Амплификация библиотек нуклеиновых кислот с применением кинетического исключения - RU2019116874A
Код документа: RU2019116874A
Формула
1. Способ, включающий:
реакцию на проточной ячейке первого раствора и отличающегося от него второго раствора, проводимую посредством протекания первого раствора по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, и затем посредством протекания второго раствора по массиву сайтов амплификации;
где первый раствор включает совокупность нуклеиновых кислот-мишеней и первую смесь реагентов, которая включает нуклеозидтрифосфаты (НТФ) и один или более ферментов репликации, причем находящиеся в первом растворе нуклеиновые кислоты-мишени переносятся к сайтам амплификации и связываются с сайтами амплификации со скоростью переноса, и под действием первой смеси реагентов происходит амплификация нуклеиновых кислот-мишеней, которые прикреплены к сайтам амплификации, в результате чего получают клональные популяции ампликонов, полученных из соответствующих нуклеиновых кислот-мишеней, и при этом ампликоны образуются со скоростью амплификации, которая превышает скорость переноса;
и второй раствор включает вторую смесь реагентов и не содержит нуклеиновых кислот-мишеней, причем второй раствор предназначен для увеличения количества ампликонов в клональных популяциях, находящихся на сайтах амплификации.
2. Способ по п. 1, в котором вторая смесь реагентов включает НТФ и один или более ферментов репликации первой смеси реагентов.
3. Способ по п. 1, в котором проточная ячейка включает совокупность праймеров, присоединенных к проточной ячейке в сайтах амплификации, и в проточной ячейке первый раствор вступает в реакцию связывания нуклеиновых кислот-мишеней и ампликонов с первой подгруппой праймеров, и также в проточной ячейке второй раствор вступает в реакцию образования дополнительных ампликонов и связывания дополнительных ампликонов с по меньшей мере некоторыми праймерами, содержащимися в подгруппе праймеров, доступных для взаимодействия и отличающихся от праймеров первой подгруппы.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий удаление первого раствора из проточной ячейки перед пропусканием второго раствора по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, в результате чего единственные нуклеиновые кислоты-мишени, присутствующие в проточной ячейке во время протекания второго раствора по массиву сайтов амплификации, связаны с проточной ячейкой и не представляют собой нуклеиновые кислоты-мишени, свободно перемещаются в первом растворе.
5. Способ по п. 1, в котором массив сайтов амплификации расположен на поверхности проточной ячейки, и первый раствор пропускают через впускное отверстие проточной ячейки по поверхности проточной ячейки, а затем второй раствор пропускают через впускное отверстие по поверхности проточной ячейки.
6. Способ по п. 1, в котором проточная ячейка включает совокупность праймеров, присоединенных к проточной ячейке в сайтах амплификации, и по меньшей мере некоторые из праймеров связываются с нуклеиновыми кислотами-мишенями, находящимися в первом растворе, под воздействием первого раствора, протекающего по массиву сайтов амплификации, после чего протекание второго раствора, который не содержит нуклеиновых кислот-мишеней, по массиву сайтов амплификации не приводит к дополнительному связыванию праймеров с нуклеиновыми кислотами-мишенями.
7. Способ по п. 1, в котором нуклеиновые кислоты-мишени пропускают по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, только в первом растворе.
8. Способ по п. 1, в котором вторая смесь реагентов включает НТФ и полимеразу.
9. Способ по п. 1, в котором вторая смесь реагентов включает один или более из следующих ферментов: геликазу и рекомбиназу.
10. Способ по п. 1, в котором вторая смесь реагентов включает праймер, содержащий по меньшей мере одну из следующих последовательностей: последовательность праймера Р5 или последовательность праймера Р7.
11. Способ по п. 1, в котором сайты амплификации представляют собой лунки на поверхности проточной ячейки, где лунки отделены друг от друга промежуточными участками на поверхности.
12. Способ по п. 1, дополнительно включающий регулирование скорости переноса нуклеиновых кислот-мишеней к сайтам амплификации с помощью одного или более следующих воздействий: регулирования концентрации нуклеиновых кислот-мишеней в первом растворе, регулирования вязкости первого раствора, регулирования среднего размера нуклеиновых кислот-мишеней и наличия или отсутствия реагента фазового исключения в первом растворе.
13. Способ по п. 1, дополнительно включающий регулирование скорости амплификации нуклеиновых кислот-мишеней с помощью одного или более следующих воздействий: регулирования концентрации НТФ в первой смеси реагентов, регулирования концентрации одного или более ферментов репликации в первой смеси реагентов и регулирования температуры на сайтах амплификации.
14. Способ по п. 1, в котором первый раствор и второй раствор пропускают по массиву сайтов амплификации в изотермических условиях.
15. Жидкостная система, включающая:
распределитель реагентов, включающий по меньшей мере один клапан, находящийся в гидравлическом взаимодействии с впускным отверстием проточной ячейки, которая включает массив сайтов амплификации, где распределитель реагентов дополнительно включает совокупность каналов, соединяющих посредством гидравлического взаимодействия по меньшей мере один клапан и соответствующие резервуары для реагентов; и
контроллер, включающий один или более процессоров, где контроллер предназначен для управления по меньшей мере одним клапаном и насосом, направляющими первый раствор через впускное отверстие по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, и затем направляющими второй, отличающийся от первого раствор через впускное отверстие по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке;
где первый раствор включает совокупность нуклеиновых кислот-мишеней и первую смесь реагентов, которая включает нуклеозидтрифосфаты (НТФ) и один или более ферментов репликации; количество нуклеиновых кислот-мишеней в первом растворе превышает количество сайтов амплификации в массиве; первый раствор вступает на проточной ячейке в реакцию, приводящую к образованию на сайтах амплификации клональных популяций ампликонов, полученных из соответствующих нуклеиновых кислот-мишеней; находящиеся в первом растворе нуклеиновые кислоты-мишени переносятся к сайтам амплификации и связываются с сайтами амплификации со скоростью переноса, и под действием первой смеси реагентов происходит амплификация нуклеиновых кислот-мишеней, которые прикреплены к сайтам амплификации, что приводит к образованию ампликонов со скоростью амплификации, которая превышает скорость переноса;
при этом второй раствор включает вторую смесь реагентов и не содержит нуклеиновых кислот-мишеней, и второй раствор вступает на проточной ячейке в реакцию, приводящую к увеличению количества ампликонов в клональных популяциях ампликонов, находящихся на сайтах амплификации.
16. Жидкостная система по п. 15, в которой вторая смесь реагентов имеет такой же состав, что и первая смесь реагентов.
17. Жидкостная система по п. 15, в которой контроллер предназначен для управления по меньшей мере одним клапаном и насосом, с помощью которых производят смешивание анализируемой матрицы, которая включает нуклеиновые кислоты-мишени, с первой смесью реагентов с образованием первого раствора, и контроллер также предназначен для управления по меньшей мере одним клапаном и насосом, с помощью которых получают второй раствор путем смешивания друг с другом второй смеси реагентов, в которую не добавляют анализируемой матрицы.
18. Жидкостная система по п. 15, в которой контроллер предназначен для управления по меньшей мере одним клапаном и насосом, с помощью которых перед пропусканием второго раствора по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, из проточной ячейки удаляют первый раствор, в результате чего единственные нуклеиновые кислоты-мишени, присутствующие в проточной ячейке во время протекания второго раствора по массиву сайтов амплификации, связаны с проточной ячейкой, а не свободно перемещаются в первом растворе.
19. Способ, включающий:
смешивание в резервуаре первой смеси реагентов с таким количеством нуклеиновых кислот-мишеней, которое подходит для получения первого раствора, причем первая смесь реагентов включает нуклеозидтрифосфаты (НТФ) и один или более ферментов репликации;
течение первого раствора из резервуара по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, и при этом находящиеся в первом растворе нуклеиновые кислоты-мишени переносятся к сайтам амплификации и связываются с сайтами амплификации со скоростью переноса, причем под действием первой смеси реагентов происходит амплификация нуклеиновых кислот-мишеней, которые прикреплены к сайтам амплификации, что приводит к образованию клональных популяций ампликонов, полученных из соответствующих нуклеиновых кислот-мишеней, где ампликоны образуются со скоростью амплификации, которая превышает скорость переноса;
после вытекания первого раствора из резервуара, смешивание второй смеси реагентов в резервуаре без добавления в резервуар дополнительного количества нуклеиновых кислот-мишеней, что приводит к получению второго раствора, где вторая смесь реагентов включает добавочные количества свежих НТФ и один или более ферментов репликации; и
протекание второго раствора из резервуара по массиву сайтов амплификации, находящихся на проточной ячейке, где вторая смесь реагентов вступает в реакцию с ампликонами, что приводит к повышению количества ампликонов в клональных популяциях, находящихся на сайтах амплификации.
20. Способ по п. 19, в котором как первая смесь реагентов, так и вторая смесь реагентов включает буферный компонент, причем вторая смесь реагентов включает большее количество буферного компонента, чем первая смесь реагентов, для компенсации не добавленного во второй раствор дополнительного количества нуклеиновых кислот-мишеней.
