Способ получения днк для диагностики н @ -а, н @ -в-гепатита - SU1711676A3

Описание

Изобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики заболевания Hu-А, Ни-В-гепатита.

Предложен способ получения ДНК, предусматривающий предварительную стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22, осаждение полиэтиленгликолем , (ПЭГ 6000) при конечной концентрации 10%, отделение осадка, растворение его в буфере, встряхивание с фреоном в соотношении 1:1, отделение фреоновой фазы, осаждение ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обработку РНК:азой и ДНК- азой, фракционирование в градиенте1 хлористого цезия, отделение фракции с плотностью 1,3 г/мл, диализ, обработку пол; ученной фракции протеиназой К, экстракцию 80%-ным фенолом и хлороформом,

обработку ДНК рестриктазой Eco R1, клонирование фрагмента ДНК в плазмиде pBR322 или в лямбдах-фагах.

Пример 1. Выделение ассоциированного с Ни-А Ни-В-гепатитом вещества из кала пациентов.

Используемый буфер: трис-HCl. рН 7,4, 0,05 н. во всех стадиях работ.

а) Обработка: 0,5 г кала суспендируют в 10 мл буфера, центрифугируют при SOOOg и собирают надосадочную жидкость. Остаток промывают еще раз с помощью 10 мл и затем 5 мл буфера. Собранные надосадоч- ные жидкости центрифугируют (30 мин, 10000 об/мин) и фильтруют через непроницаемый для бактерий фильтр (около 0,22 миллипор). Надосадочную жидкость осаждают с помощью ПЭГ 6000 (конечная концентрация 10%, соответственно . 0,4

о

s|

о

CJ

моль/л). Спустя 2-12 ч осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 10 мл буфера . Этот раствор встряхивают с 10 мл фреона, фазы разделяют путем центрифугирования , фреоновую фазу еще раз промывают 5 мл буфера. Повторяют осаждение с помощью ПЭГ и NaCI (конечная концентрация 10%, соответственно 0,4 моль/л). Осадок обрабатывают примерно 800 мкл буфера.

Полученный раствор переваривают с РНК- и DHK-азой в течение 1 ч при 37°С и наносят на градиенты хлористого цезия.

б)В пробирки для центрифугирования вносят 1 мл раствора хлористого цезия с плотностью 1,4 г/мл и сверху в каждую по 3 мл раствора с плотностью .1,3, 1,25 и 1,2 г/мл. Все растворы готовят на указанном буфере. На градиенте наслаивают 800 мкл экстракта кала, центрифугируют 65-72 ч при 10°С (31000 об/мин). Затем собирают фракции нижней области градиента (плотность 1,4-1,4 г/мл) примерно по 200 мкл, в верхней области с плотностью 1,1-1,2 г/мл можно отбирать большие фракции. Плотность каждой фракции определяется путем измерения показателя преломления. Все фракции диализируют и по 50 мкл каждой фракции исследуют по NANB-анализу на ассоциированное с Hu-А, Ни-В-гепатитом вещество . В положительных, фракциях определяют концентрацию белка.

Идентификация и характеристика вещества .

в)Приготовление градиентных полос.

Продиализированные и возможно сконцентрированные фракции градиента хлористого цезия смешивают с 10мкл SDS, 10мкл глицерина и 5 мкл бета-меркаптоэтанола, 5 мкл бромфелового синего на 100 мкл пробы и кипятят 3 мин на водяной .бане. Затем их смешивают с 5 мкл 0,1 %-ного раствора пи- ронина и наносят на градиентный полиак- риламидный гель. Продолжительность 3,5 ч, напряжение 160-300 В, сила тока 40-25 А, мощность 20 Вт.

Примерно за 5 мин до окончания электрофореза еще раз наносят 5 мкл пиронина и заканчивают операцию, как только пиро- нин пройдет через гель. Гель либо окрашивают с помощью серебра, либо осуществляют блоттинг в течение ночи при 0,5 А, затем 1 ч при 1 А.

г)Блоттинг-анализ.

По окончании блоттинга различные полосы (выделенные пирониновыми маркировками ) вырезают и в сопровождении стандарта молекулярного веса окрашивают амидо-черным. Полосы с пробами встряхивают в течение 24-72 ч в 1%-нрм

растворе желатины в PBS. 1д6-фракция пациента , соответственно Fab-2-фрагменты этой lgG-фракции маркируют с помощью иода-125 (хлорамин Т): 0,5 мкг на 100 мкг

протеина. При этом инкорпорируются примерно 70% активности. Радиоактивный индикатор , объем которого соответствует примерно 2 мкг протеина, разбавляют в 20 мл желатины в PBS и затем полосы инкуби0 руют при встряхивании в течение 12 ч. После этого полосы промывают по 1 ч 3 раза с помощью жел атины-PBS, 2 раза с помощью PBS-Твин 0,5%-ный и 1 раз водой. После высушивания полос их накладывают на чув5 ствительную рентгеновскую пленку и экспонируют при -70°С в течение 2-7 ми дней.

Пример 2. Метод обнаружения ассоциированного с HNANB вещества в кале ,

0 Полистирольные шарики вместе с сывороткой выздоровевших пациентов, болевших Hu-А, Ни-В-гепатитом, в разбавлении 1:200 в карбонатном буфере, рН 9,2, 0,01 моль/л, инкубируют 12 ч при комнатной

5 температуре, шарики промывают забуфе- ренным фосфатом физиологическим раствором хлорида натрия (PBS). Пробы кала в форме 10%-ной суспензии кала инкубируют 2 ч при 37°С с покрытыми, как указано, ша0 риками из полистирола, после чего обильно промывают с помощью PBS, который содержит 0,5% Твина-20, и затем инкубируют при 37°С в течение 1 ч с человеческим IgG из сыворотки выздоровевших от Hu-А- Ни-В5 гепатита, которая маркирована иодом-125. После промывки дистиллированной водой связанную с шариками радиоактивность подсчитывают на гамма-счетчике. Пробы кала , в которых связанная радиоактивность

0 достигает трехкратного значения отрицательного контроля, считают положительными на наличие ассоциированного с Ни-А, Hu-B-гепатитом вещества.

Установлено, что положительную реак5 цию обнаруживают в пациентов с Hu-А, Ни- В-гепатитом, что применение этого анализа у большого числа пациентов с массой совершенно различных заболеваний печени, которые , не имеют ничего общего с Hu-А,

0 Hu-B-гепатитом, вещество, если вообще находят его, находят только в очень низком процентом содержании.

Во время исследования коллективов пациентов с гепатитом другого генеза либо

5 гепатитом А, либо гепатитом В, ассоциированное с Hu-А, Hu-B-гепатитом вещество находят в очень низком процентном содержании .

Установлено, что пациенты с Hu-А, Ни- В-гепатитом имеют 30% положительных результатов , в противоположность чему в случае подозрения на гепатит А, гепатит В и постгепатит В у пациентов это число значительно ниже.

Пример 3, Выделение ДНК,из кала и клонирование ДНК-последовательностей. . Из кала пациентов с Hu-А, Ни-В-гепати- том, как описано в примере 1, выделяют ассоциированные с Ни-А, Ни-В-гепатитом частицы, как там описано, обрабатывают и очищают через градиенты хлорида цезия и диализуют. Диализованные фракции иссле- дуют.на наличие ассоциированного с NANB вещества описанным образом. Фракцию плотности 1,3 г/мл в градиентах хлорида цезия переваривают с 50 мкгпротеиназы К, 1% SDS и ЭДТА в конечной концентрации 10 мМ в течение 6 ч при 37°С. Протеины удаляют путем экстракции с помощью 80%- ного фенола (вес/объем) и хлороформа, и после этого растворенную в водной фазе ДНК в присутствии 0,3 М ацетата натрия осаждают с помощью двух с половиной кратного объема этанола в течение 60ч при -70°С. Затем центрифугируют и осадок про- мывают один раз с помощью 70%-ного этанола , высушивают и после этого обрабатывают ТЕ-буферрм, состоящим из 10 ммоль/л Трис, рН 3, и 1 мМ ЭДТА, в объемном соотношении 1 мкл/5 мг обрабо- тайного кала.

15 мкл этого основного раствора ДНК инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в общем реакционном объеме 50 мкл с б единицами полимеразы Кленова (ДНК-полимераза 1, большой фрагмент), 1 мкл раствора dATP, dTTP и dGTP, в концен-. трации 1 мМ, а также 5 мкл альфа-32 P-dCJP в инкубационном буфере для полимеразы Кленова по данным изготовителя.

После этого добавляют 2,5 мкл 1 мМ dCTP-раствора, инкубируют 1 ч при комнатной температуре, прогревают при 68°С в течение 10 мин и охлаждают до ОС. Затем реакционную смесь вместе с 2 единицами Т4-ДНК-лигазы, 1 мкг фосфорилированного EcoR-1-линкера и 6 мкл 10 мМ раствора dATP инкубируют в течение 16ч при . В реакционной смеси затем устанавливают конечную концентрацию 150 мМ NaCI и вместе с 240 единицами EcoR-1-рестрйкци- онной эндонуклеазы (80 ед./мкл) переваривают 3 ч при 37°С. Реакцию прекращают добавлением 5 мкл 80%-ного фенола и t мкл 20%-ного SDS. Радиоактивно микрированг ную и снабженную линкерами ДНК отделяют от соли и нелегированных линкеров через колонку с сефарозой (объем колонки 3 мл, длина 25 см) и осаждают 2,5-кратным объемом этанола в течение t6 ч при -7б°С

Осажденную ДНК центрифугируют 10 мин при 14000 д, осадок промывают 150 мкл 70%-ного этанола, высушивают и обрабатывают 10 мкл ТЕ-буфера.

Пример 4. Клонирование изолированной ДНК в лямбда-фаги и трансфекция на бактерии.

Для лигирования с ДНК-вектором 2 мкг ДНК лямбда-фагов 1149 вместе с 2-мя единицами EcoR-1 (4 ед./мкл) в общем реакционном объеме 6 мкл/инкубационн.ый буфер по данным изготовителя) инкубируют 1 ч при 37°С. Затем фермент инактивируют путем 40-минутного нагревания при 68°С. Этот раствор лигируют с 3 мкл маркированной ДНК, которая выделена как описано в примере 3, 1 мкл 5 мМ АТР и 1 ед. Т4-ДНК- лигазы при комнатной температуре. 4 мкл этой реакционной смеси упаковывают в оболочки лямбда-фагов. Этими упакованными фагами инфицируют штамм Escherlchla coli NM514. Для скрининга на наличие встроенной ДНК примерно 105 фагов наносят на пластины для скрининга размером 22x22 см и инкубируют в течение ночи при 37°С. ДНК-фаги переносят на фильтр из нитроцеллюлозы путем отпечатка, фильтр гиб- ридизируют с 1 мкл описанного радиоактивного основного раствора ДНК, промывают и ауторадиографируют 6 ч при -70°С.

Из 70 положительных сигналов гибридизации выбирают 17 подчиненных колоний фагов при плотности примерно 5 тромбоцитов на 1 см2. После очистки тромбоцитов готовят 16 положительных клонов, которые содержат ДНК-вставки длиной от 0,3 т.п.о. до примерно 1,5 т.п.о и гибридизируют с пробой первоначального основного раствора ДНК.

Пример 5. Характеристика ДНК- фрагмента длиной 0,45 т.п.о и субклонирование этого фрагмента в плазмиду pVCl9 в Escherichia coli.

ДНК-фрагмент удаляют из ДНК фагов путем переваривания эндонуклеазой EcoR1 при описанных условиях. Фрагмент отделяют на агарозо-геле от ДНК лямбда-фагов, и5 геля вырезают соответствующие вставке ДНК-полосы и элюируют. Изолированную ДНК-вставку вносят путем лигирования в ДНК-вектор pVC19 и после этого трансфи- цируют в штамм Н 1 Escherichia coll. После селекции штаммов бактерий осуществляют выращивание наработку штамма.

Вставку радиоактивно маркируют и испытывают путем анализа по Соузерну на гибридизацию с исходным материалом, экстракциями из калов контрольных лиц, вирусом гепатита и плазмидой PBR 322.

Пример 6. Обнаружение ассоциированной с Ни-А, Ни-Е-ДНК в сыворотке.

2-5 мл сыворотки центрифугируют при 150000 g в течение 2 ч. Осадок переваривают при 37°С в течение 1 ч в 200 мкл раствора протеиназы К (0,5 мг/мл, 10 мМ ЭДТА), к раствору добавляют 165 мкл горячего насыщенного раствора иодида натрия (2,5 г иодида натрия /мл HiO, 75°С) до конечной концентрации 12,5 М, нагревают 1.0 мин при 90°С и фильтруют непосредственно через нитроцеллюлозный фильтр под вакуумом. После фильтрации нитроцеллюлозную. пленку промывают 3 раза 70%-ным этанолом и затем 10 мин при комнатной темпера- :туре инкубируют в 100 мл уксусного ангидрида (100 мл, 0,1 М триэтаноламина, 250 мкл уксусного ангидрида). После инкубации пленку обжигают в вакууме при 80°С в течение 1-2 ч. Высушенную пленку вносят в раствор предварительной гибридизации, инкубируют 3 ч при 65°С (6xSSC), 1 х Denhardt, 0,5% SDS, где 20 х SSC (стандартный солевой цитрат) соответствует ЗМ NaCI, 1,5 М цитрат натрия.

SDS - додецилсульфат натрия,

100 х Denhardt - раствор соответствует 2% Ficoll, 2% поливинилпирролидона, 2% бычьего сывороточного альбумина), 20 мкг/мл денатурированной, нагреванием ДНК спермы), инкубируют с 32Р-маркиро- ванной пробой в течение ночи в условиях прегибридизацйи. Затем нитроцеллюлозную пленку промывают 3 раза в растворе (1 6xSSc, IxDenhardt, 0,5% SDS, 20 мкг/мл ДНК-спермы, 1xSSC, 0,5% SDS, 1 х Denhardt, 0,1 х -SSCt.-ь 0,05% SDS). После высушивания пленки ее накладывают на рентгеновскую пленку на время от 6 ч до 2 дней при 70бС.

Приме р 7. Обнаружение Hu-А, Ни- В-ДНК в сыворотке.

200 мкл сыворо-гки инкубируют с 75 мкл раствора протеиназы К(4 мг/мл) и 25 мкл 0,5 М ЭДТА при 37°С в течение 1 ч, затем до- бавляюд 100 мкл 1 н. NaOH, выдерживают 10 мин при комнатной температуре и нейтрализуют 250 мкл 2М ацетата аммония. 500 мкл смеси (соответственно 181 мкл сыворотки ) наносят на нитроцеллюлозу, нейтрали- зуют 250 мкл 2М ацетата аммония, сушат в вакууме.при 80°С в течение 45 мин. Фильтры перегибридизируют в 6 х SSC, 0,5% SDS, 1 X растворе Denhardt и 20 мкл/мл денатурированной (5 мин, 100°С) ДНК спермы при 65°С в течение 3 ч.

Для гибридизации, которую осуществляют в течение ночи в условиях прегибридизацйи , используют маркированную с помощью 32 Р за счет Nick-трансляции

вставку фаговых клонов (удельная активность примерно 1-2 х 10 срт (мкг ДНК). Фильтры затем, смотря по обстоятельствам, промывают еще раз 20 мин при 65°С с помощью 6 х SSC, 1 х раствором Denhardt, 0,5% SDS,: 20 мкг/мл денатурированной ДНК Hering-спермы, затем 1 х SSC, 0,5% SDS, 1 х раствора Denhardt и 0,1 х SSC, 0,05% SDS и высушивают при 80°С. Аутора- диографию осуществляют с помощью рентгеновской пленки и усилительной пленки при времени ауторадиографии 6-48 ч при -70°С.

Пример 8. Подготовка проб для анализа.

1 мл сыворотки с 350 мкл раствора протеиназы К (3 мг/мл протеиназы К, 10 мМ Трис, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5% SDS) и 125 мкл 0,5 М ЭДТА инкубируют 30 мин при 37°С. Затем раствор разбавляютс помощью 8 мл 2 М ТСА (рН 7,0), 3,2 мл 2М ацетата аммония, 20 мкл РНК(10 мг/мл)и 5,3 мл НгО до 16 мл. ДНК осаждают 10 мл изопропано- ла при комнатной температуре в течение 30 мин. Осадок ДНК отделяют центрифугированием (15 минут при 8000 об/мин) промывают его 2 мл 70%-ного этанола, растворяют в 600 мкл 10 мМ Трис, рН 8,4, и 1 мМ ЭДТА, экстрагируют 1 раз фенолом, 1 раз хлороформом и еще раз осаждают. Ал и квотные части осажденной ДНК используют для Dot- блоттинг-анализа или для рестрикционного анализа.

Получение ассоциированной с частицами ДНК из проб кала осуществляют таким же образом. Суспензии кала предварительно стерильно фильтруют и осаждают с помощью ПЭГ.

Пример 9. Если имеется относительно мало ассоциированного с Hu-А, Ни-В вещества , то оказывается целесообразным обнаружить ДНК путем амплификации.

Обнаружение Ни-А, Hu-B-ДНК в сыворотке осуществляют путем гибридизации с радиоактивно маркированной клонированной Hu-А, Ни-В-ДНК-пробы после предва-4 рительной специфической ферментативной ДНК-амплификации.

25 мкл сыворотки, 50 мкл Nal (насыщенный раствор) смешивают, инкубируют 2 мин при 37°С, после чего инкубируют 10 мин при 0°С. Инкубат диализу ют на поликарбонатной мембране против ТЕ-буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА) 20 мин. 5 мкл диализата отбирают для специфической ферме.нтатив- ной ДНК-ампяификации с помощью по 0,5 мкг олигопраймера (пара Аи В,.соответственно , С и D). Олигопраймерные пары готовят по известным данным секвениррвания посредством ДНК-синтезатора. После амплификации реакционную смесь разделяют электрофоретически на 2%-ном агарозном геле, наносят на нейлоновую мембрану- и гибридизуют с маркированной с помощью 32Р, клонированной Hu-А, Hu-B-ДНК-про- бы. После ауторадиографии идентифицируют положительные результаты,.руководствуясь стандартом и маркерами. Сопровождающие контроли служат для оценки эффективности, амплификации, как с помощью HBV-специфических праймеров, так и также с помощью специфических к Ни-А, Hu-B-праймеров. Доказательство идентичности находящейся в инфекционной загрузке ДНК с ДНК из кала пациентов с Ни-А, Ни-В-гепатитом говорит об идентификации включенной в Hu-А, Ни-В-гепатит ДНК.

Исследование дальнейших 57 проб кала пациентов со спорадическим и пост-гемот- рансфузионным Hu-А, Ни-В с помощью ра- диоиммуноанализа, как описано в предыдущих примерах, ив Dot-блоттингс- пособе, дает замечательную корреляцию обоих способов исследования в отношении обнаруживаемого, ассоциированного с Ни- А, Ни-В-вещества (R 1 А) и обнаруживаемой ДНК(ОЬг-блоттинг, см. пример 7).

ДНК показывает родство с. HBV-ДНК. Если клонированный 0,45 кВ фрагмент или очищенный материал кала маркирован Р и гибридизован.в анализе по Соузерну до .HBV-ДНК, обе пробы дают сигнал, правда, примерно в 1000 раз слабее, чем сам по себе. Плазмида pBR 322 и лямбда-фаги не дают никакого сигнала. В предварительных опытах очищенную пробу кала, без осуще ствления денатурации, можно очень хорошо маркировать маленьким фрагментом Е coll полимеразы.

Обработанная полимеразо й Кленова проба кала мигрирует в геле агарозы отчетливо медленно, чем необработанная проба. Это говорит о том, что исследованная ДНК, также как HBV-ДНК, частично двунитевая. Результаты и обработка рестрикционнымй ферментами и экстрензия праймера доказывают циркулярную структуру ДНК.

Полученные ДНК, в особенности нахо- дя щиеся в этих ДНК гены, можно использовать для включения в соответствующие векторы экспрессии, как клетки и бактерии

(например E.coll и дрожжи, как Saccharomyces cerevislae, а также культуры клеток) и для получения вирусных антигенов . Таким образом возможна диагностика и получение иммунореагентов и вакцин. В

случае диагностики нужно назвать в особенности исследование на инфекционность (исследование консервированной крови) и диагноз острой, хронической или по времени прошедшей инфекции. Приготовленные

в культурах клеток антигены, а также соответствующие , синтезированные благодаря этим вирус-ДНК ин виво и ин витро протеины можно использовать для установления иммунологической диагностики. ДНК-последовательность может применяться для идентификации потенциальных вирусных протеинов (белков) и их синтетического получения , следовательно, получения синтетических антигенных пептидов.

Формула изобретения

Способ получения ДНК для диагностики Ни-А, Hu-B-гепатита, заключающийся в ,

предварительной стерилизации суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоро- вый фильтр размером пор 0,22 мкм осаждении полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделении осадка, растворении его в буфере, встряхивании с фреоном в соотношении 1:1, отделении фреоновой фазы, осаждении полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, обработке РНК-и ДНК-азой, фракционировании в градиенте хлористого цезия, отделении фракции с плотностью 1,3 г/мл, диализе, обработке полученной фракции протеиназой К, экстракции 80%-ным фенолом и хлороформом, обработке ДНК рестриктазой Eco R 1, клонировании фрагмента ДНК в плазмиде pBR 322 или в лямбда-фагах.

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть применено для диагностики заболевания Ни-А, Hu-В-гепатита, Способ получения ДНК для диагностики Hu-А- Ни- В-гепатита заключается в том, что осуществляют стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22 мкм осаждают поли- этиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделяют осадок, растворяют его в буфере, встряхивают с фреоном в соотношении 1:1, отделяют фреоновую фазу, осаждают ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обрабатывают РНК- и ДНК- азой, фракционируют в градиенте хлористого цезия, отдел я ют фракции с плотностью Т,3 г/мл, диализуют, обрабатывают полученную фракцию протинозой К, экстрагируют 80%-ным фенолом и хлороформом, обрабатывают ДНК рестриктазой EcoRI, клонируют фрагмент ДНК в плазмиде pRR 322 или в лямбда-фагах. & В

Формула