Способ иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель - RU2041262C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к молекулярной биологии, а точнее к способу иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель, находящему применение в медицине, молекулярной биологии, сельском хозяйстве, для генетической диагностики, секвенирования и картирования ДНК, детектирования мутаций и другого.

Известно значительное число химических методов иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений, например белков, пептидов и фрагментов ДНК (олигонуклеотидов и полинуклеотидов) на капиллярно-пористых носителях. Она основаны на создании ковалентных связей между биоорганическим соединением и носителем. В качестве носителя используются; целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, агароза, декстран, полиаминополистирол, полиакриламиды и их производные и другие.

Известен способ иммобилизации олигонуклеотидов на капиллярно-пористый носитель матрицу геля, заключающийся в том, что на высушенную на воздухе матрицу геля с помощью микроманипулятора, снабженного дозатором, наносят капли раствора олигонуклеотидов, затем матрицу с нанесенным раствором олигонуклеотидов помещают во влажную камеру, где выдерживают 4 ч до окончания реакции связывания олигонуклеотидов с гелем, затем сушат 0,5 ч на открытом воздухе, промывают гибридизационным буфером (1 М NaCl, 10 мМ Na-фосфат, рН 7,0, 1 мМ этилендиамин- тетрауксусная кислота), ополаскивают водой и хранят сухими при температуре -20^оС. Олигонуклеотиды иммобилизуют на матрице геля, нанесенного на подложку, в виде участков (квадратных ячеек), отделенных один от другого промежутками.

Химические реакции связывания олигонуклеотида с гелем осуществляют следующим образом.

В качестве линкера берут 3-метилуридин, присоединенный 5'-3' межнуклеотидной фосфодиэфирной связью к иммибили- зуемому олигонуклеотиду. Выбор 3-метилуридина определялся тем, что он не образует прочных водородных связей ни с одним из природных оснований.

Предварительно перед нанесением на матрицу геля олигодезоксинуклеотиды, содержащие на 3'-конце 3-метилуридин, окисляют 1 мМ перйодатом натрия в течение 1 ч при комнатной температуре, осаждают 10 объемами 2%-ного LiClO₄ в ацетоне и растворяют в воде.

Окисление олигодезоксинуклеотида приводит к образованию производного, несущего на 3'-конце диальдегидную группировку. Перед использованием матрицу геля обрабатывают 50%-ным гидразином. Обработка полиакриламидного геля гидразином приводит к замещению части амидных групп на гидразидные, которые легко реагиpуют с 3'-диальдегидом. При этом образуется стабильное морфолиновое производное.

Ход иммобилизации контролируют по метке [5'-³²P] введенной с помощью киназы в иммобилизуемые олигонуклеотиды. Выход иммобилизации (т.е. доля олигонуклеотида, необратимо связавшегося с гелем) ≈80%
Однако указанный метод имеет ограничение в случаях, когда необходимо провести иммобилизацию большого количества различных олигонуклеотидов (более 10), содержащихся в микрообъемах (до десятков нанолитров) растворов в ячейках (с размерами до 100 мкм) плотной микроматрицы из полиакриламидного геля (с расстоянием между ячейками до 200 мкм), причем строго одного типа в каждую, из-за трудности создания кондиционных условий для протекания реакции ковалентного связывания олигонуклеотидов с носителем во всех ячейках микроматрицы (из-за неизбежного преждевременного высыхания растворов в части ячеек до полного завершения реакции уже в процессе нанесения растворов и при перенесении микроматрицы во влажную камеру). При этом снижается качество иммобилизации и соответственно микромат- рицы, увеличивается расход дорогостоящих реактивов и повышается стоимость процесса.

Кроме того, при помещении микроматрицы во влажную камеру процесс влагообмена на ее поверхности становится трудноуправляемым. При этом не исключается ситуация, когда из парогазовой фазы может выпасть на поверхность микроматрицы в избытке конденсат воды и соединить соседние ячейки или раствор упарится настолько, что реакция прекратится. Оба случая приводят к полной потере микроматрицы. Все это усложняет технологию указанного способа.

В основу изобретения положена задача изменить технологические операции способа иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель таким образом, чтобы исключить возможность испарения жидкости в процессе иммобилизации и обеспечить полное протекание химической реакции ковалентного связывания олигонуклеотидов со структурой геля, и тем самым, снизить трудоемкость процесса и получить технологию, пригодную для автоматизации и серийного производства.

Задача решена тем, что в заявленном способе иммобилизации водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель, включающем нанесение водорастворимых биоорганических соединений на капиллярно-пористый носитель с последующей выдержкой их до окончания химической реакции связывания биоорганических соединений с носителем, согласно изобретению, после нанесения растворов водорастворимых биоорганических соединений устанавливают температуру носителя, равной или ниже точки росы окружающего воздуха, и выдерживают носитель до появления конденсата воды и полного его набухания, после чего поверхность носителя покрывают слоем несмешивающегося с водой нелюминесцирующего инертного масла и выдерживают до окончания реакции связывания биоорганических соединений с носителем.

Предпочтительно использовать в качестве водорастворимых биоорганических соединений олигонуклеотиды или полинуклеотиды, а в качестве капиллярно-пористого носителя полиакриламидный гель.

Целесообразно, в качестве несмешивающегося с водой, нелюминесцирующего инертного масла использовать масло (ТУ Ю2-64; нормаль ЛОМО СТПЮ-132-72). Целесообразно носитель под слоем масла выдерживать не менее 48 ч. Все это позволяет исключить возможность испарения жидкости в процессе иммобилизации и обеспечить полное протекание химической реакции связывания биоорганических соединений с носителем. Заявляемый способ характеризуется упрощенной технологией по сравнению с известным способом, повышением качества иммобилизации, улучшенной воспроизводимостью способа.

Заявляемый способ менее трудоемкий, легко автоматизируется и может быть использован для серийного производства.

На фиг. 1 изображен фрагмент носителя-микроматрицы в разрезе, вид сбоку в процессе иммобилизации (А. фрагмент микроматрицы в момент загрузки микрообъемов растворов биоорганических соединений; В. фрагмент микроматрицы в момент завершения загрузки; С. фрагмент микроматрицы в момент установления температуры микроматрицы, равной или ниже точки росы для окружающего воздуха; D. фрагмент микроматрицы после покрытия пленкой инертного нелюминесцирующего масла); на фиг. 2 кривые отмывки совершенных и несовершенных дуплексов, полученные на микроматрице после гибридизации с иммобилизованными олигонуклеотидами.

Заявленный способ осуществляют следующим образом. Приготавливают растворы биоорганических соединений, в качестве которых могут быть использованы олигонуклеотиды, полинуклеотиды, водорастворимые белки, пептиды и другие. Микрообъемы приготовленных растворов наносят на поверхность капиллярно-пористого носителя-микроматрицы. В качестве носителя могут быть использованы: целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, агароза, дестран, полиаминополистирол и другие. Предпоч- тительно используют полиакриламидный гель.

После нанесения микрообъемов растворов биоорганических соединений во все ячейки микроматрицы ее температуру устанавливают равной или ниже температуры точки росы, для условий окружающего воздуха на момент проведения процесса, и поддерживают до полного набухания геля и появления несливающихся капель конденсата воды в промежутках между ячейками, после чего на поверхность микроматрицы осторожно наслаивают тонким (толщиной > 100 мкм) слоем инертное нелюминесцирующее масло, например нелюминесцирующее масло (ТУ Ю2-64; нормаль ЛОМО МТПЮ-132-72); вазелин очищенный; OV-3 фенил (10%) метилсиликоновое масло; OV-7 фенил (20%) метилсиликоновое масло и др. После этого микроматрицу выдерживают под слоем масла при комнатной температуре до полного завершения процесса иммобилизации, предпочтительно не менее 48 ч. Затем масло удаляют растворителем (например, хлороформом), а матрицу высушивают и хранят до использования. Предпочтительно использовать в качестве покрытия поверхности микроматрицы нелюминесцирующее масло (ТУ Ю2-64; нормаль ЛОМО СТПЮ-132-72).

На фиг. 1 изображен фрагмент микроматрицы в разрезе, вид сбоку, где А. фрагмент микроматрицы в момент загрузки микрообъемов растворов биоорганических соединений в ячейки микроматрицы, температура микроматрицы в этот момент равна температуре окружающего воздуха; В. фрагмент микроматрицы в момент завершения загрузки, все капли испарились, состояние геля одинаковое во всех ячейках; С. фрагмент микроматрицы в момент завершения конденсации воды из окружающего воздуха, температура микроматрицы ниже или равна температуре точки росы (для окружающего воздуха на момент проведения процесса), ячейки геля набухли и покрыты конденсатом, в пространстве между ячейками появились несливающиеся мелкие капельки конденсата; D. Микроматрица покрыта пленкой нелюминесцирующего масла толщиной более чем 100 мкм, температура микроматрицы равна температуре окружающего воздуха.

Заявляемый способ иммобилизации пригоден для иммобилизации любых водорастворимых биоорганических веществ в структуру носителя, особенно в тех случаях, когда для полного протекания химической реакции ковалентного связывания в системе вещество-носитель необходимо наличие и сохранение жидкой (водной) фазы.

П р и м е р 1. Подготавливают растворы олигонуклеотидов Sp-33 (3'-CCGTCCAA-5'), Sm-33 (3'-CCGTCTAA-5') с концентрацией 60 пмоль в мкл, содержащие на 3'-конце 3-метилуридин, окисленные 1 мМ перйодатом натрия в течение 1 ч при комнатной температуре и осажденные 10 объемами 2%-ного LiClO₄ в ацетоне и раствор сукцинимидного производного тетраметилпродамина в диметилсульфоксиде с концентрацией 0,5-1 мкг на 100 мкл (который служит для контроля качества нанесения микродоз). Приготавливают 8%-ный полиакриламидный гель толщиной 30 мкм, формируют микроматрицу из геля с размерами ячеек 100х100 мкм с промежутками 200х200 мкм и обрабатывают ее в течение часа при комнатной температуре 50%-ным гидразином, наносят микрообъемы приготовленных растворов на поверхность ячеек геля по 1, 4 0,29 мл в каждую (фиг. 1, А). Температура микроматрицы не контролируется и равна температуре окружающего воздуха (комнатная температура) (фиг. 1, В). После нанесения микрообъемов растворов олигонуклеотидов во все ячейки температуру микроматрицы устанавливают равной или ниже температуры точки роcы, для условий окружающего воздуха на момент проведения процесса, и поддерживают до полного набухания геля и появления несливающихся капель конденсата воды в промежутках между ячейками (фиг. 1, С). Затем на поверхность микроматрицы осторожно наслаивают тонким (толщиной > 100 мкм) слоем предварительно насыщенное дистиллированной водой нелюминесцирующее масло (ТУ Ю2-64; нормаль ЛОМО СТПЮ-132-72), после чего микроматрицу выдерживают под слоем масла при комнатной температуре до полного завершения процесса иммобилизации 48 ч (фиг. 1, D). Затем масло удаляют растворителем (хлороформом), а матрицу высушивают и хранят.

Так как иммобилизация биоорганических соединений на носители проводится с основной целью использовать полученную систему для проведения специфического химического связывания других биоорганических соединений для их наработки или идентификации, оценку качества иммобилизации целесообразно проводит косвенно, в данном примере оценку проводят по гибридизации приготовленной олигонуклеотидной микроматрицы с флюоресцентно меченным по 5'-концу фрагменту ДНК из 19 оснований (5'-CCTGGGCAGGTTFFTATCA-3'), содержащимся в растворе буфера (1 М NaCl; 10 mМ Na-фосфат; 1 mМ ЭДТА; рН 6,8). Раствор (из расчета 1 мкл на 4 ячейки) равномерно наносят на поверхность олигонуклеотидной микроматрицы, охлажденной до 0^оС. Для полного протекания гибридизации матрицу выдерживают при этих условиях 2 ч, затем гибридизационный раствор с остатками фрагментов ДНК смывают охлажденным 1 М раствором NaCl. На поверхность матрицы наносят тонким слоем чистый охлажденный 1 М раствор NaCl, накрывают покровным стеклом и устанавливают на термостолик флюоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС камерой и компьютерной системой обработки изображения. Проводят цикл измерений. Изображение микроматрицы запиcывают в интервале от 0^о С до 25^оС c шагом в 5^оС (включая края диапазона) и выдержкой в течение 4 мин на каждом шаге. Изображения анализируют, при этом сигнал, измеренный ПЗС камерой, усредняют по области соответствующей каждой ячейке микроматрицы (погрешность такого определения не превышает 5%). Фон оценивают по сигналам точек, расположенных в области близкой к анализируемой ячейке (погрешность определения фона составляет 15%). Из полученных сигналов вычитают значение фона, результат делят на время накопления кадра (задающегося в ходе измерения). Все результаты выражены в процентах относительно самой ячейки и графически приведены на фиг. 2 в виде кривых отмывки, совершенных (Sp-33 3'-CCGTCCAA-5') и несовершенных (Sm-33 3'-CCGTCTAA-5') дуплексов, полученных на микроматрице (4 ячейках) после гибридизации с иммобилизованными олигонуклеотидами. На фиг. 2 по оси ординат отложены в оставшиеся дуплексы, а по оси абсцисс температура отмывки,^оС.

Известно, что количество гибридизированного олигонуклеотида (при прочих равных условиях) разное и зависит от состава олигонуклеотида, а также при одинаковом количестве иммобилизованного олигонуклеотида и их одинаковом составе зависит от локальных условий в конкретной ячейке (состояние структуры носителя: точность геометрических размеров, наличия примесей и т.д.). Это объясняется почему в исходной точке (при 0^оС) (фиг. 2) даже для олигонуклеотидов одинакового состава наблюдается некоторая разница в уровнях сигналов. Таким образом использованный косвенный метод оценки качества иммобилизации (по гибридизации) дает заниженный результат против истинного.

Из полученных кривых Sp-33 (1; 2) и Sm-33 (1,2) (фиг. 2) видно, что гибридизация, а следовательно, и иммобилизация количественно и качественно достаточна для однозначной идентификации тестируемого фрагмента ДНК (высокий уровень исходного гибридизационных сигналов при температуре 0^оС и исчезновение сигнала для Sm-33 (1, 2) при 15^оС при сохраняющемся для Sp-33 (1, 2) высоком уровне сигнала).

Аналогичные кривые получены для большого числа различных дуплетов (графики не приводятся), при этом качество иммобилизации во всех случаях было не хуже, чем в приведенном примере, и воспроизводилось в 100% проведенных экспериментов. Это свидетельствует о высокой воспроизводимости и качестве заявляемого способа иммобилизации.

Реферат

Использование: относится к молекулярной биологии, к способам иммобилизации водорастворимых биологических соединений на капиллярно-пористый носитель. Сущность изобретения: способ включает нанесение растворов водорастворимых биологических соединений на капиллярно-пористый носитель, установление температуры носителя равной или ниже точки росы окружающего воздуха, после чего поверхность носителя покрывают слоем несмешивающегося с водой нелюминесцирующего инертного масла и выдерживают до окончания химической реакции связывания биологических соединений с носителем. 3 з.п. ф-лы, 2 ил.

Формула