являются структурными, называются константными (С). Термин "антитело" включает в себя целые антитела, а также способные к связыванию фрагменты, модификации или производные антитела. Это также может быть рекомбинантный продукт или биспецифическое антитело или химерное антитело, такое как гуманизированное антитело. Антитела могут представлять собой поликлональную или (более чем одну или именно одну) моноклональную смесь. Они могут быть в виде цельных иммуноглобулинов, полученных из природного источника или природных источников, и могут быть в виде иммунореактивных (связывающих) частей интактной молекулы иммуноглобулинов. Антитела могут быть представлены в различных формах (производных), в том числе, например, в виде Fv (состоящего из V_L и V_H областей), dAB фрагмента (состоящего из V_H, области; см. Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), изолированного гипервариабельного участка, Fab-фрагмента (состоящего из V_L, V_H, C_L и C_HI области) и F(ab)₂-фрагмента (двухвалентного фрагмента, содержащего два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области), а также в виде одиночных цепей. Также могут быть использованы одноцепочечные антитела (SCA), в которых гены тяжелой и легкой цепей объединяются в одну кодирующую область. Некоторые одноцепочечные антитела являются рекомбинантными молекулами, которые содержат вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи и подходящий, связывающий их полипептидный линкер. «Распознающий» или «распознавание» в особенности означает, что происходит (предпочтительно специфичное, например, в 100 раз, предпочтительно в 1000 раз, более предпочтительно в 10000 раз, или в каждом случае константа диссоциации ниже, чем для любой другой молекулы, представленной в настоящем образце) связывание с высокой аффинностью, например с константой диссоциации 10^-4, более предпочтительно с константой диссоциации от 10^-6, еще более предпочтительно с константой диссоциации от 10^-8, или в каждом конкретном случае ниже по отношению к соответствующей молекуле, представляющей интерес молекуле.

Определение статуса фосфорилирования белка FRS-2 (во всех случаях употребления данного термина он включает, в том числе FRS-2, его вариант (в особенности, как определено выше)) или его фрагмент, содержащий (нефосфорилируемый и/или фосфорилируемый) тирозин), может, например, включать (по крайней мере, частичную) очистку белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, из биологических образцов, например, включая лизис тканей, клеток или фрагментов клеток и один или более этап обогащения, например, посредством классической хроматографии или быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC) и/или посредством электрофоретических методов, таких как двумерный электрофорез или, в особенности электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-ПААГ), более предпочтительно путем иммунопреципитации с направленным на белок FRS-2 реагентом биоспецифического распознавания, например, антителом или антителами, более предпочтительно поликлональным антителом с последующим электрофорезом в SDS-ПААГ, или посредством любого подходящего сочетания двух или более таких методов, за которыми следует отбор фосфорилированного белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, для определения наличия или суммарного содержания фосфорилированного (в частности, фосфорилированного по тирозину) белка FRS-2, его варианта или его фрагмента или содержание фосфотирозина в белке FRS-2, его варианте или его фрагменте с (меченым или немеченым самостоятельно) реагентом биоспецифического распознавания, распознающим фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент (в особенности, содержащий фосфотирозин).

"Частичная очистка" означает произведение по меньшей мере двукратного, более предпочтительно по меньшей мере пятикратного, еще более предпочтительно по меньшей мере десятикратного, наиболее предпочтительно по меньшей мере 25-кратного обогащения белка FRS-2, его варианта или его фрагмента по сравнению с другими белками, первоначально присутствующими в образце.

В качестве альтернативы, реагент биоспецифического распознавания, распознающий белок FRS-2, также может быть связан с твердофазным носителем (таким как мембрана или реакционный резервуар, например многолуночный планшет), например, ковалентно или путем адсорбции, помещен в среду, включающую белок FRS-2, для оценки качества (например, лизата ткани или клетки), с последующим определением дозы фосфорилированного (в особенности, фосфорилированного по тирозину) белка FRS-2 определяется с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать и маркировать фосфорилированный белок FRS-2, в частности, содержащий фосфотирозин.

Однако в качестве альтернативы, реагент биоспецифического распознавания конкретной фосфорилированной формы белка FRS-2, в особенности по фосфотирозину, может быть связан с твердофазным носителем (см. предыдущий абзац), помещен в среду, включающую белок FRS-2 для оценки, а затем связанный белок FRS-2 определен с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать и маркировать связанный белок FRS-2.

Этап маркировки, в каждом случае, предпочтительно включает в себя одну или несколько дополнительно меченых молекул специфического распознавания, способных прикрепляться к антителам, связанным с их эпитопом, таким как меченый белок А, меченый белок G, меченый стрептавидин, другие меченые антитела, например, специфичные для константной области антител и т.п.

В принципе, также возможно одноэтапное определение, например, с помощью реагентов биоспецифического распознавания, которые специфичны к фосфорилированным формам FRS-2, в том числе и к его вариантам или его фрагментам, а также позволяют маркировать и/или отделять их.

Кроме того, также представляется возможным определить как фосфорилированную (например, с помощью реагентов биоспецифического распознавания, прикрепляющихся только к фосфорилированным формам), так и нефосфорилированную формы (например, с помощью реагентов биоспецифического распознавания, прикрепляющихся только к нефосфорилированным формам) белка FRS-2 в образце (например, с целью установления их соотношения) и, тем самым, получить более подробную информацию о тонких различиях в образцах, включая возможность количественной оценки.

Эти или другие методы определения статуса фосфорилирования белка FRS-2 представляются возможными и, таким образом, являются частью изобретения.

Твердофазными носителями для агентов распознавания или белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, или иммунопреципитатов могут быть, к примеру, пластиковые или стеклянные сосуды или планшеты или многолуночные планшеты, употребляемые в области химии клетки и иммунохимии, или ими могут быть мембраны, например нитроцеллюлоза или PVDF мембраны.

На этапах определения маркировка реагента биоспецифического распознавания или связанной с ним, в дальнейшем меченой молекулы специфического распознавания (как указанно выше и ниже) предпочтительно проводится общепринятым путем, например, конъюгацией фермента, например с пероксидазой, такой как пероксидаза хрена, что позволяет определить присутствие связанного агента распознавания, конъюгированного с пероксидазой в обычных реакциях, таких как реакции с красителями или другими реагентами, например, с использованием системы SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate detection system (продукт компании Pierce, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA; №34075), включающей люминал полости и агент, усиливающий интенсивность света, или окрашивание 4-хлор-1-нафтолом и Н₂О₂, щелочной фосфатазой (с помощью фосфатазы/ BCIP-NBT-системы), β-галактозидазой; малатдегидрогеназой, стафилококковой нуклеазой, стероид-дельта-5-изомеразой, дрожжевой алкогольдегидрогеназой, альфа-глицерофосфат-дегидрогеназой с триоз-фосфат-изомеразой или глюкоамилазой, маркировку с составляющей частью биотин/стрептавидиновой системы (не связанной с реагентом биоспецифического распознавания), хромогенной, флуоресцирующей (например, флуоресцирующий хелат Европия или С5), хемилюминесцентной или биолюминесцентной метками, такими как флуоресцеин изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, орто-фталевый альдегид, флуорескамин или атомы металлов, вызывающие флуоресценцию, такие как европий или другие лантаноиды или радиоактивные метки и т.п., в каждом случае допускается использование известных и, в особенности, хорошо известных из уровня техники стандартных реакций обнаружения, например, с помощью способов, основанных на ферментах, окраске, хемилюминесценции, флуоресценции, биолюминесценции или радиоактивности (например, флуоресценция) или других способов обнаружения и определения количества.

В качестве альтернативы вместо непосредственной маркировки молекулы биоспецифического распознавания, связывающей фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, могут быть использованы в дальнейшем меченые молекулы биоспецифического распознавания, такие как меченые антитела или бактериальные белки (например, белок А или белок G) (меченые, например, как описано выше), которые, например, связываются с константными областями или олигосахаридами на молекулах биоспецифического распознавания, например, уже связанные антитела (например, меченые анти-мышиные или анти-кроличьи антитела), и, тем самым, позволяя использовать способ определения связанных антител, известный из уровня техники.

Фосфорилированный (главным образом, фосфорилированный по тирозину) белок FRS-2 может быть специфически распознан в каждом отдельном случае с помощью агентов биоспецифического распознавания (в особенности, антител), которые позволяют специфически распознавать эпитопы с конформационной и/или первичной структурой фосфорилированного белка FRS-2 или его фрагмента, содержащего фосфорилированные группы, в особенности, с помощью антител против фосфотирозина.

"Распознавания" или "распознавать" предпочтительно означает специфическое связывание с, например, константами диссоциации, указанными для агентов биоспецифического распознавания.

Различные антитела против фосфотирозина, которые доступны, например, из ряда коммерческих источников, пригодны для использования в способе в соответствии с настоящим изобретением. Например, PY-7E1, PY-1B2 и PY20 являются моноклональными мышиными антителами против фосфотирозина от компании Zymed (San Francisco, Calif.), по отдельности или в виде смеси имеются в продаже под торговой маркой PY-PLUS™. Компания Zymed также предлагает аффинно-очищенное поликлональное кроличье антитело против фосфотирозина Z-PY1. Клон РТ-66 мышиного антитела против фосфотирозина можно приобрести в компании Sigma (St. Louis, Mo.). Кроме того, поликлональные антитела к фосфотирозину могут быть индуцированы различными видами в соответствии с хорошо известными из уровня техники способами иммунизации. Способ производства моноклональных антител против фосфотирозина описан в патенте US4543439, содержание которого, в особенности в отношении способов получения и тестирования антител против фосфотирозина (в особенности, система отбора по специфичности, которая может быть использована для выявления других антител против фосфотирозина) и получаемых антител против фосфотирозина, включено в настоящее описание посредством ссылки.

Для достижения иммунопреципитации особенно предпочтительно могут быть использованы поликлональные или биспецифические антитела (связывающиеся с двумя различными эпитопами на антигене, в частности белка FRS-2) (с учетом формирования больших скоплений антигенов/антител), для связывания с твердофазной основой возможно использование любого из упомянутых антител или его производного, проявляющего (в особенности, специфичную) связывающую активность.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления способ или применение в соответствии с настоящим изобретением включает первичную очистку (по крайней мере, частичную), например, с помощью осаждения или связывания белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин (нефосфорилированный или фосфорилированный) - (любая из данных вариаций далее обозначается "FRS-2x"), из биологического образца, например, с первым реагентом биоспецифического распознавания (например, антителом), способным распознавать FRS-2x с последующим отделением FRS-2x от реагента биоспецифического распознавания, например, с помощью SDS-ПААГ, иммобилизируя FRS-2x, например с помощью блоттинга FRS-2x на мембране, с последующим связыванием со вторым реагентом биоспецифического распознавания (который может быть либо мечен самостоятельно, таким образом, не требуется дальнейшая реакция маркировки, либо не мечен), способным распознавать фосфорилированные FRS-2x, в особенности, по фосфотирозину, и (если второй реагент биоспецифического распознавания не мечен самостоятельно), затем дополнительное связывание меченого реагента биоспецифического распознавания (метки и меченые реагенты биоспецифического распознавания предпочтительно могут быть такими, как определено выше) со вторым реагентом биоспецифического распознавания, присоединенным к FRS-2x, и выявление связанного меченого реагента биоспецифического распознавания. Таким образом, видно присутствие FRS-2x в образце и степень его фосфорилирования, в особенности по тирозину.

Термин "фрагменты, содержащие тирозин", употребляемый на протяжении всего контекста описания настоящего изобретения, может относиться к их нефосфорилированным и/или (предпочтительно) фосфорилированным формам.

Иммунопреципитация, маркировка, блоттинг и другие используемые здесь методы можно установить из стандартных работ, таких как as Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991; E.Bast: Mikrobiologische Methoden (Microbiologic Methods), 2^nd edition, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, 2001; Hans Gunter Gassen/Gangolf Schrimpf(eds.), Gentechnische Methoden, 2^nd edition Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin, 1999, каждая из которых предпочтительно включена в описание настоящего изобретения посредством ссылки.

Способ или применение, в конкретном варианте воплощения настоящего изобретения, может также включать сравнение статуса фосфорилирования (в частности, по тирозину) белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, из биологического образца пациента с ранее определенным диапазоном в полученных от пациентов образцах, не проявляющих чувствительность к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R, и/или от пациентов, проявляющих такую чувствительность, для определения статуса фосфорилирования, достаточного для выявления восприимчивости к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R. Чем выше коэффициент фосфорилирования, тем выше вероятность ингибирования передачи сигнала через рецептор FGF-R.

Константы диссоциации, в упомянутых случаях, предпочтительно измеряются в фосфатно-буферном растворе с pH 7,4, который может быть подготовлен следующим образом: 10 литров фосфатно-буферного раствора 10×(PBS) могут быть получены путем растворения 800 г NaCl, 20 г KCl, 144 г Na₂HPO₄ и 24 г KH₂PO₄ в 8 л дистиллированной воды и доведением до 10 л. Уровень pH составляет ~ 6,8, но при разбавлении до 1×PBS он должен измениться до 7,4. После разбавления итоговая концентрация полученных компонентов 1×PBS будет следующей: 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфат, 2,7 мМ KCl, pH 7,4.

Под термином "биомаркер" (или "маркер") в настоящем документе понимается биологическая молекула (здесь, в особенности нефосфорилированный или фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин), присутствие и/или концентрация которой могут быть обнаружены и соотнесены с известным состоянием, в частности состоянием заболевания или расстройства, которое зависит от передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R и/или который проявляет восприимчивость. Он также включает в себя фрагменты (получаемые, например, обработкой протеазой (например, сайт-специфической протеазой) или подобными белкам FRS-2), которые, тем не менее, позволяют определить статус фосфорилирования белка FRS-2 (особенно включающего в свой состав фосфорилированный тирозин) или его варианта. Такие биомаркеры дифференциально присутствуют в субъектах, страдающих состояниями, такими как болезни или расстройства, которые реагируют на ингибирование передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R или его вариант, и у пациентов с заболеваниями, которые не реагируют на такое ингибирование.

Изобретение также относится к набору, который позволяет выявлять восприимчивость к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R или его вариант, состоящему из средств для определения статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в особенности средства для выявления фосфорилированного, предпочтительно, фосфорилированного по тирозину белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, в качестве биомаркера для установления такой чувствительности к ингибированию.

Набор в соответствии с настоящим изобретением может, к примеру, представлять собой набор для сэндвич-иммуноанализа (энзим-связанного иммуносорбентного анализа - ELISA) (в том числе сэндвич-ELISA или конкурентный ELISA) для флуоресцентных иммуноанализов или для других иммуноанализов или иммуноферментных анализов, таких как иммуноанализы, основанные на усиленной поверхностью лазерной десорбции/ионизации (SELDI - от англ. surface-enhanced laser desorption/ionization), Вестерн блоты, иммунопреципитации, иммуногистохимический, иммунофлюоресцентный, радиоиммунологический анализы и/или иммунорадиометрический анализ. Компоненты и ингредиенты, необходимые для таких анализов, известны из уровня техники, и набор в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере два таких компонента, которые позволяют определить статус фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин.

Наборы могут включать в свой состав биочипы, например белковые биочипы, настроенные на захват белка, например, от компаний Ciphergen Biosystems, Inc. (Fremont, CA, USA), Packard Bioscience Co. (Meriden, CT, USA), Zyomyx (Hayward, CA, USA), Phylos (Lexington, MA, USA) или Biacore (Uppsala, Sweden), которые, например, описаны в US 6225047, WO 99/51773, US 6329209, WO 00/56934 или US 5242828.

Предпочтительно, набор в соответствии с настоящим изобретением состоит из: в качестве средства для определения статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин - реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать, в особенности связываться с фосфорилированным белком FRS-2, его вариантом или его фрагментом, содержащим (предпочтительно фосфорилированный) тирозин, в особенности, с антителом, предпочтительно с антителом против фосфотирозина; а также еще более предпочтительно, из - в качестве средства для по меньшей мере частичной очистки белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин - реагента биоспецифического распознавания, способного к распознаванию, предпочтительно к иммунопреципитации белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, и меток для выявления указанного реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать, в особенности связываться с ним, белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий (предпочтительно фосфорилированный) тирозин. Метки предпочтительно могут представлять собой дополнительные молекулы биоспецифического распознавания, например, как указано выше, которые распознают (в особенности связываются с ним) реагент биоспецифического распознавания, способный распознавать (в особенности связываться с ним) фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий (фосфорилированный) тирозин, в состоянии, в котором последний присоединен к фосфорилированному белку FRS-2, к его фосфорилированному варианту или его фрагменту, содержащему фосфорилированный тирозин, которые мечены, как описано выше, например меченый белок А, меченый белок G, меченый стрептавидин, другие меченые антитела, например, для конкретной константной области антител и т.п.

Соединения, допускающие модуляцию, особенно ингибирование, передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R или его вариант, представляют собой, главным образом, модуляторы, предпочтительно ингибиторы, которые могут, например, быть выбраны из группы, состоящей из: антител (особенно гуманизированных), их фрагментов, одноцепочечных антител или других химических агентов, в особенности ингибиторов, например, одного или нескольких из упомянутых в US6774237 (включенном в настоящее описание посредством ссылки), наиболее предпочтительно соединений (конечных продуктов), попадающих под объем формулы изобретения, более предпочтительно соединений, упомянутых здесь, в частности, в качестве примера), 3-(2,6-дихлор-3,5-диметоксифенил)-1-(6-[4-(4-этил-пиперазин-1-ил)-фениламино]-пиримидин-4-ил)-1-метил-мочевины (также называемой здесь ингибитором 1, см. Пример 1), других соединений, попадающих под объем формулы изобретения, или, в особенности, упомянутых в WO 2006/000420A (включенном в настоящее описание посредством ссылки, в особенности в отношении соединений (конечных продуктов, попадающих под объем формулы изобретения, более предпочтительно упомянутых здесь, в частности, в качестве примеров), PD 17307 (ингибитор 2), или других соединений (конечных продуктов, попадающих под объем формулы изобретения) или, в особенности, упомянутых в патенте US 5,733,913 (включенном в настоящее описание посредством ссылки), в особенности в отношении конечных соединений, попадающих под объем формулы изобретения, более предпочтительно соединений, упомянутых здесь, в частности, в качестве примера), PD 166866 (J. Med. Chem. 40: 2296-2303, 1997).

На протяжении всего описания изобретения и формулы в настоящем описании изобретения слова "содержит" и "включает" и вариации данных слов, например, "содержащая" и "включающая", обычно подразумевают "включая, но не ограничиваясь", и не имеют целью исключить (и не исключают) другие частицы, добавки, компоненты, целые числа или этапы, в отличие от выражения "представлять собой" и его вариаций, таких как "представляет собой" или "представляющий собой", что означает, что компоненты и функции, к которым оно относится, ограничиваются оговоренными в контексте настоящего описания. В случае употребления слов "включает" или "включающий", там, где это уместно и целесообразно, они могут быть заменены словами "состоит из" или "состоящий из".

Любые упомянутые документы или ссылки, представленные в настоящем описании изобретения, не подразумевают признания того, что материал, на который даны ссылки, является уровнем техники, негативно сказывающимся на патентоспособности и объеме притязаний настоящего изобретения.

Описание чертежей:

На фиг.1 приводятся результаты определения фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 в клеточных линиях. В экспоненциальной фазе роста клетки лизируются (см. пример 1), и суммарные лизаты клеток подвергаются иммунопреципитации с α-FRS-2 антителом с последующим проведением иммуноблотинга с антителом против pTyr или антителом против FRS-2 или непосредственно подвергаются иммуноблотингу с антителом против pFRS2, приведенному в таблице 1 в примере 1. ВБ = Вестерн блот, ИП = иммунопреципетация, IC₅₀ = половина ингибирующей концентрации.

На фиг.2 приводятся результаты сравнительного анализа фосфорилирования белка FRS-2 после воздействия ингибитором рецептора FGF-R, PD173074 (ингибитор 1, см. способы в примере 1), на клетки RT4, и TKI258/CHIR258, 4-амино-5-фтор-3-[6-(4-метил-1-пиперазинил)-1Н-бензимидазол-2-ил]-2(1Н)-хинолинона (ингибитор 2, см. способы в примере 1) - на клетки RT112. Обработка указанных клеточных линий проводится согласно приведенной схеме. Фосфорилированный по тирозину белок FRS-2 определяется иммунопреципитацией со специфичным к FRS-2 антителом с последующим проведением анти-FRS-2 Вестерн блот анализа с помощью антитела, обнаруживающего фосфорилированный Tyr196 в FRS2. Примечание: в белке FRS-2 зачастую отмечаются различные сдвиги в электрофоретической подвижности, вызванные фосфорилированием по остаткам серин/треонина при участии митоген-активируемой протеин-киназы (Lax et al., Mol. Cell, 10, 2004, cc.709-719,). ВБ = Вестерн блот, ИП = иммунопреципетация, Ингибит.1 = ингибитор 1, ингибит.2 = ингибитор 2, ДМСО = диметилсульфоксид.

(А) = RT4 - линия клеток рака мочевого пузыря

(Б) = RT112 - линия клеток рака мочевого пузыря

На фиг.3 приводятся результаты сравнительного анализа фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 при стимуляции фактором роста: линии клеток рака мочевого пузыря RT112 и RT2 стимулируются aFGF/гепарином (50 нг/мл // 5 мкг/мл), ЭФР (10 нг/мл) - (от R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA; №236-EG-200) или инсулином (5 мкг/мл) (Sigma, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, МО, USA; №1882). Клетки лизируют и получают суммарные лизаты белка. Фосфорилирование по тирозину белка FRS-2 определяется посредством иммунопреципитации, за которой следует Вестерн блот анализ с антителами против pTyr с использованием антител, упомянутых в таблице 1 примера 1. Суммарные лизаты клеток подвергаются проверке на активацию митоген-активируемой протеинкиназы (далее МАРК - от англ. Mitogen-Activated Protein Kinase) Вестерн блот методом с антителом против фосфо-МАРК (рМАРК антитело в таблице 1 Примера 1). Равное количество белка МАРК контролируется Вестерн блот методом с помощью α-МАРК (МАРК в таблице 1 примера 1). ВБ = Вестерн блот, ИП = иммунопреципетация. Контр. = контроль (без стимуляции), INS = инсулин.

На фиг.1-3, ссылаясь на таблицу 1 примера 1, антитело №sc-8318 от Santa Cruz используется для иммунопреципитации, когда Вестерн блот осуществляется с помощью PTyr-антитела; антитело №05-502 используется для иммунопреципитации, когда Вестерн блот осуществляется с помощью антитела против FRS-2. Антителом для проведения Вестерн блот анализа FRS-2 является №Sc-8318 от Santa Cruz. "№" - обозначает номер по каталогу.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Далее упоминаются некоторые предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, другие предпочтительные варианты осуществления изобретения могут, как уже упоминалось выше, быть получены путем замены одного или более терминов, описывающих предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, на определения, приведенные выше или в примерах.

(А1) В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретение относится к способу идентификации клеток, проявляющих чувствительность к модуляции, особенно к ингибированию, передачи сигнала в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, включающему определение статуса фосфорилирования субстрата 2 (FRS-2) рецептора FGF-R, его варианта или фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, в качестве биомаркера для установления такой чувствительности к ингибированию, где статус фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 используется в качестве биомаркера.

(А2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу согласно (А2), при котором успешное обнаружение фосфорилирования, особенно по тирозину, в белке FRS-2 или его варианте, в отсутствие модулятора, особенно FGF, используется в качестве индикатора того, что ингибирование передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, может быть эффективным для воздействия на передачу сигнала, особенно для ингибирования передачи сигнала.

(A3) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с (А2) или (A3), при котором статус фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце после инкубации в присутствии и в отсутствие ингибитора передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, сравнивается с целью выявления клеток, реагирующих на введение ингибитора, где обнаружение ингибирования фосфорилирования принимается за вероятность возникновения ответной реакции.

(А4) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (A1)-(A3), при котором термин «рецептор FGF-R или его варианты» включает в себя все те формы или варианты рецептора FGF-R, которые, тем не менее, являясь активными вследствие связывания (предпочтительно с константой диссоциации от 10^-3 и более, более предпочтительно от 10^-5 и более, еще более предпочтительно от 10^-7 и более) одного или более фактора роста фибробластов, или, предпочтительно конститутивно активными, способны к фосфорилированию белка FRS-2 для получения его формы, содержащей фосфотирозин, как показывает пример с антителом против фосфотирозина, и которые содержат, предпочтительно состоят из, последовательности, которая идентична на 70% или более, более предпочтительно которая идентична по меньшей мере на 85% или более, еще более предпочтительно которая идентична на 90% или более, намного более предпочтительно идентична на 95% или более, наиболее предпочтительно на 98% или более идентична любому из рецепторов FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 или FGF-R4 соответственно, и где термин «субстрат 2 (FRS-2) рецептора FGF-R, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, включает такие формы белка FRS-2, которые, тем не менее, могут прикрепляться к рецепторам FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 и/или FGF-R4, в особенности таким вариантам белка FRS-2, которые идентичны на 70% или более, более предпочтительно идентичны по меньшей мере почти на 85% или более, еще более предпочтительно идентичны почти на 90% или более, намного более предпочтительно идентичны почти на 95% или более, наиболее предпочтительно на 98% или более идентичны FRS-2α или FRS-2β, или их фрагментам, содержащим фосфотирозин.

(А5) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (A1)-(А4), включающему по меньшей мере частичную очистку белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин и последующее определение наличия или содержания фосфорилированного, особенно фосфорилированного по тирозину, с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, в особенности, содержащего фосфотирозин, при котором либо указанный реагент биоспецифического распознавания, либо в дальнейшем молекула биоспецифического распознавания, способная связываться с указанным реагентом биоспецифического распознавания, маркируется и вводится, что позволяет обнаружить фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента.

(А6) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу по (А5), при котором реагент биоспецифического распознавания представляет собой антитело.

(А7) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (А1)-(А6), при котором белок FRS-2, содержащий фосфотирозин, его вариант, содержащий фосфотирозин, или его фрагмент, содержащий фосфотирозин, используется в качестве биомаркера, указывающего на клетки, проявляющие чувствительность к модуляции, особенно к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, и, предпочтительно, включает в себя применение реагента биоспецифического реагента распознавания в форме антитела против фосфотирозина для определения наличия или содержания фосфорилирования по тирозину в указанном белке FRS-2, его варианте или его фрагменте.

(А8) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (А1)-(А7), при котором клетки, чувствительные к модуляции, особенно ингибированию, передачи сигнала через рецептор FGF-R, различаются от клеток, которые пролиферируют, независимо от рецепторов FGF-R, в особенности там, где в клетках, чувствительных к ингибированию, отмечается FGF-независимое, более предпочтительно конститутивное, фосфорилирование белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в особенности фосфорилирование по тирозину.

(А9) В следующем своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (А1)-(А8), при котором отсутствие фосфорилирования белка FRS-2, в особенности отсутствие фосфорилирования в отсутствие белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, принимается в качестве доказательства невозможности ингибирования передачи сигнала через рецептор FGF-R под действием ингибитора передачи сигнала через рецептора FGF-R.

(Б1) Кроме того, предпочтительно изобретение относится к способу определения фосфорилирования (в особенности по фосфотирозину) в белке FRS-2, его варианте или его фрагменте, содержащем тирозин, в качестве биомаркера для клеток, тканей или органов, проявляющих гиперактивность, в особенности конститутивно активированную, передачу сигнала через рецептор FGF-R, в особенности, поддающиеся воздействию ингибиторами рецептора FGF-R или его варианта, и, реагирующих на такие ингибиторы, где указанный способ или применение включает выявление наличия фосфорилированного тирозина в белке FRS-2, в его варианте или в его фрагменте, содержащем тирозин, из биологического образца с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфотирозин в белке FRS-2, эффективно обнаруживать фосфорилирование, указывающее на гиперактивную, в особенности конститутивно активированную, передачу сигнала через рецептор FGF-R.

(Б2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с (Б1), дополнительно включающему, с целью различения восприимчивых клеток, тканей или органов от клеток, тканей или органов, не восприимчивых к ингибиторам передачи сигнала, в котором участвует рецептор FGF-R или его вариант, сравнение статуса фосфорилирования по тирозину в отсутствие или в присутствии ингибитора передачи сигнала, опосредованной рецептором FGF-R или его вариантом, и где снижение фосфорилирования по тирозину в присутствии ингибитора указывает на такую восприимчивость.

(Б3) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с (Б1) или (Б2), при котором степень фосфорилирования по тирозину белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце после инкубации в присутствии и в отсутствие ингибитора передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, сравнивается с целью выявления клеток, реагирующих на воздействие ингибитора, где обнаружение частичного или полного ингибирования фосфорилирования, то есть уменьшение фосфорилирования, принимается за вероятность возникновения такой реакции.

(Б4) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (Б1)-(Б3), при котором термин «FGF-R или его варианты» включает в себя все те формы или варианты рецептора FGF-R, которые тем не менее, являясь активными вследствие связывания (предпочтительно с константой диссоциации 10^-3 или более сильной, более предпочтительно от 10^-5 и более, намного более предпочтительно от 10^-7 и более) одного или более фактора роста фибробластов, или, предпочтительно, конститутивно активными, способны к фосфорилированию белка FRS-2 для получения его формы, содержащей фосфотирозин, как показывает пример с антителом против фосфотирозина, и которые содержат, предпочтительно состоят из, последовательности, которая идентична на 70% или более, более предпочтительно идентична по меньшей мере на 85% или более, еще более предпочтительно идентична на 90% или более, намного более предпочтительно идентична на 95% или более, наиболее предпочтительно идентична на 98% или более, по сравнению с любым из рецепторов FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 или FGF-R4 соответственно, и где термин «FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин», включает такие формы белка FRS-2, которые, тем не менее, могут прикрепляться к рецепторам FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3 и/или FGF-R4, в особенности таким вариантам белка FRS-2, которые идентичны на 70% или более, более предпочтительно идентичны по меньшей мере почти на 85% или более, еще более предпочтительно, идентичны почти на 90% или более, намного более предпочтительно, идентичны почти на 95% или более, наиболее предпочтительно, идентичны на 98% или более FGF-2α или FRS-2β, или их фрагментам, содержащим фосфотирозин.

(Б5) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (Б1)-(Б4), включающему по меньшей мере частичную очистку белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, и последующее определение наличия или содержания фосфотирозина в указанном белке FRS-2, в его указанном варианте или в его указанном фрагменте, содержащем тирозин, с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать указанный фосфотирозин, при котором либо указанный реагент биоспецифического распознавания, либо в дальнейшем молекула биоспецифического распознавания, способная связываться с указанным реагентом биоспецифического распознавания, маркируется и вводится, таким образом, позволяя обнаружить фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента.

(Б6) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу по (Б5), при котором реагент биоспецифического распознавания представляет собой антитело против фосфотирозина.

(Б7) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (Б1)-(Б6), при котором белок FRS-2, содержащий фосфотирозин, его вариант, содержащий фосфотирозин, или его фрагмент, содержащий фосфотирозин, используется в качестве биомаркера, указывающего на клетки, проявляющие чувствительность к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, и, предпочтительно, включает в себя использование реагента биоспецифического распознавания в форме антитела против фосфотирозина для определения наличия или содержания фосфорилирования по тирозину в указанном белке FRS-2, его варианте или его фрагменте.

(Б8) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (Б1)-(Б7), при котором клетки, восприимчивые к модуляции, в особенности к ингибированию, передачи сигнала через рецептор FGF-R, отличаются от таких клеток, которые пролиферируют, независимо от рецепторов FGF-R, в особенности там, где отмечается FGF-независимое, более предпочтительно конститутивное, фосфорилирование белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, особенно фосфорилирование по тирозину.

(Б9) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (Б1)-(Б8), при котором отсутствие фосфорилирования по тирозину белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, принимается в качестве доказательства невозможности ингибирования передачи сигнала через рецептор FGF-R под действием ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R.

(Б10) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу в соответствии с любым из (Б1)-(Б10), включающему:

а) контактирование биологического образца с реагентом биоспецифического распознавания, способного распознавать белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин;

б) определение статуса фосфорилирования по тирозину с помощью реагента биоспецифического распознавания, содержащего фосфотирозин; и

в) соотнесение статуса фосфорилирования с чувствительностью к ингибированию передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R), и/или состояния заболевания и/или эффективности лечения.

(В1) В еще одном своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к набору, состоящему из реагента биоспецифического распознавания для рецептора FGF-R или его варианта и реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, для использования при идентификации клеток из биологического образца, особенно клеток, тканей или органов, проявляющих чувствительность к модуляции, в особенности к ингибированию, передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R). Указанный набор состоит из средств для определения статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологических образцах, в качестве биомаркера такой чувствительности к ингибированию, средств для определения статуса фосфорилирования, реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, из них (в особенности антитело против фосфотирозина) для идентификации клеток, тканей или органов, чувствительных к модуляции, особенно к ингибированию, передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R), включая определение статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в особенности, для возможности определения гиперактивности передачи сигнала через рецептор FGF-R, в особенности, конститутивной активации передачи сигнала через рецептор FGF-R.

(B2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к набору согласно (В1), в котором реагент биоспецифического распознавания, способный распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, представляет собой антитело против фосфотирозина, а реагент биоспецифического распознавания рецептора FGF-R или его варианта представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.

(B3) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к набору в соответствии с (В1) или (В2), состоящему из средств определения статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать, в особенности прикрепляться к нему, фосфорилированного белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего (предпочтительно фосфорилированный) тирозин, в особенности антитела, главным образом антитела против фосфотирозина; и, кроме того, средства по меньшей мере частичной очистки белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, - реагента биоспецифического распознавания, способного к распознаванию, предпочтительно к иммунопреципитации белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, и метки для выявления указанного реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать, в особенности прикрепляться к нему, белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий фосфорилированный тирозин.

(Г1) В следующем своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к реагенту биоспецифического распознавания, способному распознавать фосфорилированную форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, для идентификации клеток (в особенности в биологическом образце, наиболее предпочтительно пациента), которые проявляют чувствительность к модуляции, в особенности к ингибированию, передачи сигнала, в которой участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, в особенности клеток, которые проявляют гиперактивность, в особенности, конститутивную активацию передачи сигнала через рецептор FGF-R, где указанная идентификация предпочтительно состоит из определения статуса фосфорилирования указанного белка FRS-2, его варианта или его фрагмента; где обнаружение фосфорилирования в отсутствие модуляции предпочтительно означает вероятность восприимчивости к указанному ингибированию. Более предпочтительно, агент биоспецифического распознавания используется для определения состояния пациента, реагирующего на лечение посредством ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R.

(Г2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к реагенту биоспецифического распознавания в соответствии с (Г1) для идентификации клеток, которые проявляют гиперактивность, в особенности FGF-независимую активацию, в особой степени, конститутивную активацию передачи сигнала через рецептор FGF-R.

(Г3) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к реагенту биоспецифического распознавания в соответствии с любым из (D1)-(D2), который способен определять фосфорилированную по тирозину форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, более предпочтительно, который представляет собой антитело против фосфотирозина.

(Д1) Тем не менее, в следующем своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, для производства диагностикума для идентификации клеток из числа клеток или тканей, восприимчивых к модуляции передачи сигнала, в котором участвует рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант. Указанная идентификация заключается в определении статуса фосфорилирования субстрата 2 (FRS-2) рецептора FGF-R, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, где реагент биоспецифического распознавания, способный выявлять фосфорилированную по тирозину форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, более предпочтительно представляет собой антитело против фосфотирозина.

(Д2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению в соответствии с (Д1), для выявления клеток, проявляющих гиперактивность, предпочтительно FGF-независимую активацию, наиболее предпочтительно конститутивную активацию передачи сигнала через рецептор FGF-R.

(Е1) В очередном своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент для выявления клеток, пригодных для идентификации соединений, модулирующих передачу сигнала через рецептор FGF-R, где реагент биоспецифического распознавания способен определять фосфорилированную по тирозину форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, более предпочтительно представляет собой антитело против фосфотирозина.

(Е2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению в соответствии с (Е1), предусматривающему сравнение степени фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в отсутствие и в присутствии известного ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, снижение фосфорилирования в присутствии ингибитора указывает на клетки, используемые для выявления других ингибиторов.

(Ж1) В следующем своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу определения клеток, пролиферация которых требует FGF-независимой, в особенности конститутивной, активации рецептора FGF для пролиферации и которые реагируют на ингибирование передачи сигнала через рецептор FGF-R, состоящему из:

а) испытания образца изолированных клеток и тканей в среде без ингибитора рецептора FGF-R и параллельного испытания образца в среде с ингибитором рецептора FGF-R при отсутствии FGF,

б) по меньшей мере частичной очистки белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, из указанных образцов;

в) определения статуса фосфорилирования белка FRS-2 в указанных образцах; и

д) сравнения статуса фосфорилирования в образцах, обработанных ингибитором, со статусом фосфорилирования в образцах, не обработанных ингибитором, снижение фосфорилирования в присутствии ингибитора указывает на клетки, подходящие для определения ингибиторов, которые пригодны для лечения состояния, включающего в себя гиперактивность передачи сигнала через рецептор FGF-R, где определение статуса фосфорилирования на этапе в) осуществляется с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного определять фосфорилированную по тирозину форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, более предпочтительно с помощью антитела против фосфотирозина.

(З1) Тем не менее, в следующем своем предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к применению реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированный белок FRS-2, его вариант или его фрагмент, содержащий тирозин, для выявления потенциальных ингибиторов передачи сигнала через рецептор FGF-R, включающему определение с помощью указанного реагента статуса фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, и, в случае обнаружения фосфорилирования, сравнение степени фосфорилирования в присутствии тестируемого соединения со степенью фосфорилирования в его отсутствии, уменьшение фосфорилирования свидетельствует о пригодности тестируемого соединения в качестве ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, где реагент биоспецифического распознавания способен идентифицировать фосфорилированную по тирозину форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, более предпочтительно представляет собой антитело против фосфотирозина.

(З2) В другом своем предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению в соответствии с (З1), при котором биологический образец проявляет гиперактивность, в особенности, независимую от рецептора FGF-R, главным образом, конститутивную активность передачи сигнала через рецептор FGF-R.

(И1) В следующем своем предпочтительном варианте осуществления изобретение, относящемся к способу диагностики заболевания, поддающегося лечению посредством ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, заключающемся в выявлении фосфорилированной формы белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце пациента, при котором выявление предпочтительно происходит с помощью реагента биоспецифического распознавания, способного распознавать фосфорилированную по тирозину форму белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в особенности, антитело против фосфотирозина.

(И2) Более предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является в соответствии с (И1) способ выявления гиперактивности, в особенности FGF-независимой, в особой степени, конститутивной, активации передачи сигнала через рецептор FGF-R, в биологическом образце, взятом от пациента, который является наглядным для выявления фосфорилированного по тирозину белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего часть тирозина, в особенности, также и в отсутствие ЭФР или других возбудителей передачи сигнала через рецептор FGF-R.

Во всех предыдущих и последующих вариантах воплощения настоящего изобретения определяемое отсутствие фосфорилирования предпочтительно служит для выявления клеток в биологических образцах, от которых не ожидается реакции на ингибирование передачи сигнала через рецептор FGF-R, что позволяет, благодаря клеткам или тканям, полученным из таких образцов, например, выявлять больных с такими состояниями и, таким образом, пациентов, не восприимчивых и, следовательно, не подлежащих лечению посредством ингибитора передачи сигнала через рецептор FGR-R, таким образом, позволяя избежать ненужного воздействия курсом лечения, включающим такие ингибиторы, а с другой стороны, определяемое отсутствие, в особенности позволяет выявлять больных на основе взятых от них биологических образцов, проявляющих, предпочтительно конститутивное (имеется в виду, например, несмотря на отсутствие FGF или других активаторов передачи сигнала через рецептор FGF-R) фосфорилирование (в особенности по тирозину) белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего частицу тирозина, в особенности восприимчивых (биологический образец, показывающий уменьшение фосфорилирования по тирозину в присутствии ингибитора) к ингибитору передачи сигнала через рецептор FGF-R и, таким образом, позволяющие рассматривать возможность их лечения с помощью ингибитора передачи сигнала через рецептор FGF-R, в виде лекарственного средства.

Наиболее предпочтительными являются варианты воплощения изобретения, которые связаны с успешной идентификацией фосфорилирования по тирозину в белке FRS-2, его варианте или его фрагменте, содержащем тирозин, в биологическом образце в отсутствие модулятора передачи сигнала через рецептор FGF-R, в особенности FGF, что означает, что клетки проявляют активность передачи сигнала через рецептор FGF-R (например, гиперактивность или конститутивную активность), которая должна быть доступна для ингибирования передачи сигнала через рецептор FGF-R.

При наличии вероятности того, что ингибитор окажет благоприятное влияние на состояние, требующее лечения, во время лечения в биологическом образце от соответствующего пациента будет отмечаться уменьшение степени фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, у пациента. Это предпочтительный вариант. Однако и наоборот, если активатор благоприятно влияет на состояние, требующее лечения, во время лечения в биологическом образце соответствующего пациента будет отмечаться повышение степени фосфорилирования белка FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, у пациента.

Наиболее предпочтительными являются способы и компоненты, представленные в примерах, а также упомянутые здесь антитела для применения в одном из патентоспособных способов или применений.

Настоящее изобретение также относится к содержимому реферата, включенному здесь посредством ссылки.

Примеры

Настоящее изобретение продемонстрировано на приведенных ниже примерах, не ограничивающих его объем притязаний.

Пример 1: Иммунопреципитация и Вестерн блот анализ для распознавания фосфорилирования белка FRS-2 в клеточных линиях

1 Способы

1.1 Характеристики клеточных линий и культур клеток

(АТСС: American Type Culture Collection = Американская коллекция типовых культур, открыта для доступа через LGC Promochem GmbH, Mercatorstr. 51, Wesel, Germany или http://www.lgcpromochem-atcc.com/:

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH = Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Braunschweig, Germany).

RT112: переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря человека, образовавшаяся в результате первичного рака мочевого пузыря, степень злокачественности - G2, стадия не зарегистрирована (Masters et al., Cancer Res., 46, 1986, сс.3630-3636). Клетки получены из DSMZ ACC №418.

RT4: переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря человека, образовавшаяся в результате рецидивирующего рака мочевого пузыря, степень злокачественности - G1, стадия Т2. (Masters et al., 1986, loc.cit.). Клетки получены из АТСС №НТВ-2.

VMCUB-1: переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря человека, образовавшаяся в результате первичного рака мочевого пузыря. Стадия и степень злокачественности не зарегистрированы (Masters et al., 1986, loc.cit.). Клетки получены из DSMZ ACC №400.

J82: переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря человека, образовавшаяся в результате первичного рака мочевого пузыря, степень злокачественности - G3, стадия Т3 (Masters et al., 1986, loc.cit.). Клетки получены из АТСС №НТВ-1.

НТ1197: переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря человека, образовавшаяся в результате рецидивирующего рака мочевого пузыря, степень злокачественности - G4, стадия Т2 (Masters et al., 1986, loc.cit.). Клетки получены из АТСС №CRL-1473.

Линии клеток рака мочевого пузыря выращиваются в среде MEM на растворе Эрла (минимальная питательная среда Игла с солями Эрла - англ. MEM EBS - Minimum Essential Medium with Earls Basal Salts) (Amimed, Allschwil, Switzerland, №1-31F0-I) с добавлением 1% L-глютамина (Amimed, №5-10K00-H), 1% MEM NEAA (раствор заменимых аминокислот MEM Игла - англ. MEM Non-Essential Amino Acid Solution). (Amimed №5-13K00-H), 1% натрия пирувата (Amimed, №5-60F00-H) и 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Gibco, Invitrogen AG, Basel, Schweiz, №10082-147).

SUM52: линия клеток рака молочной железы человека, полученная из образца плеврального выпота больного раком молочной железы (Ethier et al., Cancer Res., 56, 1996, cc.899-907; Forozan et al., Br. J. Cancer, 81, 1999, cc.1328-34). Данная клеточная линия предоставлена Dr. N Hynes, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland.

Клетки SUM52, выращенные в питательной среде HAM'S F12 (Amimed, №1-14F01-I) с добавлением 1% L-глютамина (Amimed, №5-10К00-Н), 2% ФБС (Gibco, №10082-147), 0,1% БСА (Gibco, №15260-037), 10mM, буферного раствора HEPES (Gibco, №15630-56), 10 мкМ ТЗ (Sigma, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, МО, USA, №T6397), 1 мкг/мл гидрокортизона (Sigma, №H0888) и смеси инсулин-трансферин-селен-Х (Gibco, №51500-056).

ОРМ2 и KMS11: линии клеток множественной миеломы (ММ) человека, полученные от пациентов на терминальной стадии заболевания. Клетки ОРМ2 получают из DSMZ АСС №50

Клетки KMS11 предоставлены Dr. T Otsuki, Kawasaki Medical School, Okayama, Japan. Согласно полученным данным обе клеточные линии несут транслокацию-t(4;14) и экспрессируют модифицированную, конститутивно активированную форму рецептора FGF-R3. В частности, клетки ОРМ2 скрывают мутации в АТФ-связывающем участке домена киназы, приводя к замене лизина в положении 650 на глутаминовую кислоту. Клетки KMS11 скрывают мутацию во внеклеточном домене рецептора, заменяя тирозин в позиции 373 на цистеин. Обе линии клеток выращиваются в питательной среде RPMI 1640 (Gibco, №21875) с дополнением 1% L-глютамина (Amimed, №5-10К00-Н) и 20% ЭБС (ФБС) (Gibco, №10082-147).

1.2 Антитела

Используемые в настоящем описании антитела приведены в таблице 1:

Santa Cruz: Sant Cruz Biotechnology, Inc.;

Upstate Biotechnology: Upstate Biotechnology, Inc., в настоящее время входит в состав Millipore Corp., Billerica, MA, USA;

Cell Signaling: Cell Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA;

Amersham: Amersham pie, Buckinhamshire, United Kingdom, в настоящее время входит в состав GE Healthcare.

1.3 Соединения, ингибирующие рецептор FGF-R

PD 173074 (также называемый здесь ингибитором 1), ингибитор, направленный на рецептор FGF-R от компании Parke Davis (см. Mohammadi et al., EMBO J., 17, cc.5896-5904), специфичность и эффективность которого подтверждена. Ингибитор 1 имеет следующую формулу:

TKI258/CHIR258 (также называемый здесь ингибитором 2), ингибитор, направленный на рецептор FGF-R, от компании Chiron, активность которого подтверждена в отношении рецепторов FGFR1, FGFR2 и FGFR3. Ингибитор 2 имеет следующую формулу:

1.4 Иммунопреципитация / Вестерн блот

Клетки растворяли в 1% Triton экстракционном буфере, содержащем ингибиторы протеазы и фосфатазы ("буфер для лизиса" 50 мМ трис pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭГТК (этиленгликольтетрауксусная кислота), 5 мМ ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота), 1% Triton, 2 мМ NaVanadate (натрия ванадат), 1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонил фторид) и ингибирующую протеазу смесь - продукт Hoffmann-LaRoche, Basel, Switzerland, №1187358001). Лизаты очищали центрифугированием при 12000 G в течение 15 минут и концентрат белка определяли с помощью DC™ Protein Assay Reagents (продукт компании Bio Rad, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA, №500-0116) (анализ основан на методе Bradford, М., см. Anal. Biochem., 72, 1976, с.248, с использованием Coomassie Blue®, продукта компании ICI) и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве стандарта.

Иммунопреципитации осуществлялись посредством инкубации равных количеств белка с 1 мкг антител, указанных в фигурах, в течение 2 часов на льду. Иммунокомплексы собирались на белок А или белок G сефарозе (продукты Sigma, №Р-9424 и №Р-3296 соответственно) и трижды промывались буфером для лизиса. Связанные белки расщепляли кипячением в 2Х буфере для образцов (20% SDS (додецил-сульфат натрия), 20% глицерина, 160 мМ Трис pH 6,8, 4% β-меркаптоэтанола, 0,04% бромфенола синего).

Образцы (суммарный лизат клеток или иммунокомплексы) подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-ПААГ) и белки переносили с геля путем наложения (блоттинга) на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (фильтр). Перед добавлением первичных антител фильтры блокировали в 20% лошадиной сыворотке (inVitromex, Geilenkirchen, Germany; №S092I) или 5% молоке в случае с α-FGF-R3 (антитело против рецептора FGF-R3, "α-Х", как правило, означает антитело против X, а Х означает мишень антитела), циклин D1 или тубулин Вестрн блот анализы. Белки визуализировались конъюгированными пероксидазой антимышиными или антикроличими антителами с помощью системы SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate detection system (продукт компании Pierce, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA, №34075, включая люминал и усиливающий агент (энхансер) интенсивности света). Мембраны очищали в 62,5 мМ трис-HCl с pH 6,8; 2% SDS (додецил-сульфат натрия); 1/125 β-меркаптоэтаноле в течение 30 мин при 60°С.

2 Результаты

2.1 Фосфорилирование по тирозину белка FRS-2 в линиях клеток рака, пролиферация которых зависит от передачи сигнала через рецептор FGF-R

Так как белок FRS-2 является субстратом рецепторов FGF-R, мы исследовали уровни содержания фосфотирозина в белках FRS-2 в клеточных линиях, которые восприимчивы к ингибиторам рецептора FGF-R и которые, возможно, имеют высокую активность рецептора FGF-R по сравнению с резистентными клеточными линиями.

Линии клеток рака мочевого пузыря RT4 и RT112, линии клеток множественной миеломы ОРМ2 и KMS11, а также линии клеток рака молочной железы SUM52 зависят от одного из рецепторов FGF-R, и их рост ингибируется ингибитором 1 и/или ингибитором 2. И наоборот, линии клеток рака мочевого пузыря J82, VMCUB1 или НТ1197 устойчивы к ингибированию ингибитором 1 и ингибитором 2. Точнее, экспрессия рецепторов FGF-R1, FGF-R2 и FGF-R4 определялась с помощью Вестерн блота с использованием соответствующих специфических антител: sc-121 (Santa Cruz), sc-122 (Santa Cruz) and sc-124 (Santa Cruz). Для определения экспрессии рецептора FGF-R3, в первую очередь, рецептор FGF-R3 подвергался иммунопреципитации с антителом F-0425 от компании Sigma, а иммунокомплексы подвергались Вестерн блоту с антителами F-0425 от компании Sigma. Пролиферация клеток измерялась в 96-луночных планшетах. Клетки отбирались в объеме 100 мкл на лунку в вышеуказанной питательной среде. Для RT112, RT4 и SUM52 отобрано 8500 клеток/лунку, для VMCUB1, J82, НТ1197 и KMS11 отобрано 5000 клеток/лунку, для ОРМ2 отобрано 30000 клеток/лунку. Спустя 24 часа после посева в указанном порядке добавляли среду, содержащую ингибитор 1 рецептора FGF-R, ингибитор 2 рецептора FGFR или (в качестве контроля) ДМСО. Через 72 часа клетки фиксировали добавлением 25 мкл/лунку глютаральдегида (20%) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем клетки дважды промывали Н₂О по 200 мкл/лунку и добавляли 100 мкл метиленового синего (0,05%). После 10 минут инкубации при комнатной температуре клетки три раза промывали Н₂О по 200 мкл/лунку. При добавлении 200 мкл/лунку HCl (3%) и инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре на планшетном шейкере определяли оптическую плотность (OD при λ=650 нм). Концентрацию ингибитора 1, обеспечивающая 50% ингибирование пролиферации, рассчитывали с использованием модуля Excel. Результаты приведены в таблице 2.

Зависимость рецептора FGF-R, так же как и восприимчивость к ингибитору 1 и/или ингибитору 2 для каждой из указанных клеточных линий, характеризуется, как описано выше. Влияние ингибитора 1 и ингибитора 2 на жизнеспособность клеток оценивали посредством анализов пролиферативной активности; обозначенная половина ингибирующей концентрации (IC₅₀) является средним показателем IC₅₀, исходя из нескольких независимых анализов (их количество обозначено N).

Уровни содержания фосфотирозина белков FRS-2 повышались во всех клеточных линиях, восприимчивых к ингибиторам рецепторов FGF-R, но не были определены или имели низкие значения в невосприимчивых клеточных линиях J82, НТ1197, VMCUB1 (Фиг.1).

2.2 Блокирование фосфорилирования по тирозину белка FRS-2 посредством ингибирования рецептора FGF-R

Специфичный ингибитор рецептора FGF-R (ингибитор 1) и ингибитор рецептора FGF-R (ингибитор 2), прекращают фосфорилирование по тирозину белка FRS-2 в линиях клеток рака, проявляющих ингибирование роста с помощью соединения. Данный результат показывает, что в этих линиях клеток рецепторы FGF-R отвечают за фосфорилирование белка FRS-2. (Фиг.2).

Указанные линии клеток рака рассматриваются, как показано в обозначениях на Фиг.1 и на самой Фиг.2. Примечание: в белке FRS-2 часто отмечаются различные электрофоретические изменения, вызванные фосфорилированием по остаткам серин/треонин по МАРК (Lax et al., 2002).

2.3 Индуцирование лигандом рецептора FGF-R, а не рецепторов EGF-R или INS-R фосфорилирования белка FRS-2

Проведено исследование возможности активации других RTK, не связанных с рецептором FGF-R, модулировать фосфорилирование белка FRS-2. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и инсулин активируют МАРК в клетках RT112, однако они не индуцируют фосфо-РР8-2. Аналогичным образом, ЭФР стремительно индуцирует рМАРК, но не фосфо-PRS-2 в клетках RT4. Как и ожидалось, aFGF эффективно увеличивает содержание фосфотирозина белка FRS-2 в клеточных линиях (Фиг.3).

3. Обсуждение

Как показали исследования, белок FRS-2 является субстратом 5'-3' дирекционного типа членов семейства рецепторов FGF-R, а также играет решающую роль в качестве связывающей молекулы для множества белков, участвующих в трансдукции сигнала через рецептор FGF-R.

Мы определили группу линии клеток рака человека, которые демонстрируют значительное повышение уровней фосфо-FRS-2 и которые проявляют высокую восприимчивость к ингибированию рецептора FGF-R, что указывает на активную передачу сигнала через FGF-R-FRS-2 в этих линиях клеток. В подтверждение к сказанному, специфичный к рецептору FGF-R ингибитор (ингибитор 1) полностью ингибирует фосфорилирование белка FRS-2. Кроме того, только лиганд рецептора FGF-R, aFGF, но не лиганды EGF-R или INS-R, может способствовать дальнейшему увеличению фосфорилирования белка FRS-2.

Таким образом, данные результаты подтверждают эффективность фосфо-FRS-2 в качестве биомаркера для отбора типа клеток, в особенности типов клеток пациентов, и, следовательно, групп пациентов с конститутивной передачей сигнала через рецептор FGF-R и, следовательно, со способностью реагировать на ингибиторы рецептора FGF-R.

Кроме того, представляется возможным отбор линий клеток, пригодных для применения в экспериментах с ингибиторами, что позволяет установить соответствующие тест-системы для скрининга потенциальных лекарственных средств.

Реферат

Изобретение относится к области биохимии. Способ идентификации клеток, которые показывают восприимчивость к ингибированию передачи сигнала, в которую вовлечены рецептор фактора роста фибробластов (FGF-R) или его вариант, включающий определение статуса фосфорилирования субстрата 2 рецептора FGF-R (FRS-2), его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в биологическом образце, в качестве биомаркера такой чувствительности к ингибированию, где в отношении клеток, которые показывают фосфорилирование тирозина FRS-2, можно ожидать, что они покажут восприимчивость к ингибированию передачи сигнала с участием FGF-R. Способ идентификации фосфорилирования в FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащих тирозин, в качестве биомаркера для клеток, тканей или органов. Применение идентификации фосфорилирования в FRS-2, его варианта или его фрагмента, содержащего тирозин, в качестве биомаркера для клеток, тканей или органов, которые показывают гиперактивную передачу сигнала с участием FGF-R. Применение реагента биоспецифического распознавания FGF-R. Способ идентификации клеток, пролиферация которых требует активации рецептора FGF-R. Использование заявленного изобретения позволяет эффективно идентифицировать клетки, которые показывают восприимчивость к ингибированию передачи сигнала, в которую вовлечены рецептор FGF-R, и клеток, пролиферация которых требует активации рецептора FGF, а также осуществляют идентификацию фосфорилирования идентификации фосфорилирования в FRS-2. 5 н. и 5 з.п.ф-лы, 2 табл., 3 ил., 1 пр.

Формула