Модуль проточной ячейки и способ его получения - RU2754808C2

Чертежи

Описание

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на полезный эффект предварительной патентной заявки US 62/438316, поданной 22 декабря 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Биологическая матрица (англ. biological array, также называемая биочипом или биологическим блоком) - это один из огромного множества инструментов, применяемых для обнаружения и анализа молекул, включающих дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Матрицы для указанного применения конструируют таким образом, чтобы они включали зонды для нуклеотидных последовательностей, находящихся в генах человека и других организмов. Например, в некоторых вариантах применения отдельные зонды для ДНК и РНК могут быть присоединены к небольшим участкам, создаваемым на подложке матрицы (чипа) в виде геометрической сетки (или неупорядоченным образом). Например, испытуемый образец, полученный из организма определенного человека или другого организма, может быть нанесен на сетку таким образом, чтобы комплементарные фрагменты гибридизовались с зондами на индивидуальных сайтах матрицы. Затем матрица может быть исследована сканированием сайтов при определенных частотах света, и по флуоресценции тех сайтов, с которыми гибридизованы фрагменты, может быть установлено, какие именно фрагменты присутствуют в образце.

Биологические матрицы могут быть применены для проведения генетического секвенирования. В общем, генетическое секвенирование включает определение порядка нуклеотидов или нуклеиновых кислот по протяженности генетического материала, такого как фрагмент ДНК или РНК. Постепенно удлиняющиеся последовательности пар оснований анализируют, и полученная информация о последовательности может быть применена в различных биоинформатических методиках для логического расположения фрагментов относительно друг друга с целью надежного определения последовательности генетического материала большой длины, из которого были получены фрагменты. Были разработаны методики автоматизированного компьютеризированного исследования характеристических фрагментов, которые применяют для картирования генома, идентификации генов и их функций, оценки риска развития некоторых состояний и заболеваний и т.д. Кроме указанных применений биологические матрицы могут быть применены для обнаружения и исследования разнообразных молекул, семейств молекул, уровней экспрессии генов, однонуклеотидных полиморфизмов и для проведения генотипирования.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из примеров способа согласно изобретению формируют структурированную пластину (англ. patterned wafer) с модифицированной поверхностью, и две структурированные пластины с модифицированной поверхностью скрепляют друг с другом, располагая между ними разделительный слой. Для образования структурированных пластин с модифицированной поверхностью, силан или производное силана присоединяют к поверхности структурированной пластины, которая включает углубления, разделенные промежуточными участками, получая силанизированные углубления и силанизированные промежуточные участки. В силанизированных углублениях и на силанизированных промежуточных участках формируют слой покрытия, состоящего из функционализированных молекул. Слой покрытия удаляют шлифовкой с силанизированных промежуточных участков. В некоторых примерах слой покрытия удаляют шлифовкой с силанизированных промежуточных участков с помощью i) щелочной водной суспензии, рН которой составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, которая включает абразивные частицы, имеющие твердость, величина которой меньше твердости структурированной пластины, или с помощью ii) шлифовальной подушки и раствора, не содержащего абразивных частиц. К слою покрытия, находящемуся в силанизированных углублениях, прививают праймер, получая функционализированные углубления.

В другом примере способа согласно изобретению способ включает образование структурированной пластины с модифицированной поверхностью посредством: плазменного травления поверхности структурированной пластины, включающей углубления, разделенные промежуточными участками; образования слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул, в углублениях и на промежуточных участках; сошлифовки слоя покрытия с промежуточных участков (необязательно с помощью i) щелочной водной суспензии, рН которой составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, которая включает абразивные частицы, имеющие твердость, величина которой меньше твердости структурированной пластины, или ii) шлифовальной подушки и раствора, не содержащего абразивных частиц); и прививки праймера к слою покрытия, находящегося в углублениях, что приводит к образованию функционализированных углублений. Этот способ также включает скрепление двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью друг с другом с помощью располагаемого между ними разделительного слоя.

Пример модуля проточной ячейки включает первую и вторую структурированные пластины с модифицированной поверхностью и разделительный слой. Первая структурированная пластина с модифицированной поверхностью включает первые углубления, разделенные первыми промежуточными участками, и первая функционализированная молекула присоединена к первому силану или производному силана в по меньшей мере некоторых первых углублениях, и первый праймер привит к первой функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых первых углублениях. Вторая структурированная пластина с модифицированной поверхностью включает вторые углубления, разделенные вторыми промежуточными участками, и вторая функционализированная молекула присоединена ко второму силану или производному силана в по меньшей мере некоторых вторых углублениях, и второй праймер привит ко второй функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых вторых углублениях. Разделительный слой скрепляет по меньшей мере некоторые первые промежуточные участки с по меньшей мере некоторыми вторыми промежуточными участками, и разделительный слой по меньшей мере частично ограничивает соответствующие камеры для текучей среды (англ. fluidic chamber) модуля проточной ячейки.

Другой пример модуля проточной ячейки включает первую и вторую структурированные пластины с модифицированной поверхностью и разделительный слой, где первая структурированная пластина с модифицированной поверхностью включает первые углубления, разделенные первыми промежуточными участками, первая функционализированная молекула присоединена к первой структурированной пластине с модифицированной поверхностью в по меньшей мере некоторых первых углублениях, и первый праймер привит к первой функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых первых углублениях. Вторая структурированная пластина с модифицированной поверхностью включает вторые углубления, разделенные вторыми промежуточными участками, вторая функционализированная молекула присоединена ко второй структурированной пластине с модифицированной поверхностью в по меньшей мере некоторых вторых углублениях, и второй праймер привит ко второй функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых вторых углублениях. Разделительный слой скрепляет по меньшей мере некоторые первые промежуточные участки с по меньшей мере некоторыми вторыми промежуточными участками, и разделительный слой по меньшей мере частично ограничивает соответствующие камеры для текучей среды модуля проточной ячейки.

В одном из примеров способа применения модуля проточной ячейки модуль проточной ячейки нарезан (англ. diced) на индивидуальные проточные ячейки, содержащие по меньшей мере две соответствующие камеры для текучей среды. В другом примере способа применения модуля проточной ячейки модуль проточной ячейки нарезан на индивидуальные проточные ячейки, содержащие по меньшей мере одну из соответствующих камер для текучей среды.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Признаки и полезные эффекты примеров осуществления настоящего изобретения станут более очевидными при более подробном их рассмотрении с учетом фигур, в которых подобные числовые обозначения относятся к подобным, но не обязательно идентичным, компонентам. Для краткости числовые обозначения или признаки, имеющие функции, описанные ранее, могут быть описаны или могут не быть описаны в комбинации с другими фигурами, на которых они изображены.

На Фиг. 1 представлен вид сверху примера структурированной пластины, включающей углубления, разделенные промежуточными участками;

На Фиг. 2А представлен вид в разрезе вдоль линии 2А-2А структурированной пластины, представленной на Фиг. 1;

На Фиг. 2А-2Е представлены виды в разрезе, которые совместно иллюстрируют пример способа получения структурированной пластины с модифицированной поверхностью;

На Фиг. 3А представлен вид в разрезе примера модуля проточной ячейки, который включает две скрепленные друг с другом структурированные пластины с модифицированной поверхностью, разделительный слой, который ограничивает камеры для текучей среды, и углубления, которые представляют собой лунки, находящиеся в проточном канале соответствующей камеры для текучей среды;

На Фиг. 3В представлен вид сверху модуля проточной ячейки, представленного на Фиг. 3А, в котором верхняя часть структурированной пластины, имеющей модифицированную поверхность, удалена для лучшего обзора разделительного слоя, прикрепленного к нижней части структурированной пластины с модифицированной поверхностью; пунктирными линиями на Фиг. 3В обозначены линии, вдоль которых модуль может быть разделен на индивидуальные проточные ячейки;

На Фиг. 4А представлен вид в разрезе примера модуля проточной ячейки, который включает две скрепленные друг с другом структурированные пластины с модифицированной поверхностью, разделительный слой, который ограничивает камеры для текучей среды, и углубления, которые представляют собой проточные каналы, которые соответственно соединены с одной камерой для текучей среды; и

На Фиг. 4В представлен вид в перспективе модуля проточной ячейки, представленного на Фиг. 4А, в котором верхняя часть структурированной пластины, имеющей модифицированную поверхность, удалена для лучшего обзора проточных каналов.

ВВЕДЕНИЕ

Согласно одному из аспектов, способ включает образование структурированной пластины с модифицированной поверхностью посредством: присоединения силана или производного силана к поверхности структурированной пластины, включающей углубления, разделенные промежуточными участками, что приводит к образованию силанизированных углублений и силанизированных промежуточных участков; образования в силанизированных углублениях и на силанизированных промежуточных участках слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул; сошлифовки слоя покрытия с силанизированных промежуточных участков (необязательно с помощью i) щелочной водной суспензии, рН которой составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, которая включает абразивные частицы, имеющие твердость, величина которой меньше твердости структурированной пластины, или с помощью ii) шлифовальной подушки и раствора, не содержащего абразивных частиц); и прививкой праймера к слою покрытия, находящегося в силанизированных углублениях, что приводит к образованию функционализированных углублений. Способ также включает скрепление двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью друг с другом с помощью располагаемого между ними разделительного слоя.

В одном из примеров этого аспекта присоединение силана или производного силана к поверхности структурированной пластины включает по меньшей мере один из следующих способов: способ осаждения из газовой фазы и способ, разработанный Yield Engineering Systems (YES способ). В другом примере присоединение включает применение химического осаждения из газовой фазы (сокращенно "ХОГФ"). В других примерах присоединение включает применение плазмостимулированного ХОГФ, инициируемого ХОГФ, ХОГФ металлорганических соединений или других способов осаждения.

В одном из примеров этого аспекта образование слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул, включает реакцию функциональной группы функционализированной молекулы с ненасыщенным фрагментом силана или производного силана, где ненасыщенный фрагмент выбран из группы, состоящей из циклоалкенов, циклоалкинов, гетероциклоалкенов, гетероциклоалкинов, их замещенных вариантов и комбинаций перечисленных соединений.

В другом примере этого аспекта образование слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул, включает осаждение раствора, включающего функционализированные молекулы, на силанизированные углубления и силанизированные промежуточные участки, и отверждение функционализированных молекул. В некоторых примерах отверждение служит для образования ковалентных связей между функционализированной молекулой и силаном или производным силана.

В другом примере этого аспекта образование слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул, включает осаждение раствора, включающего функционализированные молекулы, на углубления и промежуточные участки структурированной пластины с модифицированной поверхностью, и отверждение функционализированных молекул. В таких примерах функционализированная молекула может образовывать ковалентные связи с поверхностью пластины. В некоторых примерах перед осаждением функционализированной молекулы на поверхность пластины поверхность пластины подвергают плазменному травлению.

В одном из примеров одного из аспектов способа щелочная водная суспензия, дополнительно включает хелатирующий агент, поверхностно-активное вещество, диспергирующее вещество или их комбинации.

В одном из примеров этого аспекта прививка праймера к слою покрытия включает нанесение покрытия маканием, нанесение покрытия распылением, распределением раствора или их комбинации.

В одном из примеров этого аспекта перед присоединением силана или производного силана способ дополнительно включает плазменное травление структурированной пластины.

В этом аспекте способа толщина слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул, составляет приблизительно 200 нм или менее.

Этот аспект способа может дополнительно включать нарезку скрепленных структурированных пластин, имеющих модифицированную поверхность, на соответствующие проточные ячейки.

В примерах этого аспекта способа разделительный слой включает материал, поглощающий излучение. В этих примерах скрепление включает расположение материала, поглощающего излучение на границе раздела между двумя структурированными пластинами с модифицированной поверхностью таким образом, что материал, поглощающий излучение, контактирует с по меньшей мере некоторыми промежуточными участками каждой из указанных двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью, и приложение давления к границе раздела и облучение материала, поглощающего излучение. В других примерах этого аспекта способа, материал, поглощающий излучение, находится в контакте с разделительным слоем. В этих примерах скрепление включает расположение материала, поглощающего излучение, у соответствующей границы раздела, проходящей между разделительным слоем и каждой из двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью, таким образом, что материал, поглощающий излучение, контактирует с по меньшей мере некоторыми промежуточными участками каждой из указанных двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью, и приложение давления к соответствующим границам раздела и облучение материала, поглощающего излучение. В некоторых примерах указанных методик промежуточные участки, контактирующие с материалом, поглощающим излучение, были подвергнуты силанизации, как указано в настоящей заявке (например, под действием остаточного силана, остающегося на поверхности после шлифовки), и/или были подвергнуты активации плазменным травлением.

В одном из примеров этого аспекта способа абразивные частицы выбраны из группы, состоящей из карбоната кальция, агарозы и графита. В других примерах материалом абразивных частиц является оксид кремния, оксид алюминия или оксид церия. В некоторых примерах материалом абразивных частиц является оксид кремния.

Следует понимать, что любые признаки этого аспекта способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом и/или с образованием любой требуемой конфигурации.

Согласно другому аспекту, способ включает образование структурированной пластины с модифицированной поверхностью посредством: плазменного травления поверхности структурированной пластины, включающей углубления, разделенные промежуточными участками; образования слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул, в углублениях и на промежуточных участках; сошлифовки слоя покрытия с промежуточных участков (необязательно с помощью i) щелочной водной суспензии, рН которой составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, которая включает абразивные частицы, имеющие твердость, величина которой меньше твердости структурированной пластины, или с помощью ii) шлифовальной подушки и раствора, не содержащего абразивных частиц); и прививки праймера к слою покрытия, находящегося в углублениях, что приводит к образованию функционализированных углублений. Способ также включает скрепление двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью друг с другом с помощью располагаемого между ними разделительного слоя.

В одном из примеров этого альтернативного аспекта способа абразивные частицы выбраны из группы, состоящей из карбоната кальция, агарозы и графита. В других примерах материалом абразивных частиц является оксид кремния, оксид алюминия или оксид церия.

Следует понимать, что любые признаки этого аспекта способа могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого аспекта способа и/или первого аспекта способа могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или обоих раскрытых аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей заявке.

В некоторых примерах некоторых способов две структурированные пластины с модифицированной поверхностью расположены таким образом, что по меньшей мере некоторые функционализированные углубления одной из двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью совмещены с соответствующими функционализированными углублениями другой из указанных двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью с образованием камеры для текучей среды, и при этом разделительный слой ограничивает продольные стенки между соседними камерами для текучей среды. В некоторых аспектах две структурированные пластины с модифицированной поверхностью расположены таким образом, что по меньшей мере некоторые функционализированные углубления одной из двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью совмещены с соответствующими функционализированными углублениями другой из указанных двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью с образованием совмещенных пар функционализированных углублений, где две структурированные пластины с модифицированной поверхностью ограничивают верхнюю и нижнюю части совокупности камер для текучей среды, и разделительный слой ограничивает продольные стенки между соседними камерами для текучей среды, причем каждая камера для текучей среды включает совокупность совмещенных пар функционализированных углублений.

В некоторых примерах некоторых способов каждое из функционализированных углублений находится в проточном канале, ограниченном двумя скрепленными структурированными пластинами с модифицированной поверхностью. В некоторых примерах каждое функционализированное углубление представляет собой одно из углублений совокупности лунок, расположенных в проточном канале.

Модуль проточной ячейки согласно одному из аспектов включает первую структурированную пластину с модифицированной поверхностью, которая включает первые углубления, разделенные первыми промежуточными участками, причем первая функционализированная молекула присоединена к первому силану или первому производному силана в по меньшей мере некоторых первых углублениях, и первый праймер привит к первой функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых первых углублениях; вторую структурированную пластину с модифицированной поверхностью, которая включает вторые углубления, разделенные вторыми промежуточными участками, причем вторая функционализированная молекула присоединена ко второму силану или производному второго силана в по меньшей мере некоторых вторых углублениях, и второй праймер привит ко второй функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых вторых углублениях; и разделительный слой, скрепляющий по меньшей мере некоторые из первых промежуточных участков с по меньшей мере некоторыми из вторых промежуточных участков, где разделительный слой по меньшей мере частично ограничивает соответствующие камеры для текучей среды модуля проточной ячейки.

В одном из примеров этого аспекта модуля проточной ячейки по меньшей мере некоторые первые углубления и по меньшей мере некоторые вторые углубления совмещены так, что они образуют одну из соответствующих камер для текучей среды, и разделительный слой образует продольные стенки, расположенные между соседними камерами для текучей среды. В этом примере по меньшей мере одно из первых и вторых углублений расположено: в проточном канале, ограниченном двумя скрепленными структурированными пластинами с модифицированной поверхностью; или представляет собой одну из совокупности лунок, находящихся в проточном канале. В некоторых аспектах две структурированные пластины с модифицированной поверхностью расположены таким образом, что по меньшей мере некоторые функционализированные углубления одной из двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью совмещены с соответствующими функционализированными углублениями другой из указанных двух структурированных пластин с модифицированной поверхностью и образуют совмещенные пары функционализированных углублений, где две структурированные пластины с модифицированной поверхностью ограничивают верхнюю и нижнюю части совокупности камер для текучей среды, и разделительный слой ограничивает продольные стенки между соседними камерами для текучей среды, и где каждая камера для текучей среды включает совокупность совмещенных пар функционализированных углублений.

В одном из примеров этого аспекта модуля проточной ячейки каждая из молекул: первая функциональная молекула и вторая функциональная молекула включает повторяющееся звено, имеющее Формулу (I):

где:

R¹ представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;

R^A выбран из группы, состоящей из азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидроксигруппы, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона и тиола;

R⁵ выбран из группы, состоящей из Н и необязательно замещенного алкила;

каждая из групп -(СН₂)_р- может быть необязательно замещенной;

р представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50;

n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50000; и

m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 100000.

Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что полимер, включающий повторяющиеся звенья имеющие Формулу (I), включает совокупность субъединиц "n" и "m", которые присутствуют в случайном порядке во всей структуре полимера. Специалисту также должно быть понятно, что в полимере могут присутствовать другие мономерные компоненты.

В другом аспекте каждая из молекул: первая функциональная молекула и вторая функциональная молекула включает повторяющееся звено, имеющее Формулу (Ia):

где:

R¹ представляет собой Н или алкил;

R^A выбран из группы, состоящей из аминогруппы, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, оксоаминогруппы, азидогруппы, формила, галогена, гидроксила, гидразинила, гидразонила, триазинила, карбоксигруппы, глицидила, активированного сложного эфира, азиридинила, триазолинила, эпоксигруппы и тиола;

каждая из -(СН₂)_o- групп необязательно замещена; и

о представляет собой целое число, составляющее от 1 до 50.

В некоторых примерах первая и вторая функциональные молекулы ковалентно связаны с первым силаном или производным силана или со вторым силаном или производным силана, соответственно.

В этом примере первая функциональная молекула ковалентно связана с первым силаном или производным первого силана через первый ненасыщенный фрагмент первого силана или производного первого силана; вторая функциональная ковалентно связана со вторым силаном или производным второго силана через второй ненасыщенный фрагмент второго силана или производного второго силана; и ненасыщенные фрагменты независимо выбраны из группы, состоящей из норборнена, гетеронорборненов, производных норборнена, транс-циклооктена, производных транс-циклооктена, циклооктина, бициклоалкинов, их необязательно замещенных вариантов и комбинаций.

В одном из примеров этого аспекта модуля проточной ячейки материал разделительного слоя представляет собой черный полиимид. Дополнительные примеры подходящих материалов разделительного слоя включают пленки из сложного полиэфира, пленки из полиэтилена, циклоолефиновые полимеры (например, Zeonor®), акрилонитрил-бутадиен-стирол (англ. acrylonitrile butadiene styrene, сокращенно ABS), пленки из поликарбоната (англ. polycarbonate, сокращенно PC) и подобные материалы.

В одном из примеров этого аспекта модуля проточной ячейки диаметр каждой из пластин: первой структурированной пластины с модифицированной поверхностью и второй структурированной пластины с модифицированной поверхностью составляет от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм. В одном из примеров структурированные пластины имеют круглую, овальную или прямоугольную форму. В других примерах структурированные пластины имеют круглую форму с диаметром, составляющим от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм.

Следует понимать, что любые признаки этого аспекта модуля проточной ячейки могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого аспекта модуля проточной ячейки и/или способа могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или обоих этих аспектов могут быть скомбинированы с любыми примерами, рассмотренными в настоящей заявке.

Один из аспектов способа применения модуля проточной ячейки включает нарезку модуля проточной ячейки на индивидуальные проточные ячейки, содержащие по меньшей мере две соответствующие камеры для текучей среды. В другом аспекте способ применения модуля проточной ячейки включает нарезку модуля проточной ячейки на индивидуальные проточные ячейки, содержащие по меньшей мере два соответствующих проточных канала или камеры для текучей среды.

Следует понимать, что любые признаки способа применения модуля проточной ячейки могут быть скомбинированы друг с другом любым требуемым образом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков любого или обоих способов и/или модуля проточной ячейки могут быть применены совместно, и/или что любые признаки любого или всех раскрытых аспектов могут быть скомбинированы с любыми признаками примеров, рассмотренных в настоящей заявке.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Примеры способа согласно изобретению включают обработку открытой пластины с целью нанесения располагаемого на поверхности химического вещества (например, силанизацию, нанесение слоя функционализированных молекул, праймеров) на структурированные пластины, что приводит к образованию структурированных пластин с модифицированной поверхностью. Затем структурированные пластины с модифицированной поверхностью могут быть включены в модуль проточной ячейки, который может быть разделен на проточные ячейки, подходящие для применения в биологических методиках, таких как секвенирование.

Способ обработки открытой пластины, рассмотренный в настоящей заявке, может быть адаптирован для выпуска более крупных объемов продукции и позволяет с высокой производительностью, которая включает высокую производительность при получении покрытия и образовании прививки, образовывать структурированную пластину с модифицированной поверхностью до выполнения этапа соединения, приводящего к образованию модуля проточной ячейки. Способ обработки открытой пластины также отличается воспроизводимостью и стабильным характером нанесения располагаемого на поверхности химического вещества, при котором не происходит повреждение нижележащей структурированной пластины.

Способ обработки открытой пластины также позволяет применять различные метрологические/аналитические методики для контроля качества и получения характеристик. До соединения с образованием модуля проточной ячейки, структурированная пластина с модифицированной поверхностью может быть исследована, например, методиками, включающими атомно-силовую микроскопию (АСМ), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ), эллипсометрию, гониометрию, рефлектометрию (scatterometry) и/или флуоресцентные методики.

Следует понимать, что, если не указано иное, то используемые в настоящем описании термины имеют свои обычные значения, известные в соответствующей области техники. Некоторые используемые в настоящем описании термины и их значения приведены ниже.

Формы единственного числа включают множественное число, если из контекста не ясно иное.

Термины "включающий", "содержащий" и различные формы этих терминов синонимичны по отношению друг к другу и имеют одинаково широкое значение.

Термины "верх", "низ", "верхний", "нижний", "на" и т.д. используются в настоящей работе для описания модуля проточной ячейки и/или различных компонентов модуля проточной ячейки. Следует понимать, что такие обозначения направления не относятся к специальной ориентации, а применяются для обозначения ориентации компонентов относительно друг друга. Применение обозначений направления не должно рассматриваться как ограничение примеров, рассмотренных в настоящем описании, какой-либо конкретной ориентацией (ориентациями).

Используемый в настоящем описании термин "алкил" относится к полностью насыщенной (т.е. не содержащей двойных или тройных связей) неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке. Алкильная группа может содержать от 1 до 20 атомов углерода. Примеры алкильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил, гексил и подобные группы. Например, обозначение "С1-4 алкил" указывает на то, что в алкильной цепочке содержится от одного до четырех атомов углерода, т.е. алкильная цепочка выбрана из группы, состоящей из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила.

Используемый в настоящем описании термин, "алкенил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более двойных связей. Алкенильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода. Примеры алкенильных групп включают этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил и подобные группы. Алкенильная группа может быть обозначена, например, "С2-4 алкенил", что означает, что в алкенильной цепочке содержится от двух до четырех атомов углерода.

Используемый в настоящем описании термин, "алкинил" относится к неразветвленной или разветвленной углеводородной цепочке, содержащей одну или более тройных связей. Алкинильная группа может содержать от 2 до 20 атомов углерода. Алкинильная группа может быть обозначена, например, "С2-4 алкинил", что означает, что в алкинильной цепочке содержится от двух до четырех атомов углерода.

Термин функциональная "аминная" группа (аминогруппа) относится к группе -NR_aR_b, в которой каждый из R_a и R_b независимо выбран из водорода, С_1-6-алкила, С_2-6-алкенила, С_2-6-алкинила, С_3-7-карбоциклила, С₆-₁₀-арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетероциклила, определения которых представлены в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин "арил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. двух или более сконденсированных циклов, которые имеют два общих соседних атомов углерода), которые содержат в основной цепи цикла только атомы углерода. Если арил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе представляет собой ароматический цикл. Арильная группа может содержать от 6 до 18 атомов углерода, и такая группа может быть обозначена С6-18. Примеры арильных групп включают фенил, нафтил, азуленил и антраценил.

Используемый в настоящем описании термин "присоединенный" означает состояние двух предметов, которые объединены, скреплены, склеены, соединены или прикреплены друг к другу. Например, нуклеиновая кислота может быть присоединена к слою покрытия, состоящего из функционализированных молекул, ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется обобществлением пары электронов атомами. Нековалентная связь представляет собой химическую связь, которая не включает обобществление пар электронов и может включать, например, водородные связи, ионные связи, ван дер Ваальсовы силы, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия.

Термин "азид" или функциональная "азидогруппа" означает -N₃.

Используемый в настоящем описании термин "карбоциклил" означает неароматическое циклическое кольцо (цикл) или циклическую систему, содержащую в основной цепи циклической системы только атомы углерода. Если карбоциклил представляет собой систему циклов, то два или более цикла могут быть соединены друг с другом в сконденсированную систему, соединены мостиком или в виде спироциклической системы. Карбоциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. Таким образом, карбоциклилы включают циклоалкилы, циклоалкенилы и циклоалкинилы. Карбоциклильная группа может содержать от 3 до 20 атомов углерода (т.е. С3-20). Примеры карбоциклильных колец включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, 2,3-дигидроинден, бицикло[2,2,2]октанил, адамантил и спиро[4,4]нонанил.

Используемый в настоящем описании термин "карбоновая кислота" или "карбоксил" означает -С(O)ОН.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкил" означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов. Примеры включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкилен" означает полностью насыщенное карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, которая присоединена к остатку молекулы в двух точках присоединения.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкенил" или "циклоалкен" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере одну двойную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов. Примеры включают циклогексенил или циклогексен и норборнен или норборненил. Также используемый в настоящем описании термин "гетероциклоалкенил" или "гетероциклоалкен" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом и содержащую по меньшей мере одну двойную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов.

Используемый в настоящем описании термин "циклоалкинил" или "циклоалкин" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере одну тройную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов. Примером является циклооктин. Другим примером является бициклононин. Также используемый в настоящем описании термин "гетероциклоалкинил" или "гетероциклоалкин" означает карбоциклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую в основной цепи цикла по меньшей мере один гетероатом и содержащую по меньшей мере одну тройную связь, причем система циклов не содержит ароматических циклов.

Используемый в настоящем описании термин "слой покрытия из функционализированных молекул" означает полужесткий или нежесткий (например, желатинообразный) материал, проницаемый для жидкостей и газов. Обычно слой покрытия, состоящего из функционализированных молекул представляет собой гидрогель, который может набухать при впитывании жидкости и может сжиматься при удалении жидкости сушкой.

Используемый в настоящем описании термин "осаждение" относится к любой подходящей методике нанесения, которая может быть выполнена вручную или может быть автоматизированной. Обычно осаждение может быть выполнено с применением методик осаждения из газовой фазы, методик нанесения покрытия, методик прививки или подобных методик. Некоторые конкретные примеры включают химическое осаждение из газовой фазы (ХОГФ), нанесение покрытия распылением, нанесение покрытия центрифугированием, нанесение покрытия маканием или погружением, трафаретную печать, нанесение покрытия с помощью щелевой экструзионной головки, нанесение полосового покрытия, нанесение покрытия распределением раствора или подобную методику.

Используемый в настоящем описании термин "углубление" относится к дискретному (отдельному) вогнутому элементу структурированной пластины, который имеет на поверхности отверстие, полностью окруженное промежуточным участком (участками) поверхности структурированной пластины. Углубления могут иметь множество различных форм находящегося на поверхности отверстия, примеры которых включают круглую, эллиптическую, квадратную, многоугольную, звездчатую форму (с любым количеством лучей) и т.д. Поперечное сечение углубления в плоскости, перпендикулярной плоскости поверхности, может быть искривленным, квадратным, многоугольным, гиперболическим, коническим, имеющим углы и т.д. Одним из примеров углубления может быть лунка или проточный канал. Также используемый в настоящем описании термин "функционализированное углубление" относится к дискретному вогнутому элементу, к которому присоединены слой покрытия из функционализированного полимера и праймер (праймеры).

Термин "каждый", используемый в сочетании с набором предметов, предназначен для идентификации индивидуального предмета набора, но не обязательно относится к каждому предмету в наборе. Исключениями могут быть прямые контекстные указания или, если из контекста ясно вытекает иное.

Согласно изобретению, "проточный канал" может представлять собой углубление, ограниченное в поверхности пластины, которое расположено на значительной части пластины, или может представлять собой площадь, ограниченную двумя скрепленными структурированными пластинами с модифицированной поверхностью, на которой имеется совокупность углублений. Проточная ячейка может включать совокупность проточных каналов. В некоторых аспектах каждая проточная ячейка включает по меньшей мере два, три, четыре проточных канала.

"Камера для текучей среды" представляет собой площадь модуля проточной ячейки, в которую может быть помещен жидкостной образец. Камера для текучей среды ограничена двумя скрепленными структурированными пластинами с модифицированной поверхностью, и продольные стенки камеры для текучей среды ограничивает разделительный слой.

Используемый в настоящем описании термин "функционализированная молекула" включает функциональные группы, выбранные из необязательно замещенного алкенила, азида/азидогруппы, необязательно замещенной аминогруппы, карбоксила, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, гидроксила, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона или тиола. В других аспектах функционализированная молекула включает функциональные группы, выбранные из групп, перечисленных выше, а также эпоксигруппу, формил, глицидил, триазинил, азиридинил, оксоаминогруппу и галогеногруппы. В некоторых примерах функционализированная молекула не представляет собой норборнен или полимеризованный норборнен. В одном из примеров функционализированная молекула включает повторяющиеся звенья, имеющие Формулу (I) или (Ia). В одном из примеров функционализированная молекула представляет собой сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (англ. poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide, сокращенно PAZAM).

Используемый в настоящем описании термин "гетероарил" относится к ароматическому циклу или системе циклов (т.е. двум или более сконденсированным циклам, имеющим два общих соседних атома), которые содержат один или более гетероатомов, то есть элемент, отличный от углерода, и неограничивающие примеры гетероарилов включают в основной цепи цикла азот, кислород и серу. Если гетероарил представляет собой систему циклов, то каждый цикл в системе является ароматическим. Гетероарильная группа может содержать от 5 до 18 членов цикла.

Используемый в настоящем описании термин "гетероциклил" означает неароматическое циклическое кольцо (цикл) или систему циклов, содержащую по меньшей мере один гетероатом в основной цепи цикла. Гетероциклилы могут быть соединены друг с другом в сконденсированную систему, соединены мостиком или в виде спироциклической системы. Гетероциклилы могут иметь любую степень насыщения при условии, что по меньшей мере один цикл в системе циклов не является ароматическим. В системе циклов гетероатом (гетероатомы) может присутствовать в неароматическом или ароматическом цикле. Гетероциклильная группа может содержать от 3 до 20 членов цикла (т.е. количество атомов, составляющих основную цепь цикла, включая атомы углерода и гетероатомы). Гетероциклильная группа может быть обозначена как "3-6-членный гетероциклил" или аналогичными обозначениями. В некоторых примерах гетероатом (гетероатомы) представляет собой О, N или S.

Используемый в настоящем описании термин "гидразин" или "гидразинил" относится к группе -NHNH₂.

Используемый в настоящем описании термин "гидразон" или "гидразонил" относится к группе

Используемый в настоящем описании термин "гидроксил" означает -ОН группу.

Используемый в настоящем описании термин "промежуточный участок" относится к области, находящейся в подложке/в пластине или на поверхности, которая отделяет другие области подложки/ пластины или поверхности. Например, промежуточный участок может отделять один элемент биочипа от другого элемента биочипа. Два отделенных друг от друга элемента могут быть дискретными, т.е. не имеющими контакта друг с другом. В другом примере промежуточный участок может отделять первую часть элемента от второй части элемента. Во многих примерах промежуточный участок непрерывен, в то время как элементы дискретны, например, как в случае совокупности лунок, ограниченных в остальном непрерывной или плоской поверхностью. Разделение, обеспечиваемое промежуточным участком, может быть частичным или полным разделением. Поверхностный материал промежуточных участков может отличаться от поверхностного материала элементов, сформированных в поверхности. Например, элементы биочипа могут включать количество или концентрацию слоя покрытия и праймера (праймеров), которая превышает их количество или концентрацию в промежуточных участках. В некоторых примерах в промежуточных участках слой покрытия и праймер (праймеры) могут отсутствовать.

Используемый в настоящем описании термин "нитрилоксид" означает группу "R_aC≡N⁺O^-", в которой R_a имеет определение, рассмотренное в настоящем описании выше. Примеры получения нитрилоксида включают генерацию in situ из альдоксимов под действием хлорамида-Т или при действии основания на имидоилхлориды [RC(Cl)=NOH].

Используемый в настоящем описании термин "нитрон" означает группу "R_aR_bC≡NR_c⁺O^-", в которой R_a и R_b имеют значения, рассмотренные в настоящем описании выше, и R_c выбран из С_1-6-алкила, С_2-6-алкенила, С_2-6-алкинила, С_3-7-карбоциклила, С_6-10-арила, 5-10-членного гетероарила и 5-10-членного гетеро цикл ила, которые имеют значения, рассмотренные в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин "нуклеотид" включает азотсодержащее гетероциклическое основание, сахар и одну или более фосфатных групп. Нуклеотиды представляют собой мономерные единицы последовательности нуклеиновой кислоты. В РНК сахар представляет собой рибозу, и в ДНК сахар представляет собой дезоксирибозу, т.е. сахар, не имеющий гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' рибозы. Азотсодержащее гетероциклическое основание (т.е. нуклеиновое основание) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G) и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидна или N-9 пурина.

Используемый в настоящем описании термин "обработка открытой пластины" относится к серии последовательно выполняемых способов, применяемых для модификации поверхности структурированной пластины располагаемым на поверхности химическим веществом перед выполнением скрепления.

Термин "структурированная пластина" относится к подложке (например, к пластине), в или на поверхности которой имеются углубления. Обычно подложка является жестким материалом, нерастворимым в водной жидкости. Подложка может быть инертной по отношению к химическому веществу, применяемому для модификации или нанесения слоя покрытия, состоящего из функционализированных молекул. Например, подложка может быть инертной по отношению к химическому веществу, применяемому для присоединения слоя покрытия к слою силана или производного силана, или по отношению к активированному поверхностному слою и/или по отношению к химическому веществу, применяемому для присоединения праймера (праймеров) к слою покрытия в способе согласно изобретению. Примеры подходящих материалов подложек включают эпоксисилоксан, стекло и модифицированное или функционализированное стекло, полимеры (включающие акриловые полимеры, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (такой как TEFLON®, поставляемый Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (англ. cycloolefin polymer, сокращенно СОР) (такие как ZEONOR®, поставляемый Zeon), полиимиды и т.д.), нейлон, керамические материалы, оксид кремния, плавленый оксид кремния или материалы на основе оксида кремния, такие как силсесквиоксан и/или полиэдральный олигомерный силсесквиоксан (англ. polyhedral oligomeric silsesquioxane, сокращенно POSS), силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний, нитрид кремния, оксид тантала, углерод, металлы, неорганические стекла и пучки оптических волокон. Твердость подложки (или структурированной пластины) может составлять от приблизительно 5 ГПа до приблизительно 6 Гпа.

Используемый в настоящем описании термин "плазменное травление" относится к способу удаления органического вещества со структурированной пластины кислородной плазмой. Продукты, получаемые при плазменном травлении, могут быть удалены с помощью вакуумного насоса/вакуумной системы. Плазменное травление может активировать структурированную пластину посредством введения реакционноспособных гидроксильных групп (-ОН групп, присоединенных к атому углерода или кремния) или карбоксильных групп. Плазменное травление также может быть применено для активации пластины за счет удаления с ее поверхности органических веществ.

Используемый в настоящем описании термин "праймер" означает одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты (например, одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК), которая служит начальной точкой для синтеза ДНК или РНК. Конец 5' праймера может быть модифицирован для проведения реакции присоединения к слою покрытия, состоящего из функционализированных молекул. Длина праймера может составлять любое количество оснований, и праймер может включать различные не встречающиеся в природе нуклеотиды. В одном из примеров праймер секвенирования представляет собой короткую цепочку, включающую от 20 до 40 оснований.

Используемые в настоящем описании термины "силан" и "производное силана" относятся к органическому или неорганическому соединению, содержащему один или более атомов кремния. Примером неорганического силана является SiH₄ или галогенированный SiH₄, в котором водород замещен одним или более атомами галогена. Примером органического силана является X-R^B-Si(OR^C)₃, в котором X представляет собой негидролизуемую органическую группу, такую как аминогруппа, винил, эпоксигруппа, метакрилат, сера, алкил, алкенил, алкинил; R^B представляет собой спейсер, например -(СН₂)_n-, где n составляет от 0 до 1000; R^C выбран из водорода, необязательно замещенного ал кила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, необязательно замещенного карбоциклила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного 5-10-членного гетероарила и необязательно замещенного 5-10-членного гетеро цикл ила, определения которых представлены в настоящем описании. В некоторых примерах все группы R^C одинаковы, и в других примерах они могут быть различными. В некоторых примерах X представляет собой алкенил или циклоалкенил, R^B представляет собой -(СН₂)_n-, где n составляет от 2 до 6, и/или R^C представляет собой алкил. В другом примере силан имеет формулу X-R^B-Si(R^D)₃, где определения X и R^B представлены выше, и каждая группа R^D независимо представляет собой R^C или OR^C. В некоторых примерах X включает подложку или носитель. Используемые в настоящем описании термины "силан" и "производное силана" могут включать смеси различных силанов и/или производных силана.

В некоторых примерах силан или производное силана включает ненасыщенный фрагмент, который может реагировать с функциональной группой функционализированной молекулы. Используемый в настоящем описании термин "ненасыщенный фрагмент" относится к химической группе, которая включает циклоалкены, циклоалкины, гетероциклоалкены, гетероциклоалкины или их необязательно замещенные варианты, включающие по меньшей мере одну двойную связь или одну тройную связь. Ненасыщенные фрагменты могут быть одновалентными или двухвалентными. Если ненасыщенный фрагмент одновалентен, то циклоалкены, циклоалкины, гетероциклоалкены и гетероциклоалкины применяют взаимозаменяемо с циклоалкенилами, циклоалкинилами, гетероциклоалкенилами и гетероциклоалкинилами, соответственно. Если ненасыщенный фрагмент двухвалентен, то циклоалкен, циклоалкин, гетероциклоалкен и гетероциклоалкин применяют взаимозаменяемо с циклоалкениленом, циклоалкиниленом, гетероциклоалкениленом и гетероциклоалкиниленом, соответственно. В некоторых примерах ненасыщенный фрагмент представляет собой норборнил или производное норборнила. В других примерах ненасыщенный фрагмент представляет собой норборнил.

Ненасыщенный фрагмент может быть ковалентно присоединен либо непосредственно к атомам кремния силана или производного силана, либо присоединен опосредованно через линкеры. Примеры подходящих линкеров включают необязательно замещенные алкилены (т.е. двухвалентные насыщенные алифатические радикалы (такие как этилен), которые можно рассматривать как радикалы, полученные из алкена при раскрытии двойной связи или из алкана удалением двух атомов водорода у разных атомов углерода), замещенные полиэтиленгликоли или подобные соединения. В некоторых примерах линкер представляет собой этилен.

Используемый в настоящем описании термин "разделительный слой" относится к материалу, который связывает друг с другом две структурированных пластины с модифицированной поверхностью. В некоторых примерах разделительный слой может состоять из материала, способного поглощать излучение, который способствует образованию связи или может контактировать с материалом, способным поглощать излучение, который способствует образованию связи.

в некоторых аспектах используемый в настоящем описании термин "располагаемое на поверхности химическое вещество" означает силан или производное силана, слой покрытия, состоящего из функционализированных молекул, и праймер (праймеры), присоединенный к по меньшей мере части слоя покрытия, находящегося на поверхности структурированной пластины. В других аспектах "располагаемое на поверхности химическое вещество" означает слой покрытия, состоящего из функционализированных молекул, находящийся на активированной поверхности структурированной пластины, и праймер (праймеры), присоединенный к по меньшей мере части слоя покрытия.

Функциональная "тиольная" группа означает -SH.

Используемые в настоящем описании термины "тетразин" и "тетразинил" означают шестичленную гетероарильную группу, включающую четыре атома азота. Тетразин может быть необязательно замещен.

Используемый в настоящем описании термин "тетразол" означает пятичленную гетероциклическую группу, включающую четыре атома азота. Тетразол может быть необязательно замещен.

Используемый в настоящем описании термин "способ YES" относится к способу химического осаждения из газовой фазы, разработанному Illumina, Inc., в котором применяют устройство для химического осаждения из газовой фазы, предоставляемое Yield Engineering Systems (сокращенно "YES"). Устройство включает три различные системы осаждения из газовой фазы. Автоматизированная система YES-VertaCoat для нанесения покрытия из паров силана предназначена для серийного выпуска и снабжена гибким модулем для манипулирования конструкциями, подходящим для работы с конструкциями размером 200 мм или 300 мм. Система YES-1224P для нанесения покрытия из паров силана с ручной загрузкой предназначена для универсального серийного выпуска и снабжена камерами большой емкости с изменяемой конфигурацией. Система Yes-LabKote представляет собой экономичную настольную версию, идеально подходящую для анализа применимости и для проведения исследований.

Аспекты и примеры, представленные в настоящем описании и раскрытые в пунктах формулы изобретения, следует рассматривать в свете приведенных выше определений.

Примеры структурированных пластин с модифицированной поверхностью, модуля проточной ячейки и способов их изготовления и применения раскрыты ниже со ссылками на прилагаемые графические материалы.

На Фиг. 1 представлен вид сверху структурированной пластины 10, и на Фиг. 2А представлен вид в разрезе структурированной пластины 10. Структурированная пластина 10 включает пластину/подложку 12, углубления 14, изготовленные на или в наружном слое или поверхности подложки 12, и промежуточные участки 16, разделяющие соседние углубления 14. В примерах, рассмотренных в настоящей заявке, углубления 14 функционализируют располагаемым на поверхности химическим веществом, в то время как промежуточные участки 16 могут быть применены для связывания, но не содержат праймера (праймеров) (как показано на Фиг. 2Е).

Может быть применен любой пример подложки 12, рассмотренный выше. В одном из примеров диаметр подложки 12 составляет от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм.

Углубления 14 могут быть изготовлены в или на подложке 12 с помощью различных методик, включающих, например, фотолитографию, наноимпринтную литографию, методики штамповки, методики тиснения, методики формования, методики микротравления, методики печати, методики взрывной литографии и т.д. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что выбор применяемой методики зависит от состава и формы пластины/подложки 12, а также от природы материала подложки.

Изобретение включает применение различных схем расположения углублений 14, которые включают упорядоченные, повторяющиеся и неупорядоченные схемы. В одном из примеров углубления 14 расположены в виде гексагональной сетки с целью плотной упаковки и достижения повышенной плотности. Другие схемы расположения могут включать, например, прямолинейные (т.е. прямоугольные) схемы расположения (см. Фиг. 4В), треугольные схемы расположения и т.д. Как показано на Фиг. 1, схема или шаблон расположения углублений 14 может находиться в х-у формате, то есть включать ряды и колонки. В некоторых других примерах схема или шаблон расположения углублений 14 и/или промежуточных участков 16 может представлять собой повторяющееся размещение. В других примерах схема или шаблон расположения углублений 14 и/или промежуточных участков 16 может представлять собой размещение в случайном порядке. Шаблон может включать участки, плоскости, лунки, столбики, полосы, изгибы, линии, треугольники, прямоугольники (например, ограничивающие проточные каналы 14", показанные на Фиг. 4А), круги, арки, шахматные схемы, перекрещивающиеся полосы, диагонали, стрелки, квадраты и/или перекрещивающиеся штрихи. Другие примеры структурированных поверхностей, которые могут быть применены в примерах согласно изобретению, рассмотрены в патентах US 8778849, US 9079148, US 8778848 и в патентной заявке US 2014/0243224, и содержание каждого из документов полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Схема или шаблон расположения углублений может быть охарактеризована плотностью углублений 14 (т.е. количеством углублений 14) в ограниченной области. Например, углубления 14 могут присутствовать с плотностью, составляющей приблизительно 2 миллиона на мм². Могут быть достигнуты различные значения плотности, включающие, например, плотность, составляющую по меньшей мере приблизительно 100 на мм², приблизительно 1000 на мм², приблизительно 0,1 миллиона на мм², приблизительно 1 миллион на мм², приблизительно 2 миллиона на мм², приблизительно 5 миллионов на мм², приблизительно 10 миллионов на мм², приблизительно 50 миллионов на мм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно может выбрана величина плотности, не превышающая приблизительно 50 миллионов на мм², приблизительно 10 миллионов на мм², приблизительно 5 миллионов на мм², приблизительно 2 миллиона на мм², приблизительно 1 миллион на мм², приблизительно 0,1 миллиона на мм², приблизительно 1000 на мм², приблизительно 100 на мм² или менее. Также следует понимать, что плотность размещения углублений 14 на подложке 12 может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. В некоторых примерах биочип с высокой плотностью может быть охарактеризован как биочип, содержащий углубления 14, разделенные областью, составляющей менее приблизительно 100 нм, биочип со средней плотностью может быть охарактеризован как биочип, содержащий углубления 14, разделенные областью, составляющей от приблизительно 400 нм до приблизительно 1 мкм, и биочип с низкой плотностью может быть охарактеризована как биочип, содержащий углубления 14, разделенные областью, составляющей более чем приблизительно 1 мкм.

Также или в альтернативном варианте характеристикой схемы или шаблона расположения может быть средний шаг, т.е. расстояние от центра одного углубления 14 до центра соседнего углубления (расстояние от центра до центра). Шаблон может быть упорядоченным, то есть иметь малый коэффициент отклонения среднего шага, или шаблон может быть неупорядоченным, и в этом случае коэффициент отклонения может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 10 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно наибольшее значение среднего шага может составлять, например, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее. Величина среднего шага конкретного шаблона расположения сайтов 16 может составлять от одной из нижних величин до одной из верхних величин, выбранных из указанных выше диапазонов. В одном из примеров шаг между углублениями 14 (расстояние от центра до центра) составляет приблизительно 1,5 мкм.

В примере, показанном на Фиг. 1 и 2А, углубления 14 представляют собой лунки 14', и, таким образом, поверхность подложки 12 включает массив лунок 14'. Лунки 14' могут представлять собой микролунки или нанолунки. Характеристики каждой лунки 14' могут включать объем, площадь отверстия лунки, ее глубину и/или диаметр.

Каждая лунка 14' может иметь любой объем, достаточный для удержания жидкости. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, для достижения требуемой производительности (например, мультиплексности) и разрешения, для соответствия составу анализируемого вещества или реакционной способности анализируемого вещества, ожидаемой при применении биочипа 10 в качестве единицы последующей обработки. Например, объем может составлять по меньшей мере приблизительно 1×10^-3 мкм³, приблизительно 1×10^-2 мкм³, приблизительно 0,1 мкм³, приблизительно 1 мкм³, приблизительно 10 мкм³, максимальный объем может составлять приблизительно 1×10⁴ мкм³, приблизительно 1×10³ мкм³, приблизительно 100 мкм³, приблизительно 10 мкм³, приблизительно 1 мкм³, приблизительно 0,1 мкм³ или менее. Следует понимать, что слой покрытия из функционализированных молекул может заполнять весь объем или часть объема лунки 14'. Объем слоя покрытия в индивидуальной лунке 14' может превышать указанные выше величины, быть меньше указанных выше величин или иметь промежуточное значение.

Площадь, занимаемая отверстием каждой лунки на поверхности, может быть выбрана с учетом критериев, аналогичных указанным выше для объема лунки. Например, площадь, занимаемая отверстием каждой лунки на поверхности, может составлять по меньшей мере приблизительно 1×10^-3 мкм², приблизительно 1×10^-2 мкм², приблизительно 0,1 мкм², приблизительно 1 мкм², приблизительно 10 мкм², приблизительно 100 мкм² или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальная площадь может составлять приблизительно 1×10³мкм², приблизительно 100 мкм², приблизительно 10 мкм², приблизительно 1 мкм², приблизительно 0,1 мкм², приблизительно 1×10^-2 мкм² или менее.

Глубина каждой лунки 14' может составлять по меньшей мере приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальная глубина может составлять приблизительно 1×10³ мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее.

В некоторых случаях диаметр каждой лунки 16' может составлять по меньшей мере приблизительно 50 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм или более. В альтернативном варианте или дополнительно максимальный диаметр может составлять приблизительно 1×10³ мкм, приблизительно 100 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 0,1 мкм или менее (например, приблизительно 50 нм).

Структурированная пластина 10 может быть подвергнута серии этапов обработки с целью модификации поверхности в по меньшей мере углублении (углублениях) 14. На Фиг. 2В-2Е представлены способы образования структурированной пластины с модифицированной поверхностью 10' (показанной на Фиг. 2Е).

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что для очистки и активации поверхности структурированная пластина 10 может быть подвергнута плазменному травлению. Например, с помощью плазменного травления может быть удален органический материал и введены поверхностные гидроксильные или карбоксильные группы.

Затем структурированная пластина 10 может быть подвергнута силанизации, которая состоит в присоединении силана или производного 18 силана (Фиг. 2В) к структурированной поверхности пластины. Силанизация позволяет вводить силан или производное 18 силана по всей площади поверхности, включая углубления 14, 14' (например, на нижнюю поверхность и вдоль боковых стенок) и промежуточные участки 16.

Для силанизации может быть применен любой силан или производное 18 силана. Выбор силана или производного 18 силана может частично зависеть от типа функционализированной молекулы, которую используют для образования слоя 20 покрытия (показанного на Фиг. 2С), поскольку может быть желательным образование ковалентной связи между силаном или производным 18 силана и впоследствии осаждаемыми функционализированными молекулами. Способ, применяемый для присоединения силана или производного 18 силана к подложке 12, может зависеть от типа применяемого силана или производного 18 силана. Ниже представлены некоторые примеры.

В одном из примеров силаном или производным 18 силана является (3-аминопропил)триэтоксисилан (англ. (3-aminopropyl)triethoxysilane, сокращенно APTES) или (3-аминопропил)триметоксисилан (англ. (3-aminopropyl)trimethoxysilane, сокращенно APTMS) (т.е. X-R^B-Si(OR^C)₃, где X представляет собой аминогруппу, R^B представляет собой -(СН₂)₃-, и R^C представляет собой этил или метил). В этом примере поверхность подложки 12 может быть предварительно обработана (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES) или (3-аминопропил)триметоксисиланом (APTMS) с образованием ковалентной связи между кремнием и одним или более атомами кислорода, находящимися на поверхности (не придерживаясь какого-либо механизма, можно предположить, что каждый атом кремния может связываться с одним, двумя или тремя атомами кислорода). Такую обработанную химическим способом поверхность подвергают воздействию повышенных температур для образования монослоя из аминогрупп. Затем аминогруппы вводят в реакцию с Сульфо-HSAB (англ. N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate, т.е. N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат) с образованием азидопроизводного. При активации УФ излучением энергией в диапазоне от 1 Дж/см² до 30 Дж/см² при 21°С приводит к генерации активных нитреновых частиц, которые могут с легкостью вступать в различные реакции включения с PAZAM (например, с функционализированной молекулой).

Также могут быть применены другие способы силанизации. Примеры подходящих способов силанизации включают осаждение из газовой фазы, способ YES, нанесение покрытия центрифугированием или другие способы осаждения. Некоторые примеры способов и материалов, которые могут быть применены для силанизации подложки 12 в примерах согласно настоящему изобретению, рассмотрены в патентной заявке US 2015/0005447, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

В одном из примеров, в котором для проведения способа YES применяют печь ХОГФ, структурированную пластину 10 помещают в печь ХОГФ. Камера может иметь быть продута, после чего начинают цикл силанизации. При проведении циклов емкость с силаном или производным силана может выдерживаться при подходящей температуре (например, приблизительно 120°С для норборненсилана), подходящая температура может поддерживаться в трубопроводах для подачи паров силана или производного силана (например, приблизительно 125°С для норборненсилана), и подходящая температура (например, приблизительно 145°С) может поддерживаться в вакуумных трубопроводах.

В другом примере силан или производное 18 силана (например, жидкий норборненсилан) может быть осаждено внутри стеклянного флакона, и флакон может быть помещен в стеклянный вакуумный эксикатор, содержащий структурированную пластину 10. Затем из эксикатора может быть откачан воздух до достижения давления, составляющего от приблизительно 15 миллитор до приблизительно 30 миллитор (приблизительно от 2 до 4 Па), и эксикатор может быть помещен в печь, находящуюся при температуре, составляющей от приблизительно 60°С до приблизительно 125°С. По завершении силанизации эксикатор извлекают из печи, охлаждают и уравновешивают с атмосферой.

Осаждение из газовой фазы, способ YES и/или силанизация в вакуумном эксикаторе могут быть применены для обработки различными силанами или производными 18 силана, такими как силан или производные 18 силана, включающие примеры ненасыщенных фрагментов, рассмотренные в настоящем описании. Например, эти способы могут быть применены, если силан или производное 18 силана включает ненасыщенный циклоалкеновый фрагмент, такой как норборнен, производное норборнена (например, (гетеро)норборнен, включающий атом кислорода или азота вместо одного из атомов углерода), трансциклооктен, производные трансциклооктена, трансциклопентен, транс-циклогептен, транс-циклононен, бицикло[3,3,1]нон-1-ен, бицикло[4,3,1]дец-1(9)-ен, бицикло[4,2,1]нон-1(8)-ен и бицикло[4,2,1]нон-1-ен. Любой из этих циклоалкенов мог быть замещен, как это рассмотрено в патентной заявке US 2015/0005447. Пример производного норборнена включает [(5-бицикло[2,2,1]гепт-2-енил)этил]триметоксисилан. В других примерах эти способы могут быть применены, если силан или производное 18 силана включает ненасыщенный циклоалкинный фрагмент, такой как циклооктин, производное циклооктина или бициклононины (например, бицикло[6,1,0]нон-4-ин или его производные, бицикло[6,1,0]нон-2-ин или бицикло[6,1,0]нон-3-ин). Эти циклоалкины могут быть замещены, как это рассмотрено в патентной заявке US 2015/0005447.

Затем силанизированная структурированная пластина 10S может быть подвергнута обработке, которая приводит к образованию слоя 20 покрытия из функционализированных молекул на силанизированных углублениях и силанизированных промежуточных участках. Эта обработка представлена обозначением "образование СФМ (слоя функциональных молекул)", которое имеется между Фиг. 2В и Фиг. 2С.

Примеры функционализированной молекулы включают соединения, включающие повторяющиеся звенья, имеющие Формулу (I) или Формулу (Ia), рассмотренную выше.

Конкретным примером функционализированной молекулы является сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (англ. poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide), сокращенно PAZAM (см., например, патентные заявки US 2014/0079923 А1 или US 2015/0005447 А1, содержание каждой из документов полностью включено в настоящее описание посредством ссылки), который включает структуру, показанную ниже:

где n представляет собой целое число, составляющее от 1 до 20000, и m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 100000. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что, как и в Формуле (I), субъединицы "n" и "m" являются отдельными повторяющимися звеньями, которые присутствуют в случайном порядке во всей структуре полимера.

Молекулярная масса функционализированной молекулы или PAZAM может составлять от приблизительно 10 кДа до приблизительно 1500 кДа, или в одном из конкретных примеров она может составлять приблизительно 312 кДа.

В некоторых примерах функционализированная молекула или PAZAM представляет собой линейный (неразветвленный) полимер. В некоторых других примерах функционализированная молекула или PAZAM представляет собой полимер, включающий небольшое количество поперечных сшивок. В других примерах функционализированная молекула имеет разветвления.

Для образования слоя 20 покрытия могут быть применены другие функционализированные молекулы, при условии, что их функционализация позволяет им взаимодействовать со структурированной пластиной 12 и наносимым впоследствии праймером (праймераии) 22. Другие примеры подходящих функционализированных молекул включают молекулы, имеющие коллоидную структуру, такие как агароза; или полимерную сетчатую структуру, такие как желатин; или поперечно-сшитую полимерную структуру, такие как полиакриламидные полимеры и сополимеры, не содержащий силана акриламид (англ. silane free acrylamide, сокращенно SFA, см., например, опубликованную патентную заявку US 2011/0059865, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки) или азидолизированый вариант SFA. Примеры подходящих полиакриламидных полимеров могут быть получены из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, как рассмотрено, например, в документе WO 2000/031148 (содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки), или из мономеров, которые вступают в реакции [2+2] фотоциклоприсоединения, которые рассмотрены, например, в документах WO 2001/001143 или WO 2003/0014392 (содержание каждого из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки). Другими подходящими полимерами являются сополимеры SFA и SFA, функционализированного бромацетамидной группой (например, BRAPA), или сополимеры SFA и SFA, функционализированного азидоацетамидной группой.

Функционализированная молекула (например, PAZAM) может быть осаждена на поверхности силанизированной структурированной пластины 10S (т.е. на силанизированные углубления и силанизированные промежуточные участки) посредством нанесения покрытия центрифугированием или нанесения покрытия погружением или маканием, или посредством пропускания потока функционализированных молекул при положительном или отрицательном давлении или с помощью методик, рассмотренных в патенте US 9012022, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. Функционализированная молекула может присутствовать в растворе. В одном из примеров раствор включает PAZAM в смеси этанола и воды.

После нанесения, функционализированные молекулы также могут быть подвергнуты отверждению с образованием слоя 20 покрытия, показанного на Фиг. 2С. В одном из примеров отверждение функционализированных молекул может быть проведено при температуре, составляющей от комнатной температуры (например, приблизительно 25°С) до приблизительно 60°С, в течение времени, составляющего от приблизительно 5 минут до приблизительно 2 часов.

Функционализированная молекула может быть присоединена к силанизированным углублениям и силанизированным промежуточным участкам посредством ковалентной связи. Ковалентное присоединение функционализированной молекулы к силанизированным углублениям позволяет удерживать слой 20 покрытия в углублениях 14, 14' в течение срока службы готовой проточной ячейки в различных вариантах ее эксплуатации. Ниже приведены некоторые примеры реакций, которые могут протекать между силаном или производным 18 силана и функционализированной молекулой.

Если силан или производное 18 силана включает в качестве ненасыщенного фрагмента норборнен или производное норборнена, то норборнен или производное норборнена может: i) вступать в реакцию 1,3-биполярного циклоприсоединения с азидом/азидогруппой PAZAM; ii) вступать в реакцию сочетания с группой тетразина, присоединенной к PAZAM; вступать в реакцию циклоприсоединения с группой гидразона, присоединенной к PAZAM; вступать в фото-клик реакцию с группой тетразола, присоединенной к PAZAM; или вступать в реакцию циклоприсоединения с группой нитрилоксида, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное 18 силана в качестве ненасыщенного фрагмента включает циклооктин или производное циклооктина, то циклооктин или производное циклооктина могут: i) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию азид-алкинного 1,3-циклоприсоединения (англ. strain-promoted azide-alkyne 1,3-cycloaddition, сокращенно SPAAC) с азидом/азидогруппой PAZAM или ii) вступать в протекающую под действием напряжения реакцию алкин-нитрилоксидного циклоприсоединения с нитрилоксидной группой, присоединенной к PAZAM.

Если силан или производное 18 силана в качестве ненасыщенного фрагмента включает бициклононин, то бициклононин может вступать в аналогичную реакцию циклоприсоединенияа алкина согласно механизму SPAAC с азидами или нитрилоксидами, присоединенными к PAZAM, под воздействием напряжения в бициклической кольцевой системе.

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что в некоторых примерах способа структурированная пластина 12 может не подвергаться силанизации. Напротив, структурированная пластина 12 может быть подвергнута плазменному травлению, после чего функционализированные молекулы могут быть непосредственно нанесены центрифугированием (или осаждены другим способом) на протравленную плазмой структурированную пластину 12. В этом примере при плазменном травлении может образовываться вещество (вещества), активирующее поверхность (например, -ОН группы), с помощью которого функционализированные молекулы могут закрепляться на структурированной пластине 12. В этих примерах функционализированную молекулу выбирают таким образом, чтобы она была способна реагировать с поверхностными группами, образующимися при плазменном травлении. В этих примерах образование структурированной пластины с модифицированной поверхностью происходит в результате выполнения следующих этапов: плазменного травления поверхности структурированной пластины 12, включающей углубления 14, разделенные промежуточными участками 16; образования слоя 20 покрытия из функционализированных молекул в углублениях 14 и на промежуточных участках 16; сошлифовки слоя 20 покрытия с промежуточных участков 16 (необязательно с применением i) щелочной водной суспензии, рН которой составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, которая включает абразивные частицы, имеющие твердость, величина которой меньше твердости структурированной пластины, или ii) шлифовальной подушки и раствора, не содержащего абразивных частиц); и прививки праймера 22 к слою 20 покрытия, находящегося в углублениях 14, что приводит к образованию функционализированных углублений. В некоторых аспектах шлифовку производят с использованием водной суспензии, включающей абразивные частицы, твердость которых ниже твердости структурированной пластины.

Несмотря на то, что это не показано на схеме способа, представленной на Фиг. 2А-2Е, следует понимать, что силанизированная структурированная пластина 10SC с покрытием (показанная на Фиг. 2С) может быть подвергнута очистке. Очистка может включать применение водяной бани и ультразвукового воздействия. Температура водяной бани может поддерживаться относительно низкой и составлять от приблизительно 22°С до приблизительно 45°С. В другом примере температура водяной бани составляет от приблизительно 25°С до приблизительно 30°С.

Как показано на Фиг. 2С и 2D, силанизированную структурированную пластину 10SC с покрытием затем сошлифовывают часть (части) слоя 20 покрытия с силанизированных промежуточных участков. Способ шлифовки, рассмотренный в настоящей заявке, отличается от обычных способов шлифовки, применяемых при обработке микроэлектромеханической системой (англ. microelectromechanical system, сокращенно MEMS), которая может включать обработку сильными химическими средствами и жесткими поверхностями значительной толщины (например, металлическими). Силанизированная структурированная пластина 10SC с покрытием имеет относительно высокую мягкость, и толщина слоя 20 покрытия может составлять приблизительно 200 нм или менее. Учитывая эти условия, для шлифовки может быть применена мягкая химическая суспензия (включающая абразивные частицы с определенной твердостью и размером), с помощью которой тонкий слой 20 покрытия может быть удален с силанизированных промежуточных участков без повреждения нижележащей подложки 12 на этих участках. В альтернативном варианте при шлифовке может быть применен раствор, не включающий абразивных частиц.

Мягкая химическая суспензия представляет собой щелочную водную суспензию, рН которой составляет от приблизительно 7,5 до приблизительно 11, которая включает абразивные частицы, имеющие твердость, величина которой меньше твердости структурированной пластины 12 (твердость которой может превышать твердость слоя 20 покрытия). Следует понимать, что мягкая химическая суспензия может иметь любой щелочной рН, величина которого составлять, например, от величины, превышающей 7, до 8 или от 11 до 14. В одном из примеров твердость структурированной пластины 12 составляет от приблизительно 5 ГПА до приблизительно 5 ГПа, твердость слоя 20 покрытия составляет от приблизительно 0,5 ГПа до приблизительно 0,7 ГПа, и твердость материала абразивных частиц составляет приблизительно 0,2 ГПа. Однако, следует понимать, что могут быть применены любые абразивные частицы, твердость которых меньше твердости структурированной пластины 12. Твердость абразивных частиц выбирают таким образом, чтобы после проведения шлифовки в углублениях 14 оставался по меньшей мере по существу неповрежденный слой 20 покрытия. Примеры абразивных частиц включают карбонат кальция (СаСО₃), агарозу, графит, полиметилметакрилат (ПММА), оксид кремния, оксид алюминия, оксид церия, полистирол и комбинации перечисленных соединений. В некоторых примерах абразивные частицы выбраны из группы, состоящей из карбоната кальция (СаСО₃), агарозы и графита. Средний размер абразивных частиц может составлять от приблизительно 15 нм до приблизительно 5 мкм, и в одном из примеров он составляет приблизительно 700 нм.

Кроме абразивных частиц, щелочная водная суспензия также может включать буфер, хелатирующий агент, поверхностно-активное вещество и/или диспергирующее вещество. Пример буфера включает трис-основание (т.е. трис(гидроксиметил)аминометан), которое может присутствовать в растворе, имеющем рН, приблизительно равный 9. Примером хелатирующего агента является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), которая может присутствовать в растворе, имеющем рН, приблизительно равный 8. Примером поверхностно-активного вещества является анионное поверхностно-активное вещество, такое как додецилсульфат натрия. Могут быть применены полиакрилатные диспергирующие вещества, имеющие различные молекулярные массы. Примером диспергирующего вещества является натриевая соль полиакриловой кислоты. Диспергирующее вещество способствует поддержанию размера абразивных частиц и по меньшей мере по существу предотвращать осаждение абразивных частиц.

В одном из примеров щелочная водная суспензия образуется при добавлении буфера к деионизированной (ДИ) воде в таком количестве, чтобы молярность буфера составляла приблизительно 100 мМ. В одном из примеров для достижения такой молярности отношение количества буфера к количеству ДИ воды составляет приблизительно 5:4. Хелатирующий агент может быть добавлен в количестве, составляющем приблизительно 1% об. (в пересчете на общий объем раствора). В одном из примеров концентрация хелатирующего агента в щелочной водной суспензии составляет приблизительно 1 мМ. Диспергирующее вещество может быть добавлено в количестве, составляющем от приблизительно 0,025% об. до приблизительно 2,5% об. (в пересчете на общий объем раствора). Если количество диспергирующего вещества находится в указанном диапазоне, то достигается подходящая величина дзета-потенциала (электрокинетического потенциала). Поверхностно-активное вещество может быть добавлено в любом подходящем количестве, например, приблизительно 0,125% об. Содержимое может быть перемешано, после чего может быть добавлено в сухой порошок абразивных частиц или гранул, в результате чего образуется суспензия, для применения в шлифовке эта суспензия может быть дополнительно разбавлена ДИ водой.

Щелочная водная суспензия может быть применена в химической системе механического удаления шлифовкой для шлифовки поверхности силанизированной структурированной пластины 10SC с покрытием. Шлифовальная головка (головки)/пластина (пластины) или другое шлифовальное устройство (устройства), применяемое в этой системе, способно снимать шлифовкой слой 20 покрытия с промежуточных участков 16, оставляя слой 20 покрытия в углублениях 14, 14' и оставляя нижележащую подложку 12 по меньшей мере по существу неповрежденной. Например, головка для удаления шлифовкой может представлять собой головку для удаления шлифовкой Strasbaugh ViPRR II.

Как было отмечено выше, сошлифовывание может быть выполнено с помощью шлифовальной пластины и раствора, не содержащего абразива. Например, шлифовальная пластина может быть применена в комбинации с раствором, не содержащим абразивных частиц (т.е. раствором, который не включает абразивных частиц).

Как показано на Фиг. 2D, при сошлифовке удаляется часть (части) слоя 20 покрытия с силанизированных промежуточных участков, и часть (части) слоя 20 покрытия остается в силанизированных углублениях. Кроме того, как показано на Фиг. 2D, после завершения сошлифовки промежуточный участок (участки) 16 может оставаться силанизированным. Другими словами, после шлифовки силанизированные промежуточные участки могут оставаться неповрежденными. В альтернативном варианте в результате шлифовки силан или производное 18 силана могут быть удалены с промежуточного участка (участков) 16.

Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что силанизированная структурированная пластина 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой (показанная на Фиг. 2D), может быть подвергнута очистке. Очистка может включать применение водяной бани и ультразвукового воздействия. Температура водяной бани может поддерживаться относительно низкой и составлять от приблизительно 22°С до приблизительно 30°С. Силанизированная структурированная пластина 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, также может быть высушена центрифугированием или с помощью любой подходящей методики.

Затем силанизированная структурированная пластина 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, может быть подвергнута обработке, приводящей к прививке праймера 22 к слою 20 покрытия из функциональных молекул, находящемуся в силанизированных углублениях. После прививки праймера (праймеров) 22 образуются функционализированные углубления 15, пример которых показан на увеличенном изображении, представленном на Фиг. 2Е.

Примеры подходящих праймеров 22 включают праймеры прямой амплификации или праймеры обратной амплификации. Специфические примеры подходящих праймеров 22 включают праймеры Р5 или Р7, которые закрепляют на поверхности коммерчески доступных проточных ячеек, коммерчески предоставляемых Illumina Inc. для секвенирования на инструментальных платформах HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq®, MiSeqX®, NextSeq® и Genome Analyzer®.

Прививка может быть произведена нанесением покрытия маканием, нанесением покрытия распылением, распределением раствора, нанесением покрытия через экструзионную головку или другим подходящим способом, с помощью которого праймер (праймеры) 22 может быть прикреплен к слою 20 покрытия, находящемуся в по меньшей мере некоторых углублениях 14, 14'. В каждом из этих примеров могут быть использованы раствор или смесь праймера, которые могут включать праймер (праймеры) 22, воду, буфер и катализатор.

Нанесение покрытия маканием мог включать погружение силанизированной структурированной пластины 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, в совокупность последовательно расположенных ванн с регулируемой температурой. В ваннах также может быть установлен контроль потока, и/или они могут находиться в атмосфере азота. Ванны могут содержать раствор или смесь праймера. При прохождении различных ванн праймер (праймеры) 22 закрепляется на слое 20 покрытия, расположенном в по меньшей мере некотором углублении (некоторых углублениях) 14, 14'. В одном из примеров силанизированную структурированную пластину 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, вводят в первую ванну, содержащую раствор или смесь праймера, в которой протекает реакция присоединения праймера (праймеров) 22, после чего биочип 10' перемещают в следующие ванны для промывки. Силанизированная структурированная пластина 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, может быть перемещена из ванны в следующую ванну с помощью механического манипулятора или вручную. При нанесении покрытия маканием также может быть применена система сушки, такая как нагреваемый пневматический азотный шабер или устройство для нанесения растворов центрифугированием.

Нанесение покрытия распылением может быть выполнено распылением раствора или смеси праймера непосредственно на силанизированную структурированную пластину 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, пластина с покрытием, нанесенным распылением, может быть подвергнута инкубации в течение времени, составляющего от приблизительно 4 минут до приблизительно 60 минут, при температуре, составляющей от приблизительно 0°С до приблизительно 70°С. После инкубации раствор или смесь праймера могут быть разбавлены и удалены с помощью, например, устройства для нанесения растворов центрифугированием.

Распределение раствора может быть выполнено способом, включающим налив и центрифугирование, и, таким образом, оно может быть выполнено с помощью устройства для нанесения растворов центрифугированием. Раствор или смесь праймера может быть нанесена (вручную или автоматизированным способом) на силанизированную структурированную пластину 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой. Нанесенный раствор или смесь праймера могут быть нанесены на всю поверхность или распределены по всей поверхности силанизированной структурированной пластины 10SCP с покрытием, обработанным шлифовкой, пластина 10SCP с покрытием, содержащим праймер, может быть подвергнута инкубации в течение времени, составляющего от приблизительно 2 минут до приблизительно 60 минут, при температуре, составляющей от приблизительно 0°С до приблизительно 80°С. После инкубации раствор или смесь праймера могут быть разбавлены и удалены с помощью, например, устройства для нанесения растворов центрифугированием.

В результате прививки праймера (праймеров) к слою 20 покрытия в по меньшей мере некотором силанизированном углублении (углублениях) 14, 14' образуются функционализированные углубления 15, представленные на Фиг. 2Е. После прививки наносят необходимое химическое вещество, располагаемое на поверхности, получая структурированную пластину 10' с модифицированной поверхностью.

Структурированная пластина 10' с модифицированной поверхностью может быть исследована с помощью любой требуемой методики контроля качества и/или получения характеристик поверхности. Например, структурированная пластина 10' с модифицированной поверхностью может быть исследована с помощью, например, атомно-силовой микроскопии (АСМ), сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), эллипсометрии, гониометрии, рефлектометрии, гибридизационных способов определения качества и/или флуоресцентных методик.

Структурированные пластины 10' с модифицированной поверхностью могут быть применены для получения модуля 30 проточной ячейки, показанного на Фиг. 3А. Для образования модуля 30 проточной ячейки две структурированных пластины 10' с модифицированной поверхностью (обозначенные 10'А и 10'В на Фиг. 3А) могут быть скреплены друг с другом.

Обычно две структурированные пластины 10' с модифицированной поверхностью могут быть расположены таким образом, чтобы по меньшей мере некоторые функционализированные углубления 15 одной (первой) структурированной пластины 10'А с модифицированной поверхностью были совмещены с по меньшей мере некоторыми функционализированными углублениями 15 другой (второй) структурированной пластины 10'В с модифицированной поверхностью, и так, чтобы по меньшей мере некоторые из промежуточных участков 16 одной (первой) структурированной пластины 10'А с модифицированной поверхностью были совмещены с по меньшей мере некоторыми промежуточными участками 16 другой (второй) структурированной пластины 10'В с модифицированной поверхностью. Две структурированные пластины 10'А, 10'В с модифицированной поверхностью могут быть соединены друг с другом на протяжении по меньшей мере по существу совмещенных промежуточных участков 16. Две структурированные пластины с модифицированной поверхностью могут быть соединены друг с другом на протяжении по меньшей мере некоторых по существу совмещенных промежуточных участков, в результате чего образуется совокупность дискретных камер для текучей среды. Две структурированные пластины с модифицированной поверхностью могут быть соединены друг с другом в областях, которые не включают углубления. Две структурированные пластины с модифицированной поверхностью могут быть соединены друг с другом на протяжении по меньшей мере некоторых по существу совмещенных промежуточных участков и в тех областях пластины, в которых не имеется углублений и которые не являются промежуточными участками (например, по краям пластины). Скрепление пластин может быть выполнено с помощью любой подходящей методики, такой как лазерная сварка, диффузионное соединение, анодная сварка, пайка эвтектическим сплавом, плазмоактивируемое соединение, пайка стеклокристаллическим припоем или другими способами, известными в данной области техники.

Пример, показанный на Фиг. 3А и Фиг. 3В (на Фиг. 3В представлен вид модуля 30 сверху без верхних структурированных пластин 10'В с модифицированной поверхностью) включает разделительный слой 24, который контактирует с и скреплен с по меньшей мере некоторыми из по меньшей мере по существу совмещенных промежуточных участков 16. Как показано на виде сверху, представленном на Фиг. 3В, разделительный слой 24 может не контактировать со всеми промежуточными участками 16 пластин 10'А, 10'В. Это может быть желательным, например, если в одной камере 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды должны находиться несколько рядов и колонок функционализированных углублений 15. Например, камеры 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды, представленные на Фиг. 3А и 3В, включают три колонки и восемь рядов функционализированных углублений 15, а промежуточные участки 16 в камерах 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды остаются открытыми. Следует понимать, что разделительный слой 24 может быть нарезан заранее так, чтобы он соответствовал размеру пластины, а также требуемому количеству камер 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды, которые должны образовываться.

В примере, показанном на Фиг. 3А и 3В, камеры 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды по меньшей мере частично ограничены разделительным слоем 24 и расположены между двумя скрепленными структурированными пластинами 10'А, 10'В с модифицированной поверхностью. В примере, показанном на Фиг. 3А и 3В, разделительный слой 24 ограничивает продольные стенки 29 и концы 31 (Фиг. 3В) каждой из камер 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды.

В этом примере каждая камера 28, 28', 28'', 28''' для текучей среды включает проточный канал 26, 26', 26'', 26'''. Также в этом примере каждый проточный канал 26, 26', 26'', 26''' представляет собой область, ограниченную скрепленными структурированными пластинами 10'А, 10'В с модифицированной поверхностью, в которой имеется совокупность функционализированных углублений 15.

Материалом разделительного слоя 24 может быть любой материал, способный герметично скреплять по меньшей мере некоторые из промежуточных участков 16 структурированных пластин 10'А, 10'В с модифицированной поверхностью друг с другом. Примеры разделительного слоя 24 и соединений, получаемых с помощью разделительного слоя 24, рассмотрены в опубликованной патентной заявке US 2016/0023208, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

В одном из примеров материалом разделительного слоя 24 может быть материал, поглощающий излучение, который поглощает излучение с длиной волны, которую пропускают подложки 12. В свою очередь, поглощенная энергия затрачивается на образование связи между разделительным слоем 24 и соответствующими структурированными пластинами 10'А, 10'В с модифицированной поверхностью. Одним из примеров материала, поглощающего излучение, является черный Kapton® (полиимид, содержащий углеродную сажу), поставляемый DuPont (США), полоса поглощения которого находится при приблизительно 1064 нм. Следует понимать, что может быть применен полиимид, не содержащий углеродной сажи, но при этом должна быть выбрана такая длина волны, при которой происходит существенное поглощение энергии натуральным полиимидным материалом (например, при длине волны 480 нм). В другом примере соединение может быть осуществлено с помощью полиимида CEN JP, который облучают светом с длиной волны 532 нм.

Если разделительный слой 24 изготовлен из материала, поглощающего излучение, то разделительный слой 24 может быть расположен на границе раздела между пластинами 10'А и 10'В таким образом, чтобы разделительный слой 24 контактировал с целевыми силанизированными промежуточными участками. Может быть приложено сжимающее усилие (например, давление приблизительно 50, 60, 70, 80, 90 или 100 PSI, или приблизительно 60 PSI (что приблизительно соответствует 3,45⋅10⁵ Па, 4,13⋅10⁵ Па, 4,82⋅10⁵ Па, 5,51⋅10⁵ Па, 6,20⋅10⁵ Па или 6,89⋅10⁵ Па)) при одновременном воздействии на границу раздела энергии лазера с подходящей длиной волны (т.е. с облучением материала, поглощающего излучение). Для создания подходящего соединения между разделительным слоем 24 и соответствующими пластинами 10'А, 10'В, энергия лазера может воздействовать на границу раздела как сверху, так и снизу.

В другом примере разделительный слой 24 может контактировать с материалом, поглощающим излучение. Материал, поглощающий излучение, может быть нанесен на границу раздела между разделительным слоем 24 и пластинами 10'А, а также на границу раздела между разделительным слоем 24 и пластинами 10'В. Например, разделительный слой 24 может состоять из полиимида, и отдельный материал, поглощающий излучение, может представлять собой углеродную сажу. В этом примере отдельный материал, поглощающий излучение, поглощает лазерную энергию, которая затрачивается на образование связей между разделительным слоем 24 и соответствующими структурированными пластинами 10'А, 10'В с модифицированной поверхностью.

Если разделительный слой 24 находится в контакте с отдельным материалом, поглощающим излучение, то материал, поглощающий излучение, может быть расположен на соответствующих границах раздела между разделительным слоем 24 и каждой пластиной 10'А и 10'В таким образом, что материал, поглощающий излучение, контактирует по меньшей мере с некоторыми силанизированными промежуточными участками каждой из пластин 10'А, 10'В, а также с разделительным слоем 24. К соответствующим границам раздела может быть приложено сжимающее усилие при одновременном воздействии лазерной энергии с подходящей длиной волны (т.е. производят облучение материала, поглощающего излучение). Для создания подходящего соединения между разделительным слоем 24 и соответствующими пластинами 10'А, 10'В, энергия лазера может воздействовать на границу раздела как сверху, так и снизу.

В примере, показанном на Фиг. 3А и 3В, разделительный слой 24 (и соединительные участки) может быть размещен между камерами 28 для текучей среды таким образом, что разделительный слой 24 физически отделяет одну камеру 28 для текучей среды от соседней камеры 28 для текучей среды (для предотвращения перекрестного загрязнения) и может быть расположен на периферии пластин 10'А, 10'В (для герметизации модуля 30 проточной ячейки). Однако, следует понимать, что в зависимости от примера осуществления разделительный слой 24 (и соединительные участки) может быть расположен в любом требуемом участке.

На Фиг. 3В также представлены пунктирные линии в тех местах, где модуль 30 проточной ячейки может быть разрезан на соответствующие проточные ячейки 40А и 40В. Модуль 30 проточной ячейки может быть разделен в соответствии с любой требуемой конфигурацией, таким образом, что образующиеся индивидуальные проточные ячейки 40А, 40В будут иметь по меньшей мере две камеры 28 для текучей среды. В некоторых примерах может быть желательным разделение модуля 30 проточной ячейки таким образом, чтобы каждая проточная ячейка 40А, 40В включала восемь отдельных камер для текучей среды. В других примерах модуль проточной ячейки разделяют на две, три, четыре или более проточных ячеек. В других примерах каждая проточная ячейка включает одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь отдельных камер для текучей среды. В другом примере каждая проточная ячейка включает две, четыре или восемь отдельных камер для текучей среды.

На Фиг. 4А и 4В изображен другой пример проточной ячейки 40С. Следует понимать, что проточная ячейка 40С может быть получена как часть модуля проточной ячейки способом (способами), рассмотренным в настоящей заявке. Таким образом, показанная проточная ячейка 40С получена после разделения модуля проточной ячейки. В этом примере соответствующие углубления 14 (и, соответственно, функционализированные углубления 15) представляют собой проточные каналы 14'', располагаемые вдоль значительной части длины подложки 12 каждой из частей 10'С, 10'D пластины (а не лунки 14', показанные на предыдущих изображениях).

Проточная ячейка 40С включает две части 10'С, 10'D структурированной пластины с модифицированной поверхностью, которые скреплены друг с другом с помощью разделительного слоя 24 в области соединительных участков. В этом примере разделительный слой 24 может контактировать со всеми промежуточными участками 16 частей 10'С, 10'D пластины. Это может потребоваться, например, если функционализированные углубления 15 представляют собой удлиненные проточные каналы 14'', а не дискретные лунки 14'. Каждый канал 14'' соединен с единственной камерой 28, 28', 28'' для текучей среды.

В примере, показанном на Фиг. 4А и 4В, камеры 28, 28', 28'' для текучей среды частично ограничены разделительным слоем 24 и расположены между двумя скрепленными частями 10'С, 10'D структурированной пластины с модифицированной поверхностью. В примере, показанном на Фиг. 4А и 4В, разделительный слой 24 ограничивает часть продольных стенок 29 и концы 31 каждой из камер 28, 28', 28'' для текучей среды, а углубления/проточные каналы 14' 14'' каждой части 10'С, 10'D пластины образуют оставшуюся часть продольных стенок 29 и концов 31 каждой камеры 28, 28', 28'' для текучей среды.

Проточные ячейки 40А, 40В, 40С могут быть применены для проведения контролируемых химических или биохимических реакций в автоматизированном реакционном устройстве, таком как секвенатор нуклеотидов. Несмотря на то, что это не показано, следует понимать, что через подложку 12 нижних структурированных пластин 10'А, 10'D с модифицированной поверхностью могут быть просверлены отверстия (порты) в соответствующие камеры 28 для текучей среды. Присоединенное к отверстиям автоматизированное реакционное устройство может регулировать потоки реагента (реагентов) и продукта (продуктов) в герметизированных камерах 28 для текучей среды. В некоторых примерах применения автоматизированное реакционное устройство может регулировать давление, температуру, состав газа и другие параметры среды в проточной ячейке 40А, 40В, 40С. Дополнительно, в некоторых примерах применения отверстия могут быть просверлены в подложке 12 верхних структурированных пластин 10'В, 10'C с модифицированной поверхностью или и в верхних, и в нижних подложках 12. В некоторых примерах применения реакции, протекающие в герметизированных камерах 28 для текучей среды можно отслеживать через подложку (подложки) 12 посредством получения изображений или при измерении количества теплоты, испускаемого света и/или флуоресценции.

Проточные ячейки 40А, 40В, 40С, рассмотренные в настоящей заявке, могут быть применены для осуществления множества различных методик или способов секвенирования, включающих методики, часто называемые секвенированием синтезом (англ. sequencing-by-synthesis, сокращенно SBS), секвенированием лигированием, пиросеквенированием и т.д. Поскольку при осуществлении таких методик функциональная молекула и присоединенный праймер (праймеры) 22 секвенирования присутствуют в функционализированных углублениях и не присутствуют на промежуточных участках 16, протекание амплификации будет ограничено областями функционализированных углублений.

Вкратце, реакция секвенирования синтезом (SBS) может быть проведена в такой системе, как системы-секвенаторы HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq® или NextSeq®, поставляемые Illumina (San Diego, CA). Набор подвергаемых секвенированию целевых молекул ДНК подвергают гибридизации с закрепленными праймерами 22 секвенирования и затем проводят мостиковую амплификацию или амплификацию способом кинетического исключения. После денатурации остаются одноцепочечные матрицы (англ. template), прикрепленные к функционализированным молекулам (слою 20 покрытия), и генерируется несколько миллионов плотных кластеров двухцепочечной ДНК (т.е. генерация кластеров). Затем проводят реакции секвенирования. Данные синхронизируют и сравнивают с эталоном, определяя разности секвенирования.

Дополнительные замечания

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше признаков (при условии, что эти признаки не являются взаимоисключающими) составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящем описании. В частности, все комбинации раскрытых предметов изобретения, очевидные после прочтения предлагаемого описания, составляют часть предмета изобретения, рассмотренного в настоящем описании. Также следует понимать, что применяемая в настоящем описании терминология, которая также может употребляться в любом документе, включенном в настоящее описание посредством ссылки, должна иметь значение, в наибольшей мере соответствующее конкретным признакам, рассмотренным в настоящем описании.

Содержание всех публикаций, патентов и патентных заявок, цитируемых в настоящем описании, полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Упоминание в настоящем описании "одного примера", "другого примера", "примера" и т.д. означает, что конкретный элемент (например, элемент, структура и/или характеристика), раскрытый при описании этого примера, включен в по меньшей мере один пример, рассмотренный в настоящем описании, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что, если из контекста не ясно иное, то рассмотренные элементы любого примера могут быть скомбинированы в различных примерах любым подходящим образом.

Следует понимать, что приведенные в настоящем описании диапазоны включают указанные диапазоны и любые величины или поддиапазоны, находящиеся в пределах указанного диапазона. Например, следует понимать, что диапазон, составляющий от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм, включает не только явным образом упомянутые пределы от приблизительно 200 мм до приблизительно 300 мм, но также включает индивидуальные величины, такие как приблизительно 208 мм, приблизительно 245 мм, приблизительно 275,5 мм и т.д., и поддиапазоны, такие как от приблизительно 225 мм до приблизительно 990 мм, от приблизительно 235 мм до приблизительно 280 мм и т.д. Кроме того, если для описания величины используют модификаторы "приблизительно" и/или "по существу", то они составляют небольшие вариации (до +/- 10%) от означенной величины.

Несмотря на то, что некоторые примеры были описаны подробно, следует понимать, что рассмотренные примеры могут быть модифицированы. Таким образом, приведенное выше описание не является ограничивающим.

Реферат

Модуль проточной ячейки включает первую и вторую структурированные пластины, имеющие модифицированную поверхность, и разделительный слой. Первая структурированная пластина с модифицированной поверхностью включает первые углубления, разделенные первыми промежуточными участками, и первая функционализированная молекула присоединена к первому силану или производному силана в по меньшей мере некоторых первых углублениях, и первый праймер привит к первой функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых первых углублениях. Вторая структурированная пластина с модифицированной поверхностью включает вторые углубления, разделенные вторыми промежуточными участками, и вторая функционализированная молекула присоединена ко второму силану или производному силана в по меньшей мере некоторых вторых углублениях, и второй праймер привит ко второй функционализированной молекуле в по меньшей мере некоторых вторых углублениях. Разделительный слой скрепляет по меньшей мере некоторые первые промежуточные участки с по меньшей мере некоторыми вторыми промежуточными участками и по меньшей мере частично ограничивает соответствующие камеры для текучей среды модуля проточной ячейки. 4 н. и 29 з.п. ф-лы, 10 ил.

Формула