Кодированный микроноситель и способ кодирования микроносителей - RU2242746C2
Код документа: RU2242746C2
Чертежи
Описание
Область техники
Настоящее изобретение относится к кодированным микроносителям и, более точно, к микроносителям с записанными на них кодами. Любая ссылка в описании на коды, записанные “на” микроносителях, включает коды, записанные на поверхности микроносителей, и коды, записанные внутри микроносителей. Настоящее изобретение относится также к способам записи кодов на микроносители, способам считывания кодов и способам использования закодированных микроносителей. Предпочтительный способ кодирования микроносителей включает воздействие на микроносители, которые содержат способное обесцвечиваться вещество, световым источником с высоким пространственным разрешением для обесцвечивания кодов на микроносителях. Закодированные микроносители могут использоваться, например, как материалы подложки в химических и биологических тестах и синтезе.
Предшествующий уровень техники
Поиск и создание лекарственных препаратов в химии и биологии обычно включает испытания большого числа соединений или молекул. Эти тесты обычно включают подбор химических библиотек для соединений, представляющих интерес, подбор конкретных целевых молекул в тестовых образцах, и проверку общих химических и биологических взаимодействий между молекулами, представляющими интерес. Опыты, описанные выше, часто требуют проведения тысяч индивидуальных химических или биологических реакций. Например, опыты при поиске лекарственного препарата могут включать тестирование тысяч соединений для определенного целевого анализируемого препарата. Любые соединения, которые вступают в реакцию, связываются или взаимодействуют с целевым анализируемым препаратом, могут давать надежду для различных использований, где, как считается, наблюдаемое взаимодействие является значительным.
При проведении большого числа индивидуальных реакций в опытах, описанных выше, существует ряд практических проблем. Наиболее значительной проблемой является необходимость маркировать и отслеживать каждую реакцию. Например, если реакция, представляющая интерес, наблюдается только в единственном числе в группе из тысяч реакций, исследователь должен иметь возможность определить, какое одно из тысяч первоначальных соединений или молекул произвело эту реакцию.
Одним из известных способов отслеживания идентичности реакций является физическое разделение, т.е. проведение каждой реакции из огромного множества в отдельном реакционном сосуде и сохранение записи о том, какие индивидуальные реагенты использовались в каждом сосуде. Таким образом, например, когда реакция, представляющая интерес, наблюдалась в сосуде, обозначенном как номер 5 из 1000, исследователь может ссылаться на запись используемых реагентов и поймет из записи для сосуда номер 5, какие конкретные реагенты, представленные в нем, привели к реакции, представляющей интерес. Примерами структур с высокой плотностью, на которые дается ссылка выше, являются 384-, 864-, 1,536-, 3,456- и 9,600-ячеистые в виде пластины микротитра, где каждая ячейка на пластине микротитра представляет собой миниатюрный реакционный сосуд. Используются миниатюрные реакционные клетки, потому что они занимают мало места и снижают стоимость реагентов, используемых при тестировании.
Использование пластин микротитра в химических и биологических опытах имеет ряд недостатков. Например, использование пластин требует тщательного разделения очень большого числа отдельных реакционных сосудов, вместо того, чтобы дать возможность всем реакциям протекать свободно и, что более удобно, в одном реакционном сосуде. Кроме того, требование, чтобы реакционные объемы были пространственно разделены, приводит к физическому ограничению размера используемой пластины микротитра и, таким образом, числа различных реакций, которые могут быть проведены на пластине.
До настоящего времени при использовании пластин микротитра предпринимались попытки разработать другие средства отслеживания индивидуальных реакций при высокопроизводительном тестировании. При этом пришлось отказаться от концепции пространственного разделения реакций, вместо этого, индивидуальные реакции отслеживаются с помощью других средств. Например, были разработаны способы проведения высокопроизводительного анализа и реакций на микроносителях как подложках. Каждый микроноситель может содержать один конкретный лиганд, связанный с его поверхностью для действия в качестве реагента, и микроноситель может дополнительно содержать “код”, который идентифицирует микроноситель и, следовательно, идентифицирует конкретный лиганд, присоединенный к его поверхности. Способы, описанные выше, позволяют осуществлять “широкую обработку”. Это означает, что тысячи уникально закодированных микроносителей, каждый из которых имеет лиганд, связанный с его поверхностью, могут быть смешаны и подвергнуты анализу одновременно. Такие микроносители, которые проявляют реакцию, представляющую интерес, между прикрепленным лигандом и целевым анализируемым материалом, могут иметь считанный код, что приводит к идентификации лиганда, который дает требуемую реакцию.
Практика широкой обработки, описанной выше, требует точного кодирования каждого микроносителя в отдельности, а также точной и последовательной идентификации кодов. Так как анализ, использующий широкую обработку, основан в основном на кодировании микроносителей для получения результатов, качество анализов зависит в значительной степени от качества и считываемости кодов микроносителей. Попытки кодировать микроносители ограничены по отношению к фракционной окраске (Dye-Trak микросферы), флуоресцентной маркировке (флуоросферы; Nu-flow), так называемыми программируемыми на расстоянии матрицами с памятью (IRORI; патент США 5751629), детектируемым меткам, таким как олигонуклеотиды и малые пептиды (патент США 5565324; патент США 5721099, патент США 5789172), и твердофазным частицам, которые несут транспондеры (патент США 5736332).
Каждый из указанных известных способов для кодирования микроносителей имеет недостатки. Например, микроносители, которые различаются только на основе своего размера, формы, цвета, интенсивности флуоресценции или их сочетания, часто не могут обеспечить достаточно уникальные считываемые комбинации варьируемых параметров для создания ряда массивов уникальных кодов, необходимых для сопровождения тестирования соответствующего большого числа различных молекул. Кроме того, недостаток любых микроносителей, несущих на своей поверхности инородные тела, служащие как коды, например съемные метки или флуоресцентные метки, связан с тем, что прикрепленные части могут мешать образовывать связь или вступать в реакцию молекулам со связанным лигандом на микроносителях, которые нацелены на анализируемые материалы в анализах. После выделения микроносителей, представляющих интерес и проявляющих требуемую реакцию, способы кодирования микроносителей со съемными метками также включают дополнительную стадию расщепления и анализа меток для окончательной идентификации лежащих ниже лигандов на микроносителях, которые дают подходящие реакции. Эта стадия расщепления естественно увеличивает время и усилия, необходимые для определения результатов тестов.
Поэтому необходимо разработать простые пути идентификации отдельных микроносителей в большой группе других идентичных микроносителей, особенно пути кодирования большего числа уникальных кодов, которые нет необходимости прикреплять в качестве инородных тел к поверхностям микроносителей.
Краткое изложение существа изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание микроносителя, который кодируется без необходимости прикрепления инородного элемента, служащего в качестве кода, к поверхности микроносителя. Другой задачей настоящего изобретения является создание способа кодирования микроносителей, который имеет по существу неограниченные возможности по отношению к разнообразию уникальных кодов, которые могут быть записаны на микроносителях и прочитаны на них.
Поставленная задача решается путем создания микроносителей, имеющих коды, записанные на них, и способов кодирования микроносителей. Предпочтительными микроносителями являются микроносители, содержащие вещества, способные обесцвечиваться, например, флуоресцентные молекулы. Способ кодирования микроносителей включает воздействие на микроносители, содержащие вещество, способное обесцвечиваться, светового излучения от источника с высоким пространственным разрешением для обесцвечивания кодов на микроносителях. Этот способ может предпочтительно включать обесцвечивание кодов на флуоресцентных носителях, где обесцвечивание производится либо на одном и том же, либо на разных уровнях интенсивности флуоресценции внутри обесцвечиваемых частей кода. Еще одним предпочтительным способом кодирования микроносителей является запись кодов внутри микроносителей.
В еще одном варианте реализации большие количества химических соединений или биологических молекул связывают с соответствующим большим числом микроносителей, связанные с микроносителем лиганды смешивают и реагируют одновременно в соответствии с протоколом отбора или испытаний, и те лиганды, которые реагируют, идентифицируют путем считывания кода на микроносителях, с которыми они связываются.
Закодированные микросферы согласно изобретению дают возможность проводить одновременно анализ большого числа анализируемых материалов в отдельном реакционном сосуде с использованием одной аликвоты образца. Использование заявленных микроносителей в высокопроизводительном способе анализа и реакциях позволяет получить значительные преимущества по сравнению с использованием технологии пластины микротитров.
Микроносители согласно изобретению также позволяют использовать фактически неограниченное число кодов, которые могут быть записаны и прочитаны на микросферах, и поэтому превосходят известные микроносители, закодированные с цветными или флуоресцентными метками, которые имеют ограниченное число возможностей кодирования. Микроносители согласно изобретению также превосходят микроносители, закодированные с элементами, прикрепленными к поверхностям микроносителей. Это происходит потому, что записи на микроносителях согласно изобретению не имеют риска, связанного с тем, что известные микроносители потенциально мешают взаимодействию анализируемого вещества/лиганда, на поверхностях микроносителей.
Дополнительные особенности и преимущества изобретения представлены в следующем описании.
Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, на которых:
Фиг.1 изображает схему проведения известного микрофотолиза и сканирующего микрофотолиза (SCAMP);
Фиг.2а и 2b изображают код в виде полос и код в виде колец с различными интенсивностями, причем каждая интенсивность обозначается различными цветами, согласно изобретению;
Фиг.3а и 3b - конфокальные изображения средней плоскости микросферы из декстран-метакрилата (FD148-dex-ma) до и после обесцвечивания полосы 3 мкм на расстоянии приблизительно 10 мкм под поверхностью микросферы согласно изобретению;
Фиг.4 - диаграммы флуоресцентного восстановления FD148 в 148-dex-ma микросферах (А) и флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) в dex-ma микросферах с FITC за счет погружения в раствор с FITC (В) согласно изобретению;
Фиг.5 - конфокальное изображение средней плоскости FD148-dex-ma микросферы после обесцвечивания произвольной геометрии с помощью SCAMP согласно изобретению;
Фиг.6а и 6b - конфокальные изображения средней плоскости в FITC-маркированном шарике 45 мкм из латекса один час спустя после обесцвечивания кода в виде полос (фиг.6а) и кода в виде полос плюс числа (фиг.6b) согласно изобретению;
Фиг.7 - конфокальное изображение средней плоскости в FITC-маркированном шарике 45 мкм из латекса один час спустя после обесцвечивания кода R1247 согласно изобретению;
Фиг.8 - конфокальное изображение средней плоскости в FITC-маркированном шарике 45 мкм из латекса один час спустя после обесцвечивания эмблемы Гентского университета согласно изобретению;
Фиг.9 - конфокальное изображение средней плоскости в FITC-маркированном шарике 45 мкм из латекса один час спустя после обесцвечивания фирменного знака компании Tibotec согласно изобретению;
Фиг.10а - конфокальное изображение кодов, обесцвеченных по отношению к разным интенсивностям, и фиг.10b-10d - диаграммы различных интенсивностей в кодах согласно изобретению;
Фиг.11а и 12а - конфокальные изображения кодов, обесцвеченных по отношению к разным интенсивностям, согласно изобретению; и
Фиг.11b и 12b - диаграммы различных интенсивностей в кодах согласно изобретению.
Согласно настоящему изобретению микроносители имеют коды, записанные на них. Микроносители могут быть выполнены из любых материалов, которые обычно используются в технологии высокопроизводительного отбора и диагностике. Например, микроносители могут быть выполнены из твердого материала, полутвердого материала и комбинации твердого и полутвердого материала. Примерами этих материалов могут быть латекс, полистирол, поперечно-сшитые декстраны, метилстирол, поликарбонат, полипропилен, целлюлоза, полиакриламид и диметилакриламид. Предпочтительные материалы включают латекс, полистирол и поперечно-сшитые декстраны. Микроносители могут быть прокариотными или эукариотными клетками.
Микроносители могут иметь любую форму и размер, пригодные для кодирования и использования микроносителей. Например, микроносители могут иметь форму сфер, или бусинок, которые необязательно являются сферическими. Микроносители могут быть цилиндрическими или овальными по форме. Если они имеют сферическую форму, то они могут иметь диаметр от 1 до 200 мкм.
Коды, записанные на микроносителях, могут иметь любую геометрию, дизайн или символы. Например, коды могут быть записаны как числа или буквы, или как коды в форме символов, картин, кодов в виде полос, кодов в виде колец или трехмерных кодов. Коды в виде колец аналогичны кодам в виде полос, за исключением того, что используются концентрические окружности, а не прямые линии. Кольцо может содержать информацию, такую же как одна полоса. Коды могут быть записаны на поверхности микроносителей или внутри микроносителей. Например, коды могут быть записаны внутри микроносителей, и, более конкретно, в центральной плоскости микроносителей. В зависимости от формы микроносителей центральная плоскость может быть предпочтительной для записи кодов, потому что она может обеспечивать наибольшую площадь поверхности для записи. Кроме того, для микроносителей, имеющих искривленные поверхности, более преимущественной может быть запись кодов внутри носителя, а не на искривленных поверхностях. Часто более удобно записывать и читать коды на плоской поверхности, а не на искривленной поверхности.
Микросферы согласно изобретению могут содержать вещество, способное обесцвечиваться, и коды на микроносителях могут быть в форме обесцвеченных изображений внутри частей микроносителей, способных обесцвечиваться. Микроносители могут содержать вещество, способное обесцвечиваться либо на поверхности микроносителя, либо внутри микроносителя. Любая ссылка в этой заявке на обесцвечивание веществ “на” микроносителях включает обесцвечивание на поверхности микроносителя и внутри микроносителя. Предпочтительные способные обесцвечиваться вещества включают способные обесцвечиваться вещества, поглощающие флуоресцентное или электромагнитное излучение. Микроносители могут содержать люминофоры, способные обесцвечиваться. Примерами люминофоров, которые могут использоваться, являются флуоресцирующие вещества, фосфоресцирующие вещества, сцинтилляторы. Могут использоваться способные обесцвечиваться хемилюминесцентные, биолюминесцентные вещества или окрашенные вещества. Вещества, способные обесцвечиваться, могут представлять собой флуоресцеин-изотиоцианат (FITC), фикоэритрины, кумарины, люцифер желтый и родамин. Вещества, способные обесцвечиваться, должны выбираться таким образом, что, когда происходит обесцвечивание, код остается на микроносителе в течение периода времени, который требуется для использования микроносителей и считывания кодов. Таким образом, диффузия необесцвеченных молекул в обесцвеченные области в допустимых пределах является приемлемой на протяжении срока службы кода.
Коды, обесцвеченные на микроносителях, могут быть записаны таким образом, чтобы они имели различную интенсивность флуоресценции или цвет внутри обесцвеченных областей микроносителей. Например, кодирование с обесцвечиванием может содержать несколько различных степеней обесцвечивания, тем самым давая несколько различных интенсивностей флуоресценции внутри всей области обесцвечивания. Микроносители могут кодироваться не только за счет геометрии изображения, обесцвеченного на микроносителях, но также за счет использования различной интенсивности флуоресценции внутри изображения.
В другом аспекте изобретение относится к способу записи кодов на микроносители. Указанный способ может быть использован для записи кодов как на поверхности микроносителей, так и внутри микроносителей. Коды могут быть записаны на микроносителях, например, путем использования источника светового излучения с высоким пространственным разрешением, такого как лазер, лампа, или источник, который излучает рентгеновские лучи, α- и β-лучи, ионные пучки, или имеет форму электромагнитного излучения. Коды также могут быть записаны на микроносителях путем фотохромирования или химического травления. Предпочтительный способ записи кодов - использование источника светового излучения с высоким пространственным разрешением и, в частности, лазера или лампы в комбинации с конфокальным микроскопом. Другой предпочтительный способ для записи кодов состоит в обесцвечивании кода в обесцвечивающемся веществе микроносителя. Предпочтительные вещества, способные обесцвечиваться, включают вещества, определенные выше в описании микроносителей, и флуоресцентные молекулы. Объем материала может быть обесцвечен внутри микроносителей, один пример такого объема находится между одним кубическим нанометром и восемью кубическими миллиметрами микроносителя.
Предпочтительным способом записи кодов на микроносители является использование сканирующего микрофотолиза (SCAMP). Технические особенности SCAMP впервые были описаны Wedekind и др. в статье “Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging”. Journal of Microscopy, vol.176, pp.23-32 (1994). В статье раскрыто использование SCAMP для обесцвечивания и визуализации изображений в тонком флуоресцентном слое лака для ногтей. В статье не предполагается использование SCAMP для кодирования носителей.
Мы использовали SCAMP для записи кодов на микроносители за счет обесцвечивания флуоресцентных молекул внутри микроносителей. Фотообесцвечивание хорошо известно в технике и относится к исчезновению цветов из-за того, что определенные длины волн света при освещении данного красителя будут заставлять молекулы красителя резонировать и разрушаться случайным образом. Это является причиной того, почему флуоресцентные молекулы часто имеют тенденцию обесцвечиваться при возбуждении мощным лазерным пучком конкретной длины волны.
На протяжении многих лет использовались методики флуоресцентного микрофотолиза (МР), также называемые флуоресцентным восстановлением после фотообесцвечивания (FRAP), для изучения подвижности флуоресцентных молекул как в биологических средах, таких как клетки и ткани, так и в небиологических средах (см. например, Peters and Scholtz, “Fluorescence pho-tobleaching techniques” in New Techniques of Optical Microscopy and Microspectroscopy, R.J.Cherry (ed.), MacMillan, New-York, pp.199-228 (1991); De Smedt et al., “Structural Information on Hyaluronic Acid Solutions as Studied by Probe Diffusion Experiments”, Macromolecules, vol.27, pp.141-146 (1994), De Smedt et al., “Diffusion of Macromolecules in Dex-tran Methacrylate Solutions and Gels as Studied by Confocal Scanning Laser Microscopy”, Macromolecules, vol.30, pp.4863-4870 (1997)).
Подвижность флуоресцентных молекул может быть измерена при обесцвечивании (фотолизинге) флуоресцентных молекул, двигающихся в фокальной плоскости светового пучка, который может быть лазерным пучком (фиг.1: А, В). Непосредственно после короткого процесса обесцвечивания, обычно длящегося приблизительно десять миллисекунд, сильно ослабленный лазерный пучок измеряет восстановление флуоресценции в области, подвергавшейся воздействию фотообесцвечивания благодаря диффузии флуоресцентных молекул из окружающих необесцвеченных областей в обесцвеченную область (фиг.1: В, С). Характеристическое время диффузии, мера для коэффициента диффузии и доли соответственно неподвижных и подвижных флуоресцентных молекул могут быть получены из восстановления флуоресценции в обесцвеченной области (фиг.1: D).
Доля подвижных молекул R определяется как
где F(i) - интенсивность флуоресценции обесцвеченного пятна перед обесцвечиванием, F(0) - интенсивность флуоресценции обесцвеченного пятна сразу после обесцвечивания, F(∞) - интенсивность флуоресценции обесцвеченного пятна через длительное время после обесцвечивания.
В опытах по фотообесцвечиванию, использующих традиционный несканирующий световой микроскоп, стационарный (лазерный) световой пучок фокусируется на образце во время обесцвечивания и восстановления. Стационарное расположение (лазерного) светового пучка в ходе обесцвечивания приводит к появлению фотообесцвеченной области, которая имеет круговую геометрию. Хотя несканирующие световые микроскопы технически дают в диаметре освещенную область величиной 2 мкм или менее, расширение обесцвеченного пятна часто происходит из-за стационарного лазерного пучка. В результате это приводит к большим круглым обесцвеченным пятнам, которые обычно составляют 10-20 мкм в диаметре или даже больше, как схематически показано на фиг.1: B-II.
Сканирующие микроскопы на основе лазерного излучения открыли новые возможности для микрофотолиза. Сочетание фотолиза, сканирования пучка и конфокальной микроскопии приводит к развитию SCAMP. В SCAMP обесцвечивание происходит в ходе сканирования образца за счет переключения между низким уровнем интенсивности лазера с мониторингом и высоким уровнем интенсивности с фотообесцвечиванием менее чем за микросекунду при использовании устройства с интенсивной модуляцией, такого как акустооптический модулятор (“АОМ”). Сочетание обесцвечивания в ходе сканирования и использование АОМ, который генерирует экстремально короткие обесцвечивающие импульсы, предотвращает расширение обесцвеченного пятна, которое происходит в традиционном микрофотолизе из-за большего времени фотообесцвечивания и стационарности лазерного пучка. SCAMP позволяет осуществлять в образце обесцвечение пятен размером менее микрометра.
На фиг.1 схематически показано, как осуществляется SCAMP для измерения подвижности флуоресцентных молекул. Во-первых, флуоресценция вдоль одной х-линии плоскости, представляющей интерес в образце, измеряется путем сканирования этой линии (фиг.1: А - точечная линия). Во-вторых, маленький сегмент (например, 3 мкм) на этой х-линии, в котором должна измеряться диффузия, выделяется для того, чтобы обесцвечиваться (фиг.1: B-I). Длина, положение, так же, как и число сегментов, свободно выбираются путем компьютерных программ SCAMP. Фотообесцвечивание этого сегмента происходит в то время, когда лазерный пучок сканирует этот сегмент при наличии временного сильного увеличения интенсивности лазерного пучка. Обычно соотношение между уровнями интенсивности мониторинга и фотообесцвечивания лазерного пучка больше, чем 100.
Поскольку SCAMP осуществляет использование конфокального микроскопа, детектирование флуоресценции возможно не только на поверхности образца, но также на произвольной глубине образца со слабым препятствием за счет рассеянного излучения с уровней образца вне фокуса (как происходит в традиционном микроскопе). В противоположность этому, когда используется флуоресцентная лампа для освещения и традиционный (нефокальный) микроскоп, имеется возможность обычно наблюдать только поверхность шариков. Кодирование на глубине является довольно сложным процессом для наблюдения с помощью традиционного микроскопа, но становится хорошо заметным при использовании конфокальных оптических устройств. Как конфокальные, так и сканирующие особенности микроскопа позволяют осуществлять фотолизинг и считывать микрообласти при хорошо определенных положениях внутри микроносителя. Это изобретение четко отличается от всех других, описанных ранее, например, тем, что при использовании SCAMP с высоким пространственным разрешением можно безвозвратно пометить микросферы внутри, на конкретной глубине и считать это кодирование с помощью конфокальной методики.
Способы записи кодов на микроносителях также могут включать обесцвечивание микроносителей для получения различных уровней интенсивности в веществах, обесцвеченных в коде. Кроме того, при передаче информации в конструкцию самого кода, информация также может быть передана с различной интенсивностью внутри обесцвеченных изображений. Возможность кодировать микроносители с различными интенсивностями позволяет использовать меньше кодов на микроносителях, сохранить пространство, но при этом передавать то же самое или большее число уникальных идентификаторов для кодирования микроносителей. Согласно изобретению возможно обесцветить и получить четыре различных интенсивности в шариках. Это можно выполнить несколькими способами, например, повторением обесцвечивания в некоторых частях шарика по отношению к другим частям или путем диссипации различных уровней акустической мощности в АОМ для получения множества различных лазерных мощностей, которые будут создавать обесцвеченные изображения, имеющие различные интенсивности на основе мощности лазерного излучения, используемого для каждой части кода. На фиг.2а и 2b показаны два примера кодов, обесцвеченных при использовании различных интенсивностей, один из них имеет изображение в виде полос, другой - в виде колец. Различные интенсивности в кодах представлены различными цветами на чертежах. Различные уровни интенсивности могут быть совмещены с различной шириной кодирующих элементов, таких как полосы, в кодах в виде полос.
Другой вариант реализации изобретения относится к считыванию кодов закодированных микросфер. Считывание кодов может осуществляться с помощью обычного микроскопа, если код расположен на поверхности микроносителя, или, если микроноситель является достаточно светопрозрачным, внутри микроносителя. Считывание кодов также может осуществляться при использовании конфокального микроскопа. В частности, коды могут считываться при временном погружении микроносителей в водную среду, при размещении микроносителей между двумя предметными стеклами или размещении носителей в микрокапиллярах и наблюдение кодов через микроскоп или конфокальный микроскоп.
Другой вариант реализации изобретения относится к способам использования закодированных микросфер согласно изобретению. Микроносители могут использоваться в качестве носителей для измерения биомолекулярных взаимодействий, для нахождения лекарственных препаратов, для тестов на связывание рецепторов в терапии, медицинской диагностике, в комбинаторной химии, для выделения и очистки целевых молекул, захвата и детектирования макромолекул в аналитических целях, селективного удаления загрязнений, ферментативного катализа, химической модификации, реакции гибридизации и применения в судебной медицине.
Микроносители могут использоваться в качестве подложек для химических и биологических опытов и синтеза. В этом случае микроносители могут содержать один или более лигандов, связанных с поверхностью микроносителей. Микроносители со связанными лигандами затем могут приводиться в контакт с целевыми анализируемыми препаратами для определения присутствия или отсутствия целевых анализируемых препаратов, представляющих интерес, или могут служить как носители для реакций комбинаторной химии, осуществляемых на основе лиганда, связанного с микроносителем. Примеры целевых анализируемых препаратов для лигандов, связанных с микроносителями, включают антигены, антитела, рецепторы, гаптены, энзимы, протеины, пептиды, нуклеиновые кислоты, лекарственные препараты, гормоны, патогены, токсины или любые другие химикаты или молекулы, представляющие интерес. Связан ли лиганд с микроносителем или реагирует с целевым анализируемым препаратом, можно определить с помощью известных методик. Например, реакция может проявляться с помощью люминометрического отклика. Реакция может проявляться с помощью колориметрического, хемилюминометрического или флюринометрического отклика. Лиганд, связываемый с микроносителем, представляющим интерес, может быть сконструирован таким образом, чтобы в присутствии анализируемых препаратов, представляющих интерес, на который он нацелен, оптическая характеристика микросферы изменялась. Например, такое изменение оптической характеристики может быть результатом фотохимической реакции, которая происходит, когда связывание или реакция имеет место между лигандом и анализируемым препаратом. Микроносители затем можно наблюдать под микроскопом для детектирования флуоресценции, сопровождающей фотохимическую реакцию.
Широкий спектр химических и биологических функциональных характеристик может быть закреплен за микроносителями изобретения в качестве лигандов. Эти функциональные характеристики включают все характеристики, которые регулярно используются в технологии высокопроизводительного отбора и диагностики. Лиганды могут прикрепляться к микроносителям за счет средств, обычно используемых для прикрепления лигандов к микроносителям, включающим средства ковалентной связи и путем непосредственного прикрепления или прикрепления через линкер. Кроме того, микроносители могут быть функционализированы для возможности прикрепления начального реагента.
Микроносители согласно изобретению могут использоваться в способах детектирования наличия или отсутствия одного или более целевых анализируемых препаратов в образце, который содержит контактирующий лиганд со связанным микроносителем по меньшей мере с одним анализируемым материалом, для детектирования того, прореагировал ли анализируемый препарат с лигандом или присоединился к нему, и считывания кода любого микроносителя, при котором произошла любая реакция или связывание.
Более конкретно, изобретение относится к способу детектирования наличия или отсутствия одного или более анализируемых препаратов в образце, который содержит выбор одного или более лигандов, которые связываются или реагируют с одним или более анализируемым препаратом, связывание лигандов со множеством микроносителей, корреляцию идентичности лигандов с кодами микроносителей, к которым присоединены лиганды, контактирование одного или более анализируемых препаратов с микроносителями со связанными лигандами, наблюдение любых микроносителей, для которых анализируемый препарат связывается или реагирует с лигандом со связанным микроносителем, и считывание кодов микроносителей для идентификации любых лигандов, с которыми один или более анализируемых препаратов прореагировали, посредством чего определяется наличие или отсутствие одного или более анализируемых препаратов.
В предпочтительном варианте способа целевой анализируемый материал представляет собой нуклеиновую кислоту, в частности, дезоксирибонуклеиновую кислоту (DNA) или рибонуклеиновую кислоту (RNA), и при этом по меньшей мере один лиганд со связанным микроносителем является противоположным представлением нуклеиновой кислоты. Таким образом, микроносители согласно изобретению являются полезными в гибридизации дезоксирибонуклеиновой кислоты. Микроносители также являются полезными для тестирований на основе энзимов и иммунотестирований. Микроносители также могут быть использованы в тестах, проводимых для отбора определенных соединений в образцах и также для детектирования и изоляции соединений из этих образцов. Микроносители также могут быть использованы как носители для создания или как реагенты комбинаторной химической библиотеки.
Микроносители согласно изобретению также могут использоваться в способах и устройствах у применяемых для эффективного и быстрого отбора большого числа компонентов, когда разнообразие может состоять в том, что присутствует либо лиганд, связанный с микроносителем, либо растворимый компонент анализируемого препарата, либо они оба, когда интересуются определением того, произошло ли взаимодействие между двумя компонентами. Устройства включают микроматрицу, такую как твердая подложка, на которой размещены связанные лиганды в заданной регистрации и считыватель для детектирования взаимодействия между компонентами. Способ может включать изготовление такой микроматрицы, например, как твердая подложка для прикрепления лиганда, затем совмещение лиганда и анализируемого материала для осуществления любого взаимодействия между компонентами и последовательного определения наличия взаимодействия между компонентами и конкретного местоположения.
Микроматрица обычно содержит множество различных компонентов. Теоретически необходим только один компонент, но существовать может более 105 компонентов. В то время как число компонентов обычно не превышает 105, число индивидуальных закодированных микроносителей может быть существенно больше.
Связанный лиганд может быть, например, органическим объектом, таким как отдельная молекула или группы молекул, лиганды и рецепторы, связанные компоненты нуклеиновых кислот, рибонуклеиновая кислота, белки, связывающие однонитевые и двунитевые ДНК, которые не требуют присутствия связывающего лиганда, присоединенного к нуклеиновой кислоте, олигонуклеотидам, белкам.
Закодированные микроносители в микроматрице могут располагаться на треках. Головки создаются для определения местоположения так, чтобы конкретные взаимодействия могли быть быстро определены. В частности, диски, имеющие круговые треки, обеспечиваются головками, определяющими местоположение на треках, так, что положительные сигналы могут быть интерпретированы по отношению к информации, создаваемой головкой. Круговые треки являются предпочтительно концентрическими и имеют поперечное сечение в диапазоне от 5 до 5000 мкм. Возможны различные модификации, такие как заданные заранее сегменты, которые затем могут быть прикреплены к диску для тестирования.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется примерами, которые показывают квалифицированному специалисту, как можно применять изобретение на практике. Примеры являются просто иллюстрацией изобретения и описывают различные выгодные свойства определенных вариантов реализации.
Пример 1
Декстран-метакрилат (“dex-ma”), используемый для изготовления dex-ma микросфер, был синтезирован и отличается тем, что описано подробно в W.N.E. van Dijk-Wolthius et al., “Reaction of Dextran with Glycidyl Methacrylate: An Unexpected Transesterification”, Macromolecules, vol.30, pp.3411 to 3413, 1997. Dex-ma микросферы изготавливались путем полимеризации радикалов с использованием N,N,N’,N’-тетраметилена-этилендиамина и персульфата калия из эмульсии декстран-метилкрилата/полиэтиленгликоля (PEG) (Stenekes et al. The Preparation of Dextran Microspheres in an All-Aqueous System: Effect of Formulation Parameters on Particle Characteristics”, Pharmaceutical Research, vol.15, pp.557-561, 1998). Концентрация раствора декстран-метилкрилата (в фосфатном буфере при рН 7) составляла 10% (маc./маc.). Степень замещения dex-ma, которая представляет собой число молекул метакрилата на 100 гликопиранозильных звеньев, составляла 4. Концентрация раствора PEG в фосфатном буфере при рН 7 составляла 24% (маc./маc.), а средняя молекулярная масса составляла 10000 г/моль (Merck). Одну порцию микросфер (FD148-dex-ma) готовили в присутствии декстрана (имеющего молекулярную массу 14800 г/моль), маркированного флуоресцеин-изотиоцианатом. Вторую порцию микросфер загружали с флуоресцеин-изотиционатом (FITC) путем погружения dex-ma микросфер, после полного изготовления в раствор FITC (0,01 мг/моль в фосфатном буфере при рН 7,2). Как FD 148, так и FITC были приобретены у фирмы Sigma. SCAMP эксперименты осуществлялись на обеих порциях микросфер, как объясняется в примере 2.
Пример 2
SCAMP был установлен на сканирующем конфокальном лазерном микроскопе Bio-Rad MRC1024 (CLSM), аналогично публикации Wedekind et al., “Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging”. Journal of Microscopy, vol.176, pp.23-32 (1994) и Wedekind et al., “Line-Scanning Microphotolysis for Dif-fraction-Limited Measurements of Lateral Diffusion”, Biophysical Journal, vol.71, pp.1621-1632 (1996). 40-кратный иммерсионный объектив и мощный (2 Вт) (представляющий максимальный возможный выход) аргоновый лазер (Spectra Physics 2017), используемый для получения достаточного фотообесцвечивания в ходе экстремально короткого времени обесцвечивания, использовались в SCAMP экспериментах на dex-ma микросферах, изготовленных в соответствии с примером 1. Длина волны лазерного излучения в ходе обесцвечивания составляла 488 нм.
В этом примере SCAMP эксперименты осуществлялись приблизительно на 10 мкм ниже поверхности dex-ma микросфер. Эксперимент осуществлялся следующим образом. Во-первых, флуоресценция вдоль х-линии средней плоскости dex-ma микросферы измерялась путем сканирования этой линии в течение 400 миллисекунд (фиг.1: А - точечная линия). Во-вторых, выбирался сегмент этой х-линии длиной 3 мкм для обесцвечивания (фиг.1: B-I). Длина, положение и число сегментов выбирались с помощью компьютерных программ SCAMP. Фотообесцвечивание сегмента происходит в то время, когда лазерный пучок сканирует сегмент при наличии временного сильного увеличения интенсивности лазерного пучка. Соотношение между уровнями интенсивности фотообесцвечивания и мониторинга лазерного пучка составляло 1:500. Для измерения восстановления флуоресценции в обесцвеченной полосе сильно ослабленный лазерный пучок сканировал вдоль выбранной х-линии приблизительно 4 секунды.
На фиг.3а и 3b показаны конфокальные изображения средней плоскости в FD148-dex-ma микросфере соответственно перед обесцвечиванием и через 2 минуты после обесцвечивания сегмента длиной 3 мкм. Диаметр микросферы приблизительно 25 мкм. Более позднее изображение показывает, что обесцвеченное пятно остается темным, что указывает на то, что после 2 минут не происходит восстановления флуоресценции в обесцвеченной области микросферы. На фиг.4 (кривая А) показано, что флуоресценция в обесцвеченном сегменте этого эксперимента не восстановилась, что позволило сделать вывод о том, что в рамках временной шкалы эксперимента “большие” FD148 цепочки были полностью зафиксированы в области dex-ma микросферы, которая изучается.
В то время как FD148 цепочки могут быть пространственно захвачены в полимерную dex-ma сеть, но поскольку они существовали в ходе формирования микросфер, они не могли существовать для малых молекул FITC, когда их загружали в dex-ma микросферы путем погружения полностью полимеризованных dex-ma микросфер в раствор FITC. В этом случае ожидалось и экспериментально подтвердилось полное восстановление флуоресценции. На фиг.4 (кривая В) показано, что FITC молекулы, расположенные под поверхностью микросферы на расстоянии примерно 10 мкм, остаются подвижными.
Кроме технической возможности фотообесцвечивания малых сегментов в образце, использование сканирующих микроскопов направлено на конкретный выбор микрообластей в образце, где должно проходить обесцвечивание, когда лазерный пучок может быть расположен локально. Кроме того, поскольку длина, расположение и число сегментов выбираются произвольно в SCAMP экспериментах, любой вид геометрии в образце может быть фотообесцвечиваемым. На фиг.5 показано конфокальное изображение в средней плоскости FD148 dex-ma микросферы через 2 минуты после обесцвечивания поперечного сечения, круга и прямоугольника в микросферах.
Пример 3
SCAMP эксперименты также осуществлялись для маркированных FITC латексных шариков размером 45 мкм, поставляемых фирмой PoylaB, Антверпен, Бельгия. SCAMP устанавливался на Bio-Rad MRC1024 CSLM, в соответствии с работой Wedekind et al. (1994) и Wedekind et al., 1996. 100-кратный объектив и мощный аргоновый лазер (Spectra Physics 2017), используемые для получения достаточного фотообесцвечивания в ходе экстремально коротких времен обесцвечивания, применялись в ходе SCAMP экспериментов на маркированных FITC латексных шариках размером 45 мкм. Интенсивность лазера была установлена равной 300 мВт, что приводило к интенсивности лазера при мониторинге и фотообесцвечивании соответственно 75 Вт и 20 мВт (измеряемой на конце оптического волокна, которое запускает лазерный пучок в конфокальный сканирующий лазерный микроскоп). Соответственно соотношение между интенсивностью лазера при фотообесцвечивании и мониторинге составляло 1:266. Длина волны лазерного пучка при обесцвечивании составляла 488 нм.
SCAMP измерения осуществлялись в средней плоскости FITC маркированных латексных шариков размером 45 мкм. Получалось следующее. Во-первых, изображение меняло масштаб до тех пор, пока латексный шарик полностью не закрывал картинку. Во-вторых, определялась интересующая метка и с помощью SCAMP компьютерных программ отмечалось, где метка должна быть обесцвечена на латексном шарике. Маркировку осуществляли в то время, когда лазерный пучок сканировал в средней плоскости FITC маркированных латексных шариков размером 45 мкм. Временное сильное увеличение интенсивности лазерного пучка (с 75 Вт до 20 мВт) происходило, когда лазерный пучок сканировал сегменты, которые должны были быть обесцвечены для создания интересующей метки. Поскольку сканирование происходило для х-линии за 6 мс (фиг.1А), и поскольку одно изображение конфокальной плоскости (т.е. средней плоскости латексного шарика) составляет 512 “х-линий”, требуется 3,072 секунды для маркировки латексного шарика.
На фиг.6-9 показаны конфокальные изображения средней плоскости FITC маркированных латексных шариков размером 45 мкм один час спустя после обесцвечивания кода в виде полос (фиг.6а), кода в виде полос плюс числа (фиг.6b), числа R1247 (фиг.7), эмблемы университета Гента (фиг.8) и товарного знака компании Tibotec (фиг.9). Изображения показывают, что обесцвеченные сегменты остаются темными, что свидетельствует о том, что не произошло значительного восстановления флуоресценции в обесцвеченных сегментах латексных шариков.
Величины выбора масштабирования конфокального сканирующего лазерного микроскопа Bio-Rad MRC1024 были следующими: 1,61 на фиг.6а, 1,00 на фиг.6b, 3,07 на фиг.7, 1,00 на фиг.8 и 1,00 на фиг.9. Высокое пространственное разрешение SCAMP по отношению к обесцвеченным меткам наблюдалось на фиг.6а и 6b. Метка на фиг.6а составлена из 3 различных типов линий: одна с большой шириной (2,5 мкм), одна со средней шириной (1,25 мкм) и одна с малой шириной (0,62 мкм). Все линии располагаются на расстоянии 1, 25 мкм друг относительно друга.
Пример 4
Следующие эксперименты демонстрируют способы обесцвечивания кодов во флуоресцентных микроносителях, где коды содержат различные уровни интенсивности из-за различных степеней обесцвечивания. Микроносители, используемые в следующих экспериментах, представляли собой FITC маркированные латексные шарики размером 45 мкм, выпускаемые фирмой Polyla в Антверпене, Бельгия.
Для одной серии экспериментов по обесцвечиванию использовалось 60-кратное усиление и мощность лазера 300 мВт для получения изображений, показанных на фиг.10а. Квадраты в верхнем ряду имеют ширину 32 пикселя (=2,46 мкм) в программе и разделяются другими 32 пикселями. Обесцвечивание реально их увеличивает. Квадраты в нижнем ряду составляют половину этого размера.
Как показано на фиг.10а, возможно обесцвечивание с получением нескольких интенсивностей. Предположим, например, что уровень плато составляет 200 в отношении аналоговых единиц к цифровым (“ADU”), обесцвечивание возможно по меньшей мере от около 50 до 200 ADU. Следовательно, уровни могут быть обесцвечены на интервале приблизительно 25% от первоначальной интенсивности флуоресценции. Фотография фиг.10а позволяет обнаружить, например, что возможны 6 уровней обесцвечивания. Такие шесть уровней обесцвечивания очевидны, если исходить из шести квадратов, обесцвеченных в верхнем ряду фиг.10а. Интенсивности флуоресценции этих квадратов показаны на графике фигуры 10с. Шесть квадратов с различной интенсивностью флуоресценции получались повторением обесцвечивания (от 1 до 6 раз). Использование шести кодовых местоположений, имеющих шесть различных уровней интенсивности флуоресценции, позволяет иметь 66 или 46656 различных кодов.
Серии десяти меньших обесцвеченных квадратов, показанных на фиг.10а, позволяют четко обнаружить, что обесцвечивание за счет повторного сканирования не является линейным. Эти квадраты являются по ширине только половиной от предыдущих квадратов, но остаются ясно различимыми. Уровни интенсивности для этих меток показаны на фиг.10d. Наконец, интенсивность отдельного обесцвеченного пятна между двумя рядами шести и десяти местоположений кодирования показана на фиг.10b.
Второй эксперимент был проведен для обесцвечивания кода с 8 местоположениями кодирования (ширина в программе одной полосы = 24 пикселя · 0,069 мкм/пиксель = 1,66 мкм; разделена другими 24 пикселями) и 8 различными интенсивностями (дает возможность существовать 88=16777216 различным кодам). Мощность выходного лазерного пучка выбирается равной 200 мВт. Фотография микроносителя иллюстрируется на фиг.11а, а диаграмма, показывающая различные уровни интенсивности индивидуальных кодов, показана на фиг.11b. Различные интенсивности четко видны. Этот код представляет собой число 15263748.
На фиг.12а и 12b показан другой вариант реализации восьми местоположений кодирования, имеющих восемь различных интенсивностей. В этом случае обесцвечивание осуществлялось с мощностью 250 мВт вместо 200 мВт, как в предыдущем случае, и оно проходило при использовании 0,056 мм/пиксель. Код в этом примере был 13265874. Фотография кодов и диаграммы различных интенсивностей кодов показаны на фиг.12а и 12b соответственно.
Реферат
Изобретение относится к кодированному микроносителю, который закодирован с помощью сохраняемого кода, записанного путем обесцвечивания флуоресцентных молекул на поверхности или внутри микроносителя при помощи воздействия на микроноситель светового излучения от источника с высоким пространственным разрешением. Также изобретение относится к способу кодирования микроносителя путем обесцвечивания флуоресцентных молекул и способу считывания кодированного микроносителя с помощью конфокального микроскопа. Микроносители по изобретению предназначены для использования в химическом и биологическом тестировании и синтезе. 3 с. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил.
