Способ выбора пищевого рациона, обеспечивающего получение молока, обладающего иммуностимулирующим действием - RU2545377C2

Чертежи

Показать все 79 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу выбора пищевого рациона, обеспечивающего получение молока, обладающего иммунорегуляторным действием, который может использоваться в областях продуктов питания, кормов для животных и тому подобном.

Уровень техники

Иммунитет живых организмов функционирует по существу с целью «защиты» против внешних воздействий. Например, «защитой» являются упреждение и устранение раковых клеток, и усиление иммунитета в таком случае действует эффективно.

С другой стороны, сверхответ иммунитета, т.е. «гипериммунитет» может отрицательно влиять на живые организмы. К примерам этого относятся аллергические реакции, аутоиммунные заболевания, хроническое воспаление и тому подобное. Известно, что в таком случае симптомы смягчаются при супрессии продукции провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, TNF-α и IL-1.

Кроме того, становится понятно, что иммуностимулирующие воздействия, функционирующие с целью «защиты» против внешних воздействий, и иммуносупрессивные воздействия, функционирующие для супрессии аллергических реакций, аутоиммунных заболеваний, хронического воспаления и т.д., индуцированных гипериммунореакцией, регулируются посредством микроРНК (далее также обозначаемой как «miRNA»).

После транскрипции miRNA с генома она дважды подвергается расщеплению и становится некодирующей малой РНК размером около 22 нуклеотидов. Известно, что в качестве своей функции она связывается с 3'-нетранслируемым регионом мРНК-мишеней по принципу комплементарности последовательностей, супрессируя трансляцию мРНК-мишеней. Один из видов miRNA ингибирует трансляцию большинства видов мРНК в клетке, регулируя большое число функций клетки. Особенно много сообщений было сделано по ее связи с развитием и прогрессированием рака и связи между miRNA и заболеваниями, привлекающими внимание.

Например, в отношении miR-181 было сообщено, что она включена в развитие В-клеток, активацию Т-клеток и становление иммунитета (непатентные документы 1-3).

В отношении miR-155 известно, что она вовлечена в развитие иммунитета через активацию врожденного иммунитета (непатентные документы 1-4) и регуляцию дифференциации и функций Т-клеток и В-клеток (непатентные документы 1-5) и она вовлечена в противоаллергическое и противовоспалительное действие за счет регуляции баланса Th1/Th2 (непатентные документы 1-6) и поддержание функций регуляторных Т-клеток, которые супрессируют гипериммунореакции (непатентный документ 7).

miR-17 и miR-92 взаимодействуют, регулируя дифференцировку и развитие В-клеток и Т-клеток, и таким образом принимают участие в развитии иммунитета (непатентные документы 1, 8 и 9).

Известно, что miR-223 принимает участие в иммунитете, контролируя пролиферацию и активацию нейтрофилов (непатентные документы 1-10), miR-150 принимает участие в иммунитете, супрессируя дифференциацию В-клеток (непатентный документ 1 и 11), и let-7i принимает участие в иммунитете, контролируя экспрессию TLR4 в холангиоцитах (непатентный документ 12).

Известно, что miR-125 принимает участие в противовоспалительном действии путем супрессии продукции TNF-α (непатентные документы 1и 13).

Известно, что miR-146 принимает участие в иммунитете путем отрицательной регуляции врожденного иммунитета (непатентные документы 1 и 14) и принимает участие в противоаллергическом действии за счет контроля баланса Th1/Th2 (непатентный документ 15).

Недавно было сообщено, что miRNA, которые функционируют в клетках в качестве молекул, регулирующих трансляцию, присутствуют в липидном бислое, называемом экзосомой, и секретируются из клетки (непатентный документ 16). Поскольку также было подтверждено, что секретированные miRNA встраиваются в другие клетки, было описано наличие межклеточных взаимодействий посредством miRNA. Кроме того, известно, что экзосомы присутствуют в большом числе видов жидкостей организма человека. В частности, уже было сообщено о наличии miRNA в плазме и сыворотке человека, и была предположена возможность их применения в качестве биомаркера рака простаты или рака матки (непатентный документ 17).

К жидкостям организма, содержащим экзосомы, относятся помимо плазмы и сыворотки слюна, моча, амниотическая жидкость и грудное молоко (непатентный документ 17). Среди них грудное молоко представляет собой жидкость организма, продуцируемую млекопитающими в определенный период и отвечающую за перенос веществ между индивидуумами, т.е. от матери к ребенку. Более того, грудное молоко не только добавляет ребенку питательные вещества, но также дает иммунные вещества, поставляемые матерью ребенку.

Грудное молоко содержит секреторный IgA, лактоферрин, лизозим, цитокины и тому подобное, и полагают, что оно защищает младенца от инфекций и стимулирует развитие иммунитета ребенка (непатентный документ 19). В действительности, известно, что дети, выросшие на грудном молоке, имеют меньший риск инфицирования бронхиального и кишечного тракта по сравнению с детьми, не выросшими таким образом. Грудное молоко содержит IgA, лактоферрин, гликопротеины, гликолипиды и т.д., у которых наблюдается антибактериальная активность, а также цитокины, которые регулируют иммуноциты. Тем не менее, объекты, проанализированные в исследованиях до настоящего времени, представляют собой, главным образом, белки, содержащиеся в грудном молоке, и несмотря на то, что существуют сообщения о нуклеиновых кислотах, содержащихся в грудном молоке, не было сообщено об исследованиях по нуклеиновым кислотам, содержащимся в грудном молоке и имеющим конкретные последовательности.

Более того, также известно, что развитие железистых клеток молочной железы, контролируемое экспрессией циклооксигеназы 2, регулируется с помощью miR-101а (непатентный документ 20). Тем не менее, полагают, что в молоке нет miRNA.

Кроме того, после даты приоритета настоящей заявки было сообщено, что микроРНК присутствуют в микровезикулах, полученных из коровьего молока (непатентный документ 21), и микроРНК идентифицируют в свежем молоке коров различных периодов лактации, коммерческом жидком молоке и сухом молоке (патентный документ 22).

Ссылки на документы уровня техники

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Lindsay, M.A., Trends Immunol, 29:343-351, 2008.

Непатентный документ 2: Li, Qi-Jing et al., Cell, 129:147-161, 2007.

Непатентный документ 3: Chen, Chang-Zheng et al., Science, 303:83-86, 2004.

Непатентный документ 4: O'Connel, R.M. et al., PNAS, 104 (5):1604-1609, 2007.

Непатентный документ 5: Vigorito, E. et al., Immunity, 27:847-859, 2007.

Непатентный документ 6: Rodriguez, A. et al., Science, 316:608-611, 2007.

Непатентный документ 7: Kohlhaas, S. et al., J. Immunol., 182:2578-2582, 2009.

Непатентный документ 8: Koralov, S.B. et al., Cell, 132:860-874, 2008.

Непатентный документ 9: Xiao, C. et al., Nat. Immunol., 9:405-414, 2008.

Непатентный документ 10: Jonathan, B. et al., Nature, 451:1125-1129, 2008.

Непатентный документ 11: Zhou, B. et al., PNAS, 104 (17):7080-7085, 2007.

Непатентный документ 12: Chen, Xian-Ming et al., J. Biol. Chem., 282 (39):28929-28938, 2007.

Непатентный документ 13: Tili, E. et al., J. Immunol., 179:5082-5089, 2007.

Непатентный документ 14: Taganov, K.D. et al., PNAS, 103 (33):12481-12486, 2006.

Непатентный документ 15: Monticelli, S. et al., Genome Biol., 6, R71, 2005.

Непатентный документ 16: Valadi, H. et al., Nat. Cell Biol., 9:654-659, 2007.

Непатентный документ 17: Gilad, S. et al., PLoS One, 3 (9):e3148, 2008.

Непатентный документ 18: Admyre, C., J. Immunol., 179:1969-1978, 2007.

Непатентный документ 19: Goldman, A.S., Breastfeed Med., 2 (4):195-204, 2007.

Непатентный документ 20: Tanaka, T. Et al., Differentiation, 77:181-187, 2009.

Непатентный документ 21: Hata, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 396 (2):528-533, 2010.

Непатентный документ 22: Chen, X. et al., Cell Research, (2010):1-10.

Сущность изобретения

Цель, достигаемая изобретением

Цель настоящего изобретения - предложение способа выбора пищевого рациона, обеспечивающего получение молока, обладающего иммунорегуляторным действием, и нового продукта питания, обладающего иммунорегуляторным действием, и способа его продукции.

Средства достижения цели

Авторы настоящего изобретения провели исследования, сконцентрировав внимание на том факте, что грудное молоко влияет на зрелость иммунной системы младенца. В результате они обнаружили, что в грудном молоке в значительной степени экспрессируются связанные с иммунитетом miRNA, и завершили настоящее изобретение.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу выбора пищевого рациона или вещества, обеспечивающего получение грудного молока, обладающего иммунорегуляторным действием, который содержит установление пищевого рациона или вещества, которое повышает или снижает количество микроРНК, присутствующее в молоке млекопитающего, используя корреляцию профиля микроРНК в молоке и пищевом рационе, полученном млекопитающим, или веществе, содержащемся в пищевом рационе, в виде индекса.

В одном из вариантов осуществления вышеуказанного способа иммунорегуляторное действие представляет собой иммуностимулирующее действие, и при увеличении количества микроРНК полагают, что пищевой рацион или вещество обеспечивает получение грудного молока, обладающего иммуностимулирующим действием.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа сравнивают в молоке профили микроРНК, наблюдаемые до и после получения пищевого рациона, и если количество по меньшей мере одного вида микроРНК, наблюдаемое после получения, выше, чем количество, наблюдаемое до получения, то полагают, что пищевой рацион повышает количество микроРНК в молоке.

В другом предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа сравнивают профили микроРНК в молоке и профили микроРНК в сыворотке или плазме, и если количество микроРНК, содержавшееся и в молоке, и в сыворотке или плазме, возрастает в молоке при получении пищевого рациона в 1,2 раза или больше по сравнению с количеством, обнаруженным в сыворотке или плазме, то полагают, что пищевой рацион повышает количество микроРНК в молоке.

В другом варианте осуществления вышеуказанного способа иммунорегуляторное действие представляет собой иммуносупрессивное действие, и при снижении количества микроРНК полагают, что пищевой рацион или вещество обеспечивает получение грудного молока, обладающего иммуносупрессивным действием.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа сравнивают в молоке профили микроРНК, наблюдаемые до и после получения пищевого рациона, и если количество по меньшей мере одного вида микроРНК, наблюдаемое после получения, меньше, чем количество, наблюдаемое до получения, то полагают, что пищевой рацион снижает количество микроРНК в молоке.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа сравнивают профили микроРНК в молоке и профили микроРНК в сыворотке или плазме, и если количество микроРНК, содержавшееся и в молоке, и в сыворотке или плазме, снижается в молоке при получении пищевого рациона в 0,8 раз или меньше по сравнению с количеством, обнаруженным в сыворотке или плазме, то полагают, что пищевой рацион снижает количество микроРНК в молоке.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа млекопитающее представляет собой человека.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа профили микроРНК состоят из количества микроРНК, выбранной из группы, состоящей из

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа профили микроРНК состоят из количества микроРНК, выбранной из группы, состоящей из

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа профили микроРНК состоят из количества микроРНК, выбранной из группы, состоящей из

Настоящее изобретение также относится к способу продукции молока или молочных продуктов, обладающих иммунорегуляторным действием, который содержит стадию получения пищевого рациона или вещества, как установлено посредством вышеуказанного способа выбора для млекопитающего (за исключением человека), повышающего или снижающего количество микроРНК в молоке млекопитающего, и стадию сбора молока млекопитающего.

В одном из вариантов осуществления вышеуказанного способа иммунорегуляторное действие представляет собой иммуностимулирующее действие, и определяют пищевой рацион или вещество, повышающие количество микроРНК.

В одном из вариантов осуществления вышеуказанного способа иммунорегуляторное действие представляет собой иммуносупрессивное действие, и определяют пищевой рацион или вещество, снижающие количество микроРНК.

Настоящее изобретение также относится к композиции для перорального приема, обладающей иммуностимулирующим действием, которая содержит основу композиции для перорального приема и добавленную к основе микроРНК.

В предпочтительном варианте осуществления композиции для перорального приема микроРНК выбирают из группы, состоящей из

В предпочтительном варианте осуществления композиции для перорального приема микроРНК выбирают из группы, состоящей из

В предпочтительном варианте осуществления композиции для перорального приема микроРНК выбирают из группы, состоящей из

В предпочтительном варианте осуществления композиции для перорального приема композиция представляет собой продукт питания грудных детей или продукт питания маленьких детей.

В предпочтительном варианте осуществления композиции для перорального приема продукт питания грудных детей или продукт питания маленьких детей представляет собой молочную смесь или прикорм.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлены результаты определения miRNA в грудном молоке человека, полученные с помощью микрочипового анализа.

На фиг.2 показано сравнение уровней miR-181а в грудном молоке для ребенка первых шести месяцев после рождения и шести последующих месяцев. hsa представляет человека и cel представляет нематоду (Caenorhabditis elegans) (то же применимо к последующим чертежам).

На фиг.3 представлено сравнение уровней miR-155, miR-17 и miR-92 в грудном молоке для ребенка первых шести месяцев после рождения и шести последующих месяцев.

На фиг.4 представлено сравнение уровней связанных с иммунитетом miRNA в грудном молоке и сыворотке человека.

На фиг.5 показано сравнение уровней miRNA, обнаруженных до и после замораживания-оттаивания.

На фиг.6 показано сравнение уровней miRNA, обнаруженных до и после хранения при низкой величине рН (рН 1).

На фиг.7 показано сравнение уровней miRNA, обнаруженных после обработки РНКазами и в отсутствие обработки РНКазами.

Варианты осуществления изобретения

Способ по настоящему изобретению представляет собой способ выбора пищевого рациона или вещества, обеспечивающего получение грудного молока, обладающего иммунорегуляторным действием, который содержит установление пищевого рациона или вещества, которое повышает или снижает количество микроРНК, присутствующее в молоке млекопитающего, на основе сопоставления профилей микроРНК в молоке и пищевом рационе, получаемом млекопитающим, или веществе, содержащемся в пищевом рационе.

В одном из вариантов осуществления вышеуказанного способа по настоящему изобретению иммунорегуляторное действие представляет собой иммуностимулирующее действие, и при увеличении количества микроРНК полагают, что пищевой рацион или вещество обеспечивает получение грудного молока, обладающего иммуностимулирующим действием. В другом варианте осуществления вышеуказанного способа по настоящему изобретению иммунорегуляторное действие представляет собой иммуносупрессивное действие, и при снижении количества микроРНК полагают, что пищевой рацион или вещество обеспечивает получение грудного молока, обладающего иммуносупрессивным действием.

Настоящее изобретение основано на предположении, что иммунорегуляторное действие должно достигаться пероральным введением miRNA, благодаря новой находке, что miRNA содержатся в молоке, и факту, что miRNA могут устойчиво существовать даже при кислотных условиях в желудке, и грудное молоко активирует развитие иммунитета у младенцев, получающих грудное молоко (например, статья Breastfeed Med., 2(4):195-204, 2007). И исходя из предположения, что на профиль miRNA в молоке влияет пищевой рацион, предполагалось установить пищевой рацион или активный ингредиент, содержащийся в нем, которые могли бы повысить или снизить количество miRNA, присутствующее в молоке.

К иммунорегуляторному действию, определенному в отношении способа выбора, молока, молочного продукта и тому подобного по настоящему изобретению, относятся, например, как действие усиления иммунопотенцирующего действия, которое функционирует с целью «защиты» против внешних воздействий (иммуностимулирующее действие), так и иммуносупрессивное действие, функционирующее для подавления против сверхответа иммунитета, т.е. аллергических реакций, аутоиммунных заболеваний, хронического воспаления и т.д., в которых «гипериммунореакция» негативно влияет на живые организмы.

Термины «иммуностимулирующее действие» и «иммуносупрессивное действие» используются в относительном смысле. При усилении иммунопотенцирующего действия, обычно наблюдаемого для грудного молока некоторого млекопитающего после получения пищевого рациона или вещества, грудное молоко обладает иммуностимулирующим действием, и при снижении иммунопотенцирующего действия грудное молоко обладает иммуносупрессивным действием. При усилении иммунопотенцирующего действия, наблюдаемого после получения млекопитающим пищевого рациона или вещества, по сравнению с наблюдаемым до получения грудное молоко млекопитающего обладает иммуностимулирующим действием, и при снижении иммунопотенцирующего действия по сравнению с наблюдаемым до получения грудное молоко обладает иммуносупрессивным действием.

Корреляция профилей miRNA в молоке млекопитающего и пищевом рационе, получаемом млекопитающим, или веществе, содержащемся в пищевом рационе, может быть исследована, например, согласно следующему.

Молоко собирают от млекопитающего, которое получило пищевой рацион, и оценивают профиль miRNA в молоке.

Млекопитающее особенно не ограничивается, и к примерам относятся человек, корова, коза, овца, свинья, обезьяна, собака, кошка, крыса, мышь, хомяк, морская свинка и тому подобное. Млекопитающее предпочтительно представляет собой человека или корову.

По настоящему изобретению профиль miRNA состоит из типа и количества miRNA. miRNA может состоять из одного вида miRNA или двух или больше видов miRNA. Тип miRNA особенно не ограничивается при условии, что выбирают типы, существующие в молоке, и к их примерам относятся

Эти miRNA представляют собой такие miRNA, наличие которых подтверждают либо в одном грудном молоке человека, молозиве крысы, либо молозиве коровы. Как описано выше, известно, что грудное молоко стимулирует развитие иммунитета грудных детей, которые его получают (например, документ Breastfeed Med., 2 (4):195-204, 2007). Более того, было сообщено о предположении, что многие компоненты, важные для иммунной системы грудных детей (включая детенышей животных), как правило, содержатся в молозиве (J. Anim. Sci., 2009, 87: (Suppl.1): 3-9). Поэтому полагают, что указанные выше miRNA, наличие которых в молоке подтверждается, вовлечены в иммунные функции.

Среди указанных выше miRNA предпочтительны miR-15

Существуют miRNA, для которых сообщается о иммунорегуляторном действии, miRNA, наличие которых подтверждалось в молозиве как крысы, так и коровы, или miRNA, количество которых повышено в молозиве крысы, получавшей бактерии Bifidobacterium.

Более того, среди указанных выше miRNA особенно предпочтительны

Существуют miRNA, наличие которых подтверждалось в молозиве как крысы, так и коровы.

Некоторые miRNA имеют подтипы, и, например, известно от 2 до 4 видов подтипов для каждой из miR-181, miR-92, miR-125, miR-146 и тому подобных, таких как miR-181а, miR-

соответственно. Некоторые другие miRNA также имеют подтипы, и по настоящему изобретению miRNA могут представлять собой любой из таких подтипов. К примерам подтипов относятся подтипы, наличие которых в молоке подтверждалось в примерах, описанных далее (ссылка на примеры 1, 3, 4 и 5).

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-155 человека hsa-mir-155 (MI0000681) и его активного сайта hsa-mir-155 (MIMAT0009241) представлены в SEQ ID NOS: 1 и 2, соответственно. В скобках представлены добавочные номера в базе данных miRNA (miRBase::Sequences, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml) (то же должно использоваться для последующих описаний).

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-155 коровы bta-mir-155 (MI0009752) и его активного сайта bta-mir-155 (MIMAT0000646) представлены в SEQ ID NOS: 3 и 4, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-181а человека hsa-mir-181а-1 (MI0000289) и hsa-mir-181а-2 (MI0000269) и их активного сайта hsa-mir-181а (MIMAT0000256) представлены в SEQ ID NOS: 5, 6 и 7, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-181b человека hsa-mir-181b-1 (MI0000270) и hsa-mir-181b-2 (MI0000683) и их активного сайта hsa-mir-181b (MIMAT0000257) представлены в SEQ ID NOS: 8, 9 и 10, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-181а коровы bta-mir-181а (MI0004757) и bta-mir-181а-1 (MI0010484) и их активного сайта bta-mir-181а (MIMAT0003543) представлены в SEQ ID NOS: 11, 12 и 13, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-181b коровы bta-mir-181b-1 (MI0010485) и bta-mir-181b-2 (MI0005013) и их активного сайта bta-mir-181b (MIMAT0003793) представлены в SEQ ID NOS: 14, 15 и 16, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-223 человека hsa-mir-223 (MI0000300) и его активного сайта hsa-mir-223 (MIMAT0000280) представлены в SEQ ID NOS: 17 и 18, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-223 коровы bta-mir-223 (MI0009782) и его активного сайта bta-mir-223 (MIMAT0009270) представлены в SEQ ID NOS: 19 и 20, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-17 человека hsa-mir-17 (MI0000071) и его активного сайта hsa-mir-17 (MIMAT0000070) (также называемого hsa-mir-17-5р) представлены в SEQ ID NOS: 21 и 22, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-17 коровы bta-mir-17 (MI0005031), его активных сайтов bta-mir-17-5р (MIMAT0003815) и bta-mir-17-3р (MIMAT0003816) представлены в SEQ ID NOS: 23, 24 и 25, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-92а человека hsa-mir-92а-1 (MI0000093) и hsa-mir-92а-2 (MI0000094) и их активного сайта hsa-mir-92а (MIMAT0000092) представлены в SEQ ID NOS: 26, 27 и 28, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-92b человека hsa-mir-92b (MI0003560) и его активного сайта hsa-mir-92b (MIMAT0003218) представлены в SEQ ID NOS: 29 и 30, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-92 коровы bta-mir-92 (MI0005024) и его активного сайта bta-mir-92 (MIMAT0003808) представлены в SEQ ID NOS: 31 и 32, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-92а коровы bta-mir-92а (MI0009905) и его активного сайта bta-mir-92а (MIMAT0009383) представлены в SEQ ID NOS: 33 и 34, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-92b коровы bta-mir-92b (MI0009906) и его активного сайта bta-mir-92b (MIMAT0009384) представлены в SEQ ID NOS: 35 и 36, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника let-7i человека hsa-let-7i (MI0000434) и его активного сайта hsa-let-7i (MIMAT0000415) представлены в SEQ ID NOS: 37 и 38, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника let-7i коровы bta-let-7i (MI0005065) и его активного сайта bta-let-7i (MIMAT0003851) представлены в SEQ ID NOS: 39 и 40, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-125a человека hsa-mir-125a (MI0000469) и его активных сайтов hsa-mir-125а-5р (MIMAT0000443) и hsa-mir-125а-3р (MIMAT0004602) представлены в SEQ ID NOS: 41, 42 и 43, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-125b человека hsa-mir-125b-1 (MI0000446) и hsa-mir-125b-2 (MI0000470) и их активного сайта hsa-mir-125b (MIMAT0000423) представлены в SEQ ID NOS: 44, 45 и 46, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-125a коровы bta-mir-125a (MI0004752) и его активного сайта bta-mir-125а (MIMAT0003538) представлены в SEQ ID NOS: 47 и 48, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественников miR-125b коровы bta-mir-125b-1 (MI0004753) и bta-mir-125b-2 (MI0005457) и их активного сайта bta-mir-125b (MIMAT0003539) представлены в SEQ ID NOS: 49, 50 и 51, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-146a человека hsa-mir-146a (MI0000477) и его активного сайта hsa-mir-146a (MIMAT0000449) представлены в SEQ ID NOS: 52 и 53, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-146b человека hsa-mir-146b (MI0003129) и его активных сайтов hsa-mir-146b-5p (MIMAT0002809) (также обозначаемого hsa-mir-146b) и hsa-mir-146b-3р (MIMAT0004766) представлены в SEQ ID NOS: 54, 55 и 56, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-146a коровы bta-mir-146a (MI0009746) и его активного сайта bta-mir-146a (MIMAT0009236) представлены в SEQ ID NOS: 57 и 58, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-146b коровы bta-mir-146b (MI0009745) и его активного сайта bta-mir-146b (MIMAT0009235) представлены в SEQ ID NOS: 59 и 60, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-150 человека hsa-mir-150 (MI0000479) и его активного сайта hsa-mir-150 (MIMAT0000451) представлены в SEQ ID NOS: 61 и 62, соответственно.

Нуклеотидные последовательности предшественника miR-150 коровы bta-mir-150 (MI0005058) и его активного сайта bta-mir-150 (MIMAT0003845) представлены в SEQ ID NOS: 63 и 64, соответственно.

Помимо указанных выше miRNA в таблицах 1-10 представлены miRNA, наличие которых подтверждали в молоке крысы или коровы, и miRNA других животных, соответствующие этим miRNA.

miRNA не ограничивается имеющими вышеуказанные последовательности, miRNA может включать замены, делеции, вставки, добавки или инверсии одного или нескольких нуклеотидов при условии функционирования miRNA в качестве miRNA, т.е. miRNA может регулировать экспрессию генов-мишеней. Конкретно, к примерам такой miRNA относятся РНК, имеющие нуклеотидную последовательность с гомологией 80% или больше, предпочтительно 90% или больше, более предпочтительно 95% или больше с любой из вышеуказанных последовательностей.

Количество miRNA может представлять собой абсолютное количество или относительное количество. Относительное количество может представлять собой относительное количество в зависимости от среднего количества у животных, или может представлять собой относительное количество, обнаруженное после получения пищевого рациона, в зависимости от количества, наблюдаемого до получения. Для измерения количества нуклеиновой кислоты могут быть использованы способы, обычно используемые для измерения количества miRNA, такие как количественная ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Количество miRNA также может быть измерено с помощью микрочипового способа. Для экстракции miRNA из молока могут быть использованы способы, обычно используемые для экстракции miRNA, а также может быть использован коммерчески доступный набор для выделения miRNA.

Кроме того, количество miRNA, присутствующее в молоке, также может быть косвенно измерено путем измерения экспрессируемого количества miRNA в железистых клетках молочной железы.

Оценивают корреляцию профилей miRNA в молоке млекопитающего и пищевом рационе, полученном млекопитающим, или веществе, содержащемся в пищевом рационе. Корреляция профилей miRNA в молоке млекопитающего и пищевом рационе, полученном млекопитающим, или веществе, содержащемся в пищевом рационе, соотносится с корреляцией профиля miRNA и наличия или отсутствия вещества или количества вещества. Например, если количества одного или нескольких видов miRNA в молоке животного, которое получило некоторое вещество, больше или меньше, чем количества, обнаруженные у животного, которое не получило вещество, то вещество и профили miRNA обладают положительной или отрицательной корреляцией, соответственно. Кроме того, если получение некоторого вещества не влияет на профили miRNA, то вещество и профили miRNA не коррелируют друг с другом.

Конкретно, например, если при сравнении профилей miRNA в молоке, обнаруженных до и после получения пищевого рациона, количество или количества одного вида, предпочтительно двух видов или больше, более предпочтительно пяти видов или больше miRNA, обнаруженные после получения, больше, чем обнаруженные до получения, то полагают, что пищевой рацион повышает количества miRNA, присутствующие в молоке.

Кроме того, если при сравнении профилей miRNA в молоке, обнаруженных до и после получения пищевого рациона, количество или количества одного вида, предпочтительно двух видов или больше, более предпочтительно пяти видов или больше miRNA, обнаруженные после получения, меньше, чем обнаруженные до получения, то полагают, что пищевой рацион снижает количества miRNA, существующие в молоке.

Более того, измерение профилей miRNA до получения пищевого рациона не обязательно, и корреляция пищевого рациона и количества miRNA также может быть оценена путем сравнения профиля miRNA, измеренного после получения пищевого рациона, с типичными профилями miRNA целевого млекопитающего, измеренными ранее.

В другом варианте осуществления сравнивают профили miRNA в молоке и профили miRNA в сыворотке или плазме, и если количество miRNA, содержащееся и в молоке, и в сыворотке или плазме, при получении пищевого рациона повышается в большей степени в молоке по сравнению с обнаруженным в сыворотке или плазме, то полагают, что пищевой рацион повышает количество miRNA, присутствующее в молоке. Степень повышения количества miRNA в молоке составляет, например, в 1,2 раза или больше, предпочтительно в 2 раза или больше, более предпочтительно в 5 раз или больше, еще более предпочтительно в 10 раз или больше количества, обнаруженного в сыворотке или плазме.

Кроме того, при сравнении профилей miRNA в молоке и профилей miRNA в сыворотке или плазме если количество miRNA, содержащееся и в молоке, и в сыворотке или плазме, при получении пищевого рациона снижается в меньшей степени в молоке по сравнению с обнаруженным в сыворотке или плазме, то полагают, что пищевой рацион снижает количество miRNA, присутствующее в молоке. Степень снижения количества miRNA в молоке составляет, например, в 0,8 раз или меньше, предпочтительно в 0,5 раз или меньше, более предпочтительно в 0,2 раза или меньше, еще более предпочтительно в 0,1 раз или меньше количества, обнаруженного в сыворотке или плазме.

Пищевой рацион может состоять из одного вещества или может представлять собой композицию при условии, что она может быть получена перорально. Кроме того, «до получения» и «после получения» может означать «до и после однократного получения пищевого рациона» или «до и после двух или больше раз получения пищевого рациона». Кроме того, два или больше раз получения пищевого рациона может представлять собой два или больше раз получения одного и того же пищевого рациона или получение двух или больше видов пищевых рационов.

Пищевой рацион может быть получен по намеченной схеме или получен свободно. В последнем случае корреляция пищевого рациона и профилей miRNA в молоке может быть оценена путем рассмотрения состава полученного пищевого рациона в случае человека. При получении или введении пищевого рациона по намеченной схеме пищевой рацион может рассматриваться как «тестируемый образец». Пищевой рацион может представлять собой привычный пищевой рацион или привычный пищевой рацион, содержащий тестируемое вещество. Количество получаемого пищевого рациона, время получения и кратность получения особенно не ограничиваются.

При выборе пищевого рациона, который повышает количество miRNA в молоке, вещество, которое содержится в пищевом рационе и повышает количество miRNA в молоке, может быть определено тем же способом, что и указанный выше. Кроме того, при выборе пищевого рациона, который снижает количество miRNA в молоке, вещество, которое содержится в пищевом рационе и снижает количество miRNA в молоке, может быть определено тем же способом, что и указанный выше.

При определении пищевого рациона или вещества, которое повышает или снижает количество miRNA в молоке, может быть составлен пищевой рацион, который повышает или снижает количество miRNA в молоке. То есть полагают, что для получения молока, обладающего иммуностимулирующим действием, предпочтителен пищевой рацион, который повышает количество miRNA в молоке, или вещество, содержащееся в нем, и пищевой рацион, который снижает количество miRNA в молоке, или вещество, содержащееся в нем, не предпочтительны для получения молока, обладающего иммуностимулирующим действием.

Кроме того, полагают, что для получения молока, обладающего иммуносупрессивным действием, предпочтителен пищевой рацион, который снижает количество miRNA в молоке, или вещество, содержащееся в нем, и пищевой рацион, который повышает количество miRNA в молоке, или вещество, содержащееся в нем, не предпочтительны для получения молока, обладающего иммуносупрессивным действием.

Выбор пищевого рациона или вещества, обеспечивающего получение грудного молока, обладающего иммунорегуляторным действием, или пищевого рациона или вещества, не подходящего для получения грудного молока, обладающего иммунорегуляторным действием, может быть осуществлен, как описано выше. Как показано в примерах, описанных позже, наличие большого числа видов miRNA подтверждалось в молозиве крысы и коровы. Это подтверждает предположение настоящего изобретения, что пероральное введение miRNA обеспечивает иммунорегуляторное действие. Кроме того, как показано в примерах, описанных позже, при пероральном введении крысам бактерий Bifidobacterium (Bifidobacterium longum) повышались количества 52 видов miRNA.

Известно, что бактерии Bifidobacterium функционируют в качестве пробиотиков и обладают в частности иммунорегуляторным действием. Поэтому то обстоятельство, что введение бактерий Bifidobacterium повысило количества miRNA в молоке, также подтверждает вовлеченность miRNA в молоке в иммунорегуляцию. Демонстрация повышения количеств miRNA в молоке, индуцированного введением бактерий Bifidobacterium, т.е. взаимосвязи бактерий Bifidobacterium и профилей miRNA, показывает, что способ выбора по настоящему изобретению осуществим. Кроме того, несмотря на то, что существовали также miRNA, количества которых в молоке не изменялись при введении бактерий Bifidobacterium, не отрицается вероятность, что количества этих miRNA могут быть повышены другим видом пищевого рациона или вещества, содержащегося в нем.

Благодаря пробиотическим функциям бактерий Bifidobacterium имеет место известная профилактика или смягчение инфекций дыхательных путей, острой инфекционной диареи, диареи, ассоциированной с приемом антибиотиков, диареи, ассоциированной с Clostridium dificile, некротизирующего энтероколита, диареи путешественников, инфицирования Helicobacter pylori и тому подобного (The Journal of Nutrition, 2010 Mar;140(3):698S-712S. Epub 2010 Jan 27). Полагают, что у животных, которые ее получают, miRNA, количество которой в молоке повышается при введении бактерий Bifidobacterium, не только регулирует иммунитет, но также обладает функциями, сходными с вышеуказанными пробиотическими функциями.

При получении пищевого рациона или вещества, которое повышает количество miRNA в молоке, выбранного, как описано выше для млекопитающего, и сборе молока у животного может быть получено молоко, обладающее иммуностимулирующим действием, или молоко, иммуностимулирующее действие которого усиливается. Кроме того, при снижении или отмене получения млекопитающим пищевого рациона или вещества, которое снижает количество miRNA в молоке, выбранного, как описано выше, иммуностимулирующее действие молока может быть усилено или может быть предотвращено снижение иммуностимулирующего действия.

Кроме того, получение пищевого рациона или вещества, которое повышает количество miRNA в молоке, и уменьшение или отмена пищевого рациона или вещества, которое снижает количество miRNA в молоке, могут быть объединены. Кроме того, при получении пищевого рациона или вещества, которое снижает количество miRNA в молоке, выбранного, как описано выше для млекопитающего, и сборе молока у животного может быть получено молоко, обладающее иммуносупрессивным действием, или молоко, иммуностимулирующее действие которого снижается. Кроме того, при снижении или отмене получения млекопитающим пищевого рациона или вещества, которое повышает количество miRNA в молоке, выбранного, как описано выше, иммуносупрессивное действие молока может быть усилено или может быть снижено иммуностимулирующее действие молока. Кроме того, получение пищевого рациона или вещества, которое снижает количество miRNA в молоке, и уменьшение или отмена пищевого рациона или вещества, которое повышает количество miRNA в молоке, могут быть объединены.

При обработке молока, обладающего иммунорегуляторным действием, полученного, как описано выше, могут быть получены молочные продукты, обладающие иммунорегуляторным действием.

Тип молочных продуктов особенно не ограничивается при условии, что miRNA в них могут существовать с сохранением своих функций, и к примерам относятся переработанное молоко, молочная смесь, молочные напитки, порошковая молочная смесь, кисломолочный продукт, сливки, масло, сыр, мороженое и тому подобное. В качестве молочного продукта предпочтителен молочный продукт для грудных или маленьких детей.

По настоящему изобретению было показано наличие в молоке miRNA, особенно miRNA, которые, как было известно, принимают участие в повышении иммунитета, таком как развитие иммунитета, антиаллергическое действие, противовоспалительное действие и защита против инфекций. Кроме того, хорошо известно, что грудное молоко оказывает на младенца, который его получает, иммуностимулирующее действие. Поэтому разумно предполагают, что miRNA, принимающая участие в иммунорегуляции, может регулировать иммунитет организма, такого как человек, который его получает. Поскольку miRNA представляет собой вещество, которое регулирует экспрессию большого числа генов, полагают, что перенос таких регуляторных молекул от матери к грудному ребенку крайне важен в частности для грудных детей, имеющих неразвитую иммунную систему.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой композицию для перорального приема, обладающую иммуностимулирующим действием, которую получают добавлением к основе композиции для перорального приема miRNA.

К примерам miRNA относятся

и тому подобные.

Среди вышеуказанных miRNA предпочтительны

miRNA может состоять из одного вида miRNA или произвольных двух или больше видов miRNA.

Основа композиции для перорального приема не особенно ограничивается при условии выбора основы, получаемой или вводимой перорально, в которой miRNA может существовать с сохранением своих функций, и к примерам относятся продукты питания, напитки, основы лекарственных средств, корма для животных и тому подобное.

Продукты питания могут существовать в любой форме, и к ним относятся напитки. К продуктам питания относятся продукты питания для взрослых, продукты питания для грудных детей, продукты питания для маленьких детей и тому подобное.

К примерам продуктов питания для взрослых относятся энтеральные питательные вещества, жидкие диеты, такие как концентрированные жидкие диеты, продукты дополнительного питания и тому подобное.

К примерам продуктов питания для грудных детей или продуктов питания для маленьких детей относятся, например, модифицированное молоко (например, молочная смесь, молочная смесь для детей с низким весом при рождении, прикорм и т.д., а также молочная смесь для детей-аллергиков, безлактозное молоко, специальное молоко для детей с врожденными нарушениями обмена веществ и т.д. и сухое молоко, полученное из них), порошки для дополнения грудного молока или порошковая молочная смесь, детское питание и тому подобное.

Молочные смеси в настоящем документе представляют собой продукты питания, полученные, используя в качестве основных сырых материалов молоко или молочные продукты и добавив питательные вещества, необходимые грудным детям, и, главным образом, используются в качестве альтернативного грудному молоку питания в младенчестве и в качестве альтернативного грудному молоку питания или дополнительного питания в детстве. К другим их примерам относятся продукты питания, полученные с целью содействия получению питательных веществ, подходящему для грудных детей с конкретным врожденным или приобретенным заболеванием.

miRNA относительно устойчива к замораживанию-оттаиванию, низкой величине рН, такой как кислотные условия с рН 1, и РНКазам, таким как РНКаза А и РНКаза Т, и, таким образом, подходит в качестве активного ингредиента, добавляемого в продукты питания. Устойчивость при низкой величине рН предполагает, что молекулы miRNA резистентны к среде желудка грудного ребенка и могут всасываться кишечным трактом, который представляет собой один из главных иммунных органов грудных детей, и, таким образом, они могут влиять на иммунную систему грудных детей. Кроме того, хранение и замораживание-оттаивание грудного молока не приводят к денатурации miRNA, и это важно для питания младенцев с малой массой при рождении и госпитализированных грудных детей, которые обычно получают замороженное грудное молоко. Более того, устойчивость miRNA к РНКазам предполагает, что miRNA может существовать в комплексе, таком как экзосома и микровезикула в грудном молоке.

На основании вышеупомянутых находок создается впечатление, что матери дают младенцам такое специально созданное грудное молоко, которое младенцы могут адаптировать к среде. Существует сообщение, что экзосомы, полученные из грудного молока, повышают число Foxp3+ CD4+ CD25+ регуляторных Т-клеток. При содержании в экзосомах грудного молока miRNA, связанных с иммунитетом, они, вероятно, могут содействовать увеличению Foxp3+ CD4+ CD25+ регуляторных Т-клеток в пищеварительном тракте грудных детей. Это происходит, поскольку связанные с иммунитетом miRNA, детектированные в грудном молоке, такие как miR-181а и miR-181b, экспрессируются в значительной степени, и они вовлечены в дифференцировку Т-клеток. Более того, поскольку известно, что miR-181 и miR-155, в избытке содержащиеся в грудном молоке, индуцируют дифференцировку В-клеток и в грудном молоке почти не существует miR-150, которая супрессирует дифференцировку В-клеток, miRNA в грудном молоке могут индуцировать дифференцировку В-клеток.

Несмотря на то, что содержание miRNA в композиции не особенно ограничивается и может быть выбрано подходящим образом, в целом оно составляет, например, от 10 до 10000 нг/мл, предпочтительно от 20 до 10000 нг/мл, более предпочтительно от 50 до 10000 нг/мл. Кроме того, количество получаемой miRNA в целом составляет, например, от 5 мкг до 120 мг/день, предпочтительно от 10 мкг до 120 мг/день, более предпочтительно от 25 мкг до 120 мг/день.

miRNA может быть получена посредством получения в качестве предшественника miRNA (pri-miRNA) частично двухцепочечной РНК и расщепления ее с помощью фермента Dicer. В качестве фермента Dicer могут быть использованы коммерчески доступные ферменты. Двухцепочечная РНК может быть получена, например, с помощью реакции РНК-полимеразы, используя в качестве матрицы двухцепочечную ДНК, имеющую комплементарную последовательность. Двухцепочечная ДНК может быть получена амплификацией на основе ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК млекопитающего и праймеры, созданные, чтобы иметь возможность амплифицировать последовательность miRNA.

miRNA может быть получена путем расщепления двухцепочечной РНК, полученной, как описано выше, с помощью фермента Dicer или подобного.

Кроме того, miRNA также может быть получена химическим синтезом. То есть miRNA может быть получена путем синтеза смысловой цепи и антисмысловой цепи и их отжигом.

Кроме того, двухцепочечная РНК, которая позволяет получить miRNA-мишень с помощью эндогенного фермента Dicer млекопитающего, может быть добавлена к композиции для перорального приема.

Если композиция для перорального приема по настоящему изобретению представляет собой фармацевтический агент, то композиция может быть получена путем объединения miRNA с фармацевтически приемлемыми носителями для перорального введения. Форма фармацевтического препарата не особенно ограничивается, и к примерам относятся таблетка, пилюля, порошок, раствор, суспензия, эмульсия, гранула, капсула, сироп и тому подобное. Для препаративной формы могут быть использованы добавки, широко применяемые для обычных фармацевтических агентов в качестве фармацевтических носителей для перорального введения, такие как эксципиенты, связующие вещества, дезинтегрирующие агенты, смазывающие вещества, стабилизаторы, корригирующие вещества, разбавители и поверхностно-активные вещества. Кроме того, если эффект по настоящему изобретению не снижается, miRNA может быть использована вместе с другим лекарственным средством, обладающим иммунорегуляторным действием.

Несмотря на то, что количество miRNA, содержащееся в фармацевтическом агенте, особенно не ограничивается, в целом оно составляет, например, от 2 мкг/кг до 2 мг/кг, предпочтительно от 4 мкг/кг до 2 мг/кг, более предпочтительно от 10 мкг/кг до 2 мг/кг.

Если композиция для перорального приема представляет собой продукт питания, то она может быть предназначена для любого из большого числа применений, использующих иммуностимулирующее действие. К примерам применения относятся, например, применения в качестве продуктов питания, подходящих для индивидуумов со сниженной сопротивляемостью, применения в качестве продуктов питания или напитков, используемых для снижения и устранения факторов риска большого числа заболеваний, обусловленных иммунной депрессией, и тому подобное.

Продукты питания или напитки по настоящему изобретению могут продаваться в виде продуктов питания с указанием, что продукты питания используются для иммунорегуляции.

К вышеупомянутому термину «указание» относятся все действия по информированию потребителей вышеуказанного применения, и любые указания, доводящие до сведения или объясняющие вышеуказанное применение, охватываются термином «указание» по настоящему изобретению независимо от цели, содержания, реального предмета, способа и т.д. указания. Тем не менее, указание предпочтительно создают с формулировкой, которая позволяет потребителям непосредственно понять вышеуказанное применение. К конкретным примерам относятся действия по указанию вышеупомянутого применения на продукции или комплекте продукции, относящейся к продукту питания по настоящему изобретению, действия по назначению, доставке, представлению с целью назначения или доставки или импорта такой продукции или комплекта продукции, на которой указано вышеупомянутое применение, представлению или распространению рекламных объяснений, прейскуранта или торговых векселей, относящихся к продукции, или предоставлению информации, включающей их, в виде содержания с указанием вышеупомянутого применения с помощью электромагнитного способа (интернет и т.д.) и тому подобное.

Указание предпочтительно представляет собой указание, одобренное органом власти и т.д. (например, указание в форме, основанной на проверке, которая проводится на основе любой из большого числа легальных систем, предлагаемых органом власти), и особенно предпочтительно указание на рекламных материалах по месту продажи, таких как упаковки, контейнеры, каталоги, брошюры и РОР, другие документы и тому подобное.

К примерам указания дополнительно относятся, например, указания в виде продукт для здоровья, функциональный продукт, продукт для энтерального питания, продукт для специального диетического применения, функциональный продукт питания, квазилекарства и тому подобное, а также указания, одобренные министерством здравоохранения, труда и социального обеспечения, например, указания, одобренные на основе системы продукта для специального применения для здоровья и аналогичных систем. К примерам последних относятся указания в виде продукт для специального применения для здоровья, указания в виде продукт для специального применения для здоровья с требованиями по снижению риска заболеваний, указания о влиянии на структуры и функции организма, указания на снижение риска заболевания и тому подобные, и более точно к типичным примерам относятся указания в виде продукт для специального применения для здоровья (особенно указания о применении для здоровья), предложенные в статьях закона об охране здоровья (министерство здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии, приказ министерства № 86 от 30 апреля 2003) и аналогичные указания.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет дополнительно более точно пояснено со ссылкой на примеры. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами.

Пример 1: Анализ miRNA в грудном молоке

Грудное молоко человека центрифугировали при 2000 х g в течение 10 минут для удаления клеток и больших преципитатов, и супернатант за исключением липидов, составляющих поверхностный слой, дополнительно центрифугировали при 12000 х g в течение 30 минут для удаления клеточного дебриса и небольших частиц. Суммарную РНК экстрагировали из супернатанта, используя набор для выделения miRNA mirVana согласно протоколу производителя. Экстракцию РНК из сыворотки осуществляли таким же образом, что и использованный для грудного молока.

Экстрагированные РНК анализировали, используя биоанализатор. Несмотря на то, что в грудном молоке содержалось значительное количество РНК, рибосомальных РНК (18S рРНК, 28S рРНК) содержалось мало или не содержалось вообще.

miRNA детектировали, используя систему микрочипового анализа (использовали систему фирмы Agilent Technologies). Уровень экспрессии miRNA анализировали, используя GeneSpring GX11.0 (продукция фирмы Agilent Technologies). Результаты представлены на фиг.1. В результате, miR-181а, miR-181b, miR-155, miR-125b, miR-146b, miR-223 и let-7i детектировались на заметном уровне. miR-150, которая контролирует Т-клетки и В-клетки, не могла быть детектирована. Кроме того, большинство орган-специфических miRNA, таких как miR-122 (печень), miR-216, miR-217 (поджелудочная железа), miR-142-5р и miR-142-3р (гематопоэтическая клетка) могли быть определены с трудом. Более того, miR-124 (мозг) детектировали в небольшом количестве.

Результаты сравнения уровней miR-181а, проанализированных с помощью количественной ОТ-ПЦР в грудном молоке детей первых шести месяцев после рождения (n=5) и последующих шести месяцев (n=13), представлены на фиг.2. Результаты аналогичных анализов, проведенных для miR-155, miR-17 и miR-92а, также представлены на фиг.3. Для нормализации вариаций среди образцов, индуцированных процессом выделения РНК, к образцам добавляли денатурированную cel-miR-39 (синтезированную фирмой Qiagen), которая представляет собой синтезированную miRNA нематоды (Caenorhabditis elegans), (в количестве олигонуклеотида 25 фмоль в общем объеме 5 мл), и количества miRNA представлены в виде относительных количеств, исходя из количества cel-miR-39 (то же должно быть применено к последующим экспериментам).

В результате, количество miR-181а оказалось больше в молоке первых шести месяцев после рождения по сравнению с количеством в молоке последующих шести месяцев (фиг.2). Аналогичные тенденции также наблюдались в отношении miR-155, miR-17 и miR-92а (фиг.3).

В качестве праймеров для ОТ-ПЦР использовали праймеры, производимые фирмой Applied Biosystems и идентифицированные следующими ID анализа.

- miR-181a: 000480

- miR-155: 002623

- miR-17: 002308

- miR-92a: 000431

- Cel-miR-39: 000200

Результаты сравнения уровней связанных с иммунитетом miRNA в грудном молоке и сыворотке семи здоровых людей в течение 6 месяцев после родов представлены на фиг.4 (грудное молоко: n=5, сыворотка: n=6). Профили miRNA в грудном молоке отличаются от профилей miRNA в сыворотке. Например, miR-223, представляющая собой miRNA, которая контролирует гранулоциты, в нормальной сыворотке и плазме человека присутствовала на самом высоком уровне, тогда как ее экспрессируемое количество в грудном молоке оказалось крайне низким по сравнению с таковым в сыворотке. Кроме того, miR-146b, которая в сыворотке присутствует в незначительном количестве, в грудном молоке имеется в избытке.

С другой стороны, miR-181 и miR-155 в избытке присутствовали в грудном молоке в экспрессируемых количествах, сравнимых с таковыми, обнаруженными в сыворотке. Интересно, что большинство видов относящихся к иммунитету miRNA экспрессировалось в значительной степени в грудном молоке в течение шести месяцев после родов, которое представляет собой этап перед получением детского питания.

Межклеточный перенос miRNA указывает на то, что miRNA не только контролируют внутриклеточные молекулы, но также они представляют собой молекулы, имеющие значение во взаимодействии между клетками подобно цитокинам. Вышеупомянутые результаты указывают на то, что miRNA представляют собой «генетический материал», который может быть перенесен от матери ребенку. Рассчитано, что через грудное молоко младенец получает около 0,15 пг/л/день (1,3×10⁷ копий/л/день) miR-181.

Кроме того, в результате кластерного анализа было обнаружено, что профили miRNA в грудном молоке различных матерей схожи.

Пример 2: Физико-химические свойства miRNA

Грудное молоко оставляли при комнатной температуре в течение 24 часов или повторно подвергали замораживанию (-20°С) и оттаиванию до 3 раз. Уровни miRNA (miR-21, miR-181а) измеряли посредством qRT-PCR TaqMan. Результаты представлены на фиг.5. Кроме того, грудное молоко обрабатывали в растворе с низкой величиной рН (рН 1) в течение 3 часов, и уровень miRNA (miR-181а) измеряли посредством qRT-PCR TaqMan до и после обработки. Результаты представлены на фиг.6.

Кроме того, к грудному молоку добавляли раствор РНКазы А/Т (смешанный раствор РНКазы А (500 Ед/мл) и РНКазы Т1 (20000 Ед/мл), продукция фирмы Ambion) в объеме 2% грудного молока, смесь оставляли при 37°С в течение 3 часов и с помощью qRT-PCR TaqMan измеряли уровень miRNA (miR-181а) до и после обработки. Результаты представлены на фиг.7.

В качестве праймеров для qRT-PCR TaqMan использовали праймеры, производимые фирмой Applied Biosystems и идентифицированные следующими ID анализа.

- miR-181a: 000480

- miR-21: 000397

- Cel-miR-39: 000200

Было показано, что miRNA оказались относительно устойчивы к замораживанию-оттаиванию, низкой величине рН и РНКазам.

Пример 3: Определение пищевого рациона или вещества, обеспечивающего получение молока, обладающего иммунорегуляторным действием

Приобретали крыс SD с 9 по 10 день беременности, и крысам в тестируемой группе (n=3) перорально ежедневно в объеме 1 мл/день на крысу с 13 по 20 дни беременности вводили суспензию бактерий Bifidobacterium, Bifidobacterium longum BB536 (ATCC BAA-999) в PBS (фосфатно-солевом буфере) (1×10⁹ КОЕ/мл).

Кроме того, в качестве контрольной группы (n=3) ежедневно в объеме 1 мл на крысу вводили PBS. Штамм В. longum АТСС ВАА-999 может быть приобретен у American Type Culture Collection (Адрес: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America).

Все крысы родили в 21 день беременности, и у них в первый день после родов собирали молоко под анестезией с помощью эфира. Полученный образец молозива центрифугировали дважды при 1200 х g и 4°С в течение 10 минут для удаления липидного слоя и клеточного дебриса.

Затем супернатант центрифугировали при 21500 х g и 4°С в течение 40 минут и дополнительно центрифугировали в течение 1 часа при тех же условиях для удаления казеиновой фракции и, таким образом, получения молочной сыворотки. Суммарную РНК получали из образца полученной молочной сыворотки, используя набор miRNeasy Mini (продукция фирмы Qiagen).

Используя 100 нг полученного образца РНК, принятым способом определяли miRNA, используя систему микрочипового анализа (продукция фирмы Agilent Technologies). Результаты анализировали, используя GeneSpring GX11.0 (продукция фирмы Agilent Technologies).

При проведении статистического анализа данных по микрочипам, используя GeneSpring GX11.0, было обнаружено, что количество типов микроРНК, экспрессию которых подтверждали в тестируемой группе и контрольной группе, в которых их детектировали, составило в целом 155. Такие микроРНК представляют собой следующие. Кроме того, miR-150 не определялась.

МикроРНК, экспрессию которых подтверждали в тестируемой группе и контрольной группе, 155 типов:

miRNA, перечисленные с указаниями в скобках после miR-No., имеют подтипы, и подтипы, указанные в скобках, реально экспрессировались.

Кроме того, при статистическом сравнении, используя U-тест Манна-Уитни, экспрессируемых количеств вышеуказанных микроРНК в группе, которой ввели бактерии Bifidobacterium ВВ 536, и контрольной группе было обнаружено, что в группе, которой ввели бактерии Bifidobacterium ВВ 536, с вероятностью меньше чем 5% возросли уровни следующих 52 типов микроРНК. Размах вариации экспрессии miRNA представлен в таблице 11.

МикроРНК, повышение уровня которых подтверждалось в группе, которой ввели бактерии Bifidobacterium ВВ 536, 52 типа:

Как видно из результатов, представленных в таблице 11, было обнаружено, что размах вариации, обнаруженный для всех 52 типов микроРНК, повышение уровня которых подтверждалось, составил 1,2 раза или больше.

То есть было обнаружено, что на основе определения этих 52 типов микроРНК штамм бактерий Bifidobacterium ВВ536 мог быть выбран в качестве пищевого рациона или вещества, обеспечивающего получение молока, обладающего иммунорегуляторным действием.

Пример 4: Определение микроРНК, экспрессированных в молозиве крысы

Приобретали трех крыс F344 со сроком беременности 14 день. Все купленные крысы родили на 21 день беременности, и на второй день после родов у них под анестезией с помощью эфира получали молозиво.

Каждый образец молозива центрифугировали дважды при 1200 х g и 4°С в течение 10 минут для удаления липидного слоя и клеточного дебриса.

Затем супернатант центрифугировали при 21500 х g и 4°С в течение 40 минут и дополнительно центрифугировали в течение 1 часа при тех же условиях для удаления казеиновой фракции и, таким образом, получения молочной сыворотки.

Суммарную РНК получали из образца полученной молочной сыворотки, используя набор miRNeasy Mini (продукция фирмы Qiagen).

Полученный образец РНК в количестве 100 нг использовали в эксперименте на микрочипе (продукция фирмы Agilent Technologies) принятым способом. Результаты эксперимента с микрочипом анализировали, используя GeneSpring GX11.0 (продукция фирмы Agilent Technologies).

В результате было установлено, что помимо 155 видов микроРНК, подтвержденных в примере 3, экспрессировалось четыре вида микроРНК (miR-193*, miR-409-3р, miR-664, miR-877).

Пример 5: Определение микроРНК, экспрессированных в молозиве коровы

В качестве образцов молозива получали пять образцов молока коров Holstein в период с 1 по 3 день после отела. Дополнительно в качестве образцов обычного молока получали пять образцов молока коров Holstein в период с 8 дня по 8 месяц после отела.

Каждый из образцов молока (молозиво и обычное молоко) центрифугировали дважды при 1200 х g и 4°С в течение 10 минут для удаления липидного слоя и клеточного дебриса.

Затем супернатант центрифугировали при 21500 х g и 4°С в течение 40 минут и дополнительно центрифугировали в течение 1 часа при тех же условиях для удаления казеиновой фракции и, таким образом, получения молочной сыворотки.

Суммарную РНК получали из образца полученной молочной сыворотки, используя набор miRNeasy Mini (продукция фирмы Qiagen).

Полученный образец РНК в количестве 20 нг использовали в эксперименте c микрочипом (продукция фирмы Agilent Technologies) принятым способом. Результаты эксперимента с микрочипом анализировали, используя GeneSpring GX11.0 (продукция фирмы Agilent Technologies).

В результате, в образцах молозива и образцах обычного молока устанавливали экспрессию в целом 102 видов miRNA. В частности, среди 102 видов miRNA экспрессию 49 видов miRNA устанавливали лишь в молозиве.

Ниже упомянуты 49 видов микроРНК, экспрессию которых устанавливали лишь в образцах молозива.

МикроРНК, экспрессию которых устанавливали лишь в молозиве, 49 типов:

Промышленное применение

По настоящему изобретению может быть выбран пищевой рацион или вещество, содержащееся в нем, обеспечивающие получение молока, обладающего иммунорегуляторным действием. Настоящее изобретение также относится к способу продукции молочных продуктов, обладающих иммунорегуляторным действием. Композиция для перорального приема по настоящему изобретению обладает иммунорегуляторным действием и особенно может использоваться для грудных детей.

Реферат

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ выбора пищевого рациона предусматривает определение пищевого рациона или вещества, которые повышают количество микроРНК, присутствующее в молоке млекопитающего, используя корреляцию профилей микроРНК в молоке и пищевом рационе, полученном млекопитающим, или веществе, содержащемся в пищевом рационе, в качестве индекса. Сравнивают профили микроРНК в молоке, обнаруженные до и после получения пищевого рациона, и если количество по меньшей мере одного вида микроРНК, обнаруженное после получения, выше, чем обнаруженное до получения, полагают, что пищевой рацион повышает количество микроРНК в молоке. Причем способ дополнительно включает измерение профилей микроРНК в молоке и профилей микроРНК в сыворотке или плазме, и если количество микроРНК, содержащееся и в молоке, и в сыворотке или плазме, при получении пищевого рациона повышается в молоке в 1,47 раза или больше по сравнению с обнаруженным в сыворотке или плазме, полагают, что пищевой рацион повышает количество микроРНК в молоке. Использование группы изобретение позволяет получить грудное молоко, обладающее иммуностимулирующим действием. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 11 табл., 5 пр.

Формула