Удаление агрегатов с высокой молекулярной массой путем хроматографии на гидроксиапатитах - RU2006113695A

Реферат

1. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий

а) контактирование препарата антитела с гидроксиапатитовой смолой и элюирование очищенного антитела из смолы по меньшей мере одним элюэнтным буфером, содержащим от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,2 до 2,5 М NaCl; или

б) контактирование гидроксиапатитовой смолы с препаратом антитела в загрузочном буфере, содержащем от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,2 до 2,5 М NaCl, и пропускание очищенного антитела через колонку.

2. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий проведение для препарата антитела (а) аффинной хроматографии с протеином А, (б) ионообменной хроматографии и (в) гидроксиапатитовой хроматографии

1) при этом очищенное антитело элюируют из гидроксиапатитовой смолы с помощью элюэнтного буфера, содержащего от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,2 до 2,5 М NaCl; или

2) осуществляют контакт гидроксиапатитовой смолы с препаратом антитела в загрузочном буфере, содержащем от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,2 до 2,5 М NaCl, и пропускают очищенное антитело через колонку.

3. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий

а) контактирование препарата с подложкой из протеина А,

б) адсорбцию антитела на подложке из протеина А,

в) промывание подложки из протеина А и адсорбированного антитела по меньшей мере одним промывным буфером для протеина А,

г) элюирование адсорбированного антитела по меньшей мере одним элюэнтным буфером для протеина А,

д) контактирование элюата протеина А с ионообменной подложкой,

е) пропускание антитела через ионообменную подложку,

ж) промывание ионообменной подложки по меньшей мере одним ионообменным промывным буфером,

з) контактирование ионообменного потока с гидроксиапатитовой смолой,

и) адсорбцию антитела на смоле,

к) промывание смолы по меньшей мере одним промывным буфером для гидроксиапатита,

л) элюирование очищенного антитела из смолы по меньшей мере одним элюэнтным буфером для гидроксиапатита, содержащим от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,2 до 2,5 М NaCl.

4. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий

а) контактирование препарата с подложкой из протеина А,

б) адсорбцию антитела на подложке из протеина А,

в) промывание подложки из протеина А и адсорбированного антитела по меньшей мере одним промывным буфером для протеина А,

г) элюирование адсорбированного антитела по меньшей мере одним элюэнтным буфером для протеина А,

д) контактирование элюата протеина А с ионообменной подложкой,

е) пропускание антитела через ионообменную подложку,

ж) промывание ионообменной подложки по меньшей мере одним ионообменным промывным буфером,

з) введение ионообменного потока в загрузочный буфер содержащий от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,2 до 2,5 М NaCl

и) контактирование ионообменного потока с гидроксиапатитовой смолой,

к) пропускание антитела через гидроксиапатитовую смолу, и

л) промывание гидроксиапатитовой смолы по меньшей мере одним промывным буфером для гидроксиапатита.

5. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий:

а) уравновешивание гидроксиапатитовой смолы по меньшей мере одним уравновешивающим буфером, содержащим от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,01 до 2,0 М NaCl,

б) контактирование препарата антитела с указанной гидроксиапатитовой смолой в условиях, при которых возможно связывание как мономера так и агрегатов с высокой молекулярной массой,

в) обеспечение более прочного связывания высокомолекулярных агрегатов чем мономеров антител, и по мере продолжения загрузки, обеспечение вытеснения связанного мономераагрегатами с высокой молекулярной массой, и

г) сбор указанного вытесненного мономера.

6. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий проведение для препарата антитела (а) аффинной хроматографии с протеином А, (б) ионообменной хроматографии и (в) гидроксиапатитовой хроматографии, согласно которому:

1) уравновешивают гидроксиапатитовую смолу с помощью по меньшей мере одного уравновешивающего буфера, содержащего от 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,01 до 2,0 М NaCl,

2) осуществляют контакт препарата антитела с указанной гидроксиапатитовой смолой при условиях, в которых происходит связывание как мономера так и агрегатов с высокой молекулярной массой,

3) обеспечивают более прочное связывание высокомолекулярных агрегатов, чем мономеров антител, и, по мере продолжения загрузки, обеспечивают вытеснение связанного мономера агрегатами с высокой молекулярной массой, и

4) отбирают указанные вытесненные мономеры.

7. Способ очистки по меньшей мере одного антитела из препарата антитела, содержащего агрегаты с высокой молекулярной массой, включающий

а) контактирование препарата с подложкой из протеина А,

б) адсорбцию антитела на подложке из протеина А,

в) промывку подложки из протеина А и адсорбированного антитела по меньшей мере одним промывным буфером для протеина А,

г) элюирование адсорбированного антитела по меньшей мере одним элюэнтным буфером для протеина А,

д) контактирование элюата протеина А с ионообменной подложкой,

е) пропускание антитела через ионообменную подложку,

ж) промывку ионообменной подложки по меньшей мере одним ионообменным промывным буфером,

з) уравновешивание гидроксиапатитовой смолы по меньшей мере одним уравновешивающим буфером, содержащим 1 до 20 мМ фосфата натрия и от 0,01 до 2,0 М NaCl,

и) контактирование ионообменного потока с указанной гидроксиапатитовой смолой при условиях, которые позволяют связывать как мономер так и высокомолекулярные агрегаты,

к) обеспечение более прочного связывания агрегатов с высокой молекулярной массой, чем мономеров антител, и по мере продолжения загрузки, обеспечение вытеснения связанного мономера агрегатами с высокой молекулярной массой, и

л) отбор указанного вытесненного мономера.

8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что элюэнтный буфер или загрузочный буфер имеют рН от 6,4 до 7,6, предпочтительно рН от 6,8 до 7,2.

9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что элюэнтный буфер или загрузочный буфер содержат 3 мМ или 5 мМ фосфата натрия.

10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что элюэнтный буфер или загрузочный буфер содержат 1 М или 0,35 М NaCl.

11. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что антитело представляет собой антитело IgG, IgA, igD, IgE или IgM.

12. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что антитело является моноклональным, поликлональным, химерным, гуманизированным или их фрагментом.

13. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что антитело представляет собой рецетор анти-IL-21, анти-GDF-8, анти-Abeta, анти-CD-22, анти-Lewis Y, анти-IL-13 или анти-IL-22-антитело.

14. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что антитело имеет основной pI.

15. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что смола представляет собой керамический гидроксиапатит типа I или типа II.

16. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что аффинную хроматографию с протеином А производят вначале, а гидроксиапатитовую хроматографию - в конце.

17. Способ по любому из пп.2, 3, 4, 6 и 7, отличающийся тем, что ионообменная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию.

18. Способ по любому из пп.3, 4 или 7, отличающийся тем, что включает, по меньшей мере фильтрацию ионообменного потока перед нанесением на гидроксиапатитовую смолу, что снижает содержание вирусных загрязнителей.

19. Способ по любому из пп.3, 4 или 7, отличающийся тем, что что включает по меньшей мере одну ультрафильтрацию или диафильтрацию потока, пропущенного через гидроксиапатит.

20. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что элюэнтный буфер имеет рН от 6,2 до 8,06 предпочтительно рН 7,3.

21. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что элюэнтный буфер содержит 2 мМ или 5 мМ фосфата натрия.

22. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что элюэнтный буфер содержит 50 мМ или 100 мМ хлорида натрия.

23. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что уравновешивающий буфер дополнительно содержит 200 мМ аргинина или HEPES, предпочтительно уравновешивающий буфер дополнительно содержит 100 мМ или 120 мМ аргинина и 100 мМ или 20 мМ HEPES.

24. Способ по п.3, отличающийся тем, что элюэнтный буфер имеет диапазон рН от 6,4 до 7,6, предпочтительно рН от 6,8 до 7,2.

25. Способ по п.3, отличающийся тем, что элюэнтный буфер содержит 3 мМ или 5 мМ фосфата натрия.

26. Способ по п.3, отличающийся тем, что элюэнтный буфер содержит 1М или 0,35 М хлорида натрия.

27. Способ по п.4, отличающийся тем, что загрузочный буфер имеет диапазон рН от 6,4 до 7,6, предпочтительно рН от 6,8 до 7,2.

28. Способ по п.4, отличающийся тем, что загрузочный буфер содержит 3 мМ или 5 мМ фосфата натрия.

29. Способ по п.4, отличающийся тем, что загрузочный буфер содержит 1М или 0,35 М хлорида натрия.