Композиция, содержащая комбинацию экстракта бузины и штамма l. paracasel, l. casei, l. bulgaricus или s. thermophilics - RU2537185C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей комбинацию экстракта бузины и по меньшей мере одного штамма L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus, предназначенного преимущественно для стимуляции иммунитета и/или активации антиинфекционного и/или противовоспалительного ответа.

Бузина или Sambucus nigra L. является членом семейства Адоксовых (Adoxaceae).

Род Sambucus включает 25 видов, распространенных повсеместно в областях с умеренным климатом. Бузина черная, S. nigra ssp. nigra, широко распространена в Европе (Дания, Италия и Австрия), Северной Африке и Западной Азии. Бузина канадская, S. nigra ssp. canadensis, происходит с Северо-Востока Северной Америки и произрастает в Орегоне, Пенсильвании и Канзасе, хотя селекцию осуществляют в Канаде. Различные части бузины - кора, корни, стебли, цветы, листья и плоды, традиционно используются в различных областях, включая медицину, пищевую промышленности и изготовление инструментов и игрушек. Основное промышленное производство в настоящее время связано с изготовлением экстрактов бузины, предназначенных для рынка природных препаратов (натуроцевтиков) и промышленности красящих веществ. В некоторых публикациях сообщается о влиянии экстракта бузины на продукцию цитокинов («The effect of Sambucol, a black elderberry-based, natural product, on the production of animal cytokines: I. Inflammatory cytokines» Eur. Cytokine Netw. 2001 April-June; 12 (2): 290-296). В частности, описано влияние экстракта ягод бузины на снижение симптомов, связанных с гриппозными инфекциями, вызываемыми вирусами гриппа (A а В и/или С), а также его противовирусное действие в отношении простого вируса герпеса 1 типа, респираторно-синцитиального вируса и вируса парагриппа («Randomized Study of the Efficacy and Safety of Oral Elderberry Extract in the treatment of Influenza A and В Virus Infections» The Journal of Int. Med. Res. 2004; 32: 132-140).

Многими научными исследованиями продемонстрировано благоприятное влияние на состояние здоровье некоторых микроорганизмов, содержащихся в ферментированных продуктах, особенно в молочных продуктах. Эти микроорганизмы обычно называют «пробиотиками». Согласно широко распространенному в настоящее время определению пробиотики представляют собой «живые микроорганизмы, которые при потреблении в адекватных количествах оказывают благоприятное влияние на организм хозяина» (см. отчет ФАО/ВОЗ об оценке полезных и пищевых свойств пробиотиков в пищевых продуктах, включая сухое молоко с живыми молочнокислыми бактериями (FAO/WHO report on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria; Cordoba, Argentina; 1-4 October 2001).

В патентных заявках WO 96/20607, EP 0794707, EP 1283714 и FR 2912657 показано, что потребление пищевых продуктов, содержащих пробиотические бактерии, может привести к желаемому влиянию на здоровье, в частности, за счет установления баланса кишечной флоры, улучшения сопротивляемости инфекциям и модулирования иммунного ответа.

Пробиотические микроорганизмы, использующиеся для питания человека, обычно представляют собой молочнокислые бактерии, принадлежащие в основном к штаммам Lactobacillus и Bifidobacterium, в частности к виду Lactobacillus paracasei.

В патентной заявке США 2006/0233895 раскрыта композиция, содержащая экстракт бузины, который может быть скомбинирован с пробиотиком, таким как L-casei. Однако эта композиция обязательно содержит смесь ункарии волосистой, коры муравьиного дерева, шлемника байкальского и артемизина. Кроме того, эта композиция не предназначена для стимуляции иммунитета, а является композицией для лечения болезни Лайма, вызываемой бактериальной инфекцией, которая, соответственно, значительно отличается от вирусных инфекций гриппозного типа.

Авторы настоящего изобретения исследовали in vitro влияние композиции, включающей экстракт бузины и по меньшей мере один штамм L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus, на продукцию медиаторов неспецифического иммунитета (цитокинов) мононуклеарами периферической крови (МНПК). Результаты, полученные в in vitro модели такого типа, в значительной степени коррелируют с результатами, которые могут быть получены in-vivo (World J. Gastroenterol. 2007; 13 (2): 236-243).

Модель с клетками МНПК используется для исследования способности клеток иммунной системы человека к ответу. Этот ответ оценивают по продукции IL-10, интерферона-гамма и цитокина IL-6.

После воспалительного стресса макрофаги продуцируют IL-10, который регулирует продукцию про-воспалительных цитокинов, таких как ФНО-альфа. Он стимулирует сокращение презентации антигена, снижает пролиферацию Т-лимфоцитов, но в присутствии IL-2, -4 и -7 может действовать как фактор дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов. IL-10 улучшает выживаемость В-лимфоцитов, продуцирующих антитела.

ИФН-гамма или ИФН II типа обладают некоторой противовирусной активностью и подавляют пролиферацию клеток. Однако ИФН-гамма является в основном иммуномодулятором в отличие от интерферонов I типа (альфа- и бета-ИФН), которые обладают в основном противовирусной активностью. ИФН-гамма активирует макрофаги и естественные киллеры и таким образом воздействует на цитотоксические механизмы. Он модулирует пролиферацию Т-лимфоцитов и, как известно, активирует иммунные ответы 1 типа и, наоборот, подавляет иммунные ответы 2 типа. IL-6 представляет собой плейотропный цитокин, влияющий на антиген-специфичные иммунные ответы и воспалительные реакции. Он является одним из основных физиологических медиаторов реакций острой фазы. IL-6 является фактором дифференцировки В-лимфоцитов и фактором активации Т-лимфоцитов. В присутствии IL-2 IL-6 индуцирует дифференцировку зрелых и незрелых Т-лимфоцитов в цитотоксические Т-лимфоциты. IL-6 также является тромбопоэтином, который индуцирует созревание мегакариоцитов in vitro и увеличивает число тромбоцитов in vivo.

Оба компонента (экстракт бузины и штамм L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus) воздействуют на иммунную систему человека и потенцируют иммунные ответы, что обеспечивает лучшую подготовку организма к каким-либо инфекционным вторжениям или опасным воспалительным процессам. Полученные результаты показывают, что эти компоненты в составе одной композиции оказывают синергетическое воздействие на неспецифические иммунные ответы.

Соответственно, настоящее изобретение относится к композиции, включающей комбинацию экстракта бузины и по меньшей мере одного штамма L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilics. Предпочтительно указанная композиция не включает ункарию волосистую, и/или кору муравьиного дерева, и/или шлемник байкальский, и/или артемизин, в частности, как описано в заявке США 2006/0233895. В частности, она не включает смесь ункарии волосистой, коры муравьиного дерева, шлемника байкальского и артемизина.

В одном конкретном варианте осуществления композиция согласно настоящему изобретению представляет собой композицию, включающую комбинацию экстракта бузины и по меньшей мере одного штамма L. paracasei.

В одном конкретном варианте осуществления композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена способом, включающим следующие этапы: а) приготовление комбинации, включающей экстракт бузины и по меньшей мере один штамм L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus; b) добавление полученной комбинации в композицию согласно настоящему изобретению.

Таким образом, в этом случае комбинацию готовят до добавления в композицию. Однако также возможно приготовить композицию согласно настоящему изобретению путем добавления каждой из составляющих в композицию по отдельности, т.е. предварительного приготовления комбинации.

В одном конкретном варианте осуществления композиция согласно настоящему изобретению представляет собой композицию, включающую экстракт бузины и по меньшей мере один штамм L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus и/или S. thermophilus.

В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению предназначена для орального применения.

В предпочтительном варианте композиция согласно настоящему изобретению представляет собой пищевой продукт, пищевую добавку, лекарственное средство или продукт, отпускаемый без рецепта.

В предпочтительном варианте экстракт бузины согласно настоящему изобретению представляет собой экстракт, полученный из ягод и/или цветков бузины, предпочтительно из ягод бузины. Преимуществом является то, что экстракт согласно настоящему изобретению представляет собой водорастворимый экстракт.

Экстракт бузины, используемый в настоящем изобретении, может быть охарактеризован через содержание антоцианов, с одной стороны, и крупных молекул, таких как белки (в частности, лектины), с другой стороны.

В предпочтительном варианте экстракт бузины содержит антоцианы, более предпочтительно, принадлежащие к семейству пеларгонидинов и цианидинов, в количестве от приблизительно 0.5% до приблизительно 25%, более предпочтительно от приблизительно 3% до приблизительно 25% и наиболее предпочтительно от приблизительно 8% до приблизительно 16%, по массе в расчете на сухое вещество экстракта. В предпочтительном варианте содержание антоциана равно приблизительно 12% по массе, в расчете на содержание сухого вещества экстракта. Указанные количества выражены для цианидин-3-глукозида, определенного методом ВЭЖХ, описанного в J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 7846-7856.

В предпочтительном варианте экстракт бузины содержит белок в количестве от 2 до 10% по массе, предпочтительно от 5% до 10% по массе и более предпочтительно от 5% и 7% по массе, в расчете на сухое вещество (N x 6.25 по методу Кьельдаля: Proteines vegetales, Ed. В.Godon, Collection Sciences et Techniques Agro-alimentaires, Technique et Documentation Lavoisier, Paris, 1985).

В рамках настоящего изобретения экстракт бузины представляет собой коммерчески доступный продукт или может быть получен способом, включающим следующие этапы:

Свежие или замороженные ягоды бузины отжимают и после фильтрации получают сок. Он может быть подвергнут этапу ферментативного гидролиза It (пектиназа или смесь пектинметилэстеразы и полигалактуроназы) для осветления перед фильтрацией (Girard В. and Fukumoto L.R. Membrane processing of fruit juices and beverages: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2000, 40 (2): 91-157). Высушенные и измельченные ягоды также могут быть подвергнуты водной экстракции с последующим разделением твердого и жидкого вещества путем фильтрации.

Полученные экстракты можно использовать без дополнительной обработки, или в концентрированном виде, или после высушивания в порошок. Содержание антоциана на этом этапе составляет от 0.5% до 3% по массе в расчете на сухое вещество экстракта и равно приблизительно 1% (анализ методом ВЭЖХ, результат выражен в цианидин-3-глюкозиде).

Экстракт бузины может быть обогащен, в частности, антоцианами и/или высокомолекулярными соединениями (белками, полифенолами, полисахаридами). Для этой цели можно использовать несколько хорошо известных методов:

Ультрафильтрация: этап диафильтрации предварительно разбавленного сока с гиперконцентрированием на органической или неорганической мембране с порогом отсечения от 1 до 20 КДа и предпочтительно от 3 до 10 кДа (Girard В. and Fukumoto L.R. Membrane processing of fruit juices and beverages: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2000, 40 (2): 91-157).

Перенос на колонку с адсорбирующей смолой XAD типа Amberlite.

- Водно-спиртовая экстракция (смесь воды и C1-C4 спирта в любой пропорции) или экстракция в растворах с кислым pH (Bronnum-Hansen К. and Flink J.M. Anthocyanin colorants from elderberry (Sambucus nigra L.) IV. Further studies on production of liquid extracts, concentrates and freeze dried powders. Int. J. Food Sci Tech 1986, 21 (2): 605-614; Lee J. and Wrolstad R.E. Extraction of Anthocyanins and polyphenolics from blueberry processing waste. J. Food Sci. 2004, 69 (7): 564-573). Такое экстрагирование может быть выполнено (предпочтительно) непосредственно с высушенными и измельченными ягодами или с пюре из свежих ягод.

Полученный экстракт может быть подвергнут термическому концентрированию (при температуре выше 50°C и в вакууме) для увеличения градуса Брикса отдельно или на носителе (например, мальтодекстрин, лактоза…).

Обогащенный сок предпочтительно имеет плотность от 40 до 60° Брикса, содержит от 3 до 25% антоцианинов и от 5 до 10% белков (метод Кьельдаля, N×6.25) по массе в расчете на содержание сухого вещества.

В предпочтительном варианте количество сухих вещества на единичную дозу в композиции согласно настоящему изобретению составляет от приблизительно 100 мг до приблизительно 1 г. В более предпочтительном случае композиция содержит от приблизительно 150 мг до приблизительно 500 мг сухих веществ бузины на единичную дозу и более предпочтительно приблизительно от 150 до 300 мг сухих веществ бузины на единичную дозу, наиболее предпочтительно от 200 мг до 250 мг сухих веществ бузины на единичную дозу.

В рамках настоящего изобретения термин «доза» относится к количеству композиции согласно настоящему изобретению, используемому в одной дозировке). В предпочтительном варианте единичная доза согласно настоящему изобретению может соответствовать, например, йогурту объемом 100 или 125 мл, капсуле массой 1 г или таблетке массой 2 г. Таким образом, вне зависимости от массы композиции количество сухого вещества бузины и/или штамма L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilics на единичную дозу остается постоянным. В предпочтительном варианте режим дозирования составляет две дозы в день.

Одним из наиболее подходящих для настоящего изобретения штаммов L. paracasei является штамм L. paracasei, депонированный 10 декабря 1994 г. в CNCM (расположенная в Париже Национальная коллекция культур микроорганизмов Франции: Collection Nationale de Cultures of Microorganisms, 28 rue du Docteur Roux, Paris) под ссылочным номером 1-1518. Этот штамм, известный под ссылочным номером DN-114 001 или L. casei defensis® (торговое наименование), является объектом патента EP 0794707. Эффекты этого штамма по усилению системного иммунного ответа, специфичного в отношении патогенных микроорганизмов дыхательных путей (включая вирус гриппа), описана в патенте EP 1283714, а его влияние на усиление защиты против гриппа после вакцинации описано в заявке FR 2912657.

Номенклатура Lactobacillus casei и paracasei до сих пор нуждается в модификации и в настоящее время является обсуждается. Огромное большинство штаммов, называемых в литературе подвидами L. casei или L. paracasei, в настоящее время являются членами одного вида, который в соответствии с современной номенклатурой можно назвать Lactobacillus paracasei subsp.paracasei.

Эти штаммы бактерий можно использовать в комбинации с другими молочнокислыми бактериями или в комбинации с йогуртными ферментирующими микроорганизмами, т.е. Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus. Таким образом, в случае если L. paracasei используется в комбинации с йогуртными ферментирующими микроорганизмам, указанные композиции могут дополнительно содержать по меньшей мере 107 и предпочтительно от 5×10⁷ до 2×10⁸ клеток S. thermophilus на мл и по меньшей мере 5×10⁴, и предпочтительно от 10⁵ до 5×10⁵ клеток L. bulgaricus на мл.

Одним из наиболее подходящих для настоящего изобретения штаммов L. bulgaricus является штамм L. bulgaricus, депонированный под ссылочным номером 1-2787.

Одним из наиболее подходящих для настоящего изобретения штаммов S. thermophilus является штамм S. thermophilus, депонированный под ссылочным номером 1-2130.

Бактерии этих штаммов могут быть использованы в форме интактных, живых или не живых бактерий, а также в форме лизата или в форме бактериальных фракций. Эти бактерии также могут быть покрыты растительным маслом, как описано в патентной заявке WO 2005/070221, для улучшения выживаемости.

В предпочтительном варианте композиция содержит от 1×10⁷ до 1×10¹¹ КОЕ L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus на единичную дозу.

Преимуществом является то, что дневная дозировка L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus составляет от 10⁸ до 10¹⁰ КОЕ.

В предпочтительном варианте дневной режим дозирования составляет две единичные дозы в день.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит, в расчете на единичную дозу,

от 100 мг до 1 г сухого вещества бузины, предпочтительно от 150 мг до 500 мг, предпочтительно от 150 мг до 300 мг и более предпочтительно от 200 мг до 250 мг; и

1×10⁷ до 1×10¹¹ L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus.

В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит, в расчете на единичную дозу,

от 3 мг до 200 мг антоцианов бузины, предпочтительно от 10 до 100 мг и более предпочтительно от 20 мг до 50 и;

от 2 мг до 100 мг белков бузины, предпочтительно от 10 мг до 20 мг; и

от 1×10⁷ до 1×10¹¹ L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus.

Зафиксирован полезный синергетический эффект.

Комбинация экстрактов бузины и штаммов L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus согласно настоящему изобретению продемонстрировала хорошую способность индуцировать/стимулировать неспецифичный иммунный ответ, что показывает ее преимущества для применения в областях продуктов питания и/или фармацевтики.

Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно представлена в галеновой форме, обычно используемой в областях продуктов питания и/или фармацевтики для перорального или сублингвального использования.

В случае пищевых продуктов они могут представлять собой, в частности, ферментированные молочные продукты, йогурты, ферментированное молоко, молоко для детского питания, порошки, пастилки, овощные соки, напитки и их смеси, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из молочных продуктов фруктовых и/или молочных соков и фруктового пюре.

В предпочтительном случае фрукт выбран из группы, состоящей из яблока, апельсина, бузины, клубники, персика, абрикоса, сливы, малины, черники, красной смородины, лимона, грейпфрута, банана, ананаса, вишни, кокоса, маракуйи, манго, фиги, ревеня, дыни, экзотического фрукта, личи, винограда, голубики и их смесей.

В предпочтительном варианте пищевой продукт согласно настоящему изобретению представляет собой свежий молочный продукт.

В предпочтительном случае этот продукт представляет собой ферментированный молочный продукт. В наиболее предпочтительном случае этот продукт представляет собой молочный продукт на основе свежих фруктов.

В случае молочного продукта на основе свежих фруктов экстракт бузины в предпочтительном случае добавляют в конечный продукт в ходе подготовки фруктов. Штамм L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus, в свою очередь, добавляют в продукт в качестве закваски.

Под «фрементированным молочным продуктом» следует понимать, более конкретно, ферментированный молочный продукт, готовый для употребления человеком, т.е. пищевой ферментированный молочный продукт. Более конкретно, в настоящей заявке предложно ферментированное молоко и йогурты. Указанные ферментированное молоко и йогурты в альтернативном варианте могут представлять собой "fromage blanc" (молодой сыр) или "petit-suisse".

В настоящей заявке термины «ферментированное молоко» и «йогурт» используются в своем обычном значении, принятом в области производства молочных продуктов, т.е. продуктов, предназначенных для употребления человеком. Их получают путем молочнокислой ферментации молочного субстрата. Эти продукты содержат дополнительные ингредиенты, такие как фрукты, растения, сахар и т.д. См., например, французский стандарт №88-1203 от 30 декабря 1988, опубликованный в Journal Officiel de la Republique Francaise 31 декабря 1988 г. См. также "Codex Alimentarius" (подготовленный комитетом по Кодексу Алиментариус под эгидой ФАО и ВОЗ и опубликованный информационным отделом ФАО, который доступен он-лайн ; в частности, том 12 Кодекса Алиментариус "Codex Standards for milk and dairy products" (стандарты для молока и молочных продуктов) и стандарт" CODEX STAN А -1 1 (а) - 1975").

Таким образом, в настоящей заявке термин «ферментированное молоко» обозначает исключительно молочный продукт, приготовленный с использованием молочного субстрата, подвергнутого процессу, по меньшей мере эквивалентного пастеризации, инокулированного микроорганизмами, принадлежащими к видам, специфическим для каждого продукта. «Ферментированное молоко» не подвергается никаким процессам, отделяющим его молочные составляющие, и, в частности, не подвергается высушиванию сгустка. Сворачивание «ферментированного молока» не должно достигаться средствами, отличными от активности используемых микроорганизмов. Таким образом, на практике термин «ферментированное молоко» обычно используется для обозначения видов ферментированного молока, отличных от йогурта, которые в разных странах называют, например, «кефир», «кумыс», «ласси» ("Lassi"), «дай» ("Dahi"), «лебен» ("Leben"), фильмйолк ("Filmjolk"), «вилли» ("Villi"), ацидофильное молоко.

Что касается термина «йогурт», он используется для обозначения ферментированного молока, получаемого традиционным способом в результате активности термофильных молочных бактерий, в частности, указанных Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus, которые сохраняются в живом виде в конечном продукте в количестве, равном по меньшей мере 10 миллионов бактерий на грамм в расчете на долю молока. В некоторых странах правила допускают добавление других молочнокислых бактерий при производстве йогурта, в частности, использование в дополнение к указанным штаммам Bifidobacterium и/или Lactobacillus acidophilus. Эти дополнительные штаммы молочнокислых бактерий предназначены для того, чтобы придать конечному продукту различные свойства, такие как способность обеспечивать баланс кишечной флоры или регулировать иммунную систему.

Количество молочнокислых бактерий, содержащихся в молочном субстрате, не должно быть ниже 0.6 г на 100 г при продаже потребителю, а содержание белка в расчете на долю молока не должно быть ниже содержания в обычном молоке. Название "fromage blanc" или "petit-suisse" в настоящей заявке обозначает исключительно молодой незрелый несоленый сыр, ферментированный только молочнокислыми бактериями (никакой ферментации, кроме молочнокислой). Сухое вещество в fromage blanc может быть снижено до 15 г или 10 г на 100 г fromage blanc, и, соответственно, содержание жиров на 25% выше 20 г и составляет максимум 20 г или равно максимум 20 г на 100 г fromage blanc после полного высушивания. Сухое вещество fromage blanc составляет от 13 до 20%. Что касается сухого вещества petit-suisse, то оно не ниже, чем 23 г на 100 г petit-suisse. Обычно оно составляет от 25 до 30%. Fromage blanc и petit-suisse обычно называют «творог» (деревенский сыр). Это название традиционно для области техники настоящего изобретения. В предпочтительном варианте свежий молочный продукт выбран из йогуртов, включая взбитые йогурты, питьевые йогурты, творог и ферментированное молоко.

В рамках настоящего изобретения термин «пищевая добавка» относится к пищевому продукту, предназначенному для того, чтобы дополнить обычную диету, представляющему собой концентрированный источник питательных веществ или других субстратов, обладающий только диетическим или физиологическим действием, или их комбинацией.

В предпочтительном варианте пищевая добавка может содержать витамины, и/или минералы, и/или микроэлементы.

Указанные витамины включают витамины A, E, C и витамины группы B, в частности витамин B6. В предпочтительном случае витамины представляют собой витамины C, E и B6.

Витамин A (ретинол или каротеноиды), витамин E и витамин C являются 3 основными антиоксидантными витаминами. Фактически, эти антиоксидантные витамины обладают способностью контролировать продукцию свободных радикалов, образующихся в результате метаболизма кислорода, повышенная продукция которых является причиной большого числа заболеваний, в частности сердечно-сосудистых, иммунных, онкологических, кожных, нейродегенеративных заболеваний, ускоренного старения и т.д.

В частности, витамин C является хорошо известным антиоксиантом, растворимым в воду. Человеку необходимы внешние источники витамина C для удовлетворения потребность в витамине C. Соответствующими источниками витамина C являются аскорбиновая кислота, аскорбат натрия или их смесь.

Витамин Е также является хорошо известным антиоксидантом. Витамин E может действовать синергетически с витамином С, защищая жизненно важные функции клеток от природных окислителей. Источниками витамина E являются альфа-токоферил ацетат, триметилтокоферил ацетат и/или сукцинат витамина E.

Витамины B образуют группу водорастворимых витаминов, которая включает витамин В1 или тиамин, витамин B2 или рибофлавин, витамин B3 (PP) или никотинамид, витамин B5 или пантотеновую кислоту, витамин В6 или пиридоксин, витамин B8 (H) или биотин, витамин B9 или фолиевую кислоту, витамин B12 или цианобаламин.

В предпочтительном варианте минералы выбраны из железа, цинка, селена, хрома, меди и их смесей.

Цинк обладает противоокислительным действием как кофактор ферментов, которые непосредственно участвуют в защите от окисляющих агентов. В композициях согласно настоящему изобретению могут быть использованы оксид цинка, глюконат цинка, цитрат цинка, ацетат цинка, хлорид цинка, лактат цинка отдельно или в смеси. Предпочтителен глюконат цинка.

Селен также обладает антиокислительным действием как кофактор (например, глютатион пероксидаза) для ферментов, которые непосредственно участвуют в защите от окислителей.

В случае пищевой добавки или лекарственного средства предусмотрены следующие галеновые формы: жевательные таблетки, шипучие таблетки, капсулы, пастилки, пилюли, порошки, гранулы, растворы и суспензии для перорального применения, сублингвальные и буккальные лекарственные формы.

В случае приготовления твердой композиции в форме таблеток основной активный ингредиент может быть смешан с фармацевтическим носителем, таким как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, гуммиарабик и т.п. Таблетки могут быть покрыты сахарозой или другим подходящим материалом либо могут быть изготовлены таким образом, чтобы обеспечивать замедленное или отложенное действие и непрерывно высвобождать определенное количество активного действующего вещества.

Препарат в форме капсулы получают путем смешивания активного ингредиента с разбавителем и путем заполнения полученной смесью мягких или жестких капсул. Препарат в форме сиропа или эликсира может содержать активный ингредиент вместе с подсластителем, антисептиком, а также с вкусовой добавкой и подходящим красителем.

Порошки или гранулы для диспергирования в воде могут содержать диспергирующие агенты или смачивающие агенты, а также корректоры вкуса или подсластители.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция согласно настоящему изобретению для стимуляции иммунитета, и/или усиления иммунной защиты, и/или активации антиинфекционного или противовоспалительного ответа.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция для применения в лечении и/или предотвращения респираторных и/или кишечных инфекций.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция для применения в лечении и/или предотвращения симптомов, вызванных, в частности, инфицированием вирусом простого герпеса 1 типа, респираторно-синцитиального вируса, вируса гриппа (A, и/или B, и/или C) и вируса парагриппа, предпочтительно симптомов гриппозных заболеваний, в частности, вызванных вирусом гриппа (A, и/или B, и/или C).

Композиция согласно настоящему изобретению особенно подходит для лечения и/или предотвращения симптомов гриппозных заболеваний, вызванных инфицированием вирусами гриппа (ортомиксовирус, вирусы гриппа A, B или C). Указанные симптомы включают насморки, ринит, кашель, воспаления слизистой оболочки носа (ринорея, закупорка носовых ходов, чихание), боль в горле (различные проявления: пощипывание, затрудненное глотание), лихорадку, головную боль, мышечную боль, вялость.

Перечисленные «зимние проблемы» связаны с ослаблением иммунной защиты.

Другим объектом настоящего изобретения является применение композиции для приготовления пищевого продукта, пищевой добавки или лекарственного средства.

Другим объектом настоящего изобретения является применение композиции для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предотвращения респираторных и/или кишечных инфекций.

Другим объектом настоящего изобретения является применение композиции для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предотвращения симптомов инфицирования вирусом простого герпеса 1 типа, респираторно-синцитиального вируса, вируса гриппа (A, и/или B, и/или C) и вируса парагриппа, предпочтительно симптомов гриппозных заболеваний, в частности, вызванных вирусом гриппа (A, и/или B, и/или C).

Другим объектом настоящего изобретения является применение композиции для приготовления лекарственного средства для применения в стимуляции иммунитета и/или активации антиинфекционного или противовоспалительного ответа.

Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение способа усиления иммунной защиты, включающего оральное применение композиции на основе экстракта бузины и по меньшей мере одного штамма L. paracasei, L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilics.

Настоящее описание содержит ссылки на графические материалы.

На Фигуре 1 показана продукция, IL-10, индуцированная только экстрактом отдельно или в комбинации с L. paracasei: соотношение МНПК 4.5: 1.

Пояснения к Фигуре 1

На Фигуре 2 показана продукция of ИФН-гамма, индуцированная L. paracasei отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл.

Пояснения к Фигуре 2

На Фигуре 3 показана продукция IL-6, индуцированная L. paracasei отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл.

Пояснения к Фигуре 3

На Фигуре 4 показана продукция IL-6, индуцированная штаммом L. casei отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл.

Пояснения к Фигуре 4

На Фигуре 5 показана продукция IL-6, индуцированная L. bulgaricus отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл.

Пояснения к Фигуре 5

На Фигуре 6 показана продукция IL-6, индуцированная S. thermophilus отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл.

Пояснения к Фигуре 6

На Фигуре 7 показана продукция IL-6, индуцированная штаммом L. brevis отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл.

Пояснения к Фигуре 7

На Фигуре 8 представлена цитотоксическая активность естественных киллеров у мышей, получавших среду (зеленый), полный состав (1500 мг/кг; красный), L paracasei DN-114 001+молочная смесь (393 мг/кг; синий), экстракт ягод бузины (296 мг/кг; фиолетовый) или витамины+минералы (282 мг/кг; серый). Р - значения: полный состав сравнивают со средой.

Пояснения к Фигуре 8

Понимание настоящего изобретения облегчают приведенные ниже неограничивающие примеры, которые представляют конкретные варианты осуществления композиций согласно настоящему изобретению.

Пример 1: Приготовление экстракта бузины для применения в настоящем изобретении.

Экстракт бузины получают из сока ягод бузины, обогащенного антоцианами и высушенного на мальтодекстрине. Обогащение осуществляют с использованием процесса фильтрации через мембрану, описанного ниже.

26 литра осветленного сока бузины разбавляют 284 литрами воды (11 объемов воды на 1 объем сока). Полученные 310 литров перемешивают и нагревают 45°C, после чего осуществляют диафильтрацию на первой 5 кДа мембране с добавлением 7 объемов воды по объему сока (т.е. 181 л). Затем диализный фильтрат концентрируют на 5 кДа мембране (основная 5/10 кДа мембрана, имеющая единичную площадь поверхности 5.8 м²). Полученный в результате ультрафильтрации концентрат подвергают термическому концентрированию в вакууме при температуре не выше 50°C, а затем распыляют на мальтедекстриновый носитель таким образом, что количество мальтодекстрина ниже или равно 30% (масс./масс.). Полученный экстракт имеет следующие характеристики:

Содержание антоциана: 10-14% по массе в расчете на сухое вещество экстракта (выраженное как цианидин-3-глюкозид, определенный методом ВЭЖХ, описанным в JAgric Food Chem 2004, 52, 7846-7856) Содержание белка: 5-7% по массе в расчете на сухое вещество экстракта (N×6.25 в соответствии с методом Кьельдаля).

ПРИМЕР 2: In vitro исследование комбинированного иммуномодулирующего действия штамма L. paracasei CNCM 1-1518 и экстракта бузины на мононуклеарах периферической крови (МНПК)

Материалы и методы

Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяют у здоровых субъектов, ресуспендируют и распределят в 24-луночные планшеты в концентрации 0.5×10⁶ клеток/лунку. Эти МНПК инкубируют в течение ночи при 37°C либо с различными концентрациями экстракта бузины (3-10-30-100 мкг/мл супернатанта клеточной культуры МНПК) в присутствии или в отсутствие некоторого количества L. paracasei (4.5 L. paracasei на 1 МНПК), или, в альтернативном варианте, с различными соотношениями L. paracasei: МНПК (0.5:1-1:1-2:1-4.5:1) в присутствии или в отсутствие экстракта бузины в концентрации 10 мкг/мл супернатанта клеточной культуры МНПК.

Использовали экстракт бузины, приготовленный, как описано в Примере 1. Супернатанты культур отделяли для определения цитокинов (IL-10 и ИФН-гамма) путем проточной цитометрии. В настоящей комбинации смешиваемые бузина и L. paracasei имеют разные единицы измерения, т.е. концентрация в мкг/мл и отношение числа бактерий к МНПК, соответственно.

Для того чтобы определить, дает ли комбинация экстракт бузины+L. paracasei синегетический эффект, авторы настоящего изобретения использовали метод, описанный в публикации Etievant С, Kruczynski A, Barret JM and al. «F 11782, a dual inhibitor of topoisomerases I and II with an original mechanism of action in vitro, and markedly superior in vivo antitumour activity, relative to three other dual topoisomerase inhibitors, intoplicin, aclarubicin and TAS-103» Cancer Chemother. Pharmacol. 2000; 46: 101-113. В этой публикации описано сравнение и интерпретация экспериментальных данных, сравниваемых с построенной теоретической кривой.

Последнее основано на варьируемых экспериментальных данных для одного соединения (например, повышающаяся концентрация экстракта бузины) и на фиксированных экспериментальных данных для второго соединения (например, фиксированное отношение числа бактерий к МНПК).

Теоретическая кривая на Фигуре 1, которая показывает продукцию IL-10, индуцированную различными дозами экстракта бузины в комбинации с фиксированным отношением L. paracasei:МНПК, равным 4.5:1, была построена путем прибавления к каждой экспериментальной точке кривой для бузины отдельно (•) вклада отношения L. paracasei: МНПК, равного 4.5:1. Этот вклад, определенный экспериментально, составляет 2.4 пг/мл IL-10.

Теоретическая кривая на Фигуре 2, которая показывает продукцию ИФН-гамма, индуцированную различными дозами L. paracasei в комбинации с экстрактом бузины при фиксированной концентрации, равной 10 мкг/мл, была построена путем добавления к каждой экспериментальной точке кривой для L. paracasei отдельно (•) вклада экстракта бузины с концентрацией 10 мкг/мл. Этот вклад, определенный экспериментально, составляет 5 пг/мл ИФН-гамма.

Результаты:

На Фигурах 1 и 2 показаны полученные результаты:

На Фигуре 1 показана продукция IL-10, индуцированная экстрактом бузины отдельно или в комбинации с отношением L. paracasei:МНПК, равным 4.5:1.

На Фигуре 2 показана продукция ИФН-гамма, индуцированная L. paracasei отдельно или в комбинации с экстрактом бузины при концентрации 10 мкг/мл.

Исследовали влияние на неспецифичный иммунный ответ экстракта бузины отдельно или в комбинации с определенным отношением L. paracasei:МНПК (4.5:1).

Концентрация цитокина, полученная при использовании отношения L. paracasei:МНПК, равного 4.5:1, составляет 2.4 пг/мл.

Сравнение результатов, полученных экспериментально со значениями теоретической кривой, показывает, что L. paracasei усиливает эффект экстракта бузины, используемого отдельно: такая комбинация обеспечивает продукцию IL-10, которая намного выше суммы двух эффектов (экстракт бузины, с одной стороны, и L. Paracasei, с другой стороны).

Авторы настоящего изобретения исследовали также влияние различных отношений L. paracasei:МНПК, отдельно или в комбинации с фиксированной концентрацией экстракта бузины (10 мкг/мл), на продукцию гамма-интерферона.

Концентрация этого цитокина, полученная при использовании экстракта бузины в концентрации 10 мкг/мл, составляет 5 пг/мл.

Сравнение различных полученных кривых показывает, что экстракт бузины усиливает эффект L. paracasei: их комбинация обеспечивает продукцию ИФН-гамма, которая намного выше, чем сумма 2 эффектов (L. Paracasei, с одной стороны, и экстракт бузины, с другой стороны).

Заключение:

Экстракт бузины и L. paracasei CNCM 1-1518 (DN - 114 001) воздействуют синергетическим образом на неспецифические иммунные ответы, за счет чего клетки иммунной системы человека лучше реагируют на инфекционное вторжение или опасные воспалительные процессы.

Пример 3: In vitro исследование специфичности штамма

Материалы и методы

Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяют у здоровых субъектов, ресуспендируют и распределят в 24-луночные планшеты в концентрации 0.5×10⁶ клеток/лунку. Эти МНПК инкубируют в течение ночи при 37°С при различных отношениях (0.5:1-1:1-2:1-4.5:1) в присутствии или в отсутствие экстракта бузины в концентрации 10 мкг/мл супернатанта клеточной культуры МНПК.

Использовали экстракт бузины, приготовленный, как описано в Примере 1.

В этом in vitro исследовании тестировали пять штаммов: штамм Lactobacillus paracasei (CNCM 1-1518), штамм Lactobacillus casei, штамм Lactobacillus bulgaricus (CNCM 1-2787), штамм Streptococcus thermophilus (CNCM 1-2130) и штамм Lactobacillus Brevis.

Супернатанты культур брали для определения цитокина IL-6 методом твердофазного ИФА (ELISA).

Для того чтобы определить, дает ли комбинация экстракт бузины/штамм синергетический эффект, авторы настоящего изобретения использовали метод, описанный в публикации Etievant С (см. выше). В этой публикации описано сравнение и интерпретация экспериментальных данных, сравниваемых с построенной теоретической кривой.

Последнее основано на варьируемых экспериментальных условиях для увеличивающегося отношения числа бактерий к МНПК и фиксированных экспериментальных условиях для экстракта бузины.

Теоретические кривые на Фигурах 3-7, которые показывают продукцию IL-6, индуцируемую различными дозами штамма в комбинации с экстрактом бузины при фиксированной концентрации 10 мкг/мл, были построены путем прибавления к каждой экспериментальной точке для штамма отдельно (•) вклада экстракта бузины при 10 мкг/мл. Этот вклад определяли экспериментальным путем для каждого эксперимента.

Результаты

На Фигурах 3-7 представлены полученные результаты:

- На Фигуре 3 показана продукция IL-6, индуцированная L. paracasei отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл (концентрация цитокина, полученная с использованием экстракта бузины при концентрации 10 мкг/мл, составляет 7.7 нг/мл);

На Фигуре 4 показана продукция IL-6, индуцированная L. casei отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл (концентрация цитокина, полученная с использованием экстракта бузины при концентрации 10 мкг/мл, составляет 2.2 нг/мл);

На Фигуре 5 показана продукция IL-6, индуцированная L. bulgaricus отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл (концентрация цитокина, полученная с использованием экстракта бузины при концентрации 10 мкг/мл, составляет 2.0 нг/мл);

На Фигуре 6 показана продукция IL-6, индуцированная S. thermophilus отдельно или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации 10 мкг/мл (концентрация цитокина, полученная с использованием экстракта бузины при концентрации 10 мкг/мл, составляет 2.4 нг/мл);

На Фигуре 7 показана продукция IL-6, индуцированная или в комбинации с экстрактом бузины в концентрации (концентрация цитокина, полученная с использованием экстракта бузины при концентрации 10 мкг/мл, составляет 6.0 нг/мл).

Влияние различных отношений штамм:МНПК отдельно или в комбинации с фиксированной концентрацией экстракта бузины (10 мкг/мл), на продукцию IL-6 исследовали для 5 различных штаммов.

Эксперименты, проведенные с L. paracasei (Фиг.3), подтверждают, что экстракт бузины усиливает эффект L. paracasei: их комбинация обеспечивает продукцию ИФН-гамма, которая намного выше, чем сумма 2 эффектов (L. Paracasei, с одной стороны, и экстракт бузины, с другой стороны).

Синергию этого типа наблюдали также при использовании L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilics, не на с L. brevis, что указывает на то, что синергетический эффект является штамм-специфичным

Заключение:

Было подтверждено, что экстракт бузины и L. paracasei воздействуют синергетическим образом на неспецифические иммунные ответы, за счет чего клетки иммунной системы человека лучше реагируют на инфекционное вторжение или опасные воспалительные процессы.

Кроме того, было показано, что синергетический эффект является штамм-специфичным. Экстракт бузины и L. casei, L. bulgaricus или S. thermophilus синергетически воздействуют на неспечифические иммунные ответы.

В случае комбинации экстракта бузины и L. brevis, синергия, напротив, не наблюдалась. Таким образом, этот штамм может служить отрицательным контролем в дальнейших исследованиях.

ПРИМЕР 4: In vivo исследование цитотоксической активности спленоцитов, взятых у мышей, получавших полный состав

Введение

Как показано в примерах 2 и 3, экстракт ягод бузины и пробиотики, такие как L. paracasei DN-114 001, in vitro действуют синергетически, вызывая увеличение продукции цитокинов. Целью данного исследования были оценка влияния полного состава in vivo на иммунную функцию и сравнение его активности с каждой группой ингредиентов:

- L. paracasei+молочная смесь

- экстракт ягод бузины

- смесь витаминов и минеральных солей=Витамины+минералы.

Использовали экстракт бузины, приготовленный, как описано в Примере 1. Полный состав представляет собой комбинацию следующих ингредиентов:

L. paracasei+молочная смесь, экстракт ягод бузины, смесь витаминов и минеральных солей и наполнители. Количество используемых ингредиентов в 3 группах ингредиентов равно соответствующему количеству ингредиентов, присутствующему в полном составе.

Для этой цели авторы настоящего изобретения выбрали мониторинг функции естественных киллеров (NK). Действительно, первичные иммунные ответы, включая NK, имеют огромное значение для защиты хозяина от респираторных вирусов. Клетки NK представляют собой отдельную субпопуляцию лимфоцитов, которые играют важную роль в ранней фазе иммунных ответов, направленных против некоторых вирусов, паразитов и микробных патогенов (3), путем осуществления цитотоксических функций. Более того, растущее число данных указывает на то, что клетки NK имеют важную функцию, заключающуюся во влиянии на адаптивные иммунные ответы (1; 2).

Материалы и методы

Животные и лечение

Самок мышей BALB/c в возрасте 7 недель случайным образом делили на 5 групп:

Группа 1 > Среда (стерильная вода)

Группа 2 > Полый состав (1500 мг/кг)

Группа 3 > L. paracasei DN-114 001+молочная смесь (393 мг/кг)

Группа 4 > Экстракт ягод бузины (296 мг/кг)

Группа 5 > Витамины+минералы (282 мг/кг)

В дни DO, D1 и D2 мышам перорально вводили 10 мл/кг тестируемого продукта. В D9 мышей забивали и извлекали селезенку.

Анализ цитотоксичности

Цитотоксическую активность в отношении мишеней определяли Cytolytic при помощи теста цитотоксичности без использования радиоактивности CytoTox 96. Собирали спленоциты мышей и культивировали вместе с клетками YAC-I (линия клеток Т-клеточной лимфомы мышей) в качестве клеток-мишеней при подходящем соотношении эффектор:мишень в 96-луночных планшетах с V-образным дном. После 4 часов инкубации при 37°С измеряли количество высвобожденной лактдегидрогеназы (ЛДГ) в супернатанте. Количество высвобожденной ЛДГ измеряли с использованием субстрата ЛГ при длине волны 490 нм. Для каждой мыши определяли средний процент цитотоксичности NK (%) при трех соотношениях эффектор:мишень (100:1, 50:1 и 25:1) по следующей формуле:

[А₄₉₀ экспериментальное высвобождение - А₄₉₀ спонтанное высвобождение клетками-эффекторами+А₄₉₀ спонтанное высвобождение клетками-мишенями)×100]/(А₄₉₀ максимальное высвобождение клетками-мишенями - А490 спонтанное высвобождение клетками-мишенями).

Статистический анализ

Статистический анализ осуществляли с использованием пакета SigmaStat 3.5 package для Windows. Результаты оценивали методом одностороннего дисперсного по группам множественного сравнения с использованием метода Холма-Сидака. Во всех случаях статистически значимым считали Р<0.05.

Результаты

Исследовали цитотоксическую активность спленоцитов мышей, получавших полный состав или каждый ингредиент. Спленоциты мышей, иммунизированных полным составом, продемонстрировали значительно повышенную активность в отношении клеток-мишеней YAC-I по сравнению со спленоцитами мышей, получавших среду (воду) (Фигура 8). Мыши, иммунизированные отдельными ингредиентами, напротив, не продемонстрировали повышенной цитотоксичности в отношении клеток-мишеней YAC-I.

Заключение

Эти данные ясно показывают, что комбинация ингредиентов, по отдельности не оказывающих влияния на активацию клеток NK, становится заметно активной при смешивании компонентов в подходящих количествах.

Ссылки

1. Di Santo, J.P. Natural killer cell developmental pathways: a question of balance. Annu. Rev. Immunol. 24, 257-286 (2006) 2. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T. & Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008) 3. Lodoen, M. B. & Lanier, L.L. Natural killer cells as an initial defense against pathogens. Curr. Opin. Immunol. 18, 391-398 (2006).

ПРИМЕР 5: Пищевая добавка

Предусмотрены любые типа пищевых добавок. Например, единичная доза может представлять собой 1 г капсулу или 2 г таблетку. Общий состав является следующим:

Соответственно, популяция L. paracasei DN-114 001 таблетки или капсулы в конце процесса приготовления составляет 2×10¹⁰ КОЕ. Эту пищевую добавку получают способами, хорошо известными специалистам. В частности, штамм L. paracasei и экстракт бузины добавляют в композицию независимо друг от друга с получением, например, таблеток или капсул.

ПРИМЕР 6: Ферментированный молочный продукт

Единичная доза соответствует 100 мл ферментированного молочного продукта. Однако следует отметить, что, например, 100 г Actimel® соответствует 94-97 мл продукта в зависимости от того, идет речь о «легкой» или стандартной рецептуре.

Ферментированный молочный продукт содержит (в % по массе): - 95% молочного продукта, ферментированного штаммом L. paracasei DN-114 001, (CNCM I - 1518) (типа продукта Actimel®) и промышленным штаммом Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus.

- 5% традиционного препарата ягод бузины, содержащего 5% концентрированного экстракта сока бузины, как описано в Примере 1. Сухое вещества ферментированного молочного продукта составляет около 17% до сушки.

Состав ферментированного молочного продукта (стандартные ингредиенты в % по массе):

- 77% стандартного обезжиренного молока (3.64% белков молокаins)

- 9.6% пастеризованных сливок

- 5.7% концентрированного обезжиренного молока

- 0.6% белков обезжиренного молока

- 6.6% сахарозы

- 0.5% декстрозы (Cargill)

- DN-114 001 (CNCM 1-1518) Ferment: 108-109 KOE/ml

- Закваску, состоящую из нескольких коммерческих штаммов L. bulgaricus и S. thermophilus, общая популяция которых составляет от 10⁷ КОЕ/мл до 10⁸ КОЕ/мл.

Традиционный препарат фруктов, дополненный концентрированным соком бузины, добавляют после тепловой обработки ферментированного молочного продукта.

Характеристики конечного продукта:

250 мг сухого вещества бузины на 100 г этого продукта, т.е. для единичной дозы это составляет 1.47% по массе сухого вещества бузины в расчете на массу сухого вещества единичной дозы.

Содержание антоциана: 25 мг/100 г, т.е. для единичной дозы это составляет 0.147% по массе антоциана на сухое вещество в расчете на массу сухого вещества единичной дозы.

Популяция L. paracasei: 10⁸ КОЕ/мл на 100 мл ферментированного продукта.

Реферат

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции для стимуляции иммунитета. Композиция для стимуляции иммунитета и/или усиления иммунной защиты включает комбинацию экстракта бузины и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus или Streptococcus thermophilus, взятые в определенном соотношении. Вышеописанная композиция обладает повышенным иммуномодулирующим эффектом. 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.

Формула