Мутантные иммуноглобулин-связывающие полипептиды - RU2017115342A
Код документа: RU2017115342A
Формула
1. Fc-связывающий полипептид, содержащий мутант родительского Fc-связывающего домена белка A Staphylococcus (SpA), определенного посредством, или имеющего по меньшей мере 90%-ную, например по меньшей мере 95% или 98%-ную идентичность SEQ ID NO: 4, 5 или 7, где по меньшей мере:
остаток глутамина в положении, соответствующем положению 9 в SEQ ID NO: 4, 5 или 7, мутирован в аланин [А]; и
остаток аспарагина в положении, соответствующем положению 11 в SEQ ID NO: 4, 5 или 7, мутирован в глутаминовую кислоту [Е] или лизин [K].
2. Fc-связывающий полипептид по п. 1, где мутант содержит дополнительные мутации в одном или более положениях, соответствующих положениям 3, 6, 10, 15, 18, 23, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 42, 43, 44, 47, 50, 51, 55 и 57 в SEQ ID NO: 4, 5 или 7; и/или где одна или более аминокислот возможно делетированы из положений 1-6 и/или из положений 56-58 в SEQ ID NO: 4, 5 или 7.
3. Полипептид по п. 1, где Fc-связывающий домен белка А Staphylococcus (SpA) определен как SEQ ID NO: 7.
4. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 11 в SEQ ID NO: 7, мутирован в глутаминовую кислоту [Е].
5. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 18 в SEQ ID NO: 7, мутирован в лизин [K].
6. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 28 в SEQ ID NO: 7, мутирован в аланин [А].
7. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 33 в SEQ ID NO: 7, мутирован в лизин [K].
8. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 37 в SEQ ID NO: 7, мутирован в глутаминовую кислоту [Е].
9. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 40 в SEQ ID NO: 7, мутирован в валин [V].
10. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 42 в SEQ ID NO: 7, мутирован в лизин [K] или аргинин [R].
11. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 43 в SEQ ID NO: 7, мутирован в аланин [А].
12. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 44 в SEQ ID NO: 7, мутирован в изолейцин [I].
13. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 50 в SEQ ID NO: 7, мутирован в аргинин [R].
14. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 7, мутирован в тирозин [Y].
15. Полипептид по п. 4, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 43 в SEQ ID NO: 7, мутирован в аланин [А] или глутаминовую кислоту [Е].
16. Полипептид по п. 15, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 40 в SEQ ID NO: 7, мутирован в валин [V].
17. Полипептид по п. 16, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 44 в SEQ ID NO: 7, мутирован в изолейцин [I].
18. Полипептид по п. 3, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 11 в SEQ ID NO: 7, мутирован в лизин [K].
19. Полипептид по п. 18, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 43 в SEQ ID NO: 7, мутирован в аланин [А] или глутаминовую кислоту [Е].
20. Полипептид по п. 19, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 40 в SEQ ID NO: 7, мутирован в валин [V].
21. Полипептид по п. 20, где аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению 44 в SEQ ID NO: 7, мутирован в изолейцин [I].
22. Полипептид по п. 1, содержащий последовательность SEQ ID NO: 8, 9, 10 или 11.
23. Полипептид по п. 1, содержащий последовательность SEQ ID NO: 24, 25, 27 или 28.
24. Полипептид по п. 1, где мутант содержит последовательность SEQ ID NO: 36 или 37.
25. Fc-связывающий полипептид, который содержит последовательность SEQ ID NO: 53:
KEX1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NDAQAPK (SEQ ID NO 53),
где независимо друг от друга:
X1=A,
Х2=Е или K,
Х3=Н или K,
Х4=А или N,
Х5=А или G,
X6=Q,
X7=S или K,
Х8=Е или D,
X9=Q или V, (положение 40),
Х10=K, R или А, (положение 42),
Х11=А, Е или N, (положение 43),
Х12=I или L, (положение 44),
X13=K или R; и
X14=L или Y.
26. Полипептид по п. 25, где Х3=K.
27. Полипептид по п. 25, где X5=A.
28. Полипептид по п. 25, где Х7=K.
29. Полипептид по п. 25, где Х8=Е.
30. Полипептид по п. 25, где Х11=А.
31. Полипептид по п. 25, где X14=Y.
32. Полипептид по п. 25, где Х2=Е.
33. Полипептид по п. 32, где X9=V.
34. Полипептид по п. 33, где Х11=А или Е.
35. Полипептид по п. 34, где X12=I.
36. Полипептид по п. 25, где Х2=K.
37. Полипептид по п. 36, где X9=V.
38. Полипептид по п. 37, где Х11=А или Е.
39. Полипептид по п. 38, где X12=I.
40. Разделительная матрица, содержащая множество Fc-связывающих полипептидов по п. 1, связанных с твердой подложкой.
41. Разделительная матрица по п. 40, где полипептиды связаны с твердой подложкой посредством тиоэфирных связей.
42. Разделительная матрица по п. 40, где твердая подложка представляет собой полисахарид.
43. Разделительная матрица по п. 40, где IgG емкость матрицы после 24 ч инкубации в 0,5 М NaOH при 22 +/- 2°С составляет по меньшей мере 80% IgG емкости до инкубации.
44. Разделительная матрица по п. 40, где IgG емкость матрицы после 24 ч инкубации в 1,0 М NaOH при 22 +/- 2°С составляет по меньшей мере 70% IgG емкости до инкубации.
45. Разделительная матрица по п. 40, содержащая 5-25 мг/мл полипептидов, связанных с твердой подложкой.
46. Способ выделения иммуноглобулина, включающий стадии:
а) приведения жидкого образца, содержащего иммуноглобулин, в контакт с разделительной матрицей, содержащей множество Fc-связывающих полипептидов по п. 1, связанных с твердой подложкой,
б) промывания указанной разделительной матрицы промывной жидкостью,
в) элюирования иммуноглобулина с разделительной матрицы с помощью элюирующей жидкости, и
г) очистки разделительной матрицы очищающей жидкостью, имеющей рН 13-14.
47. Способ по п. 46, где очищающая жидкость содержит по меньшей мере 0,5 М NaOH или KOH.
48. Способ по п. 47, где очищающая жидкость содержит 0,5-1,0 М NaOH или KOH.
49. Способ по п. 47, где очищающая жидкость содержит 0,5-2,0 М NaOH или KOH.
50. Способ по п. 46, где разделительную матрицу инкубируют в очищающей жидкости в течение по меньшей мере 10 минут.
51. Способ по п. 46, где стадии (а)-(г) повторяют по меньшей мере 10 раз.
52. Способ по п. 46, где стадии (а)-(в) повторяют по меньшей мере 10 раз до выполнения стадии (г).
53. Способ по п. 46, где жидкий образец дополнительно содержит белки клетки-хозяина.
54. Способ по п. 46, где полипептиды связаны с твердой подложкой посредством тиоэфирных связей.
55. Способ по п. 46, где твердая подложка представляет собой полисахарид.
56. Способ по п. 46, где IgG емкость матрицы после 24 ч инкубации в 0,5 М NaOH при 22 +/- 2°С составляет по меньшей мере 80% IgG емкости до инкубации.
57. Способ по п. 46, где IgG емкость матрицы после 24 ч инкубации в 1,0 М NaOH при 22 +/- 2°С составляет по меньшей мере 70% IgG емкости до инкубации.
