Способ получения нерацемических сложного эфира и спирта, а также двухфазная негомогенная система для его осуществления - RU2247779C2

Описание

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу опосредованного биокатализатором энантиоселективного преобразования энантиомерных смесей гидрофобных сложных эфиров с использованием двухфазной системы растворителей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к ферментативно опосредованному энантиоселективному синтезу противовирусных соединений, таких как 2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (FTC) и его аналоги, в негомогенной реакционной системе.

Предпосылки создания изобретения

При разработке коммерчески выгодных способов ферментативного разделения энантиомерных смесей гидрофобных сложных эфиров возникают серьезные препятствия. Так, например, в способе, предусматривающем ферментативное преобразование в присутствии органического растворителя, в отличие от того же способа, осуществляемого в водном растворителе, степень инактивации фермента очень высока. Основная проблема заключается в том, что растворители, которые являются менее деструктивными для данного катализатора, часто обладают меньшей способностью солюбилизировать более гидрофобные субстраты. В идеальном случае многие способы могли бы быть более эффективными, если бы они осуществлялись в более гидрофобных растворителях, таких как несмешивающиеся органические растворители. Одной из целей настоящего изобретения является получение негомогенной системы, которая позволяла бы преобразовывать в продукт более высокие концентрации гидрофобных субстратов, и требовала бы при этом меньшего потребления катализатора.

Вышеуказанные проблемы должны быть решены в целях снижения стоимости изготовления энантиомерных противовирусных лекарственных средств. Указанные лекарственные средства являются жизненно необходимыми в борьбе за полное преодоление вирусных заболеваний. Так, например, даже в настоящее время уровень инфицирования ВИЧ во всем мире неуклонно возрастает и ежедневно регистрируется 16000 новых случаев заражения [Balter, M. Science 280, 1863-1864 (1998)]. В Африке существуют регионы, расположенные ниже Сахары, например Ботсвана и Зимбабве, где инфицированным является, по крайней мере, 25% населения. Однако стоимость противовирусных лекарственных средств в настоящее время настолько высока, что они недоступны для большинства людей, инфицированных ВИЧ.

Нуклеозидные аналоги, такие как 3'-тиарибофуранозил-βL-цитозин ("3-ТС"), 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT) [Blair Е., Darby G., Gough E., Littler, D., Rowlands, D., Tisdale, M. Antiviral Therapy, BIOS Scientific Publishers Limited, 1998], (-)-2',3'-дидезокси-5-фтор-3'-тиацитидин ("FTC") и 2’,3’-дидезокси-3’-тиацитидин являются важными противовирусными агентами [Liotta, D.C. 216^th ACS National Meeting, Medicinal Chemistry Abstract, Boston, MA, August 2327, 1998; Hoong L.K. Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W. Burns C.L., & Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565]. 3-ТС имеется в продаже как лекарственное средство против ВИЧ и против HBV, a FTC проходит клинические испытания на его эффективность в качестве противовирусного лекарственного средства [Liotta, D.C., Schinazi, R.F., & Choi, W.B., патенты США №5210085, 5700937 и 5814639]. Поскольку оно представляет собой (-)-энантиомер как (-)-FTC, так и (-)-2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина, который обладает наиболее сильной противовирусной активностью и наименьшей токсичностью по сравнению с соответствующими (+)-изомерами, то для расширения возможностей лечения пациентов во всем мире крайне необходимо разработать эффективные и недорогостоящие методы получения (-)-FTC и (-)-2’, 3'-дидезокси-3'-тиацитидина [Liotta, D.C. 216^th ACS National Meeting, Medicinal Chemistry Abstract, Boston, MA, August 23-27, 1998; Hoong L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W., Burns, C.L., & Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565].

Для разделения сложных эфиров FTC используется множество гидролазных ферментов [Hoong, L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W., Burns, C.L., & Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565]. Однако при практической разработке ферментно-опосредованных химических способов продуцирования FTC и аналогичных соединений возникают определенные трудности. Во-первых, предполагается, что гидролазные ферменты, за исключением липаз, подвержены воздействию двухфазной среды (WO 97/44445, Lalonde et al., J. Am. Chem. Soc., 117, 6845-6852 (1995), Milton et al., Chemical Abstracts, 124(5), abstract # 55352 (1996), Brand et al., Chemical Abstracts, 127(20), abstracts # 278395 (1997)). Во-вторых, растворимость многих сложных эфиров FTC в водных средах является слишком низкой для осуществления экономически выгодного производства энантиомерно чистого продукта. Одним из возможных решений этой проблемы является добавление смешивающегося с водой органического сорастворителя для увеличения концентрации сложного эфира в растворе. Примером является использование растворов ацетонитрила и воды [Нооng L.K., Strange, L.E., Liotta, D.C., Koszalka, G.W. Burns, C.L., & Schinazi, R.F., J. Org. Chem. 1992, 57, 5563-5565; Liotta et al., патент США №5827727]. Хотя использование смешивающегося с водой органического растворителя и водного раствора увеличивает концентрацию субстрата в растворе, однако при этом существует нежелательный эффект резкого снижения степени катализируемого ферментом преобразования и стабильности фермента. Эта проблема является особенно очевидной в том случае, когда субстрат полностью не растворяется, и также присутствует в виде нерастворенной твердой суспензии (высокая концентрация загрузки субстрата). Аналогичные результаты были получены в лаборатории заявителей. Если смешивающиеся с водой органические растворители, такие как изопропанол, диметилформамид (ДМФ), 1-метил-2-пирролидинон, диметилсульфоксид (ДМСО), метанол, ацетонитрил, этанол, 1-пропанол, были использованы в качестве сорастворителя для разделения, то максимальная концентрация загрузки субстрата составляет 3%. Присутствие нерастворенного субстрата приводит к снижению энантиоселективности в том случае, если концентрация субстрата составляет выше 3%. Кроме того, использование смешивающегося с водой органического растворителя и водного раствора при концентрации смешиваемых с водой органических сорастворителей выше 20% оказывает значительное негативное влияние на активность фермента, в частности эстеразы печени свиньи (PLE).

В настоящем изобретении рассматриваются некоторые недостатки прототипов, из-за которых указанное ферментативное разделение энантиомерных смесей является экономически невыгодным. Во-первых, очевидно, что ферментативное преобразование должно осуществляться в гомогенных условиях, поскольку двухфазные системы дают плохую воспроизводимость [См. Liotta et al., патенты США №5827727, 5892025, 5914331; или Matson, патент США №4800162, где предполагается, что активированная мембрана разделяет водные и органические компоненты]. Одно из потенциальных преимуществ использования негомогенных систем заключается в том, что оно позволяет увеличить солюбилизацию субстрата. Предполагается, что в негомогенную систему может быть введена более высокая концентрация многих гидрофобных субстратов. Исходя из работ, предшествующих настоящему изобретению, очевидно, что следует избегать использования спиртовых растворителей, поскольку эти растворители денатурируют ферменты [Liotta et al., патенты США №5827727, 5892025, 5914331]. Настоящее изобретение имеет явное преимущество по сравнению с прототипами, поскольку оно конкретно относится к использованию спиртовых растворителей, которые образуют негомогенные системы с водой. Кроме того, использование негомогенных систем растворителей позволяет увеличивать солюбилизацию более гидрофобных субстратов в отличие от предшествующих методов. Этот способ отличается от других способов, в которых сам субстрат делают более водорастворимым, а затем его диспергируют в водный компонент (Wald et al., патент США №5057427). Следовательно, в настоящем изобретении описан способ, который требует меньшего количества фермента на единицу продукта.

Другие усовершенствования, достигаемые посредством настоящего изобретения, позволяют использовать некоторые спиртовые растворители в ферментативном процессе. Кроме того, настоящее изобретение относится к альтернативному способу, в котором потребность в ферменте и органическом растворителе снижается благодаря добавлению поверхностно-активных веществ. И, наконец, настоящее изобретение относится к разработке более эффективного ферментативного способа, который позволяет поддерживать энантиоселективность на высоком уровне.

На Схеме 1 показано энантиоселективное преобразование энантиомерной формы энантиомерной смеси бутирата FTC в соответствующий нерацемический спирт и желаемый нерацемический сложный эфир.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к некоторым усовершенствованным способам получения хирального нерацемического сложного эфира. Более конкретно, настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу, в котором используется двухфазная негомогенная система, применяемая в биокатализе для разделения энантиомерных смесей сложных эфиров FTC и аналогов сложных эфиров FTC. Кроме того, настоящее изобретение относится к усовершенствованиям, которые обеспечивают высокую загрузку субстрата и снижение количества потребляемого фермента.

Первый усовершенствованный способ по настоящему изобретению относится к диспергированию энантиомерной смеси сложного эфира в системе органических растворителей с получением органического компонента при высокой загрузке субстрата. Для этого получают водный компонент, который предпочтительно содержит диспергированный гидролазный фермент. Альтернативно, данный гидролазный фермент может быть добавлен ко всей негомогенной системе или, менее предпочтительно, к органическому компоненту. Этот способ, кроме того, требует контактирования органического компонента и водного компонента с образованием негомогенной системы в условиях, позволяющих проводить разделение смеси с получением хирального нерацемического сложного эфира и нерацемического спирта. Сочетание органического компонента и водного компонента образует негомогенную систему. С использованием негомогенной системы можно получить гораздо большие концентрации субстрата. В одном из вариантов осуществления изобретения, после проведения реакции, хиральное нерацемическое сложноэфирное соединение может быть выделено из органического компонента, а хиральное нерацемическое спиртовое соединение может быть выделено из водного компонента. Стадии выделения могут варьироваться в зависимости от конкретного соединения и условий.

Настоящее изобретение также относится к альтернативному способу, который дает улучшенные результаты благодаря резкому снижению количества фермента, требуемого для получения данного продукта. Такое усовершенствование достигается добавлением поверхностно-активного вещества к указанной негомогенной системе в целях получения улучшенной негомогенной системы, которая требует меньшего количества органического растворителя для солюбилизации субстрата.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу, который предусматривает использование пониженного соотношения органической/водной фазы и который приводит к дополнительному снижению требуемого количества гидролазного фермента.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения добавление поверхностно-активного вещества к этой системе позволяет увеличивать скорость ферментативной реакции и улучшать солюбилизацию субстрата. Более высокие скорости реакции приводят к общему снижению затрат на ферменты, используемые для осуществления этого способа.

Подробное описание изобретения

В нижеследующем описании используемые термины имеют следующие значения:

Биокатализатор - молекула белка, такая как гидролазный фермент. Примерами являются эстеразы, протеазы и липазы.

Хоральное соединение - соединение, которое не совмещается со своим зеркальным отражением и обычно содержит ассиметрический атом углерода, где четыре различных группы присоединены к одному и тому же атому углерода.

Сорастворитель - органический растворитель.

Преобразование - процесс обработки энантиомерной смеси соединений катализатором, который преобразует один энантиомер в другую химическую молекулу.

Диастереомеры - стереоизомеры, которые не являются зеркальными отражениями друг друга.

Диспергирование - распределение фермента или материала энантиомерной смеси в растворителе. Этот фермент может присутствовать в виде кристаллического перекрестносшитого фермента, иммобилизованного фермента или растворимого фермента, а энантиомерная смесь может быть растворимой или может содержать остаточные частицы. Эта дисперсная система может содержать вплоть до трех фаз, а именно твердые кристаллические и/или корпускулярные вещества и две другие жидкие фазы.

Энантиомеры - пары стереоизомеров, которые являются зеркальными отражениями по отношению друг к другу. Энантиомер не совмещается со своим зеркальным отражением. Энантиомерами являются хиральные стереоизомеры, которые отличаются только тем, как они реагируют с другими хиральными молекулами, и своим поведением по отношению к плоскополяризованному свету. Отдельные энантиомеры вращают плоскость поляризованного света одинаково, но в противоположном направлении. Различные энантиомеры идентифицируются по R- и S-обозначениям, и по тому признаку, поворачивается ли плоскость поляризованного света вправо (правовращение (+)) или влево (левовращение (-)).

Энантиомерный избыток - в смеси (растворе) двух энантиомеров, где один энантиомер присутствует в большем количестве, причем этот раствор обнаруживает оптическое вращение ((+)- или (-)-вращение), соответствующее энантиомеру, присутствующему в избытке. Энантиомерный избыток представляет собой процентное содержание энантиомера, имеющегося в избытке по отношению к рацемической смеси, и вычисляется следующим образом: (удельное вращение смеси)÷(удельное вращение чистого энантиомера) × 100 = % энантиомерного избытка.

Энантиомерная смесь - смесь двух энантиомеров.

Энантиоселективность - предпочтение превращению одного энантиомера из энантиомерной смеси.

Бутират FTC - означает энантиомерную смесь соединения 2',3'-дидезокси-5'-бутират-5-фтор-3'-тиацитидина или в соответствии с альтернативной номенклатурой это соединение представляет собой 2-бутирилоксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан или, менее формально, эфир 5'-масляной кислоты и 2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1, 3-оксатиолана.

Неполностью смешивающийся с водой органический растворитель - органический растворитель, который не полностью растворяется в воде при 25°С и образует негомогенные растворы с водой.

Негомогенная система - двухфазная среда, содержащая биокатализатор, органический компонент, водный компонент и субстрат. Негомогенная система может также называться негомогенной средой, негомогенными условиями или негомогенной композицией.

Система органических растворителей - раствор, содержащий один или несколько нижеследующих растворителей, таких как незамещенные C₁ -С₈-алканы, спирты, ароматические растворители, кетоэфиры, нитро-, галогеналкан или ароматический органический растворитель, такой как трет-амиловый спирт, изоамиловый спирт, 1-пентанол, 3-пентанол, 1-бутанол, 2-бутанол, трет-бутанол, 3-метил-3-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 3-этил-3-пентанол, 3-гептанол, толуол, бутилацетат, нитроэтан, нитрометан, дихлорметан, метилизобутилкетон, диметилсульфид, сульфолан или любые другие органические растворители, которые смешиваются с водой не более чем приблизительно на 50%, и которые облегчают растворение энантиомерной смеси без нарушения функции фермента.

Рацемическая смесь - эквимолярная смесь двух энантиомеров, также известная как рацемическая модификация, обычно образующаяся в результате химической реакции у хирального центра, где ни один энантиомерный продукт не является преобладающим.

Расщепление энантиомеров или разделение - процесс разделения пар энантиомеров в энантиомерной смеси.

Расщепление рацемической смеси - разделение рацемическоой смеси энантиомеров.

Стереохимия FTC и бутирата FTC - Стереохимия соединений FTC, рассматриваемая в данной заявке и показанная ниже:

Стереоизомер - соединение, атомы которого расположены в том же порядке, как и в другом соединении, и отличается от этого другого соединения лишь расположением своих атомов в пространстве. Примерами стереомеров являются энантиомеры и диастереомеры.

Загрузка субстрата - концентрация энантиомерной смеси. В качестве примера, указанного ниже: загрузка субстрата выражается в % (масса/объем негомогенной системы), т.е. исходя из полного объема растворителя. Другими словами, процент (%) (масса/объем) загрузки субстрата вычисляют, исходя из объема всей негомогенной системы, которая включает как водные, так и органические компоненты.

Поверхностно-активное вещество - поверхностно-активные вещества способствуют снижению поверхностного натяжения растворов при растворении в указанных растворах. Поверхностно-активные вещества также снижают межфазное натяжение между двумя жидкостямиили между жидкостью и твердым веществом. Поверхностно-активные вещества разделяются на три категории, которые действуют по аналогичному механизму. Эти категории включают детергенты, эмульгаторы и смачивающие агенты в зависимости от природы рассматриваемых поверхностей. Концентрацию поверхностно-активного вещества выражают в процентах (%) (масса/объем) и вычисляют, исходя из объема всей негомогенной системы, которая включает как водные, так и органические компоненты.

Не смешивающийся с водой органический растворитель - органический растворитель, который имеет растворимость в воде при 25°С максимально 10% и образует негомогенные растворы с водой. Концентрацию этого органического растворителя выражают в процентах (%) (объем/объем) и вычисляют, исходя из объема всей негомогенной системы, которая включает как водные, так и органические компоненты.

Органический растворитель, который смешивается с водой не более чем на 50% - органический растворитель, который имеет растворимость в воде при 25°С не более чем 50% и образует негомогенные растворы с водой.

Смешивающийся с водой органический сорастворитель - органический растворитель, который полностью смешивается с водой при 25°С.

Настоящее изобретение относится к способу получения хирального нерацемического сложного эфира формулы I с использованием гидролазного фермента

где

R представляет собой C₁-C₈-алкил, алкенил или алкинил;

Х=Н или F;

Y=СН₂, О, S, Se или NH;

где указанный способ включает следующие стадии:

(a) диспергирование энантиомерной смеси сложного эфира формулы I при концентрации от около 1 до около 25% (масса/объем негомогенной системы) в системе органических растворителей с получением органического компонента;

(b) получение системы водных растворителей для образования водного компонента и

(c) контактирование указанного органического компонента и указанного водного компонента с образованием негомогенной системы в условиях, позволяющих проводить разделение смеси с получением хирального нерацемического сложного эфира формулы 1 и нерацемического спирта формулы II;

где

Х=Н или F;

Y=СН₂, О, S, Se или NH и

где указанный гидролазный фермент диспергируется либо в указанном органическом компоненте, либо в указанном водном компоненте, либо в указанной негомогенной системе.

Настоящее изобретение также относится к способу получения хирального нерацемического гидрофобного сложного эфира с использованием гидролазного фермента, где указанный способ включает следующие стадии:

(a) диспергирование энантиомерной смеси указанного гидрофобного сложного эфира при концентрации от около 1 до около 25% (масса/объем негомогенной системы) в системе органических растворителей с получением органического компонента;

(b) получение системы водных растворителей для образования водного компонента и

(c) контактирование указанного органического компонента и указанного водного компонента с образованием негомогенной системы в условиях, позволяющих осуществлять энантиоселективное преобразование одной энантиомерной формы указанной энантиомерной смеси в соответствующий спирт, и

где указанный гидролазный фермент диспергируется либо в указанном органическом компоненте, либо в указанном водном компоненте, либо в указанной негомогенной системе.

Альтернативно, настоящее изобретение относится к способам получения хирального нерацемического сложного эфира формулы I из энантиомерной смеси формулы I или из энантиомерной смеси гидрофобного сложного эфира, где указанный способ, кроме того, предусматривает использование поверхностно-активного вещества.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения хирального нерацемического сложного эфира 2-бутирилоксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1, 3-оксатиолана с использованием гидролазного фермента, где указанный способ включает следующие стадии:

(a) диспергирование энантиомерной смеси указанного 2-бутирилоксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана при концентрации от около 1 до около 25% (масса/объем негомогенной системы) в системе органических растворителей с получением органического компонента;

(b) получение системы водных растворителей для образования водного компонента и

(c) контактирование указанного органического компонента и указанного водного компонента с образованием негомогенной системы в условиях, позволяющих осуществлять энантиоселективное преобразование одной энантиомерной формы указанной энантиомерной смеси в соответствующий спирт;

где указанный гидролазный фермент диспергируют либо в указанном органическом компоненте, либо в указанном водном компоненте, либо в указанной негомогенной системе и

где концентрацию указанной энантиомерной смеси вычисляют, исходя из объема указанной негомогенной системы.

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к способу получения хирального нерацемического сложного эфира 2-бутирилоксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана с использованием гидролазного фермента, где указанный способ включает следующие стадии:

(а) диспергирование энантиомерной смеси указанного 2-бутирилоксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана при концентрации от около 1 до около 25% (масса/объем негомогенной системы) в системе органических растворителей с получением органического компонента;

(b) получение системы водных растворителей для образования водного компонента и

(c) контактирование указанного органического компонента и указанного водного компонента с образованием негомогенной системы в условиях, позволяющих осуществлять энантиоселективное преобразование одной энантиомерной формы указанной энантиомерной смеси в соответствующий спирт;

где указанный гидролазный фермент диспергируют либо в указанном органическом компоненте, либо в указанном водном компоненте, либо в указанной негомогенной системе;

где указанный органический компонент составляет от около 5 до около 90% от указанной негомогенной системы;

где указанная негомогенная система также содержит от около 1 до около 20% поверхностно-активного вещества и

где указанную концентрацию поверхностно-активного вещества вычисляют, исходя из объема указанной негомогенной системы.

Другой целью настоящего изобретения является получение негомогенной системы, предназначенной для получения хирального нерацемического гидрофобного эфира с использованием гидролазного фермента, и включающей:

(a) гидролазный фермент;

(b) субстрат для гидрофобного сложного эфира;

(c) органический компонент и

(d) водный компонент.

Объектом настоящего изобретения является способ выделения желаемого энантиомера из энантиомерной смеси.

Объектом настоящего изобретения также является способ выделения желаемого энантиомера из энантиомерной смеси гидрофобных сложных эфиров.

Другим объектом настоящего изобретения является способ разделения энантиомеров противовирусных соединений, имеющих вышеуказанную формулу I.

В наиболее предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу разделения энантиомерного бутирата FTC (или вышеуказанного соединения формулы I, где R представляет пропил, Х=F и Y=S).

Загрузка субстрата приводит к диспергированию энантиомерной смеси гидрофобного сложного эфира в системе органических растворителей с образованием органического компонента. Интервал концентраций, выраженный в единицах %-ного соотношения (масса/объем негомогенной системы), выбирают из группы, включающей следующие интервалы: от около 0,5% до около 45%; от около 1,0% до около 45%; от около 5,0% до около 45%; от около 10% до около 40%; от около 10% до около 30%; от около 5% до около 20%; от около 1% до около 5% и от около 10% до около 20%.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения системы органических растворителей содержат один или несколько органических растворителей, которые смешиваются с водой не более чем на 50%, что облегчает растворение энантиомерной смеси.

В другом предпочтительном варианте системы органических растворителей по настоящему изобретению содержат один или несколько С₄-С₈ спиртов.

В наиболее предпочтительном варианте системы органических растворителей по настоящему изобретению содержат либо н-амиловый спирт, либо 3-метил-3-пентанол, либо тот и другой.

В предпочтительном варианте системы водных растворителей по настоящему изобретению содержат воду, одну или несколько буферных солей, подщелачивающие агенты, противомикробные консерванты, стабилизаторы, ускорители фильтрации, коферменты или другие наполнители, облегчающие диспергирование и функционирование данного фермента.

В другом предпочтительном варианте системы водных растворителей по настоящему изобретению содержат воду и от около 0,01 до около 0,5 моль фосфатного буфера при рН, приблизительно равном 7,0-8,0.

В наиболее предпочтительном варианте системы водных растворителей по настоящему изобретению содержат воду и от около 0,2 до около 0,4 моль фосфатного буфера при рН, приблизительно равном 7,2-7,8.

В другом варианте осуществления изобретения гидролазный фермент обладает способностью расщеплять пару энантиомеров.

В другом варианте осуществления изобретения гидролазный фермент обладает способностью расщеплять пару энантиомеров посредством ферментативно катализируемой стереоселективной реакции с одним энантиомером.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения данный гидролазный фермент обладает способностью расщеплять пару энантиомеров посредством ферментативно катализируемого стереоселективного преобразования одного энантиомера.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения гидролазный фермент обладает способностью расщеплять пару энантиомеров посредством ферментативно катализируемого стереоселективного преобразования (+)-энантиомера 2-бутирилоксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана (или соединения вышеуказанной формулы I, где R представляет пропил, Х=F и Y=S или бутират FTC).

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным биокатализатором является фермент.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения указанным ферментом является гидролаза.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный фермент выбран из группы, состоящей из эстераз, липаз и протеаз.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения данный фермент выбран из группы, включающей панкреатическую липазу свиньи ("PL"), липазу Pseudomonas species, липазу Aspergillus niger, субтилизин или эстеразу печени свиньи ("PLE").

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный биокатализатор добавляют к негомогенной системе после контактирования водного компонента с органическим компонентом, в результате чего получают негомогенную систему.

В другом варианте осуществления изобретения указанный биокатализатор добавляют к органической фазе как части органического компонента до контактирования водного компонента с органическим компонентом, в результате чего получают негомогенную систему.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения биокатализатор добавляют к водной фазе для создания водного компонента после контактирования водного компонента с органическим компонентом, но перед встряхиванием и размешиванием, в результате чего получают негомогенную систему.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения биокатализатор добавляют к водной фазе для создания водного компонента до контактирования водного компонента с органическим компонентом, в результате чего получают негомогенную систему.

В одном из вариантов осуществления изобретения негомогенная система, используемая в данном способе разделения энантиомерных смесей, содержит поверхностно-активное вещество. Интервал концентраций поверхностно-активного вещества в процентах (масса/объем негомогенной системы) выбирают из группы, содержащей следующие интервалы: от около 1% до около 30% поверхностно-активного вещества, от около 1% до около 20% поверхностно-активного вещества, от около 1% до около 10% поверхностно-активного вещества, от около 1% до около 5% поверхностно-активного вещества, от около 5% до около 30% поверхностно-активного вещества, от около 10% до около 25% поверхностно-активного вещества, от около 15% до около 25% поверхностно-активного вещества, от около 20% до около 30% поверхностно-активного вещества и от около 5% до около 15% поверхностно-активного вещества.

В одном из вариантов осуществления изобретения данный фермент иммобилизован на матрице.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения данный фермент имеет форму перекрестносшитого кристаллического фермента, такого как, например, фермент, описанный в патентной публикации РСТ WO 92/02617 (Navia et al.).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фермент имеет форму перекрестносшитого кристаллического белка с регулируемым растворением, такого как, например, фермент, описанный в патентной публикации РСТ WO 98/46732 (Margolin et al.).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения данный фермент имеет растворимую форму.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанные негомогенные системы содержат от около 10% до 99% органического компонента. В другом варианте осуществления изобретения указанные негомогенные системы содержат от около 10% до около 90% органического компонента. Более предпочтительные негомогенные системы содержат от около 20% до около 80% органического компонента. Еще более предпочтительные негомогенные системы содержат от около 30% до около 70% органического компонента. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные негомогенные системы содержат от около 10% до около 50% органического компонента. В другом более предпочтительном варианте изобретения негомогенные системы содержат от около 10% до около 60% органического компонента. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные негомогенные системы содержат от около 20% до около 70% органического компонента. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения негомогенные системы содержат от около 50% до около 20% органического компонента.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанные способы разделения нужного энантиомера осуществляют при температуре или температурах, выбранных из группы, включающей температуры: от около 0°С до около 45°С, от около 10°С до около 45°С, от около 20°С до около 45°С, от около 30°С до около 45°С, от около 10°С до около 40°С, от около 10°С до около 30°С, от около 10°С до около 25°С, от около 15°С до около 40°С, от около 15°С до около 35°С, от около 15°С до около 30°С, от около 15°С до около 25°С и от около 20°С до около 35°С.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный водный компонент, используемый в способах по настоящему изобретению, составляет по крайней мере 10% (объем/объем) от указанной негомогенной системы.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный водный компонент, используемый в способах по настоящему изобретению, составляет по крайней мере 50% (объем/ объем) от указанной негомогенной системы.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный водный компонент, используемый в способах по настоящему изобретению, составляет по крайней мере 90% (объем/объем) от указанной негомогенной системы.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ выделения нужного энантиомера осуществляют в негомогенной системе, содержащей поверхностно-активное вещество. Если поверхностно-активное вещество является частью указанной негомогенной системы, то интервал концентраций органического компонента в % (объем/объем) выбирают из группы, включающей интервал от около 5% до около 90% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 80% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 70% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 60% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 50% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 30% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 20% от указанной негомогенной системы, от около 5% до около 10% от указанной негомогенной системы, от около 10% до около 30% от указанной негомогенной системы, от около 10% до около 20% от указанной негомогенной системы, от около 20% до около 70% от указанной негомогенной системы или от около 25% до около 50% от указанной негомогенной системы и от около 30% до около 60% от указанной негомогенной системы.

Реакционная схема разделения энантиомерной смеси проиллюстрирована на Схеме 1 (см. ниже), где субстратами являются: эфир, ацетат, формиат, пропионат, бутират, пентаноат или другой н-алкил, и разветвленная цепь или сложные ариловые эфиры FTC, или производные указанных сложных эфиров FTC, а органическими сорастворителями являются любые растворители, которые не более чем на 50% смешиваются с водой, а именно спиртовые, алкановые, ароматические, кетоэфирные, нитро, нитро, галогеналкан или ароматические органические растворители, такие как н-амиловый спирт, изоамиловый спирт, трет-амиловый спирт, 3-пентанол, 1- или 3-гептанол, 3-метил-3-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 3-этил-3-пентанол, 1- или 2-бутанол, нитрометан, дихлорметан, метилизобутилкетон, диметилсульфид, сульфолан и другие.

На Схеме 1, представленной ниже, продуктами реакции являются нерацемический сложный эфир и нерацемический спирт (схема 1). В одном примере, где Х представляет фтор, R представляет С₃Н₇, а Y представляет серу, соединение А представляет собой энантиомерную смесь бутирата FTC. Различные гидролитические ферменты, такие как эстераза печени свиньи (PLE), липаза Pseudomonas species (PSL) и липаза Aspergillus niger (ANL), используются в качестве катализатора [для PLE-катализируемых реакций в смешанных органических растворителях: См. Ariente-Fliche, С., Braun, J., & Le Goffic, F., Synth. Commun. 22, 1149-1153 (1992); Basavaiah D., & Krishna, P.R., Pure & Applied Chem., 64, 1067-1072 (1992); Basavaiah, D., Pandiaraju, S., & Muthukumaran, K., Tetrahedron: Asymmetry, 1, 13-16, (1996); Mahmoudian, М., Baines, B.S., Dawson, M.J. & Lawrence, G.C., Enzyme Microb. Technol., 14, 911-916, (1992); Izumi Т. & Kasahara, А., патент Японии JP 08092269 A (1996)].

где: R представляет собой С₁-С₈ алкил, алкенил или алкинил; Х=Н или F; Y=СН₂, О, S, Se или NH; причем указанным биокатализатором может быть либо растворимый фермент, либо иммобилизованный фермент, либо перекрестносшитый фермент в кристаллической форме; а органическим сорастворителем может быть любой органический растворитель, который не более чем на 50% смешивается с водой, такой как н-амиловый спирт, изоамиловый спирт, трет-амиловый спирт, 3-пентанол, 1- или 3-гептанол, 3-Ме-3-пентанол, 4-Ме-2-пентанол, 3-Et-3-пентанол, 1- или 2-бутанол, нитрометан, дихлорметан и др.

Биокатализаторами могут быть либо растворимые ферменты, либо иммобилизованные ферменты, либо перекрестносшитые ферменты в кристаллической форме (CLEC™) (Altus Biologics, Inc., Cambridge, Massachusetts). Эта реакция может быть осуществлена в реакторе периодического действия, в колонке, в реакторе с мембраной из полых волокон [Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, pp. 138-150, edited by Drauz, К. & Waldmann, H., VCH Verlagsgesellschaft GmbH, Weinheim, 1995] или в мембранном реакторе [Dodds, D.R., Lopez., J.L., Zepp, C.M., & Rossi, R.F. патентная заявка РСТ №WO 90/04643, май, 1990].

Выбор конкретного фермента, который является наилучшим для данной пары субстратов, определяется обработкой образцов энантиомерных пар различными ферментами, такими как эстераза печени свиньи, панкреатическая липаза свиньи, липазы Pseudomonas species (PSL) и липаза Aspergillus niger (ANL), и протеазы, такие как субтилизин или α -химотрипсин. После обработки энантиомерной смеси расщепляющим ферментом полученные продукты выделяют с использованием стандартных методов экстракции или хроматографии. Фермент, продуцирующий наибольший энантиомерный избыток нужного продукта, следует рассматривать как наилучший для использования в этом способе.

Данный способ может быть далее усовершенствован путем выбора данной энантиомерной смеси и сочетания расщепляющих ферментов и определения идеальных условий растворения для данной реакции. Для двухфазной системы следует выбирать органический растворитель. Оптимальный органический растворитель может быть определен путем обработки образцов энантиомерной смеси выбранным ферментом в присутствии того же самого количества таких органических растворителей, которые смешиваются с водой не более чем приблизительно на 50%. Конкретными растворителями, которые смешиваются с водой не более чем приблизительно на 50% (растворимость в воде менее 50% при комнатной температуре), являются спиртовые, алкановые, ароматические, кетоэфирные, нитро, галогеналкановые или ароматические органические растворители, такие как н-амиловый спирт, изоамиловый спирт, трет-амиловый спирт, 3-пентанол, 1- или 3-гептанол, З-метил-3-пентанол, 4-метил-2-пентанол, З-этил-3-пентанол, 1- или 2-бутанол, нитрометан, дихлорметан, метилизобутилкетон, диметилсульфид, сульфолан и другие. После обработки энантиомерной смеси разделяющим ферментом в присутствии равных количеств различных растворителей полученные продукты выделяют с использованием стандартных методов экстракции или хроматографии. Пару растворитель/фермент, образующую наибольший энантиомерный избыток желаемого продукта, следует рассматривать как наилучшую для использования в этом способе.

Для достижения наилучших результатов должно быть также оценено относительное количество выбранного органического растворителя. Для этого осуществляют процедуру, аналогичную описанной выше. При использовании конкретного фермента/рацемической смеси отношение выбранного органического растворителя/водного растворителя варьируется следующим образом: 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 и 5:95 ([органический растворитель]:[водный растворитель]). Идентичные образцы энантиомерной смеси обрабатывают стандартным количеством конкретного фермента в присутствии различных соотношений органического растворителя к водному растворителю в течение заданного промежутка времени. Полный объем поддерживают постоянным. После обработки энантиомерной смеси расщепляющим ферментом в присутствии равных количеств различных растворителей полученные продукты выделяют с использованием стандартных методов экстракции или хроматографии. Пару растворитель/фермент, дающую наибольший энантиомерный избыток нужного продукта, следует рассматривать как наилучшую для использования в этом способе.

Альтернативно, для некоторых сочетаний "рацемическая смесь: фермент: органический растворитель", ферментативная активность может быть увеличена, а уровни органического растворителя могут быть снижены добавлением к реакционной смеси поверхностно-активных веществ. При этом следует выяснить, должно ли быть добавлено поверхностно-активное вещество в данном конкретном способе. В этот способ могут быть внесены некоторые изменения. Во-первых, поверхностно-активное вещество может быть выбрано путем обработки образцов энантиомерной смеси выбранным ферментом и рядом поверхностно-активных веществ в присутствии негомогенной системы, состоящей из неорганического растворителя, который смешивается с водой не более чем на 50%, и водного растворителя. Эта система должна быть пригодна для проведения реакции в отсутствие поверхностно-активного вещества. Примерами поверхностно-активных веществ являются твины, такие как твин 20™, твин 80™, прионекс™, типол НВ7™, тергитол TMN-6™, тергитол TMN-10™, тергитол NP-4™, тергитол 15-S-3™, игепал СА-630™, тилоксапол™, глюкодезоксихолевая кислота, октил-β-глюкопиранозид, CHAPS™, диоктилсульфосукцинат или дезоксихолевая кислота. После обработки энантиомерной смеси расщепляющим ферментом в присутствии двухфазной системы растворителей и постоянного количества различных поверхностно-активных веществ полученные продукты выделяют с использованием стандартных методов экстракции или хроматографии. Сочетание растворитель/фермент/поверхностно-активное вещество, дающее наибольший энантиомерный избыток нужного продукта, следует рассматривать как наилучшее для использования в этом способе.

Поверхностно-активное вещество может быть добавлено в концентрации или в пределах концентраций в зависимости от количества образцов, которые могут быть обработаны одновременно. Для данного сочетания "растворитель/фермент/поверхностно-активное вещество" необходимо определить оптимальную концентрацию поверхностно-активного вещества. Следует отметить, что для этого необходимо провести ряд независимых реакций, отличающихся только концентрациями поверхностно-активного вещества. Так, например, данное взаимодействие может быть осуществлено с использованием PLE в 20% пентаноле и в 80% трис(гидроксиметил)аминометане или 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиоловом буфере при рН 7,4. Могут быть проведены десять идентичных реакций с нижеследующими сочетаниями поверхностно-активного вещества: 1%, 3%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 20%, 25% и 30%. После обработки энантиомерной смеси разделяющим ферментом в присутствии двухфазной системы растворителей и возрастающей концентрации поверхностно-активного вещества в течение заданного интервала времени полученные продукты выделяют с использованием стандартных методов экстракции или хроматографии. Сочетание растворитель, фермент, поверхностно-активное вещество, дающее наибольший энантиомерный избыток желаемого продукта, следует рассматривать как наилучшее для использования в этом способе.

Поверхностно-активными веществами, подходящими для осуществления настоящего изобретения, являются катионогенные, анионогенные, неионогенные или амфотерные поверхностно-активные вещества или их смеси. Выбор предпочтительного поверхностно-активного вещества зависит от конкретных компонентов фермента и/или субстрата. Такая процедура скрининга хорошо известна специалистам. Иллюстративный процесс скрининга представлен в примерах 14-30.

Примерами используемых катионогенных поверхностно-активных веществ являются амины, соли аминов, сульфониевые, фосфониевые и четвертичные аммониевые соединения. Конкретными примерами таких катионогенных поверхностно-активных веществ являются:

хлорид метилтриоктиламмония (Aliquat 336)

N,N’N’-полиоксиэтилен(10)-N-жир-1,3-диаминопропан (EDT 20, ПЭГ-10-жир).

Подходящими анионогенными поверхностно-активными веществами являются, например, линейный алкилбензолсульфонат, сульфонат α-олефина, алкилсульфат, этоксисульфат спирта, карбоновые кислоты, сложные эфиры серной кислоты и алкансульфоновые кислоты.

Примерами анионогенных поверхностно-активных веществ являются:

Тритон QS-30 (анионогенный)

Аэрозоль 22

Диоктилсульфосукцинат (АОТ)

Алкилсульфат натрия (Niaproof):

тип 4

тип 8

С₉-С₁₃ aлкилсульфаты натрия (TEEPOL HB7).

Неионогенными поверхностно-активными веществами, используемыми для стабилизации, являются этоксилированный нонилфенол, этоксилированный спирт, триолеат сорбитана, неионогенные блок-сополимерные поверхностно-активные вещества, полиэтиленоксид или полиэтиленоксидные производные феноловых спиртов или жирных кислот. Примерами неионогенных поверхностно-активных веществ являются:

Простые полиоксиэтиленовые эфиры:

лауриловый эфир (n=4) (Brij 30)

лауриловый эфир (n=23)(Brij 35)

Октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Тритоны):

Тх-15

Тх-100

Тх-114

Тх-405

DF-16

N-57

DF-12

CF-10

CF-54

Полиоксиэтиленсорбитан:

монолаурат (твин 20)

Сорбитан:

сесквиолеат (Arlacel 83)

триолеат (Span 85)

Полигликолевый эфир (тергитол):

тип NP-4

тип NP-9

тип NP-35

тип TMN-10

тип 15-S-3

тип TMN-6 (2, 6, 8-триметил-4-нонилоксиполиэтилен-оксиэтанол)

тип 15-S-40.

После выбора подходящего поверхностно-активного вещества отношение органического растворителя иногда может быть значительно уменьшено без потери выхода продукта или энантиоселективности. Следует отметить, что один из таких способов определения того, насколько должно быть снижено количество органического растворителя, заключается в использовании конкретной комбинации ″фермент/рацемическая смесь/поверхностно-активное вещество″, в которой отношение органического растворителя к водному растворителю варьируется следующим образом: [% органического растворителя: % водного растворителя] 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90 и 5:95 и другие отношения, если это необходимо. Образцы энантиомерной смеси обрабатывают стандартным количеством конкретного фермента в присутствии варьирующихся отношений органического растворителя к водному растворителю и поверхностно-активному веществу в течение заданного промежутка времени. После обработки энантиомерной смеси разделяющим ферментом в присутствии равных количеств различных растворителей полученные продукты выделяют с использованием стандартных методов экстракции или хроматографии. Пару растворитель/фермент, дающую наибольший энантиомерный избыток нужного продукта, следует рассматривать как наилучшую для использования в данном способе.

Другим фактором, рассматриваемым при осуществлении способа настоящего изобретения, является стоимость фермента в расчете на единицу полученного продукта. Настоящее изобретение относится к уменьшению требуемого количества фермента в данном способе в расчете на единицу продукта. В одном из вариантов осуществления изобретения присутствует уменьшенное количество органического компонента в негомогенной системе. В другом варианте осуществления настоящего изобретения для дополнительного снижения количества необходимого фермента и дополнительного снижения затрат на осуществление данного способа в указанную негомогенную систему добавляют поверхностно-активное вещество.

В частности, настоящее изобретение относится к ферментативным реакциям, в которых данный субстрат содержит гидрофобный сложный эфир. Кроме того, настоящее изобретение относится к ферментативным реакциям, в которых данный субстрат является относительно нерастворимым в водных растворах. Использование негомогенной системы, содержащей неполностью смешивающиеся с водой органические сорастворители, способствует улучшению сольватации гидрофобных сложных эфиров и других гидрофобных и нерастворимых соединений по сравнению с системами, в которых используются смешивающиеся с водой органические растворители.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся конкретные примеры. Эти примеры приведены лишь в иллюстративных целях и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Примеры

Пример 1. Разделение бутирата FTC, катализируемое эстеразой свиной печени

Рацемический FTC-бутират (1,0 г) растворяли в 5,0 мл н-амилового спирта нагреванием до 75°С в течение 30 минут с получением органического компонента. Затем этот органический компонент смешивали с водным компонентом, содержащим 3,8 мл 0,3 М фосфатного буфера, рН 7,5, и данную негомогенную систему оставляли для охлаждения до 35°С. Затем к водному слою добавляли раствор эстеразы печени свиньи, 1,2 мл 650 ед/мл раствора PLE Altus (Altus Biologics, Cambridge, (МА) и полученную суспензию слегка перемешивали. Температуру поддерживали при 32°С с использованием внешней водяной бани. рН поддерживали при 7,5 путем добавления, если это необходимо, 50% водного раствора гидроксида натрия. Оптическую чистоту непрореагировавшего сложного эфира, (-)-бутирата и спиртового продукта (+)-FTC контролировали посредством ВЭЖХ-анализа с использованием колонки с хиральной стационарной фазой. Через 24 часа (+)-энантиомер сложного эфира FTC был полностью преобразован, на что указывал ВЭЖХ-анализ, описанный ниже. После экстракции непрореагировавшего сложного эфира из органической фазы и выпаривания органического растворителя получали желаемый эфир (-)-FTC. Выход составлял 89,4% в расчете на один (-)-энантиомер, а оптическая чистота превышала 99%.

Методы:

Условия хиральной ВЭЖХ: CHIRAPAK® AS; ВЭЖХ-колонка 0,46 см×25 см (Daicel Chemical Inc.), подвижная фаза = 100% ацетонитрил, скорость потока = 1 мл/мин, УФ-детекция при 260 нм. Время удерживания: (-)-FTC-бутират, 6,2 мин; (-)-FTC, 7,4 мин; (+)-FTC-бутират, 8,8 мин; и (+)-FTC, 11,4 мин.

Ферментативную активность определяли по преобразованию этилбутирата с использованием аппарата рН-стата Radiometer для получения кислоты. Этилбутират (40 мл) добавляли к 20 мл 5 мМ борной кислоты (рН 8) и перемешивали при 25°С вплоть до полного растворения (10 минут). Затем добавляли PLE и рН поддерживали при 8,0 добавлением 0,01 н. NaOH. Скорость образования кислоты определяли, исходя по скорости добавления основания в течение 5 минут.

Стабильность фермента определяли по мере протекания реакции. Измерения проводили путем периодического взятия аликвот ферментного раствора и определения активности с помощью этилбутиратного анализа.

Пример 2. Катализируемое CLEC™-PLE взаимодействие бутирата FTC в смеси 83% н-амилового спирта (или 3-Ме-3-пентанола)/воды.

Условия реакции и методы были такими же, как и в примере 1, за исключением того, что объем фосфатного буфера составлял 1 мл, а объем органического компонента составлял 8,3 мл. Степень преобразования через 36 часов составляла 38% для н-амилового спирта и 25% для 3-метил-3-пентанола (см. таблицу 1, реакции 12 и 13).

Пример 3. Катализируемое PSL взаимодействие бутирата FTC в смеси 50% н-амилового спирта/воды.

Условия реакции и методы были такими же, как и в примере 1, за исключением того, что использовали 100 мг растворимого PSL-30 (PSL-30 представляет собой PS30 от Amano). Степень преобразования через 24 часа составляла 56%, и (-)-энантиомер был преимущественно гидролизован. Оптическая чистота остаточного сложного эфира составляла 92% при 56%-ном преобразовании (см. таблицу 1, реакцию 21).

Пример 4. ANL-катализируемое взаимодействие бутирата FTC в смеси 50% н-амилового спирта/воды.

Условия реакции и методы были такими же, как и в примере 1, за исключением того, что использовали 200 мг растворимого ANL. Степень преобразования через 36 часов составляла 45%. Оптическая чистота остаточного сложного эфира составляла 63% при 45%-ном преобразовании (см. таблицу 1, реакцию 22).

Пример 5. PLE-катализируемое преобразование (±)-ЕТС-бутирата в смеси 20% изопропанола (или других смешиваемых с водой органических сорастворителей)/воды с 2% концентрацией субстрата.

Нижеследующий пример иллюстрирует известные способы, осуществляемые с использованием большого количества ферментных катализаторов в гомогенной системе. К раствору 1 мл PLE-раствора Altus (650 единиц/мл от Altus Biologics, Inc.) в 39 мл 0,3 М фосфатного буфера (рН 7,5) добавляли 10 мл 10% бутирата FTC в изопропаноле. Полученную смесь перемешивали при 24-26°С и за ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ. После взаимодействия в течение 22 часов конверсия достигала 51%, а оптическая чистота остального хирального нерацемического сложноэфирного соединения составляла выше 99% (химический выход = 48%). Эти результаты были сделаны на основе ВЭЖХ-анализа остального хирального нерацемического сложноэфирного соединения. Водный слой включал гидролизованные продукты (+)-FTC и (-)-FTC. Отношение (+)-FTC и (-)-FTC составляло 96,6:3,4. Органический слой выпаривали с получением 0,457 г (-) -FTC-бутирата.

Аналогичную реакцию проводили с использованием других смешивающихся с водой органических сорастворителей, включая ацетонитрил, ДМФ, 1-метил-2-пирролидинон, метанол, этанол, трет-бутанол, ДМСО, пиридин, ди(этиленгликоль)метиловый эфир, ПЭГ 200 и ПЭГ 600 и т.п. Ацетонитрил давал такую же высокую энантиоселективность, как и изопропанол, и требовал использования таких же больших количеств фермента. Все остальные растворители давали более низкую энантиоселективность, чем изопропанол.

Пример 6. PLE-катализируемое преобразование (±)-FTC-бутирата в 20% смеси изопропанола/воды с 5% концентрацией субстрата.

К раствору 2,5 мл PLE-раствора Altus (650 единиц/мл от Altus Biologics, Inc.) в 37,5 мл 0,3 М фосфатного буфера (рН 7,5) добавляли 10,0 мл 25% FTC-бутирата в изопропаноле. В этих условиях субстрат растворялся неполностью. Полученную смесь перемешивали при 24-26°С и за ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ. После взаимодействия в течение 96 часов преобразование достигало 60%, а оптическая чистота оставшегося сложного эфира составляла 74% (химический выход 38%). Энантиоселективность была гораздо выше, чем в реакции с 2% концентрацией субстрата.

Пример 7. PLE-катализируемое преобразование (±)-FTC-бутирата в 30% смеси изопропанола/воды с 3% концентрацией субстрата.

К раствору 1,5 мл PLE-раствора Altus (650 единиц/мл от Altus Biologics, Inc.) в 33,5 мл 0,3 М фосфатного буфера (рН 7,5) добавляли 15 мл 10% FTC-бутирата в изопропаноле. Полученную смесь перемешивали при 24-26°С и за ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ. Через 2 часа преобразование составляло 8% и больше не увеличивалось. В 30% изопропаноле этот фермент быстро терял всю свою активность.

В таблице 1 систематизированы результаты реакций разделения FTC-бутирата различными ферментами в двухфазных негомогенных системах, содержащих различные органические растворители, которые смешиваются с водой не более чем приблизительно на 50%, и водные буферные растворы.

Примеры 5-7 иллюстрируют некоторые проблемы, связанные с использованием смешивающихся с водой спиртов в гомогенных системах для осуществления способа по настоящему изобретению. Такие системы дают продукт с пониженной оптической чистотой, увеличивают продолжительность реакций и инактивируют фермент.

Примеры 8-13. PLE-катализируемое преобразование (+)-FTC-бутирата в негомогенных системах с использованием н-амилового спирта и воды.

Условия реакции и методы были аналогичны описанным в примере 1. Данная негомогенная система содержит 1 мл раствора PLE Altus (650 ед./мл) в качестве катализатора, а объемы используемого амилового спирта и фосфатного буфера являются такими, как они указаны ниже в таблице 2. Следует отметить, что в каждом случае селективность преобразования (+)-изомера была почти абсолютной, так что желаемое преобразование, слегка превышающее 50%, давало энантиомерную чистоту непрореагировавшего (-)сложного эфира почти 100% (см. таблицу 2).

Примеры 14-30: PLE-катализируемое преобразование (±)-FТС-бутирата в негомогенных системах, содержащих смеси н-амилового спирта и воды в присутствии поверхностно-активных веществ

Примеры 14-30 показаны в таблице 3. Условия реакции и методы аналогичны описанным в примере 1. Негомогенная система содержит 1 мл раствора PLE Altus (650 ед/мл) в качестве катализатора и 1 мл (примеры 14-21, 23, 24 и 30) или 0,1 г поверхностно-активного вещества (примеры 25-29), добавленного к этим реакционным смесям. Органический компонент содержал н-амиловый спирт, а водный компонент содержал 0,3 М фосфатный буфер в отношении 50:50.

Скрининг широкого ряда поверхностно-активных веществ, показанных в таблице 3, выявил, что некоторые из них обладают активирующим действием (см. примеры 14, 15, 19, 20, 24, 28 и 30), а некоторые обладают ингибирующим действием (см. примеры 16, 23, 27 и 29). Для последующего анализа были выбраны пятнадцать поверхностно-активных веществ. Все поверхностно-активные вещества тергитол NP-4, твин 80, тилоксапол и диоктилсульфосукцинат натрия увеличивали активность PLE примерно в одинаковой степени. Увеличение скорости было наиболее заметно в конце реакции, и оно может быть обусловлено стабилизацией фермента и предотвращением осаждения, а также влиянием на эффективность катализатора.

Пример 31-34. PLE-катализируемое преобразование (±)-FTC-бутирата в двухфазных смесях н-амилового спирта/воды в присутствии твина-80

Примеры 31-34 представлены в таблице 4. Реакционные условия и процедуры аналогичны описанным в примере 1. Негомогенная система содержала твин 80 в качестве супернатанта и 0,6 мл раствора PLE Altus (650 ед/мл) в качестве катализатора, а объем используемых амилового спирта и 0,3 М фосфатного буфера указан ниже в таблице.

Пример 35. Дополнительное снижение потребности как в ферменте, так и в органическом растворителе

Условия реакции и методы аналогичны описанным в примере 1. Негомогенная система содержала 0,5 мл твина-80 в качестве поверхностно-активного вещества, 0,3 мл раствора PLE Altus (650 ед/мл) в качестве катализатора и 2,0 мл амилового спирта и 7,5 мл 0, 3 М фосфатного буфера в качестве растворителей. Данная негомогенная система содержала 25% органического компонента и 75% водного компонента. Через 48 часов степень преобразования составляла 50%, а оптическая чистота остаточного сложного эфира составляла 99,3%.

В данном примере количество фермента и органического растворителя снижалось примерно наполовину по сравнению с количеством, используемым в примерах 31-34 без потери выхода продукта. Кроме того, потребность в ферменте составляла лишь 25% от количества фермента, требуемого в примере 1.

Примеры 36-39. Диоктилсульфосукцинат (Dioctyl SS) в качестве поверхностно-активного вещества

Примеры 36-39 представлены в таблице 5. Условия реакции и методы аналогичны описанным в примере 1. Данная негомогенная система содержала диоктилсульфосукцинат (Dioctyl SS) в качестве поверхностно-активного вещества и 0,4 мл раствора фермента PLE Altus (650 ед/мл) в 8 мл 0,3 М фосфатного буфера и 2 мл амилового спирта.

Пример 40.

Условия реакции и методы аналогичны описанным в примере 1. Катализатор содержал в целом 714 единиц эстеразы печени свиньи (Sigma, St. Louis, МО). Данная негомогенная система содержала 50% н-амилового спирта в качестве органического компонента и 50% 0,3 М фосфатного буфера при рН 7,4 в качестве водного компонента. Через 24 часа степень преобразования составляла 50%, а оптическая чистота остаточного сложного эфира составляла 97,5%.

Пример 41. Увеличение скорости при низкой загрузке фермента и анионогенного поверхностно-активного вещества

Помимо использования твина-80 для увеличения скорости реакции было выбрано анионогенное поверхностно-активное вещество, а именно натриевая соль диоктилсульфоянтарной кислоты. Как показано в таблице 6, 1% загрузка этого поверхностно-активного вещества в негомогенной системе была достаточной для значительного увеличения скорости реакции.

Использовали следующие реакционные условия: 1 г бутирата FTC, 0,4% загрузка PLE, органический растворитель 1-пентанол, отношение растворителей 2:8; реакцию осуществляли при 30°С (таблица 6).

Пример 42. Влияние поверхностно-активного вещества на загрузку фермента и концентрацию органического растворителя

В предпочтительном варианте настоящего изобретения нагрузка фермента составляет 0,3-0,4% по отношению к бутирату FTC с 10% загрузкой субстрата. Для более точного определения изменений от опыта к опыту и влияния преобразования на оптическую чистоту был осуществлен ряд реакций в немного более крупном масштабе. Результаты представлены ниже в таблице 7.

Как показано в таблице 8, в результате реакций, осуществленных при низком отношении "органический растворитель/вода" и при 0,3% загрузке фермента, высокая оптическая чистота достигалась менее чем за 48 часов.

Несмотря на описанные выше различные варианты осуществления настоящего изобретения, очевидно, что могут быть внесены изменения с получением других вариантов осуществления изобретения, в которых могут быть использованы способы и композиции настоящего изобретения. Поэтому необходимо иметь в виду, что объем настоящего изобретения определен нижеприведенной формулой изобретения, а не конкретными вариантами его осуществления, проиллюстрированными выше в виде примеров.

Реферат

Изобретения относятся к биотехнологии, а именно к ферментативному разделению энантиомерной смеси с получением противовирусных соединений. Способ предусматривает диспергирование энантиомерной смеси соединения формулы I при концентрации 1-25% в системе органических растворителей с образованием органического компонента. Затем получают водный компонент и приводят его в контактирование с органическим компонентом. В результате получают двухфазную негомогенную систему, в которой диспергируют гидролазный фермент. Гидролазный фермент может быть диспергирован также в органическом или водном компоненте. При осуществлении способа создают условия, которые обеспечивают разделение энантиомерной смеси на нерацемический сложный эфир формулы I и нерацемический спирт формулы II. Изобретения позволяют повысить эффективность преобразования гидрофобных субстратов и снизить расходы фермента, что приводит к снижению стоимости противовирусных лекарственных средств. 2 с. и 68 з.п. ф-лы, 8 табл.

Формула

1. Способ получения хирального нерацемического сложного эфира формулы I и нерацемического спирта формулы II:

где Х=Р; Y=S;

R представляет собой C₁-C₈ алкил, C₂-C₈ алкенил или C₂-C₈ алкинил,

включающий следующие стадии:

(a) диспергирование энантиомерной смеси соединения формулы I при концентрации от около 1 до около 25% (масса/объем негомогенной системы) в системе органических растворителей с образованием органического компонента;

(b) получение системы водных растворителей для образования водного компонента и

(с) контактирование указанных органического и водного компонентов с образованием двухфазной негомогенной системы в условиях, которые позволяют осуществить разделение энантиомерной смеси гидролазным ферментом с получением хирального нерацемического сложного эфира формулы I и нерацемического спирта формулы II, где указанный гидролазный фермент диспергируют в указанном органическом компоненте, либо в указанном водном компоненте, или в указанной негомогенной системе.

37. Двухфазная негомогенная система для разделения энантиомерной смеси сложного эфира формулы I с получением хирального нерацемического сложного эфира формулы I и нерацемического спирта формулы II:

где X=F; Y=S;

R представляет собой C₁ -C₈ алкил, C₂-C₈ алкенил или C₂-C₈ алкинил, включающая

(a) гидролазный фермент;

(b) энантиомерную смесь соединения формулы I;

(c) органический компонент;

(d) водный компонент, контактирующий с органическим компонентом,

где указанная энантиомерная смесь диспергирована в органическом компоненте.