Способы и композиции для улучшения признаков растений - RU2018105055A
Код документа: RU2018105055A
Формула
1. Способ увеличения фиксации азота у небобового растения, включающий: воздействие на растение множеством бактерий, где каждый представитель множества несет одну или несколько генетических вариаций, вводимых в один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий так, что бактерии становятся способными к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота; где бактерии не являются межродовыми микроорганизмами; и где бактерии in planta продуцируют в растении 1% или более фиксированного азота.
2. Способ по п. 1, в котором одна или несколько генетических вариаций включают вводимую регуляторную последовательность, функционально связанную с указанными одним или несколькими генами генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.
3. Способ по п. 2, в котором регуляторная последовательность представляет собой промотор.
4. Способ по п. 3, в котором промотор представляет собой индуцибельный промотор.
5. Способ по п. 1, в котором бактерии не содержат конститутивного промотора, функционально связанного с геном генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.
6. Способ по п. 1, в котором бактерии не содержат конститутивного промотора, функционально связанного с геном в кластере генов nif.
7. Способ по п. 1, в котором бактерии in planta выделяют азотсодержащие продукты фиксации азота.
8. Способ по п. 1, в котором множество бактерий, воздействующих на растение, не стимулируют увеличения захвата экзогенного неатмосферного азота.
9. Способ по п. 1, в котором растение выращивают в почве с поля, в которое вводили по меньшей мере 22,68 кг азотсодержащего удобрения на акр, и где азотсодержащее удобрение содержит по меньшей мере 5% азота по массе.
10. Способ по п. 9, в котором азотсодержащее удобрение содержит аммоний или содержащую аммоний молекулу.
11. Способ по п. 1, в котором множество бактерий включает по меньшей мере два различных вида бактерий.
12. Способ по п. 1, в котором множество бактерий включает по меньшей мере два различных штамма одного вида бактерий.
13. Способ по п. 1, в котором экзогенный азот выбран из удобрения, содержащего одно или несколько из глутамина, аммиака, аммония, мочевины, нитрата, нитрита, содержащих аммоний молекул, содержащих нитраты молекул и содержащих нитриты молекул.
14. Способ по п. 1, в котором бактерии in planta продуцируют в растении 5% или более фиксированного азота.
15. Способ по п. 1, в котором бактерии in planta продуцируют в растении 10% или более фиксированного азота.
16. Способ по п. 1, в котором один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий выбраны из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, полинуклеотида, кодирующего глутаминсинтетазу, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, полинуклеотида, кодирующего глутаминазу, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ.
17. Способ по п. 1, в котором одна или несколько генетических вариаций представляют собой мутацию, которая приводит к одному или нескольким из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной активности удаления аденилата GlnE или сниженной активности удаления уридилата GlnD.
18. Способ по п. 1, в котором одна или несколько генетических вариаций (A) представляют собой нокаут-мутацию; (B) изменяют или удаляют регуляторную последовательность гена-мишени или (C) включают вставку гетерологичной регуляторной последовательности.
19. Способ по п. 1, в котором множество бактерий представляют собой бактерии родов, включающих Enterobacter, Rahnella, Kosakonia, Burkholderia или Klebsiella.
20. Способ по п. 1, в котором множество бактерий является эндофитным, эпифитным или ризосферным.
21. Способ по п. 1, в котором множество бактерий колонизирует по меньшей мере корни растений так, что бактерии присутствуют в растении в количестве по меньшей мере приблизительно 105 КОЕ на грамм сырой массы ткани.
22. Способ по п. 1, в котором растение представляет собой сельскохозяйственную культуру.
23. Способ по п. 22, в котором сельскохозяйственная культура выбрана из сорго, канола, томата, клубники, ячменя, риса, кукурузы и пшеницы.
24. Способ по п. 22, в котором растение представляет собой генетически модифицированный организм.
25. Способ по п. 22, в котором растение не является генетически модифицированным организмом.
26. Способ по п. 22, в котором растение генетически сконструировано или выведено для эффективного использования азота.
27. Популяция бактерий, содержащая бактерии, несущие одну или несколько генетических вариаций, вводимых в один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий так, что бактерии становятся способными к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота; где бактерии не являются межродовыми микроорганизмами; и где бактерии in planta продуцируют в растении, выращиваемом в присутствии популяции бактерий, 1% или более фиксированного азота.
28. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что одна или несколько генетических вариаций включают вводимую регуляторную последовательность, функционально связанную с указанными одним или несколькими генами генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.
29. Популяция бактерий по п. 28, отличающаяся тем, что регуляторная последовательность представляет собой промотор.
30. Популяция бактерий по п. 29, отличающаяся тем, что промотор представляет собой индуцибельный промотор.
31. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что бактерии не содержат конститутивного промотора, функционально связанного с геном генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.
32. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что бактерии не содержат конститутивного промотора, функционально связанного с геном в кластере генов nif.
33. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что бактерии in planta выделяют азотсодержащие продукты фиксации азота.
34. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что бактерии, воздействующие на растение, не стимулируют увеличение захвата экзогенного неатмосферного азота.
35. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что популяция бактерий содержит по меньшей мере два различных вида бактерий.
36. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что популяция бактерий содержит по меньшей мере два различных штамма одного вида бактерий.
37. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что экзогенный азот выбран из удобрения, содержащего одно или несколько из глутамина, аммиака, аммония, мочевины, нитрата, нитрита, содержащих аммоний молекул, содержащих нитраты молекул и содержащих нитриты молекул.
38. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что бактерии in planta продуцируют в растении 5% или более фиксированного азота.
39. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что бактерии in planta продуцируют в растении 10% или более фиксированного азота.
40. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий выбраны из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, полинуклеотида, кодирующего глутаминсинтетазу, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, полинуклеотида, кодирующего глутаминазу, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ.
41. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что одна или несколько генетических вариаций представляют собой мутацию, которая приводит к одному или нескольким из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной активности удаления аденилата GlnE или сниженной активности удаления уридилата GlnD.
42. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что одна или несколько генетических вариаций (A) представляют собой нокаут-мутацию; (B) изменяют или удаляют регуляторную последовательность гена-мишени или (c) включают вставку гетерологичной регуляторной последовательности.
43. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий представляют собой бактерии родов, включающих Enterobacter, Rahnella, Kosakonia, Burkholderia или Klebsiella.
44. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий является эндофитным, эпифитным или ризосферным.
45. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что растение представляет собой сельскохозяйственную культуру.
46. Популяция бактерий по п. 45, отличающаяся тем, что сельскохозяйственная культура выбрана из сорго, канола, томата, клубники, ячменя, риса, кукурузы и пшеницы.
47. Популяция бактерий по п. 45, отличающаяся тем, что растение представляет собой генетически модифицированный организм.
48. Популяция бактерий по п. 45, отличающаяся тем, что растение не является генетически модифицированным организмом.
49. Популяция бактерий по п. 45, отличающаяся тем, что растение генетически сконструировано или выведено для эффективного использования азота.
50. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий колонизирует растение так, что бактерии присутствуют в растении в количестве по меньшей мере приблизительно 105 КОЕ на грамм свежей массы растения.
51. Композиция, содержащая популяцию бактерий по любому из пп. 27-50.
52. Композиция по п. 51, отличающаяся тем, что композиция содержит популяцию бактерий, наносимых на поверхность семян.
53. Композиция по п. 51, отличающаяся тем, что композицию формулируют в виде жидкости или порошка.
54. Выделенная бактерия, депонированная в качестве № доступа к депозиту ATCC PTA-122293 или PTA-122294.
55. Не являющаяся межродовой бактерия, несущая одну или несколько генетических вариаций, вводимых в один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий так, что бактерия становится способной к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота.
56. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что одна или несколько генетических вариаций включают вводимую регуляторную последовательность, функционально связанную с указанными одним или несколькими генами генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.
57. Бактерия по п. 56, отличающаяся тем, что регуляторная последовательность представляет собой промотор.
58. Бактерия по п. 57, отличающаяся тем, что промотор представляет собой индуцибельный промотор.
59. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия не содержит конститутивный промотор, функционально связанный с геном генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.
60. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия не содержит конститутивный промотор, функционально связанный с геном в кластере генов nif.
61. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий выбраны из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, полинуклеотида, кодирующего глутаминсинтетазу, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, полинуклеотида, кодирующего глутаминазу, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ.
62. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что одна или несколько генетических вариаций представляют собой мутацию, которая приводит к одному или нескольким из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной активности удаления аденилата GlnE или сниженной активности удаления уридилата GlnD.
63. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что одна или несколько генетических вариаций (A) представляют собой нокаут-мутацию; (B) изменяют или удаляют регуляторную последовательность гена-мишени или (C) включают вставку гетерологичной регуляторной последовательности.
64. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия представляет собой бактерию родов, включающих Enterobacter, Rahnella, Kosakonia, Burkholderia или Klebsiella.
65. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия является эндофитной, эпифитной или ризосферной.
66. Способ получения одной или нескольких бактерий, включающий:
(a) выделение бактерий из ткани или почвы первого растения;
(b) внесение генетической вариации в одну или несколько бактерий с получением одного или нескольких вариантов бактерий;
(c) воздействие вариантами бактерий на множество растений;
(d) выделение бактерий из ткани или почвы одного из множества растений, где растение, из которого выделяют бактерии, обладает улучшенным признаком относительно других растений в множестве растений; и
(e) повторение этапов (b)-(d) с бактериями, выделенными на этапе (d).
67. Способ по п. 66, в котором улучшенный признак представляет собой улучшенную фиксацию азота в растении, из которого выделяют бактерии.
68. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой вариацию в гене, выбранном из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ.
69. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой вариацию в гене, кодирующем белок с функциональностью, выбранной из группы, состоящей из: глутаминсинтетазы, глутаминазы, аденилаттрансферазы глутаминсинтетазы, активатора транскрипции, антиактиватора транскрипции, пируват:флаводоксин-оксидоредуктазы, флаводоксина или АДФ-D-рибозилтрансферазы НАД+:динитрогеназоредуктазы.
70. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой мутацию, которая приводит к одному или нескольким из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной активности удаления аденилата GlnE или сниженной активности удаления уридилата GlnD.
71. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой нокаут-мутацию.
72. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация приводит к устранению или отмене активности белкового домена.
73. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация изменение или удаление регуляторной последовательности гена-мишени.
74. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация включает вставку гетерологичной регуляторной последовательности.
75. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация включает вставку регуляторной последовательности, выявленной в геноме вида или рода бактерий соответствующих бактериям, у которых проводят генетическую вариацию.
76. Способ по п. 75, в котором регуляторная последовательность выбрана на основе уровня экспрессии гена в культуре бактерий или в ткани растения.
77. Способ по п. 66, в котором генетическую вариацию получают посредством химического мутагенеза.
78. Способ по п. 66, в котором этап (c) дополнительно включает воздействие на растения биотическими или абиотическими стрессовыми факторами.
79. Способ по п. 67, в котором бактерии, выделенные после однократного или многократного повторения этапов (b)-(d), продуцируют 1% или более азота у второго растения того же типа, что и первое растение.
80. Способ по п. 67, в котором бактерии, выделенные после однократного или многократного повторения этапов (b)-(d), демонстрируют по меньшей мере 2-кратное увеличение фиксации азота по сравнению с бактериями, выделяемыми из первого растения.
81. Способ по п. 80, в котором второе растение выращивают в присутствии удобрения, дополненного глутамином, аммиаком или другим химическим источником азота.
82. Способ по п. 66, где первое растение представляет собой сельскохозяйственную культуру.
83. Способ по п. 82, в котором сельскохозяйственная культура выбрана из ячменя, риса, кукурузы, пшеницы, сорго, сахарной кукурузы, сахарного тростника, репчатого лука, томатов, клубники или спаржи.
84. Способ по п. 66, в котором первое или растения в множестве растений являются модельными растениями.
85. Способ по п. 84, в котором модельное растение выбрано из Setaria, Brachypodium или Arabidopsis.
86. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой предопределенную генетическую вариацию, которую специфически, проводят в намеченном участке.
87. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой случайную мутацию в участке-мишени.
88. Способ по п. 66, в котором этап (a) дополнительно включает проведение генетического анализа выделенных бактерий.
89. Способ по п. 66, в котором этап (b) дополнительно включает применение селекционного давления для обогащения бактериями, несущими генетическую вариацию.
90. Способ по п. 89, в котором селекционное давление включает расщепление геномов с отсутствием генетической вариации, вводимой в намеченный участок, где расщепление происходит в пределах 100 нуклеотидов от намеченного участка.
91. Способ по п. 89, дополнительно включающий выделение бактерий, перенесших селекционное давление.
92. Способ по п. 91, в котором расщепление проводят посредством сайт-специфической нуклеазы, выбранной из группы, состоящей из контрселективного маркера, нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALE или мегануклеазы.
93. Способ по п. 92, в котором сайт-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR.
94. Способ по п. 66, в котором генетическая вариация представляет собой вставку или делецию одного или нескольких нуклеотидов.
95. Способ по п. 66, в котором бактерии, выделенные после однократного или многократного повторения этапов (b)-(d), являются эндофитными, эпифитными или ризосферными.
96. Способ по п. 66, в котором бактерии, выделенные после однократного или многократного повторения этапов (b)-(d), включают множество бактерий различных таксонов.
97. Способ по п. 66, в котором бактерии выделяют из ткани растения.
98. Способ по п. 66, в котором выделение бактерий на этапе (a) включает выделение бактерий из семян первого растения.
99. Способ модификации генома клетки вида бактерий, где способ включает:
(a) предоставление полинуклеотида, содержащего подпоследовательность, состоящую из последовательностей из вида бактерий, где подпоследовательность в направлении от 5' к 3' содержит первую гомологичную последовательность, промотор и вторую гомологичную последовательность; и
(b) индукцию гомологичной рекомбинации между локусом-мишенью генома и полинуклеотидом с получением рекомбинантной последовательности, где (i) локус-мишень содержит последовательность-мишень, фланкированную первой и второй гомологичными последовательностями, и (ii) усиливает экспрессию одного или нескольких вторичных генов, расположенных рядом с локусом-мишенью.
100. Способ по п. 99, дополнительно включающий:
(b)(iii) то, что гомологичная рекомбинация нарушает экспрессию первого гена, содержащего последовательность-мишень.
101. Способ по п. 99, дополнительно включающий:
(c) выделение бактериальных клеток, содержащих рекомбинированную последовательность.
102. Способ по п. 99, в котором промотор выбран на основе активности экспрессии выше порогового уровня в условиях окружающей среды.
103. Способ по п. 102, в котором условие окружающей среды выбрано из группы, состоящей из: доступности питательных веществ, дефицита питательных веществ, недостатка азота, увеличенного количества азота, жары, холода, осмотического стресса, засухи, затопление, засоления, присутствия или отсутствия межвидовых сигнальных соединений, присутствия или отсутствия патогенов и присутствия или отсутствия пестицидов, гербицидов, инсектицидов, нематоцидов, фунгицидов или бактерицидов, где увеличенное или сниженное воздействие определяют относительно эталонных условий.
104. Способ по п. 103, в котором отбор промотора включает: (a) воздействие на клетки вида бактерий условий окружающей среды, (b) определение уровней экспрессии транскриптов клеток и (c) идентификацию промотора, контролирующего экспрессию транскрипта с уровнем выше порогового уровня.
105. Способ по п. 99, в котором подпоследовательность не кодирует белка вида бактерий.
106. Способ по п. 99, в котором подпоследовательность не кодирует селективный маркер.
107. Способ по п. 101, в котором выделение бактериальных клеток включает применение отрицательного отбора против клеток с отсутствием рекомбинантной последовательности.
108. Способ по п. 107, в котором отрицательный отбор включает расщепление геномов с отсутствием рекомбинантной последовательности, где расщепление происходит в пределах 100 нуклеотидов от последовательности-мишени.
109. Способ по п. 108, в котором расщепление проводят посредством сайт-специфической нуклеазы, выбранной из группы, состоящей из контрселективного маркера, нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALE или мегануклеазы.
110. Способ по п. 109, в котором сайт-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR.
111. Способ по п. 99, в котором первый ген представляет собой отрицательный регулятор одного или нескольких вторичных генов.
112. Способ по п. 99, в котором первый ген, один или несколько вторичных генов или все из них являются участниками пути фиксации азота.
113. Способ по п. 99, в котором первый ген выбран из группы, состоящей из: NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT и AmtB.
114. Способ по п. 99, в котором один или несколько вторичных генов выбраны из группы, состоящей из: NifA и глутаминазы.
115. Способ по п. 99, в котором выделенные бактериальные клетки являются эндофитными, эпифитными или ризосферными.
116. Способ по п. 115, в котором выделенные бактериальные клетки продуцируют в клетках растения-хозяина 5% или более азота.
117. Способ по п. 116, в котором выделенные бактерии продуцируют азот в присутствии удобрения, дополненного глутамином, аммиаком или другим химическим источником дополнительного азота.
118. Полинуклеотид для разрушения гена-мишени в клетке вида бактерий, где полинуклеотид содержит подпоследовательность, состоящую из последовательностей, получаемых из вида бактерий, где:
(a) подпоследовательность содержит в направлении от 5' к 3' первую гомологичную последовательность, промотор и вторую гомологичную последовательность;
(b) первая и вторая гомологичные последовательности соответствуют последовательностям, фланкирующим последовательность-мишень, которая удаляется после гомологичной рекомбинации между подпоследовательностью и локусом-мишенью, содержащим последовательность-мишень;
(c) последовательность-мишень содержит по меньшей мере первую кодирующую белок часть первого гена; и
(d) подпоследовательность не кодирует белка вида бактерий.
119. Полинуклеотид по п. 118, в котором подпоследовательность не кодирует селективный маркер.
120. Полинуклеотид по п. 118, в котором промотор представляет собой промотор гена с активностью экспрессия выше порогового уровня в условиях окружающей среды.
121. Полинуклеотид по п. 120, в котором условие окружающей среды представляют собой увеличенное воздействие азота, и где увеличенное воздействие определяют относительно эталонных условий.
122. Полинуклеотид по п. 118, в котором последовательность-мишень расположена рядом с одним или несколькими вторичными генами.
123. Полинуклеотид по п. 122, в котором первый ген, один или несколько вторичных генов или все из них являются участниками пути фиксации азота.
124. Полинуклеотид по п. 118, в котором первый ген выбран из группы, состоящей из: NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT и AmtB.
125. Полинуклеотид по п. 118, в котором клетка представляет собой бактерию, которая является эндофитной, эпифитной или ризосферной.
126. Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 118-125.
127. Клетка, содержащая экспрессию по п. 126.
128. Способ по п. 1, в котором множество бактерий представляет собой бактерии рода Enterobacter.
129. Способ по п. 1, в котором множество бактерий представляет собой бактерии рода Rahnella.
130. Способ по п. 1, в котором множество бактерий представляет собой бактерии рода Kosakonia.
131. Способ по п. 1, в котором множество бактерий представляет собой бактерии рода Burkholderia.
132. Способ по п. 1, в котором множество бактерий представляет собой бактерии рода Klebsiella.
133. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий представляет собой бактерии рода Enterobacter.
134. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий представляет собой бактерии рода Rahnella.
135. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий представляет собой бактерии рода Kosakonia.
136. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий представляет собой бактерии рода Burkholderia.
137. Популяция бактерий по п. 27, отличающаяся тем, что множество бактерий представляет собой бактерии рода Klebsiella.
138. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия представляет собой бактерию из рода Enterobacter.
139. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия представляет собой бактерию из рода Rahnella.
140. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия представляет собой бактерию из рода Kosakonia.
141. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия представляет собой бактерию из рода Burkholderia.
142. Бактерия по п. 55, отличающаяся тем, что бактерия представляет собой бактерию из рода Klebsiella.
143. Способ по п. 99, дополнительно включающий:
(b)(iii) гомологичная рекомбинация нарушает экспрессию первого гена, содержащего последовательность-мишень; и
(c) выделение бактериальных клеток, содержащих рекомбинированную последовательность.
