Приготовление полых микрокапсул - RU2193397C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к приготовлению полых белковых микрокапсул. Одним из назначений этих микрокапсул является улучшение качества ультразвуковой визуализации.

Уже некоторое время известен тот факт, что для эхокардиографии могут быть использованы воздушные пузырьки в организме.

В WO 92/18164 описывается сушка распылением раствора стенкообразующего вещества, предпочтительно белка, как, например, альбумина, с целью образования микрокапсул. В WO 94/08627 для образования более крупных микрокапсул уменьшают давление, при котором раствор распыляют в нагретой камере, или увеличивают период полужизни микрокапсул в кровотоке, например, включением поверхностно-активного вещества в распыляемый раствор, или нацеливают микрокапсулы на выбранную часть организма, например, суспендированием их в растворе электрически заряженного соединения.

В US-А-4420442 (Sands; PQ Соrрn. ) предлагается вводить органические растворители в дисперсии пленкообразующих твердых частиц до сушки суспензией распылением с целью образования полых микросфер, но растворители (например, целлозольв или диглим) были менее летучими, чем вода.

Нами было установлено, что вводя летучее соединение в водный раствор, который подвергают сушке распылением, можно образовывать микрокапсулы с улучшенными свойствами, при большем выходе, с более узким распределением по размеру и с более тонкими оболочками.

Согласно одному аспекту изобретения предлагается способ образования микрокапсул, содержащий: (I) получение раствора водорастворимого вещества в водном растворителе и (II) распыление указанного раствора в газе для испарения водного растворителя и, следовательно, образования полых микрокапсул, отличающийся тем, что водный раствор содержит жидкость с большей летучестью, чем у воды.

К числу подходящих летучих жидкостей относятся этанол (предпочтительная летучая жидкость) (точка кипения 78, 3^oС), метанол (т.к. 64,5^oС) и ацетон (т. к. 56^oС). Летучая жидкость должна действовать как растворитель для стенкообразующего вещества и смешиваться с водой при используемых соотношениях.

Относительное содержание летучей жидкости в водном растворе будет меняться в соответствии с видом летучего соединения, концентрации и вида пленкообразующего вещества, температуры и давлений, при который должен распыляться раствор, и желаемого продукта из микрокапсул. Относительное содержание летучей жидкости в растворе обычно составляет 0,1-80 об.%/об., предпочтительно 1-50 об. %/об. и наиболее предпочтительно 5-30 об.%/об., например, около 20 об. %/об. Можно использовать смеси летучих жидкостей, причем в этом случае эти процентные содержания означают общее содержание летучей жидкости.

Сушка распылением может представлять собой одностадийный процесс, например, для немедленного получения желаемого продукта в виде микрокапсул. Альтернативно непосредственно полученный продукт можно подвергнуть дополнительным стадиям обработки, например, нагреванию для дальнейшего сшивания и перевода в нерастворимую форму вещества в белковой оболочке микрокапсул. Это представляет собой двухстадийный процесс.

Для получения продукта, который должен будет вводиться в кровоток человека, например, в качестве эхогенного контрастного агента при ультразвуковых диагностических методах (что является одним из назначений продукта), весь процесс предпочитается проводить в стерильных условиях. Таким образом, белковый раствор является стерильным и непирогенным, газ в камере вначале пропускают через 0,2 мкм фильтр, распылительную сушилку вначале стерилизуют в автоклаве и т.д. Альтернативно (или также) можно стерилизовать конечный продукт, подвергая его действию ионизирующего излучения.

Стенкообразующим веществом является водорастворимое вещество, предпочтительно белок (термин, при использовании включающий невстречающиеся в природе полилептиды и полиаминокислоты). Например, им может быть коллаген, желатин или (сывороточный) альбумин, причем в каждом случае (если микрокапсулы должны вводиться в людей) предпочтительно человеческого происхождения (т.е. извлеченные из людей или по структуре соответствующие человеческому белку) либо полилизин или полиглутамат. Он может быть человеческим сывороточным альбумином /ЧА/, полученным из донорских доз или при брожении, вызванном микроорганизмами (включая клеточные линии), которые преобразовывали или подвергали трансфекции для экспрессии ЧА. Альтернативно можно использовать простые или сложные углеводороды, простые аминокислоты или жирные кислоты, например лизин, маннит, декстран, пальмитиновую кислоту или бегеновую кислоту.

Способы получения ЧА (этот термин включает в себя аналоги и осколки человеческого альбумина, например, описанные в ЕР-А-322094), и полимеры мономерного альбумина (описаны, например, в ЕР-А-201239 и ЕР-А-286424). Все ссылки приведены здесь для сведения. "Аналоги и осколки" ЧА включают в себя все полипептиды, (I) которые способны образовывать микрокапсулы при изобретенном способе и (II) из которых непрерывная область, по крайней мере, 50% (предпочтительно, по крайней мере, 75, 80, 90 или 95%) аминокислотной последовательности является, по крайней мере, 80% гомологической (предпочтительно, по крайней мере, 90, 95 или 90% гомологической) с непрерывной областью, по крайней мере, 50% (предпочтительно 75, 80, 90% или 95%) природно-идентичного человеческого альбумина. Можно использовать ЧА, который произведен методами ДНК-рекомбинации. Таким образом, ЧА может быть произведен экспрессией ЧА-кодирующей нуклеотидной последовательности в дрожжах или в другом микроорганизме и очисткой продукта известным способом. Такое вещество не имеет жирных кислот, ассоциируемых с веществом, произведенном из сыворотки. Предпочтительно, чтобы ЧА был по существу свободен от жирных кислот, т.е. содержал менее 1% от содержания жирных кислот в веществе, полученном из сыворотки. Предпочтительно, чтобы жирная кислота была необнаруживаемой в ЧА.

Водный раствор или дисперсия предпочтительно содержит 0,1-50 вес.%/об., более предпочтительно около 1,0-25,0 вес.%/об. или 5,0-30,0 вес./об. белка, особенно когда этим веществом является альбумин. Оптимальным является около 5-15 вес. %/об. Можно использовать смеси стенкообразующих веществ, причем в этом случае процентные содержания, приведенные в последних двух предложениях, относятся к общему содержанию стенкообразующего вещества.

Кроме стенкообразующего вещества, воды и летучей жидкости, распыливаемый состав может содержать и другие вещества. Таким образом, водная фаза может в качестве стабилизаторов содержать 1-20 вес.% водорастворимых гидрофильных соединений, подобных сахарам и полимерам, например, поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), полиэтиленгликоль (ПЭГ), желатин, полиглутаминовую кислоту и полисахариды, как, например, крахмал, декстран, агар, ксантан и т.п.

Могут быть введены функциональные добавки, например, в количестве 1,0-40,0 вес. %/вес., как, например, рентгеновские контрастные вещества, например, "гексабрикс" (иоксагловая кислота), "оптирэй" (иоверсол), "омнипак" (иогексол) или "изовайс" (иопамидол), или вещества для получения изображения методом магнитного резонанса (например, коллоидальная окись железа или хелатные соединения гадолиния, например, гадопентетовая кислота).

В качестве жидкого носителя могут быть использованы сходные водные фазы, в которых конечный продукт в виде микрокапсул находится во взвешенном состоянии до его использования. Можно использовать поверхностно-активные вещества (0,1-5 вес.%), включая большинство физиологически приемлемых поверхностно-активных веществ, например, яичный или соевой лецитины либо синтетические лецитины, как, например, насыщенные синтетические лецитины, в частности, димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин, или ненасыщенные синтетические лецитины, в частности, диолеилфосфатидилхолин или дилинолеилфосфатидилхолин. В число других поверхностно-активных веществ входят свободные жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот с полиоксиалкиленовыми соединениями, например, с полиоксипропиленгликолем и полиоксиэтиленгликолем; простые эфиры жирных спиртов с полиоксиалкиленовыми гликолями; сложные эфиры жирных кислот с полиоксиалкилированными сорбитаном; мыла; глицеролполиалкиленовый стеарат; глицеролполиоксиэтиленовый рицинолеат; гомо- и сополимеры полиалкиленгликолей; полиэтоксилированные соевое масло и касторовое масло, а также гидрогенизированные производные; простые и сложные эфиры сахарозы или других углеводородов с жирными кислотами, жирными спиртами, необязательно полиоксиалкилированные; моно-, ди- и триглицериды насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, глицериды соевого масла и сахарозы. Однако предпочитается, чтобы жидкий носитель не содержал поверхностно-активное вещество.

Для изменения физических свойств стенки микрокапсул, например, диспергируемости, эластичности и водопроницаемости, в нее могут быть введены добавки.

Среди полезных добавок можно отметить соединения, которые могут "гидрофобизировать" стенку для уменьшения ее проницаемости, как, например, жиры, воска и высокомолекулярные углеводороды. Добавками, которые увеличивают диспергируемость микрокапсул в инъецируемом жидком носителе, являются амфипатоновые соединения, например, фосфолипиды; они также увеличивают водопроницаемость и скорость биологического разложения. Однако предпочитается, чтобы микрокапсулы не содержали добавки, которые увеличивают диспергируемость микрокапсул, потому что, как мы установили, они не требуются, по крайней мере, тогда, когда микрокапсулы изготовлены из альбумина.

Количество добавок, вводимых в стенку, весьма изменчиво и зависит от потребностей. В некоторых случаях вообще не используют никаких добавок; в других случаях возможно, что количества добавок могут достигать около 40,0 вес.% вещества стенки.

Раствор стенкообразующего вещества распыляют и сушат распылением любым подходящим способом, который приводит к получению раздельных микрокапсул диаметром 0,05-50,0 мкм. Эти цифры относятся, по крайней мере, к 90% объема микрокапсул, диаметр которых измеряли с помощью устройства "Колтер Малтисайзер П". Термином "микрокапсулы" обозначаются полые частицы, заключающие в себе пространство, которое заполнено газом или паром, но не какими-либо твердыми веществами. Не образуются пористые частицы, похожие на кондитерские изделия, продаваемые в Великобритании под зарегистрированным товарным знаком "Молтизерс". Пространство в микрокапсулах необязательно должно быть полностью закрытым (хотя это предпочитается), а микрокапсулы необязательно должны быть точно сферическими, хотя они и являются в общем сферическими. Если микрокапсулы не являются сферическими, то тогда вышеупомянутые величины диаметров относятся к диаметру соответствующей сферической микрокапсулы, имеющей одинаковую массу и охватывающей одинаковый объем пустого пространства, как и несферическая микрокапсула.

Распыление представляет собой образование аэрозоля из состава посредством, например, нагнетания состава под давлением, по крайней мере, через одно отверстие или посредством использования центробежного распылителя в камеру с теплым воздухом или другим инертным газом. Камера должна быть достаточно большой, чтобы самые крупные впрыскиваемые капли не ударялись о стенки камеры до высыхания. Если микрокапсулы предназначены для инъекции в кровоток с целью получения диагностического изображения, то тогда газ или пар в камере должен быть чистым (т. е. предпочтительно стерильным и апирогенным) и нетоксичным, когда он вводится в кровоток в количествах, сопутствующих введению микрокапсул при эхокардиографии. Скорость испарения жидкости из белкового состава должна быть достаточно высокой для образования полых микрокапсул, но не такой высокой, чтобы приводить к разрыву микрокапсул. Скорость испарения можно регулировать изменением расхода газа, концентрации белка в белковом составе, скорости подачи раствора и, что наиболее важно, температуры газа, контактирующего с аэрозолем. При сушке распылением небольшие распределения по размеру достигаются при сочетании низкого расхода подаваемого материала с очень высокой степенью распыления в высушивающем воздухе. Результатом является производство микрокапсул очень ограниченного размера и с узким распределением по размеру. Несколько исследователей вывели уравнения для определения среднего размера капель, выходящих из воздушных сопел; простым уравнением для различных параметров, которые влияют на средний размер капель, являются следующее:
D=A/(V²•d)^a+B•(M_air/M_liq)^-b
где D - средний размер капель;
А - константа, связанная с конструкцией сопла;
В - константа, связанная с вязкостью жидкости;
V - относительная скорость воздуха между жидкостью и соплом;
d - плотность воздуха;
M_air и M_liq - масса потока воздуха и жидкости;
а и b - константы, связанные с конструкцией сопла.

(Во избежание сомнения V возводится в квадрат, (V² •d) возводится в степень "а" и (M_air/M_liq) возводится в степень минус "в").

Ясно, что для любой данной конструкции сопла размер капель в наибольшей степени зависит от относительной скорости в сопле и одновременно от массового соотношения воздуха к жидкости. Для большинства обычных применений сушки соотношение воздуха к жидкости находится в пределах 0, 1-10, и при этих соотношениях средний размер капель, по-видимому, составляет 15-20 мкм. Для изготовления микрокапсул в описанном здесь интервале размеров мы обычно используем соотношения воздуха к жидкости в пределах 20-1000. При изготовлении частиц при высоких соотношениях воздуха к жидкости они оказываются чрезвычайно небольшими по сравнительным стандартам и с очень узкими распределениями по размеру. При изготовлении микрокапсул при меньших соотношениях воздуха к жидкости образуются несколько более крупные частицы, но они тем не менее по-прежнему имеют узкие распределения по размеру, которые лучше, чем у микрокапсул, изготовленных эмульсионными методами.

При концентрации альбумина в воде в количестве 5,0-25,0% для обеспечения пустотелости обычно достаточна температура вводимого газа, по крайней мере, около 100^oС, предпочтительно, по крайней мере, 110^oС, причем эта температура может быть такой высокой, как 250^oС, без разрыва капсул. Оптимальной, по крайней мере, для альбумина является температура около 180-240^oС, предпочтительно около 210-230^o С и наиболее предпочтительно около 220^o С. При одностадийном варианте способа по изобретению эта температура может оказаться достаточной для перевода в нерастворимую форму, по крайней мере, части (обычно наружной части) стенкообразующего вещества и часто по существу всего стенкообразующего вещества. Так как температура газа, встречаемого аэрозолем, будет зависеть также от скорости, с которой подается аэрозоль, и от содержания жидкости в белковом составе, то можно регулировать температуру на выходе для обеспечения соответствующей температуры в камере. Как установлено, подходящей является температура на выходе, равная 40-150^oС.

При двухстадийном способе, если стенкообразующим веществом является белок, промежуточные микрокапсулы обычно содержат 96-98% мономерного белка и сохраняют такую же растворимость в воде, как и у самого стенкообразующего вещества. Они имеют ограниченный срок существования в организме при ультразвуковом получении изображения. Однако они могут быть использованы для ультразвукового получения изображения или они могут храниться и транспортироваться до осуществления второй стадии двухстадийного способа. Поэтому они составляют другой аспект изобретения.

При второй стадии способа промежуточные микрокапсулы, приготовленные на первой стадии, фиксируют и делают менее водорастворимыми, с тем чтобы они дольше сохранялись, не будучи при этом настолько нерастворимыми и инертными, что не являются биологически разрушаемыми. При этой стадии также упрочняют микрокапсулы, с тем чтобы они обладали лучшей способностью противостоять жестким условиям их введения, сосудистому сдвигу и вентрикулярному давлению. Если микрокапсулы разрываются, то становятся менее эхогеничными. Как показали Шнайдер и др. (1992) Invest. Radiol, 27, 134-139, известные альбуминовые микрокапсулы, обработанные ультразвуком, не обладают этой прочностью и быстро теряют свою эхогеничностъ, когда подвергаются давлениям, типичным для левого желудочка. При второй стадии способа можно применять нагрев (например, СВЧ-нагрев, нагрев лучистой теплотой или горячим воздухом, например, в обычном термостате), ионизирующее облучение (например, с дозой гамма-лучей в 10, 0-100,0 кГр ) или химическое сшивание в растворителях, используя, например, формальдегид, глутаральдегид, окись этилена или вещества для сшивания протеинов, и проводить их с по существу сухими промежуточными микрокапсулами, образованными при первой стадии, или с суспензией таких микрокапсул в жидкости, в которой микрокапсулы не растворимы, например, в подходящем растворителе. При одностадийном варианте способа сшивающее вещество, как, например, глутаральдегид можно распылять в камере для сушки распылением или можно вводить в белковый состав непосредственно перед распыляющим устройством. Альтернативно температура в камере может быть достаточно высокой для перевода микрокапсул в нерастворимую форму.

Конечный продукт, измеренный таким же образом, как и промежуточные микрокапсулы, может, по желанию, состоять из микрокапсул, имеющих диаметр 0,1-50,0 мкм, но при способе по изобретению можно получить микрокапсулы диаметром 0,1-20,0 мкм и особенно 1,0-8, 0 мкм, которые являются предпочтительными для эхокардиографии. Необходимо учитывать тот факт, что на второй стадии может изменяться размер микрокапсул, определенный на первой стадии изготовления микрокапсул.

Было установлено, что способ по изобретению можно контролировать с целью получения микрокапсул с желаемыми свойствами. Таким образом, можно изменять давление, под которым белковый раствор подают в распылительное сопло, например, в пределах 1,0-20,0•10⁵ Па, предпочтительно 5,0-10,0•10⁵ Па и наиболее предпочтительно около 7,5• 10⁵ Па. Точно также можно изменять расход жидкости. Другие параметры можно изменять так, как описано выше и ниже. Таким образом, можно получить новые микрокапсулы. Как нами установлено, микрокапсулы, образованные из исходных материалов, содержащих летучие компоненты, представляют собой более целые полые капсулы с более гладкой поверхностью и с меньшими размерами, чем у капсул, образованных при отсутствии летучего компонента. В частности, может быть получен продукт, имеющий высокую отражательную способность относительно количества стенкообразующего вещества. Например, однородная суспензия из 13 мкг/мл микрокапсул может обеспечить отражательную способность, по крайней мере, -1,0 дБ при использовании ультразвука с частотой 3,5 МГЦ. Отражательные способности более -0, 3 могут быть ненужными, а подходящей является отражательная способность около -0,7÷0,5.

Предпочтительно, чтобы было сшито, по крайней мере, 50% белка в стенках микрокапсул. Предпочтительно, чтобы было достаточно сшито, по крайней мере, 75, 90, 95, 98,0, 98,5 или 99% белка для обеспечения его сопротивления экстракции в 1%-ном растворе НСl в течение 2 мин. Экстрагированный белок обнаруживают при использовании количественного анализа на белок по методу Брэдфорда с применением кумаси голубого. Степень сшивания регулируют изменением нагрева, облучения или химической обработки белка. В процессе сшивания протеиновый мономер образует поперечные связи и быстро становится недействующим при простом процессе растворения, что обнаруживалось путем гельпроникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или гель-электрофореза, как это показано ниже в примере 3. Продолженная обработка приводит к дальнейшему сшиванию уже сшитого материала, так что он становится недействующим при вышеописанной экстракции посредством НСl. В период нагревания при 175^oС микрокапсулы из ЧА в соответствии с изобретением за 20 мин утрачивают около 99% белка, способного экстрагироваться под действием НСl, в то время как во время нагревания при 150^oС в течение 20 мин устраняется только около 5%, за 30 мин - 47,5%, 40 мин - 83%, 60 мин - 93%, 80 мин - 97% и 100 мин - 97,8% белка, способного экстрагироваться под действием НСl. Поэтому для достижения хороших уровней сшивания микрокапсулы можно нагревать при 175^oС в течение, по крайней мере, 17-20 мин, при 150^oС в течение, по крайней мере, 80 мин и при других температурах в течение соответственно более длительных или более коротких периодов времени.

Микрокапсулы по настоящему изобретению можно хранить сухими в присутствии или в отсутствии добавок, улучшающих их сохранение, предотвращающих коалесценцию или способствующих повторному суспендированию. В качестве добавок можно выбрать в количестве от 0,1 до 200,0 вес.% водорастворимые физиологически совместимые соединения, как например, маннит, галактоза, лактоза или сахароза, либо гидрофильные полимеры, например, декстран, ксантан, агар, крахмал, поливинилпирролидон, полиглутаминовая кислота, поливиниловый спирт и желатин. Полезное время жизни микрокапсул в инъецируемом жидком носителе, т. е. период времени, в течение которого наблюдаются полезные эхографические сигналы, можно регулировать по продолжительности от нескольких минут до нескольких месяцев в зависимости от потребностей; это можно делать, контролируя пористость, растворимость или степень сшивания вещества стенки. Эти параметры можно контролировать правильным выбором стенкообразующих веществ и добавок и регулированием скорости испарения и температуры в камере для сушки распылением.

Для уменьшения до минимума какой-либо агломерации микрокапсул они могут быть перетерты с подходящим инертным наполнителем, используя центробежную стержневую мельницу "Фрич", оснащенную 0,5 мм ситом, или воздушную ударную струйную мельницу " Глен Крестон ". Подходящими наполнителями являются тонкоизмельченные порошки, которые являются инертными и пригодны для внутривенного применения, как, например, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, галактоза, мальтоза или хлорит натрия. Перетертую смесь микрокапсул с наполнителем можно суспендировать в водной среде с целью способствования удалению непригодных и поврежденных микрокапсул или без дальнейшей обработки поместить в конечные контейнеры для реализации. Чтобы облегчить последующее восстановление в водной фазе, можно для предотвращения агломерации ввести поверхностно-активное вещество в следовых количествах на стадии перетирания и/или в водную среду. В число анионных, катионных и неионных поверхностно-активных веществ, пригодных для этой цели, входят полоксамеры, сорбитановые эфиры, полисорбаты и лецитин.

Суспензии из микрокапсул можно затем дать возможность разделиться посредством флотации или ее можно центрифугировать для осаждения любых поврежденных частиц с поверхностными дефектами, которые при использовании частиц приводили бы к их заполнению жидкостью, так, что они не были бы эхогеничными.

Суспензию из микрокапсул затем можно вновь перемещать для обеспечения равномерного распределения частиц, промыть и восстановить в буфере, пригодном для внутривенной инъекции, как, например, изотоническом манните. Суспензию можно обезвожить для сушки вымораживанием и последующей стерилизации, например, гамма-облучением, сухим нагревом или окисью этилена.

Альтернативным способом деагломерации микрокапсул, переведенных в нерастворимую форму или фиксированных, является суспендирование их непосредственно в водной среде, содержащей подходящее поверхностно-активное вещество, например, полоксамеры, сорбитановые эфиры, полисорбаты и лецитин. Деагломерации затем можно достигнуть, используя подходящий гомогенизатор.

Суспензии из микрокапсул можно затем дать возможность разделиться посредством флотации или ее можно центрифугировать для осаждения дефектных частиц, как описывалось выше, и подвергнуть дальнейшей вышеописанной обработке.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения продукт стадии термофиксации является деагломерированным посредством вышеописанного перетирания.

Хотя микрокапсулы по этому изобретению можно сбывать в сухом состоянии, особенно когда они предназначены для применения при ограниченном сроке жизни после инъекции, может оказаться желательным продажа готовых препаратов, т.е. суспензий микрокапсул в водном жидком носителе, готовых для инъекции.

Однако продукт обычно поставляется и хранится в виде сухого порошка и суспендируется в подходящей стерильной, непирогенной жидкости непосредственно перед введением. Суспензию обычно применяют путем инъекции около 1,0-10,0 мл в соответствующую вену, как, например, локтевую вену или в другой кровяносный сосуд. Подходящей является концентрация микрокапсул в размере около 1,0•10⁵-1,0• 10¹² частиц/мл, предпочтительно около 5,0•10⁵-5,0•10⁹.

Хотя ультразвуковой способ получения изображения можно применять в отношении различных систем и органов животного и человеческого организма, одним из его главных применений является получение изображений ткани миокарда и картин кровоснабжения или кровотока.

При этом способе применяют ультразвуковое сканирующее оборудование, состоящее из сканера и устройства для получения изображения. Это оборудование создает визуальные изображения заранее определенной области, в данном случае - сердечной области человеческого тела. Обычно преобразователь помещают прямо на кожу над областью, изображение которой необходимо получить. Сканер содержит различные электронные устройства, включая ультразвуковые преобразователи. Преобразователь создает ультразвуковые волны, которые совершают секторное сканирование области сердца. Ультразвуковые волны отражаются различными частями области сердца, воспринимаются принимающим преобразователем и обрабатываются в соответствии с методами импульс-эхо, известными в технике. После обработки сигналы направляются для наблюдения в устройство для получения изображения (также хорошо известное в технике).

При способе по настоящему изобретению после "приготовления" пациента и установки сканера на место делают инъекцию суспензии из микрокапсул, например, через вену руки. Контрастное вещество течет по вене к правой венозной стороне сердца, по главной легочной артерии, ведущей к легким, через легкие, по капиллярам, в легочную вену и, наконец, в левое предсердие и левую желудочковую полость сердца.

При использовании микрокапсул по этому изобретению можно проводить наблюдения и диагнозы в отношении количества времени, необходимого для прохождения крови через легкие, особенностей кровотока, размера левого предсердия, компетенции митрального клапана (который разделяет левое предсердие и левый желудочек), размеров левой желудочковой полости и нарушений в движении стенки. По выбросу контрастного вещества из левого желудочка можно также анализировать компетенцию аортального клапана и, кроме того, долю выброса или процентное количество объема, выброшенного из левого желудочка. Наконец, контрастные изображения ткани покажут возможные области, которые не имеют достаточного кровоснабжения.

Резюмируя, такая картина изображений будет способствовать диагностике необычной особенности кровотока в сердце, вальвулярной компетенции, размеров полости и движения стенки и будет потенциальным показателем кровоснабжения миокарда.

Путем внутривенных инъекций микрокапсул можно получить изображения левых отделов сердца. Альбуминовые микрокапсулы при их инъекции в периферическую вену могут быть способны к транслегочному прохождению. В результате становится возможным эхокардиографическое контрастирование полости левого желудочка (ЛЖ), а также ткани миокарда.

Кроме сканера, кратко описанного выше, существуют другие ультразвуковые сканеры, например, которые описаны в патентах США 4134554 и 4315435. Эти патенты, в основном, относятся к различным способам, включая динамическую эхографию по сечениям (ДСЭ ) для получения последовательных двухмерных изображений тонких слоев сечения животного или человеческого организма посредством ультразвуковой энергии при частоте кадров, достаточной для возможности динамической визуализации движущихся органов. Аппараты, используемые при ДСЭ, обычно называют сканерами типа ДСЭ. Они передают и принимают короткие звуковые импульсы в виде узких лучей или линий. Уровень отраженных сигналов является функцией времени, которое преобразуется в положение с использованием номинальной скорости звука и воспроизводится на электронно-лучевой трубке или других подходящих устройствах способом, отчасти аналогичным способу воспроизведения на радиолокационных или звуковых индикаторных устройствах. Хотя ДСЭ можно использовать для получения изображений многих органов и систем, включая печень, желчный пузырь, поджелудочную железу и почку, его часто применяют для получения зрительного образа ткани и важнейших кровеносных сосудов сердца.

Микрокапсулы можно использовать для получения изображений самых разнообразных областей, даже при инъекции микрокапсул в периферическом венозном месте. К числу этих областей относятся (без ограничения): 1) система венозного оттока к сердцу; 2) характеристика ткани и кровоснабжения миокарда во время теста на переносимость физической нагрузки или т.п. и 3) ткань миокарда после перорального приема внутрь или внутривенной инъекции лекарственных средств, предназначенных для увеличения кровотока к ткани. Кроме того, микрокапсулы могут быть полезными при выявлении изменений в кровоснабжении ткани миокарда вследствие таких вмешательств, как, например, 1) пересадка вены в качестве коронарной артерии; 2) реконструкция коронарной артерии (расширение баллонным катетером суженной артерии); 3) использование тромболитических веществ (как например, стрептокиназы) для растворения сгустков в коронарных артериях; или 4) дефекты или изменения в кровоснабжении вследствие недавнего сердечного приступа.

Кроме того, при коронарографии (или ангиографии с цифровым вычитанием) инъекция микрокапсул может предоставить данные в отношении особенностей кровоснабжения ткани, которые увеличивали и дополняли бы данные, полученные при ангиографии и лишь идентифицирующие анатомию кровеносных сосудов.

Благодаря использованию микрокапсул по настоящему изобретению можно повысить качество изображений других экстракардиальных органов и систем, включая печени, селезенки и почки, которые в настоящее время получают с помощью ультразвуковых способов, и/или получать новые изображения, показывающие особенности кровоснабжения и кровотока, которые ранее не поддавались показу при использовании известных ультразвуковых способов получения изображений.

Предпочтительные стороны настоящего изобретения будут теперь описаны в качестве примера и со ссылкой на фиг.1, которая является перспективным видом спереди и сбоку (с частичным вырывом) подходящего устройства для сушки распылением на первой стадии способа по изобретению.

Пример 1
Оборудование для сушки распылением
Подходящая распылительная сушилка (фиг.1) поставляется фирмой "А/С Ниро Атомайзер", Себорг, Дания под торговым обозначением "Мобайл Майнэр". Распылительная сушилка содержит в себе резервуар 1 для белкового раствора и потолочный воздухораспределитель 2, который обеспечивает эффективный контроль за режимом потока воздуха. Закрученный поток воздуха направляется вокруг вращающегося распылителя или соплового распылителя 3 (например, типа "М-02В Майнер"), приводимого в действие воздушной турбиной при давлении воздуха от минимума 4,0•10⁵ Па до максимума в 6,0•10⁵ Па. При давлении воздуха в 6,0•10⁵ Па частота вращения колеса распылителя достигает приблизительно 33000 об/мин. Включение и отключение подачи сжатого воздуха в распылитель осуществляются посредством клапана, расположенного на пульте управления 9. Максимальный расход сжатого воздуха, подаваемого в распылитель, составляет 17 нм³/ч при давлении 6,0• 10⁵ Па. Все части, входящие в соприкосновении с жидким подаваемым материалом и порошком, изготовлены из нержавеющей стали AISI 316, за исключением подающей трубы насоса и колеса распылителя, которое изготовлено из нержавеющей стали AISI 329, чтобы противостоять большой центробежной силе.

Установка имеет ступени 5 для доступа к верху камеры и включатель 6 воздушного клапана для приведения в действие пневматического подъемного устройства, которое поднимает крышку камеры.

Сушильная камера изнутри сделана из нержавеющей стали AISI 316, с хорошим изолированием минеральной ватой "Роквулл" (зарегистрированный товарный знак) и покрыта снаружи листовым материалом из низкоуглеродистой стали. Крыша сушильной камеры изготовлена изнутри из нержавеющей стали AISI 316 и снаружи из нержавеющей стали AISI 304.

Воздухораспределитель 2, изготовленный из нержавеющей стали AISI 304, используется для распределения воздуха в сушильной камере с целью достижения наибольшего возможного сушильного эффекта. Воздухопровод 4, изготовленный из нержавеющей стали AISI 316, обеспечивает вторичную транспортировку отходящего воздуха и порошка в циклон 7, который изготовлен из нержавеющей стали AISI 316 и предназначен для разделения порошка и воздуха.

Закрывающий клапан типа дроссельной заслонки, также изготовленный из нержавеющей стали AISI 316 и имеющий прокладку из силиконовой резины, используется для выгрузки порошка снизу циклона в стеклянную банку 8 для сбора порошка, плотно установленную под циклоном посредством пружинного устройства.

Центробежный вытяжной вентилятор 10, изготовленный из силумина и снабженный 3-фазным асинхронным электродвигателем с короткозамкнутым ротором мощностью 0,25 кВт и клиноременной передачей с ограждением ремней, протягивает воздух и порошок через сушильную камеру и циклон. Поток воздуха регулируют заслонкой 11.

Воздухонагреватель 12 нагревает сушильный воздух с использованием электричества (общее потребление - 7,5 кВт/ч, плавное регулирование) и может обеспечить температуры приточного воздуха до около 350^oС, хотя такие температуры, в общем, являются слишком высокими для приготовления микрокапсул по изобретению (см. таблицу 1).

Может быть применена установка для распыления в сопле с подачей в него двух текучих сред, которое изготовлено из нержавеющей стали AISI 316 и состоит из входной трубы с соплодержателем и сопла, размещаемого на потолке сушильной камеры. Установка включает в себя водомаслоразделитель, редукционный клапан и манометр для сжатого воздуха, подаваемого в сопло для двух текучих сред. Расход сжатого воздуха: 8-15 кг/ч при давлении 0, 5-2,0•10⁵ Па.

Подходящим питающим насосом для транспортировки стенкообразующего состава, подаваемого в распылитель, является перистальтический насос. Насос снабжен электродвигателем (1•220 В, 50 Гц, 0,18 кВт) и бесступенчатой зубчатой передачей для регулирования вручную. Питающая труба, изготовленная из силиконового шланга, ведет от питающего резервуара (местная подача) через питающий насос к распылителю.

Для обработки входящего сушильного газа с целью его полной очистки используется абсолютный воздушный фильтр, состоящий из фильтра для предварительной очистки, корпуса фильтра из нержавеющей стали и абсолютного воздушного фильтра.

Способ
10,0 вес. %/об. раствор стерильного, апирогенного ЧА в апирогенной воде (пригодной для инъекции) с 25,0 об.%/об. этанола перекачивали в сопло соплового распылителя для двух текучих сред, установленного в вышеописанной промышленной распылительной сушилке. Скорость работы перистальтического насоса поддерживали при подаче приблизительно 4,0 г/мин, с тем чтобы при температуре приточного воздуха 220^oС температура отходящего воздуха поддерживалась равной 95^oС.

В сопло для распыления двух текучих сред подавали сжатый воздух при давлении 2,0-6,0•10⁵ Па. При этом интервале давлений получали микрокапсулы со средним размером в 2,0-3,0 мкм.

Увеличение среднего размера частиц (посредством снижения давления распыления) обычно приводило к увеличению количества микрокапсул размером более 100 мкм (см. таблицу 2).

В этом конкретном примере для образования микрокапсул использовали давление в 5,0•10⁵ Па.

При второй стадии способа 5 г микрокапсул нагревали в стеклянном химическом стакане, используя снабженный вентилятором термостат "Галленкамп". Температура 175^oС в течение 1 ч была достаточной для получения микрокапсул с 100%-ной фиксацией, как это было определено посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Результатом этой термофиксации было увеличение эхогеничной полужизни в склянке от нескольких секунд до свыше 30 мин. Изменяя температуру и продолжительность выдерживания в термостате, можно изменять степень фиксации в пределах между около 1 и 100%.

Вслед за термофиксацией микрокапсулы деагломерировали и диспергировали в воде одним из двух способов. Способ 1 включал в себя вначале перемешивание термофиксированных сфер с равным весовым количеством тонкоизмельченной лактозы (средний диаметр 5 мкм). Смесь затем пропускали через центробежную мельницу "Фрич" с 0,5 мм ситом и 12-зубьевым ротором. Перетертые сферы собирали и повторно пропускали через мельницу, чтобы обеспечить полное перемешивание. Перетертый порошок затем вновь суспендировали в воде, содержащей 1 мг/мл "Плюроник Ф 68" (зарегистрированный товарный знак). Обычно 10 г микрокапсул и лактозы добавляли к 100 мл воды и "Плюроник Ф 68". Способ деагломерирования 2 включает в себя добавление 5 г термофиксированных микрокапсул к 100 мл воды, содержащей 100 мг "Плюроник Ф 68". Микрокапсулы диспергировали с использованием гомогенизатора "Сильверсон" (модель L4R с 2,54 см трубчатым гомогенизирующим щупом и ситом с большим сдвигающим усилием). Гомогенизировали в течение 60 с.

Вновь суспендированные сферы разделяли на целые (газосодержащие) и разрушенные сферы, используя способ флотации. Газосодержащие сферы, понятно, всплывали к поверхности за 1 ч. Их декантировали от осаждающейся фракции, которая не содержит необходимый газ.

Процесс разделения может быть ускорен центрифугированием. Для разделения двух фракций достаточно 30-секундное центрифугирование при 5000g.

После отделения целые микрокапсулы подвергали сушке вымораживанием в присутствии лактозы и "Плюроник Ф 68". Оптимальный режим сушки вымораживанием включал в себя повторное суспендирование 30 мг микрокапсул в 5 мл воды, содержащей 50 мг лактозы и 5 мг "Плюроник Ф 68". Микрокапсулы, высушенные вымораживанием, могут быть вновь диспергированы в жидкости (например, воде, физиологическом растворе) для получения монодисперсного распределения.

Пример 2
Микрокапсулы приготавливали так, как и в Примере 1, но при условиях, подробно описанных ниже.

В качестве исходного материала использовали 100±10 мг/мл раствора стерильного, апирогенного сывороточного человеческого альбумина в апирогенной воде (пригодной для инъекции) с 25 вес.%/вес. этанола.

Используя перистальтический насос, перекачивали альбуминовый исходный материал со скоростью 4±1,5 г/мин, с тем чтобы при температуре на входе, равной 220±0,5^oС, поддерживать на выходе температуру, равную 80±10^oС.

Дополнительные условия сушки распылением были следующими: поток воздуха - 50±2%; избыточное давление распыления - 8,0±0,5•10⁵ Па; поток сушильного воздуха - 9±2 мм вод.ст.

Изготовленные микрокапсулы термофиксировали при температуре 176±2^oС в течение 55±5 мин в 5±1 г аликвотных пробах, используя 250 мл химические стаканы из нержавеющей стали.

После термофиксации микрокапсулы подвергали деагломерации. Добавляли к объединенным микрокапсулам в соотношении 2:1, перемешивали и перетирали в воздушной ударной струйной мельнице "Глен Крестон".

Деагломерированными микрокапсулами заполняли стеклянные пузырьки, которые продували азотом, герметизировали и закрывали колпачками. Продукт окончательно стерилизовали облучением при дозе 25-35 кГр.

Пример 3
Количественный анализ свободного мономерного альбумина в микрокапсулах
1 мл этанола добавляли к 100 мг микрокапсул в 20 мл стеклянной склянке и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с. К этой суспензии добавляли 19 мл Н₂О.

Смесь в течение 20 с центрифугировали в лабораторной центрифуге ("Гильсон"), после чего анализировали чистую фракцию. Анализ проводили, загружая автоматически 50 мл этой фракции в прибор типа "Shimadzu C6A" для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и хроматографировали на гельпроникающей хроматографической колонке ТСК при объемной скорости потока 1 мл/мин с использованием буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0).

Регистрировали пиковые высоты, представляющие мономерный ЧА, и использовали их для определения концентрации мономера с применением стандартной кривой между 1 и 10 мг/мл мономерного ЧА.

Процент свободного мономерного ЧА вычисляли, измеряя концентрацию мономера в фиксированных микрокапсулах и представляя эту цифру в виде процента концентрации мономера в нефиксированных микрокапсулах.

Нагрев высушенных микрокапсул в термостате (как это описано в Примере 1) приводит к уменьшению количества мономера, который может быть обнаружен. Это уменьшение количества обнаруживаемого мономерного ЧА вызвано денатурацией и сшиванием мономерного ЧА в нерастворимые полимеры, которые невозможно количественно определить с помощью вышеописанного метода ВЭЖХ.

Ясно, что при использовании метода ВЭЖХ для определения анализируемых количеств ЧА уже после 15 мин выдерживания в термостате не обнаруживается никакого мономерного ЧА, присутствующего в микрокапсулах из ЧА. Однако при нагреве в течение более длительных периодов времени все еще возможно дальнейшее сшивание в микрокапсулах из ЧА.

Длительный нагрев приводит к повышенному уровню сшивания в микрокапсулах, что, в свою очередь, позволяет изготовить микрокапсулы с увеличенной прочностью и соответственно с большей сопротивляемостью давлению.

Тщательно контролируя температуру и время выдерживания в термостате, можно изготовить микрокапсулы с регулируемой степенью сшивания (и, следовательно, сопротивляемостью давлению).

Пример 4. Классификация микрокапсул
Преимущество изобретенного способа заключается в том, что он позволяет контролировать средний размер и распределение микрокапсул по размеру. Однако при желании можно еще больше отобрать микрокапсул желаемых размеров, например флотацией. В гомогенной дисперсии из микрокапсул более крупные частицы будут подниматься к поверхности быстрее, чем более мелкие частицы, вследствие меньшей плотности (больше заключенного воздуха) более крупных частиц. Следовательно, когда суспензии предоставят возможность отстаиваться, будет со временем происходить изменение распределения частиц по размеру на любом уровне раствора.

Микрокапсулы диспергировали в 2000 мл водного раствора, содержащего 6 вес.%/об. хлористого натрия и 0,1 вес.%/об. "Плюроник Ф 68" (зарегистрированный товарный знак) и находящегося в стеклянной склянке при высоте столба жидкости приблизительно 165 мм. На 50 мм ниже верхней поверхности жидкости находилась пробоотборная трубка, позволяющая отбирать пробы через определенные интервалы времени.

Изменяя продолжительность отстаивания и концентрацию хлористого натрия, можно было получать различные распределения частиц по размеру и классифицировать микрокапсулы вплоть до размера в 2 мкм.

В число других мокрых методов классификации входят гидродинамическая хроматография и разделение в поле скоростей потока. "Сухие" способы классификации, использующие принципы отмучивания и разделения в поперечном потоке, могут быть осуществлены в имеющихся на рынке классификаторах "Майкрэсплит" ("Бритиш Рем."), "Зиг-заг" ("Альпайн") и "Турбо" ("Ниссюин").

Пример 5. Исследование микрокапсулы из человеческого сывороточного альбумина
Как установлено, при изобретенном способе изготовления полых микрокапсул благодаря их меньшему среднему размеру и улучшениям в свойствах оболочки количество стенкообразующего вещества, используемого при их производстве, значительно меньше, чем при прежних способах изготовления микрокапсул. Однако, несмотря на это, эхогеничность микрокапсул превосходит эхогеничность ранее изготавливаемых микрокапсул. Это новое свойство измеряется и выражается в децибелах (дБ) эхогеничности на микрограмм/мл альбумина. Эхогеничность может быть определена как способность материала отражать или "обратно рассеивать" ультразвуковые волны. При анализе изображений интенсивность обратного рассеяния количественно определяется в децибелах. Чем больше сила сигнала, тем более эхогеничным является образец.

Вся вода, применявшаяся при анализе, была апирогенной и взятой за два дня до ее использования, чтобы она могла дегазироваться на воздухе.

В 400 мл полипропиленовый лабораторный стакан ("Файсонз Сайэнтифик Эквипмент", Великобритания) вводили 350 мл воды, и перед использованием воды позволяли любым воздушным пузырькам всплыть на поверхность.

Использовали ультразвуковой аппарат "Хьюлетт Паккард Сонос 1000", при этом органы управления устанавливали следующим образом: полное регулирование усиления 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, все=128; сжатие =128 дВ и похождение - 60 дВ. Использовали преобразователь на 3,5 МГц с регулировкой на глубину 8 см.

Помещали преобразователь в воду на глубину 1,5 см и устанавливали магнитный повторитель на 75 об/мин. Первоначально делали фоновую регистрацию интенсивности обратного рассеяния. Использовали анализатор изображений ("Сискэн", Кембридж, Великобритания) для записи ультразвукового "скана" в течение 1,2 с и затем разделяли запись на 10 отдельных временных кадров. Анализировали каждый кадр на интенсивность обратного рассеяния и вычисляли статистические результаты.

Осторожно вводили однородный объем суспендированных микрокапсул, избегая внесения воздушных пузырьков. Введенный объем был таким, что после его введения концентрация микрокапсул в ультразвуковой опытной ячейке составляла 1• 10⁶/мл. Микрокапсулам давали возможность равномерно диспергировать в воде до того, как был "уловлен" ультразвуковой "скан" в реальном времени с использованием анализатора изображений и измерена интенсивность обратного рассеяния.

Ультразвуковой прибор тарировали по отношению к отражателю из нержавеющей стали и ряду блоков из силиконового каучука, увеличивающих эхоотражательную имитацию тканей и поставляемых "АТС Лэборетэри Инс.", Бриджпорт, СТ 06608, США. Была построена тарировочная кривая, и последующие измерения, сделанные на нижеуказанных видеодисплеях, преобразовывали обратно в децибеллы по полученной тарировочной кривой. Это испытание повторяли три раза с вычислением средней измеренной интенсивности.

Используя модифицированный метод Кельдаля, определяли содержание белка в микрокапсулах из человеческого сывороточного альбумина. При этом методе определяют содержание азота в пробе из микрокапсул, которое затем пересчитывает в общую концентрацию белка; по этому результату можно рассчитать содержание белка в постоянном числе микрокапсул и, в частности, содержание белка в пробе, взятой для анализа эхогеничности.

Используя "Текэйтор Дайджэсчэн Систем 12", сбраживали микрокапсулы, при этом любой углеводород, присутствующий в пробе, окисляли перекисью водорода. Во время сбраживания любой белок (и, следовательно, присутствующий азот) превращается в сульфат аммония. При перегонке с водяным паром в щелочных условиях он, в свою очередь, превращается в аммиак. Высвободившийся аммиак конденсируют и абсорбируют в борной кислоте, а количество абсорбированного аммиака определяют титрованием соляной кислотой. Эта процедура автоматизирована благодаря использованию анализатора "Кельтек Ото 1030". Используя соответствующие стандарты, можно рассчитать количество белка, присутствующего в пробе.

По общему анализу на белок определяли количество белка, введенного в ячейку для испытания на эхогеничность. Количество введенных микрокапсул вычисляли как вес введенного белка, и поэтому эхогеничность определяли на микрограмм/мл микрокапсул ( табл. 3 и 4).

Пример 6. Оптимизация режима сушки распылением для максимального увеличения количества целых газосодержащих частиц
Выше мы описывали изготовление гладких, сферических и полых микрочастиц для использования при эхоконтрастном получении изображений. Желательно уменьшить до минимума количество частиц крупнее 6 мкм и максимально увеличить количество газосодержащих полых частиц. При условиях, описанных в Примере 1, был проведен ряд экспериментов по исследованию влияния скорости подачи жидкости на выход целых сферических частиц. Как нами установлено, увеличение скорости подачи жидкости уменьшает количество целых микрочастиц, образовавшихся во время первоначальной сушки распылением (табл. 5). При увеличении расхода жидкости с 4 до 16 мл/мин, не изменяется средний размер частиц и общая сопротивляемость давлению, т.е. толщина оболочки, но изменяется общая эхогеничность. Считаем, что более медленные скорости испарения (при более высоких расходах жидкости) приводят к меньшему количеству образующихся целых газосодержащих частиц.

Реферат

Изобретение относится к приготовлению полых белковых микрокапсул. Способ образования микрокапсул включает (I) получение раствора белка в водном растворе и (II) распыление указанного раствора в газе для испарения водного растворителя и тем самым образования полых микрокапсул, отличающийся тем, что водный раствор содержит жидкость с большей летучестью, чем воды. В качестве белка предпочтительно используют альбумин, а в качестве летучей жидкости предпочтительно этанол. Технический результат: микрокапсулы могут быть использованы в качестве ультразвуковых эхогеничных контрастных веществ. 6 с. и 12 з.п.ф-лы, 5 табл., 1 ил.

Формула