Патенты

Изолированный штамм микроорганизма lactobacillus plantarum tensia dsm 21380 как противомикробный и гипотензивный пробиотик, продукт питания и композиция, содержащая упомянутый микроорганизм, и применение упомянутого микроорганизма для получения гипотензив - RU2477750C2

Код документа: RU2477750C2

Чертежи

Показать все 10 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому микроорганизму и его применению. Изобретение относится к области биотехнологий и используется в пищевой промышленности и медицине. Более конкретно объектом настоящего изобретения является противомикробный и гипотензивный штамм пробиотических микроорганизмов Lactobacillus. plantarum Tensia DSM 21380. Настоящее изобретение относится к применению данного штамма в составе продуктов функционального питания, например в сыре, и для получения гипотензивного препарата.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лактобактерии, использованные для получения ферментированных пищевых продуктов, применяются столетиями. В течение прошлых десятилетий лактобактерии широко использовались в качестве пробиотиков. Пробиотики являются живыми микроорганизмами, входящими в состав микрофлоры человеческого организма, которые, при введении в достаточном количестве, приносят пользу здоровью носителя. Обычно пробиотики используются для создания продуктов здорового питания. Продукт питания может быть отнесен к функциональным продуктам, если помимо достаточного количества питательных компонентов он содержит некоторые натуральные добавки (пре- и пробиотики), которые благотворно влияют на одну или более целевых функциональных систем организма, улучшая состояние здоровья и самочувствие, и/или понижая риск возникновения заболевания.

Пробиотическими продуктами могут быть обычные продукты (йогурт, творог, мягкие сыры) или диетические добавки (лиофилизированные микробные культуры).

В европейских странах несколько пробиотиков выведены на рынок в качестве продуктов, полезных для здоровья.

Противомикробные пробиотики

Противомикробные пробиотики, применяемые против условно-патогенных микроорганизмов и пищевых патогенов, например сальмонеллы, описаны в патентных заявках. В WO 2008/039531 (Little Columet Holdings KKC) описаны штаммы Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. paracasei, L. fermentum, L. plantanum, L. rhamnosus, L. salivarius, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. animalis subsp. lactis, B. longum, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis и E. faecium. Пероральное применение этих штаммов способствует подавлению Campylobacter jejuni, E. coli, S. aureus, Vibrio cholera, Bacteroides sp, Clostridium sp, Klebsiella sp, Listeria sp, Proteus sp. Salmonella sp, Shigella sp и Veillonella sp в пищеварительном тракте.

В патентной заявке WO 2008/016214 (Bioneer Corporation) описывается штамм Lactobacillus gasseri BNR17, обладающий противомикробным действием против E. coli, S. aureus, S. typhimurium, В. cereus, l. monocylogenes и Р. mirabilis.

Специалисты в данной области сталкиваются с проблемой влияния побочных лактобактерий (NSLAB), появляющихся в процессе созревания сыра, на его качества. Эти микробы могут быть причиной нежелательного протеолиза, появления различных нежелательных вкусовых качеств и потери товарного качества сыра.

Попытки в процессе созревания сыра воздействовать на количество NSLAB рН-регуляторами, антиоксидантами и консервантами (NaCl) потерпели неудачу. Добавление в сыр различных противомикробных веществ (молочной или уксусной кислоты, Н2О2), приводящих к появлению микробов-антагонистов, включая пробиотические лактобактерии, также было неэффективно. Пробиотические лактобактерии, вырабатывающие H2O2, были описаны несколькими авторами (Ouwehand, AC. Westerlund, Antimicrobial components of lactic acid bacteria. In: Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects. Eds. Salminen, S; Wright, A, .Ouwehand, AC. 2004, pp.375-395, New York, Marcel Dekker; Hiitt, P., Shchepetova, J., Loeivukene, K., Kullisaar, Т., Mikelsaar, M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J. Appl. Microbiol., 2006, 100, 1324-1332).

Лактобактерии человеческого и растительного происхождения плохо адаптируются в нетипичной для них среде сыра, богатой протеином и жирами, и бедной углеводами. Вследствие этого, существует лишь небольшое количество сыров, содержащих пробиотические лактобактерии (Gardiner, G, Ross, R.P, Collins, 1.H, Fitzgerald, G, and Stanton. C. Development of a probiotic cheddar cheese containing human derived Lactobacillus paracasei strains, Appl. Environ. Microbiol., 30 1998, 64,. 6: 2192-2199; Ross, R P, Fitzgerald, G F, Collins, J K, O'sullivan, G C, Stanton, С G. Process for the manufacture of probiotic cheese, патент США 6872411, патентная заявка WO 99/62348 AI), в которых добавленные пробиотические бактерии сохраняют свою способность вызывать вегетативное брожение (WO 2002/05665, WO 2000/60948, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas). Это же касается и сходной группы антимикробных веществ, содержащих колицины, которые в основном атакуют представителей того же рода и вида (Heinaru A, Tallmeister E. Colicin susceptibility of shigellas and coli bacteria related to episomal resistance and colicinogenicity or dissociation into S-R forms. Geneetika, 1971, 7, 5, 113-122 (на рус. яз.)). Вследствие этого, они обладают потенциалом для применения в качестве веществ, подавляющих побочные лактобактерии.

Выработка плантарицинов регулируется несколькими генами, некоторые из которых встречаются время от времени, некоторые - регулярно. Вследствие этого встречаются фенотипические различия в выработке плантарицина. Локус генома, связанный с выработкой бактериоцина, был описан в штамме 11 Lactobacillus plantarum. Два оперона этих генов, носящих названия plnEFI и plnJKLR, имеют каждый пару генов pInEF и pInJK, кодирующих два маленьких катионных бактериоциноподобных пептида глицин-сдвоенного типа лидерной последовательности (Diep, D.В., Havarstein, L.S. & Nes, 1.F. Characterization of the locus responsible for the bacteriocin production in Lactobacillus plantarum C11. J Bacterial 1996, 178, 4472-4483). Изобретений, касающихся штамма L. plantarum, который может подавлять NSLAB, и обладать полным набором офплантацирин-кодирующих генов EF и JK, не существует.

Гипотензивные пробиотики

Многие люди страдают от метаболического синдрома, симптомы которого включают избыточный вес, ожирение, рост кровяного давления, рост содержания глюкозы в крови, и некоторые другие маркеры риска развития атеросклероза. Продукты, богатые жирами (включая сыр), не являются безвредными, так как эти продукты могут увеличить риск развития атеросклероза, воспаления, диабета второго типа и/или перекисного окисления липидов (Raff M., Tholstrup Т., Basu S., Nonboe P., Sorensen MT, Straarup ЕМ. 138.509-514. A diet rich in conjugated linoleic acid and butter increases lipid peroxidation but does not affect atherosclerotic, inflammatory, or diabetic risk markers in healthy young men (American Society for Nutrition J. Nutr. 2008, 138:509-514).

Конъюгированная линолевая кислота (CLA) относится к двум естественным изомерам 18-углеводной линолевой кислоты (LA, cis-9, cis-12-18:2). CLA формируется в процессе естественной биогидронизации и окисления. Изомеры CLA формируются в процессе биогидронизации линолевой кислоты в первом отделе желудка жвачных животных и в процессе переработки вакценовой кислоты в молочной железе. В оптимальных дозах изомеры конъюгированной линолевой кислоты (CLA) имеют высокий потенциал для улучшения здоровья: они обладают противомикробным, антитуморогенным, противодиабетическим, гипоаллергенным действием и препятствуют ожирению. Гипотензивный эффект был также изучен несколькими исследовательскими группами (Inoue K., Okada F., Ito R., Kato S., Sasaki S., Nakajima S., Uno A, Saijo Y, Sata F., Yoshimura Y., Kishi R. and Nakazawa H., Perfluorooctane sulfonate (PFOS) and related perfluorinated compounds in human maternal and cord blood samples: assessment of PFOS exposure in a susceptible population during pregnancy. Environ. Health Perspect. 112 (2004), стр.1204-1207).

Однако добавление CLA в пищу в больших количествах проблематично. В ходе исследований было установлено, что потребление 5 г CLA в день ведет к росту перекисного окисления липидов (LPO), выражающегося в повышенной концентрации (83%) 8-изопростагландина F2 (Raff M., Tholstrup Т., Basu S., Nonboe P., Sorensen MT, Straarup EM. 138.509-514. A diet rich in conjugated linoleic acid and butter increases lipid peroxidation but does not affect atherosclerotic, inflammatory, or diabetic risk markers in healthy young men American Society for Nutrition 1. Nutr. 2008, 138:509-514).

Наилучшим решением является использование штамма лактобактерий, обладающего способностью ограничивать выработку CLA и физиологически выраженными антиоксидантными свойствами. Включение в пищу физиологически значимых антиоксидантных LAB позволило контролировать возрастание перекисного окисления липидов (LPO) и повышать биопригодность богатых жирами продуктов, например сыра. Lactobacillus fermentum 1VIE-3 описаны в патенте Эстонии ЕЕ04580 Университета Тарту, а в научных статьях отмечалась заметная физиологическая антиоксидантная активность (Kullisaar Т, Zilmer M, Mikelsaar M, Vihalemm Т, Annuk Н, Kairane С, Kilk A Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics. Int.; J. Food Microbiol., 2002, 72, 215-224; Kullisaar, T., Songisepp, E., Mikelsaar, M., Zilmer, K., Vihalemm, Т., Zilmer, M. Antioxidative probiotic fermented goats' milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human subjects. Br. J. Nutr., 2003, 90, 449-456; Truusalu, К. Naaber, P., Kullisaar, Т., Tamm, Н., Mikelsaar, R-H., Zilmer, K., Rehema, A, Zilmer, M., Mikelsaar, M. The influence of antibacterial and antioxidative probiotic lactobacilli on gut mucosa in a mouse model of Salmonella infection. Microbial Ecology in Health and Disease 2004, 16:4, 180-187).

Концентрация полиаминов в человеческой крови и их выделение с мочой меняется в зависимости от потребления пищи с различным содержанием полиаминов, а также в зависимости от продуцентов эндогенных полиаминамов в микрофлоре кишечника человека, таких как E. coli и некоторых анаэробных бактерий (Marino M. Maifreni M, Moret S., Rondinini G. The capacity of Enterobacteriaceae sp. to produce biogenic amines in cheese. Letters of Microbiology, 2000, 31, 169-173). Некоторые пищевые продукты содержат полиамины в относительно высоких концентрациях, например апельсины содержат значительное количество путресцина 1330 мкг/100 г (Larque E." Sabater-Molina M., Zamora S. Biological significance of dietary polyamines. Nutrition, 2007, 23, 87-95.). Штаммы лактобактерий, которые способны вырабатывать умеренное количество CLA и полиаминов, и в то же время обладать физиологически значимой антиоксидантностью, еще не были описаны.

Уровень кровяного давления регулируется такими веществами, как моноксидом азота (NO), продуктами перекисного окисления липидов (LPO), окисленными липопротеинами низкой плотности и компонентами глутатион окислительно-восстановительной системы (GSSGIGSH), которая регулирует ригидность кровяных сосудов и влияет на их вазоконстрикцию.

Кроме того, рост уровней LPO, ox-LDL, GSSGIGSH является фактором риска развития атеросклероза. Метаболизм ацетилированного спермидина обеспечивает дополнительные сосудорасширяющие свойства (понижение кровяного давления) благодаря его ацетилированной форме и обычным формам полиамина (Myung CS, Blankenship JW, Meerdink DJ. A mechanism of vasodilatory action of polyamines and acetylpolyamines: possible involvement of their Ca2+ antagonistic properties, J Pharm Phannacol. 2000, 52:695-707).

Некоторые пептиды, содержащиеся в молоке, обладают свойством понижать кровяное давление посредством подавления ангиотензин-преобразующего фермента I (АСЕ) (Meisel, Н. & Bocklemann, W. Bioactive peptides encrypted m milk proteins: proteolytic activation and tropho-functional properties. In: Proceedings of the sixth symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications. 19-23 September. Veldhoven (W.N.Konings, O.P.Kuipers, and 1. Huis in't Veld., eds.) Kluver Academic Publishers, the Netherlands. 1999. pp.207-215 (1999)).

Монооксид азота NO принадлежит к биоактивным веществам, обладающим несколькими полезными свойствами, такими как противомикробным и противовоспалительным действием, а также способностью понижать кровяное давление (Janeway, CA, Travers, P, Walport, M, Shlomchik, M1. 2005. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. New York, NY: Garland Science Publishing). NO влияет на кровяное давление различным образом, например расслабляя гладкие мышцы кровяных сосудов, подавляя АСЕ или развитие эндогенных механизмов защиты (предварительной адаптации) (Jones SP, Bolli R. The ubiquitous role of nitric oxide in cardioprotection. J Mol Cell Cardio 12006; 40: 16-23).

На сегодняшний день существует лишь несколько изобретений, касающихся пробиотических микроорганизмов, которые эндогенно вырабатывают или способствуют эндогенной выработке NO. Бактерии молочной кислоты, способствующие эндогенной выработке NO, описаны в патентных заявках Эстонии ЕЕ 00200230А и ЕЕ 200200231 (Valio Ltd.). В патентной заявке ЕЕ 00200230А описан штамм Lhelveticus LBK-16H, DSM 13137, обладающий фотолитическим действием, который вырабатывает ди- и трипептиды. Эти ди- и трипептиды, полученные из казеина благодаря молочнокислому брожению, собирают посредством нанофильтраци и затем добавляют в пищевые продукты, включая продукты брожения молока, что позволяет создать продукт, содержащий противогипертонические пептиды. В патентной заявке ЕЕ20020023 описан штамм L. heiveticus LBK-15 16H, DSM 13137, который помимо способности вырабатывать ди- и трипептиды, способен также стимулировать выработку NO в двух линиях клеток (в энтероцитах мышей и человека). Данный штамм способствует понижению кровяного давления посредством выработки пептидов и NO. Авторы заявки отмечаютают, что бактериальные клетки не были единственными продуцентами NO (страница 13, строки 8-9).

В патенте США US 7183108 (Compagnie Gervais Danone, 2007) описан штамм Lactobacillus casei, обладающий противовоспалительным свойством благодаря возрастанию выработки NO (NO вырабатывается провоспалительными цитокинами и активированными энтероцитами), и vice versa - бактериальная выработка NO подавляется тогда, когда энтероциты уже активированы провоспалительными цитоксинами и бактериальными липополисахаридами.

Корхонен и др. в 2001 (Korhpnen К, Reijonen TM, Remes К, Malmstrom K, Klaukka Т, Korppi M. Reasons for and 'costs of hospitalization for paediatric asthma: A prospective I-year follow-up in a population-based setting. Pediatr Allergy Immunol 2001:12:331338) показал, что Lactobacillus rhamnosus GG могли стимулировать выработку NO клетками эпителия кишечника или посредством индукции провоспалительных цитосинов. Эти авторы указывали на возможную предпочтительную связь между выработкой LOG и выработкой NO.

В европейском патенте ЕР 0951290 (Laboratories Standa S.A., 2002) описаны вырабатывающие NO пропионибактерии, добавляемые в композицию для выработки NO в желудочно-кишечном тракте, предположительно в энтероцитах. Там же штамм Lactobacillus farciminis упоминается как негативный пример продуцента низкого количества NO. В патенте США US 7294337 (Национальный институт агрономических исследований, 2007) однако показано, что L. farciminis может вырабатывать NO в количествах, достаточных для противовоспалительного эффекта и подавления боли после растяжения в брюшной полости.

Было выявлено, что штамм L. fermentum LF1 мог вырабатывать NO аэробно в MRS бульонной питательной среде без наличия культуры клеток человека. Штамм L. plantarum DSM9843 (LP2), тестировавшийся теми же авторами, не мог действовать сходным образом в отличие от нашего штамма L.Plantarum Tensia DSM 21380 (JXu, .W.Verstraete. Evaluation of nitric oxide production by lactobacilli L Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 56:504-507). Введение в человеческий организм штамма в качестве пробиотика с вышеупомянутыми свойствами позволяет контролировать кровяное давление благодаря свойству штамма вырабатывать NO и свойству NO влиять на уровень кровяного давления, как описано выше.

Кроме низкой выживаемости в пищевых продуктах, выбор пробиотических бактерий обуславливается проблемой низкой выживаемости штаммов при прохождении желудочно-кишечного тракта. Таким образом, требуются такие пробиотические бактерии, которые могут выжить и в верхней, и в нижней части желудочно-кишечного тракта. В международной патентной заявке WO 91/05850 (Университет Тарту и др., 1989) описан штамм 1. plantarum 38 как подходящий для регулирования микрофлоры толстого кишечника в случае бактериального дисбиоза. В европейском патенте ЕР 0554418 B1 (Probi АВ, 1998) описаны положительные свойства штамма L. plantarum 299 (DSM 6595) образовывать колонии в кишечнике человека, а также применение данного штамма в составе жидкого овсяного напитка, применяемого для хирургических пациентов с целью предотвращения внутренней инфекции. В международной патентной заявке WO 2007/003917 A1 (Matforsk AS et al., 2006) описаны штамм Lactobacillus plantarum DSM 16997 (DSM 17320) и штамм 1. pentosus (DSMI7321) как микробы, вызывающие брожение в мясных продуктах. Авторы данной заявки утверждают, что эти штаммы могут функционировать как пробиотики, регулирующие внутреннюю микрофлору человека посредством подавления вредоносных бактерий и также симбионтов Escherichia coli. С целью подтвердить это утверждение в заявке представлены результаты in vitro экспериментов. Однако в заявке не представлены доказательства in vivo подавления патогенов (т.е. на экспериментальной модели с животным). Кроме того, не продемонстрировано подавление побочных лактобактерий (NSLAB), несмотря на то, что в заявке описано, что NSLAB выживают в среде (колбасные изделия) при низких уровнях рН. Без предоставления доказательств в заявке утверждается, что пробиотические штаммы обладают иммуностимулирующим свойством и способны понижать риск возникновения сепсиса после хирургических вмешательств, а также улучшают самочувствие пациентов.

В патенте Эстонии ЕЕ04097 B1 (Probi АВ, 2003) описано применение Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) для лечения инфекций мочеполовых путей, поскольку штамм способен прикрепляться к эпителию толстого кишечника ввиду его манноза-специфического адгезина, и конкурировать с вредоносными патогенами мочеполового тракта за место прикрепления. Согласно результатам анализа REA (эндонуклеазы рестрикции) все вышеупомянутые штаммы отличаются друг от друга и от Lactobacillus plantarum Tensia DSM, 21380 четким профилем хромосом.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому изолированному штамму микроорганизма Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, используемому в качестве противомикробного и гипотензивного пробиотика, пищевым продуктам (молочным продуктам, например продуктам брожения или сыру) и композициям, содержащим упомянутые микроорганизмы, а также к использованию упомянутых микроорганизмов для производства гипотензивного лекарственного средства. Изобретение также относится к способу подавления патогенов и побочных лактробактерий в пищевых продуктах и к способу увеличения срока годности пищевых продуктов путем использовния Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380.

Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 как противомикробный пробиотик вырабатывает противомикробные вещества - молочную кислоту, уксусную кислоту, CLA, NO, H2O2 и обладает плантарицин - II b классом парных генов EF и JK, кодирующих антимикробные структуры. При помощи своих метаболитов Lactobacillus plantarum DSM 21380 подавляет в in vitro эксперименте побочные лактобактерии и кишечные патогены. Данный штамм способен развиваться и доминировать среди лактобактерий при низких температурах и в состоянии углеводной недостаточности (например, в сыре).

В дополнение к противомикробному действию Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 также является гипотензивным и антиоксидантным пробиотиком благодаря выработке NO, CLA и антиоксидантности, в in vitro эксперименте вырабатывает небольшое количество полиаминов тирамина и путресцина и превалирует в микрофлоре кишечника волонтеров после трех недель употребления сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380. Свойство Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 организовывать колонии в человеческом кишечнике было обнаружено в пробах фекалий как на профиле электрофореза в денатурирующем градиентном геле, так и традиционными способами, принятыми в бактериологии. Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в значительной степени активизирует метаболизм путресцина и ацетилированного спермидина в человеческом теле, что сопровождается понижением систолического и диастолического кровяного давления.

ОПИСАНИЕ ШТАММА

Объект изобретения, штамм микроорганизмов Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, был выделен из пробы фекалий здорового ребенка во время сравнительного изучения микрофлоры эстонских и шведских детей. Микроорганизм L. plantarum Tensia DSM 21380 выделяли путем посева раствора фекалий здорового годовалого эстонского ребенка (10-2-10-7 в фосфатном буферном растворе с 0.04% тиогликолевой кислотой; рН 7.2). Раствор сеяли в свежеподготовленную MRS агаровую среду (Oxoid) и культивировали микроаэробно при 37°С.

Штамм, который является объектом изобретения, был выделен согласно характерной морфологии колоний и подсажен к Lactobacillus sp. Предварительную и более четкую идентификацию осуществляли способами, описанными ниже.

Тот факт, что микробный штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 выделен из кишечного тракта здорового ребенка, подтверждает его GRAS статус (признан полностью безопасным), то есть этот штамм микроорганизмов безопасен для организма человека и подходит для перорального применения.

Микроорганизм Lactobacillus plantarum штамма Tensia был депонирован в немецкую коллекцию микроорганизмов и культур клеток 16.04.2008 под регистрационным номером DSM 21380.

Культурально-морфологические характеристики были выявлены после культивации в MRS агаре и MRS бульонной питательной среде (OXOID). Клетки Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 являются грамположительными, неспороносными палочками правильной формы, встречающимися поодиночке, парно или в коротких цепочках.

Физиологические биохимические характеристики

Культивацию штамма проводили в MRS бульонной питательной среде в течение 24-48 часов в микроаэробно, после чего в бульонной питательной среде произошел гомогенный турбидный рост. Колонии на пластинах с MRS агаром после 48 часов роста при 37°С в микроаэробных условиях (атмосфера CO2/O2/N2: 10/5/85) являются круглыми, 2-2.5 мм в диаметре, цельными, выпуклыми и белыми.

Оптимальная температура роста - 37°С, штамм размножается также при температуре 15°С и 45°С. Оптимальный рН уровень среды роста - 6.5.

Штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 является каталазо- и оксидазонегативным, факультативно гетероферментивным, не вырабатывает газ из глюкозы и не вызывает гидролиз аргинина. Штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 был идентифицирован на основе биохимической активности с набором системы API 50CHL (bioMerieux, Франция) как Lactobacillus plantarum (совпадение с типом штамма: превосходное, ID % - 99.9, T index - 0.86).

Сравнение с упомянутым штаммом Lactobacillus plantarum ATCC 14917 подтвердило предварительную идентификацию по API 50CHL.

Углеводородный профиль использования Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 согласно API 50 CHL следующий: положительная реакция на рибозу, L-арабинозу, галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, маннит, метил-D-маннозид, метил-D-глюкозид, N ацетил-глюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, малтозу, лактозу, мелибиозу, D-арабинозу, сахарозу, трегалозу, мелицитозу, D-рафинозу, β-генциобиоза, D-туранозу, глюконат; слабая реакция на крахмал.

Согласно тест-набору API ZYM (bioMerieux, Франция), Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 обладает лейцин ариламидазо-, кислотно-фосфатазной, а-глюкодазо-, β-глюкодазо- и ацетонин-активностью. Была отмечена слабая реакция на валин ариламидазу, нафтол-AS-BI-фосфогидролазу, β-галактозидазу, цистин арилиунидазу, эстеразу (С4), эстеразу (С8), N-30 ацетил-глюкозаминидазу.

Молекулярная идентификация Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 была подтверждена при помощи полимеразной цепной реакции внутреннего транскрибированного спейсера (ITS-PCR в сравнении с упомянутым штаммом Lactobacillus plantarum ATCC 14917 (Фиг.1)).

Способ. Идентификация штамма была подтверждена при помощи полимеразной цепной реакции внутреннего транскрибированного спейсера (ITS-PCR в сравнении с упомянутым штаммом Lactobacillus plantarum ATCC 14917).

Выделение ДНК из Lactobacillus было выполнено с использованием лизоцима (Serva, Швеция; 20 мг/мл), мутанолизина (Sigma; 0.5 мг/мл) и растворов K-протеиназы (Fermentas, Литва; 14.6 мг/мл).

Амплификация ДНК была выполнена в 1×Taq буферном растворе полимеразы, включавшем 1,5U Taq полимеразы (Fermentas, Литва), 0.5 мкМ каждого праймера (16S-1500F и 23S-32R; DNA Technology AS), 200 мкМ дезоксинуклеотида трифосфатов (Amersham Pharmacia Biotech, Германия), 2 мМ MgCh и 2 мкМ исследуемой ДНК.

Затем, продукт ПЦР (PCR) был ограничен с использованием Taq 1 рестриктазы (Fermentas, Литва). Продукты ПЦР были разделены 2% агарозным гелем в 1×TBE буффере; напряжение 100 В. Бендинговые паттерны визуализированы в ультрафиолетовом свете и сопоставлены с упомянутым штаммом L. plantarum ATCC 14917.

Молекулярные «отпечатки» Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 были сопоставлены с упомянутым штаммом L. plantarum путем гель-электрофореза в пульсирующем поле (pFGE) (Фиг.2).

Способ. Для процедуры гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) штаммы лактобактерий выращивали в MRS бульонной питательной среде при 37°С в течение 24 часов. Клетки промывали в SE буферном растворе (75 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, рН=7.4), плотность клеток была приведена к 1.5 (OD600). Выделение ДНК из изолированных Lactobacillus выполняли в ЕС буферном растворе (50 мМ EDTA (рН 8.5), 0.5% Na-лаурилсаркозин, 0.2%'Na-деоцитат 2 мг/мл лизозима, 10 ед. мутанолизина), а затем в буферном растворе, содержащем 1 мг/мг раствора K протеиназы (100 мМ EDTA-1% саркозил - 30 0.2% дезоксихолат, рН 8.0). Лизированные пробы промывали в ТЕ буферном растворе и делили по 2 мм, которые затем экстрагировали в течение ночи ферментами 50 ед. Not I (Bio-Rad). Электрофорез проводили в CHEF-DR II (Bio-Rad) в течение 22 часов при 14°С. Бендинговые паттерны визуализировали в ультрафиолетовом осветителе.

Устойчивость к антибиотикам

Способ. Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 тестировали с использованием полосок антибиотиков Е-теста (АВ Biodisk, Solna). MIC (минимальная ингибиторная концентрация) была установлена согласно эпидемиологическим контрольным значениям, рекомендованным Европейской комиссией (EUC).

Таблица 1Устойчивость Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 к антибиотикам MIC*, мкг/млMIC*, мкг/млКонтрольные значения MIC* устойчивости к антибиотикам Европейской комиссии (EUC), мкг/млАнтибиотикL. plantarum Tensia DSM 21380L. plantarum Tensia DSM 21379Ампициллин0.250.194Гентамицин1.5164Стрептомицин16664Эритромицин0.190.254Клиндамицин0.0320.0162Тетрациклин8632Хлоромицетин228Ципро/Офлоксацин32324Квинопристин/далфопристин114* минимальная ингибиторная концентрация

Штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 не проявлял устойчивость к антибиотикам при использовании большинства наиболее значимых противомикробных препаратов.

Несколько большая MIC для ципрофлоксацина была отмечена в нормальном состоянии для исходных штаммов, описанных ранее. Вследствие этого, вероятно, это исходный тип штамма (Vankerckhoven V, Huys G, Vancanneyt M, Yael С, KlareI, Romond M-B, Entenza J M, Moreillon P, D. Wind R, Knol J, Wiertz E, Pot В., Vaughan E.E, Kahlmeter G, Goossens H. Biosafety assessment of probiotics used for human consumption: recommendations from the EUPROSAFE project. Trends in Food Science & Technology, 2008; 19: 102e114) и горизонтальный перенос устойчивых к антибиотикам генов Lactobacillus planlarum Tensia DSM 21380 во время использования штамма в качестве пробиотика не может быть спрогнозирован.

Функциональные свойства

Профиль метаболитов

Способ. Профиль метаболитов определяли способом газовой хроматографии (Hewlett-Packard 6890) после инкубации в микроаробной среде в течение 24 и 48 часов (Таблица 2). Штамм L. plantarum выращивали микроаэробно в MRS агаре в течение 48 часов (10% CO2). Суспензию (McFarland 4.0 стандарт турбидности, 109 KOE/ml) культуры лактобактерий готовили в 0.9% растворе NaCl. 1.0 мл этой суспензии помещали в 9.0 мл MRS бульонной питательной среды. Концентрация метаболитов (ммоль) определяли с использованием капиллярной колонки HP-INNOWax (15 м × 0.25 мм; 0.15 мкм). Температурный режим колонки: 60°С 1 мин, 20°С/мин 120°С 10 мин; детектор (FID) 350°С.

Электрохимические замеры Н2О2 выполняли с интактными клетками 24-часового возраста в 500 мкл MRS бульонной питательной среды при помощи анализатора свободных радикалов Apollo 4000 (WPI, Berlin, Germany) и электродов типа ISO-HP02 и ISO-NOP.

Сигналы электродов ISO-HP02 регистрировали в течение 5-7 минут. Определяли средний уровень сигнала. Каждая экспериментальная точка была измерена в четырех независимых параллелях и каждая параллель была измерена дважды. Концентрация H2O2 была определена согласно калибровочной кривой корреляции с силой сигнала электродов.

Таблица 2Количество уксусной кислоты, молочной кислоты и янтарной кислоты (ммоль/л), выделяемое Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в MRS бульонной питательной среде при микроаэробной культивации в течение 24 и 48 часов и концентрация H2O2 (мкг/мл) интактных клетокL. plantarumУксусная кислота (ммоль/л)Молочная кислота (ммоль/л)Янтарная кислота (ммоль/л)H2O2 (µг/мл) 24 ч48 ч24 ч48 ч24h48h24h интактные клеткиTensia DSM 213 801,41.7112,2129.20.60.6196.4±128.8DSM213792.12.4133.3186.60.60.6288.9±175.8

Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 вырабатывает значительное количество уксусной кислоты, молочной кислоты и перекиси водорода. Концентрация последнего согласно показателям анализатора Apollo, однако, немного ниже, чем у контрольного штамма.

Противомикробное действие против патогенов и побочных лактобактерий

Lactobacillusplantarum Tensia DSM 21380 проявляет в in vitro эксперименте в MRS агаровой среде антагонистическое действие в отношении побочных лактобактерий и некоторых кишечных патогенов (Таблица 3). Это свойство позволяет использовать штамм для продления срока годности пищевых продуктов.

Таблица 3Противомикробное действие Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 проти патогенов и побочных лактобактерий в модифицированной MRS агаровой среде (зона подавления роста патогенов, мм)ПатогенЗона подавления роста, ммПобочные лактобактерии (NSLAB)8.6±4.07Listeria monocytogenes ATCC5177425.1±1.7Yersinia enterocolitica13.5±1.7Salmonella enteritidis25.2±1.5S. enterica serovar Typhimurium22.8±0.1Shigella sonnei25.1±1.6Escherichia coli29.8±3.7Enterobacter sakazakii18.5:±3.6 1Campylobacterjejuni12.9'±5.2

Противомикробное действие Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в in vitro эксперименте лабораторных условиях, определяемое при процедуре нанесения материала на питательную среду в виде полосок (определение противомикробного эффекта метаболитов) было наибольшим против Е. coli, за ним следует подавление роста Salmonella sp., Shigella sp и Listeria sp. Самое низкое противомикробное действие Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 было против других лакторактерий (NSLAB).

Противомикробное действие Lactobacillus plantarum Tensia (DSM 21380) при 4°С против психрофильных патогенов

Представляется важным выявить противомикробное действие штаммов микроорганизмов, используемых как вспомогательная закваска, против психрофильных патогенов пищевого происхождения при 4°С (т.е. при температуре хранения пищи).

Способ. Процедура окраски полос использовалась для выявления противомикробных свойств Lactobacillus sp (Hutt Р, Shchepetova J, Loivukene К, Kullisaar Т, Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appi Microbiol. 2006; 100 (6): 1324-32).

Зона ингибирования роста патогенов измерялась в миллиметрах. Аналогично работе Hutt et al. (2006), вычислялось арифметическое среднее и его отклонение, а также вычислялось стандартное отклонение в соответствии с результатами использованных образцов и на этой основе было выявлено антагонистическое действие штаммов (мм) в следующем виде: при 4°С - ниже <14.6; среднее 14.6-21.4; сильное >21.4. Все опыты повторялись, по меньшей мере, три раза, независимо друг от друга.

Таблица 3ААнтогоностическое действие (мм) L. plantarum Tensia (DSM 21380) по способу окрашивания полосок при 4°С инкубации в течение 3 недельПатогенL. plantarum Tensia (DSM 21380)Listeria monocytogenes ATCC 1393218.8±1.0Lisleria monocytogenes ATCC 5177418.5±3.0Y. enterocolitica (клинический штамм)19.0±2.9Зона ингибирования (мм): слабая <14.6; средняя 14.6-21.4; сильная >21,4

Метаболиты L. plantarum Tensia (DSM 21380) способы ингибировать жизнеспособность психрофильных L. monocytogenes и Y. enterocolitica при 4°С.

Влияние условия роста и инкубационной температуры на противомикробные свойства L. plantarum Tensia (DSM 21380)

Способ. Для оценки влияния условия роста и температуры на производство противомикробных компонентов посредством L. plantarum Tensia (DSM 21380) использовались различные инкубационные температуры (15°С; 30°C и 37°C) и различные условия роста (MRS бульон и типовое молоко для производства сыра). Лактобактерии росли при инкубационных температурах 30°С и 37°C в течение 20-22 часов и при 15°С в течение 30 дней (модель «сыра»).

Антагонистические свойства были выявлены в течение 10-дневных интервалов.

Опыты с естественным супернатантом (рН диапазон 3.65-3.85) и нейтрализованным супернатантом (рН диапазон 6.0±0.15) осуществлялись независимо друг от друга для исключения влияния органических кислот. Противомикробное действие было выявлено при проверке по методу диффузии в агар (Jimenez-Diaz R., Rios-Sanchez R.M., Desmazeaud M., Ruiz-Barba J.L. and Piard J.-C. (1993) Plantaricins S and T, Two New Bacteriocins Produced by Lactobacillus plantarum LPCO10 Isolated from a Green Olive Fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1416-1424) штамма Listeria monocytogenes ATCC 51774 ATCC 13932.

Таблица 3ВВлияние различных инкубационных температур (30°С и 37°C) и рН супернатантна (естественный: 3.65…3.85 и нейтрализованный: рН 6.0±0.15) L. plantarum Tensia, выращенного в MRS на антагонистическое действие против моноцитоенов Listeria (ингибирование роста патогенов в мм)Штамм30°С37°СестественныйнейтральныйестественныйнейтральныйL. plantarum Tensia (DSM 21380)5.1±1.4#3.7±2.6#5.4±0.5§4.2±2.0§L. plantarum DSM 213791.1±2.11.1±2.11.4±2.21.4±2.3#р=0.03;§p=0.04

Супернатант L. plantarum Tensia (DSM 21380), вырасший в молоке в течение 20-22 часов при 30°С и 37°C, не имел антагонистического воздействия на тестируемые infvvs L. monocytogenes.

Влияние бактериоцинов, произведенных лактобактериями сильнее в кислотной среде, также как и в этом случае, когда все противомикробные составляющие, произведенные бактериями, действовали синергетически. Оптимальный диапазон работы бактериоцинов рассматривается как рН 5.0…7.0 (Atrih A., Rekhif N., Moir A.J.G., Lebrihi A. and Lefebvre G. (2001) Mode of action, purification and amino acid sequnce of plantaricin С19, an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum С19. Intern. Journal of Food Microbiol. 68, 93-104; Mezaini A., Chihib N.-E., Bouras A.D., Nedjar-Arroume, N. and Hornez, J.P. (2009) Antibacterial Activity of Some Lactic Acid Bacteria Isolated from an Algerian Dairy Product. J. of Environ. And Public Health. 1-6).

Противомикробное действие супернатанта L. plantarum Tensia (DSM 21380), вырасшего в MRS бульоне, зависит от значений рН - противомикробное действие естественного супернатанта (рН 3.65…3.85) против тестируемых штаммов Listeria sp было значительно лучше, чем таковое для нейтрализованного супернатанта (Таблица 3В).

Противомикробное действие супернатанта L. plantarum Tensia (DSM 21380), вырасшего в MRS бульоне, зависит от инкубационной температуры, и является более сильным при 37°С (Таблица 3В).

Таблица 3СВлияние низкой инкубационной температуры (15°С) и различных условий роста (MRS и молоко) на противомикробное действие против Listeria sp в течение 30 дней инкубации в MRS бульоне и молоке (ингибирование роста патогенов в мм)ШтаммMRSМолоко День 10День 20День 30День 10День 20День 30L. plantarum Tensia5.6±0.85.8±1.37.1±1.403.0±2.36.0±0.7L. plantarum DSM 2137900.6±1.11.9±2.602.2±2.80

Супернатант L. plantarum Tensia (DSM 21380), вырасший при 15°C в MRS бульоне, имел антагонистическое действие начиная с первого измерения (10-й инкубационный день). Противомикробные свойства против Listeria sp супернатанта L. plantarum Tensia (DSM 21380), отделенного от молока, наблюдались начиная с 20-го инкубационного дня, и противомикробные действия супернатанта оставались и несколько усиливались при приближении к концу инкубационного периода. Противомикробные свойства супернатанта штаммов, отделенных от молока, были значительно слабее (р<0.01) в сравнении с супернатантом лактобактерий, вырасших в MRS бульоне.

Бактериоцин-гены Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380

Способ. Определение в Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 бактериоцин-кодирующих генов основывалось на Lactobacillus plantarum WCFS1 генах plnE, plnF plnJ и plnK. Эти гены кодируют предшествующие пептиды бактериоцина (Lactobacillus plantarum WCFS1 genome annotation - Kleerebezem et al., 2003. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFSI. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Feb. 18; 100 (4): 19905). Праймеры для ПЦР были разработаны с использованием Primer Express®. Аннотированный геном Lactobacillus plantarulli WCFS1 был загружен с браузера геномов NCBI (http://vmw.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes).

Эти праймеры были разработаны как E1F, E1R, F1F, FIR, JIF, JIR, K2F, K2R (см. перечень последовательностей) и их использование в ПЦР-реакции позволило получить положительные сигналы для всех упомянутых последовательностей. Штамм L. plantarum ВАА-793 NCIMB 8826 был использован в качестве положительного контроля, а штамм L. plantarum DSM 21379 - в качестве отрицательного контроля.

Таблица 4Наличие расширенного спектра продуктов ПЦР в геномной ДНК бактериоцин-кодирующих генов plnE, plnF, plnJ и plnK Lactobacillus plantarum DSM 21380 ГеныplnEplnFplnJplnKL. plantarum BAA-793 (NCIMB 8826)++++L. plantarum Tensia DSM 21380++++L. plantarum DSM 21379++--

Антагонистическое действие L. plantarum Tensia DSM 21380 по сравнению с другими противомикробными веществами также основано на вышеупомянутых генных продуктах, например противомикробных пептидах. Пептиды Е&F и J&K должны быть экспрессированы одновременно для получения максимального отклика посредством дипептидов.

Выработка микроорганизмами штамма L.plantarum Tensia DSM 21380 линолевой кислоты с сопряжёнными двойными связями (CLA)

Способ. Выработку линолевой кислоты с сопряжёнными двойными связями (CLA) определяли в MRS бульонной питательной среде (de Mann-Rogosa-Sharpe, Oxoid, UK) и в снятом молоке при помощи спектрофотометрических измерений.

MRS бульонная питательная среда39.9 мг/л (умеренная)Снятое молоко19.2 мг/л (умеренная)Сыр3.0±0.3 мг/г

Выработка монооксида азота L. plantarum Tensia DSM 21380

Способ №1. Замеры количества вырабатываемого монооксида азота выполняли с интактными клетками 24-часового возраста в 500 мк MRS бульонной питательной среды с анализатором свободных радикалов Apollo 4000 (WPI, Berlin, Germany) и электродами типа ISO-NOP. Сигналы электродов регистрировались в течение 5-7 минут. Определяли среднюю силу сигнала. Каждая экспериментальная точка была измерена в четырех различных параллелях и каждая параллель была измерена дважды. Концентрацию NO определяли согласно корреляции калибровочных кривых с силой сигнала электродов.

Таблица 5АКоличество NO (мкМ), вырабатываемого L. plantarum Tensia DSM 21380Номер штаммаКонцентрация NO (мкМ)L. plantarum Tensia DSM 213802.6±0.8L. plantarum DSM 213792.7±1.2L. coprophilus2.1±1.1L. plantarum2.1±0.9L. paracasei ssp paracasei штамм номер 11.3±0.8L. paracasei ssp paracasei штамм номер 21.8±0.9L. paracasei ssp paracasei штамм номер 32.8±1.6L. buchneri2.0±1.1

L. plantarum Tensia DSM 21380 был одним из лучших продуцентов NO в сравнении с 8 другими штаммами Lactobacillus sp.

Способ №2. Формирование оксида азота измерялось в микробных клетках с возрастом в 24 часа, инкубированных в 10 мл MRS бульона, содержащего 3 или 20 мг NaNO3.

Измерения проводились с использованием анализатора свободных радиколов Apollo 4000 как это описано выше.

Таблица 5ВШтаммКонцентрация NaNO3Концентрация NO (мкМ) в MRS бульоне MRS бульон0.0±0.0L. plantarum Tensia DSM 21380MRS бульон-0.1±0.03 мг NaNO34.5±0.930 мг NaNO311.0±2.2L. plantarum DSM 21379MRS бульон0.7±0.43 мг NaNO34.1±5.330 мг NaNO35.4±6.0

Количество NO, сфорированного L. plantarum Tensia DSM21380, зависит от концентрации NaNO3 в носителе.

Разрешенная концентрация NaNOs в соленых или пресированных продуктах является 300 мг/кг, и сыре 150 мг/кг (http;//www.riigiteataja.ee/ert/act.jsp?id=12937247).

Антиоксидантное действие Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380

Способ. Для определения ТАА и TAS микробных клеток штамм L. plantarum Tensia DSM 21380 был помещен в MRS бульонную питательную среду (Oxoid, U.K.) на 24 часа при температуре 37°С. Микробные клетки собирали путем центрифугирования (1500 RPM, в течение 10 мин) при 4°С, а осадок промывали в изотоническом растворе (4°С) и суспендировали в 1.15% KCl (Sigma, USA). Плотность суспензии составила OD 600 of 1.1×109 бактериальных клеток мл-1.

Общее антиоксидантное действие оценивали при помощи тестирования с линолиевой кислотой (ЛК-тест) (Kullisaar, Т, Songisepp, Mikelsaar M, Zilmer, K, Vihalemm, Т, Zilmer, M. British J of Nutrition. Antioxidant probiotic fermented milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human. 2003, 90, 2, 449-456), а общий антиоксидантный статус измеряли при помощи промышленного набора (TAS, Randox Laboratories Ltd., UK) (Таблица 6).

Таблица 6Общее антиоксидантное действие (ТАА) и общий антиоксидантный статус (TAS) Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380ШтаммTAA (%)TAS (ммоль/л)L. plantarum Tensia DSM 2138022±50.05±0.02L. plantarum DSM 2137926±1.20.13±0.04

Значения ТАА и TAS штамма L. plantarum Tensia DSM 21380 были немного ниже, чем штамма L. plantarum DSM 21379.

Значения L. plantarum Tensia DSM 21380 были ниже по сравнению со значениями антиоксидантного штамма L. fermentum МЕ-3 (DSMI4241) (МЕ-3, ТАА: 29±0.7; TAS: 0,16±0,03).

In vitro выработка полиаминов микроорганизмами штамма Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380

Способ. Микробные штаммы суспендировали в физиологическом растворе в соответствии с McFarland стандартом турбидности (109 CF ед./мл), 0.5 мл суспензии каждого штамма сеяли в декарбоксилированную среду (4.5 мл) и инкубировали 4 дня при 37°С (Bover-20 Cid et al., 1999).

Для определения ВА 200 мкл среды использовали для GC анализа посредством модифицированного метода Наковичи (Nakovich, L. Analysis of biogenic amines by GCIFID and GC/MS. Thesis, Virginia polytechnic institute, USA. 2003).

GC-анализ выполняли при помощи хроматографического газоанализатора HP 6890 Series GC System, с капиллярной колонкой HP-5 190911-413 (30 м XO.34 мм ; 0.25 ~м). Температурный режим колонки: 160°С 1 мин, 20°С/мин 280°С 15 мин; детектор (FID) 300°С.

Таблица 7In vitro концентрация полиаминов в декарбоксилированной средеПробаПолиамины и биогенные аминыАргининГлутаминЛизинОрнитинГистидин Путрес
цинКадаверинПутресцинКадаве
ринПутресцинКадаверинПутресцинКадаверинГистаминL. plantarum Tensia DSM 21380000000.30.50.60L. plantarum DSM 2137900.41.20.500.41.900E. coli ATCC 70033618.41.712.318.41.82401599.33.5105.1

L. plantarum Tensia DSM 21380 вырабатывает небольшое количество полиамин путресцина из орнитина. Из биогенных аминов были замечены следы кадаверина. Выработка гистамина не была зарегистрирована.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Молекулярная идентификация Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 посредством ITS-PCR

1. L. plantarum DSM 21379

2. L. plantarum Tensia DSM 21380

3. L. plantarum CRL 972 (ATCC 14917)

М - 100 bp маркер (Fermentas)

Фиг.2. Молекулярные «отпечатки пальцев» L. plantarum Tensia DSM 21380 по сравнению с контрольным штаммом L. plantarum (гель-электрофорез в пульсирующем поле, PFGE)

1. Маркер Lambda Ladder PFG (New England Bio Labs Inc.)

2. L. plantarum Tensia DSM 21380

3. L. planlarum DSM 21379 (контроль)

Фиг.3. Определение присутствия L. plantarum Tensia DSM 21380 в сыре способом DGGE.

Тестирование сыров посредством DGGE гель-электрофореза (сыр с пробиотическими добавками, контрольный сыр, сыр с пребиотическими добавками).

1. Сыр nr 529

2. Контрольный сыр

3. Сыр №5

4. Штамм L. plantarum номер 1

5. Сыр №9-1

6. L. plantarum DSM 21379

7. Сыр №19

8. Штамм L. plantarum номер 1

9. Сыр nr 9-2

10. L. plantarum DSM 21379

11. L. plantarum Tensia DSM 21380 сыр

12. L. plantarum Tensia DSM 21380 чистая культура

13. Сыр №4

14. Сыр №12

15. Штамм L. paracasei номер 1

16. L. plantarum DSM 21379

Фиг.4а, 4b, 4с. Определение рода лактобактерий посредством кластерного анализа Pearson UPMAG в группе L. plantarum Tensia DSM 21380.

Фиг.5 Понижение систолического кровяного давления (окончание эксперимента по сравнению со значениями систолического кровяного давления в начале эксперимента).

(а) Положительная корреляция с минимальным возрастанием количества лактобактерий после потребления сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 (r=0.631, р=0.044, n=11);

(б) корреляция с возрастанием путресцина в моче добровольцев после потребления сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 по сравнению со значениями в начале эксперимента (r=0.631, р=0.037, n=11).

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Подавление микробов NSLAB в пищевом продукте

Эксперимент с эстонским сыром

Способ. Микроорганизм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 добавляли в молоко для производства сыра Dairy Cooperative E-Piim (доза введения 3×108 KOE/vat), затем молоко сбраживали (25 мин). Свернувшееся молоко рубили (25 мин), нагревали (34°С, 15 мин), высушивали (25 мин), давили, отжимали (1 час), солили в растворе (12°С; 20% NaCl; pH 4,7) 20 часов, отжимали и сушили (8 часов), упаковывали в пластик и оставляли созревать при 12°С как минимум 4 недели.

Таблица 8Содержание лактобактерий в сыре, содержащем L. plantarum Tensia DSM 21380 на 28-й день созревания Сыр, содержащий L. plantarum Tensia DSM 21380Контр ольный сыр pH 5.1Сыр, содержащий L. plantarum Tensia DSM 21380Контрольный сыр День 3День 283 месяцаДень 3День 283 месяцаLactobacillus sp1099×1056×1055×1085×107ND108107L. vlantarum1092×1036×1055×1085×107NDNDNDL. caseiND8×105NDNDNDNDNDNDL. buchneriND105NDNDNDNDNDNDOHOL*NDNDNDNDNDND2×103ND* OHOL - обязательные гомоферментативные лактобактерииND - не определены

Количество L. plantarum было в 10 раз выше в сыре, содержащем L. plantarum Tensia DSM 21380, к 28-му дню по сравнению с контрольным сыром. В то время как в контрольном сыре присутствовали гомоферментативные лактобактерии, штаммы L. casei и L. buchneri, все вышеупомянутые виды отсутствовали в сыре, содержащем L. plantarum Tensia DSM 21380. Таким образом, штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 способен ингибировать NSLAB в сыре и подавлять микробиоту, содержащуюся в нем. Последняя может быть представлена патогенами, встречающимися в пищевых продуктах после их приготовления. Вследствие этого добавление L. plantarum Tensia DSM 21380 может способствовать продлению срока годности пищевого продукта.

Противомикробное действие L. plantarum Tensia DSM 21380 против Listeria monocytogenes в среде сыра

Подавление NSLAB микробов в сыре Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 описано в примере 1 в таблице 8.

Следующее иллюстрирует выживание Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в сыре и повышение метаболической активности Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в процессе созревания сыра и срока хранения при добавлении в молоко для сыроделия в лиофилизированной форме (партия 13)

Концентрация L. plantarum Tensia в лиофилизированной закваске9×1010 CFU/гКонцентрация L. plantarum Tensia в молоке для сыроделия2×104 CFU/млКонцентрация L. plantarum Tensia в свежем молоке после засаливания105 CFU/гКонцентрация L. plantarum Tensia в сыре на 15 день созревания106 CFU/гКонцентрация L. plantarum Tensia в сыре через 1 месяц созревания1×107 CFU/гКонцентрация L. plantarum Tensia в сыре через 1,5 месяца созревания1×108 CFU/гКонцентрация L. plantarum Tensia в сыре через 4 месяца созревания3×106 CFU/г

Исследование нацелено на выявление противомикробного действия L. plantarum Tensia DSM 21380 против Listeria monocytogenes в среде сыра.

Способ №1. Были подготовлены шесть экспериментальных сыров типа Эдам лабораторного размера. Два контрольных сыра не имели микробных добавок. Два сыра содержали патоген Listeria monocytogenes АТСС 13932 и два сыра содержали как L. plantarum Tensia DSM 21380, так и Listeria monocytogenes. Пастеризованное молоко было засеено 1% сырной закваски С92 (CSK Food Enrichment, Holland) и тестовыми микробами, подвергнуто сычужному свертыванию при 32°С (сырный сычужный фермент FROMASE 2200 TL granulate). Свернувшееся молоко было разрезано, разогрето (37-38°С), и

высушено, спрессовано, осушено и посолено, покрыто пластиком и вызревалось при 15°С в течение 30 дней. Количество TENSIA в свежем сыре было 105 CFU/г и L. monocytogenes 104 CFU/u.

Для микробиологического анализа сыра, образцы samples были асептически взяты из центра сырного блока. К сырным образцам было добавлено 0.9% NaCl (1:9), гомогенизированного в блендере (MiniMix, Interscience, France), последовательно разбавлено и 0.1 мл каждого раствора было засеено в MRS агар для детектирования количества лактобактерий. Использовался способ предварительно насыщенной среды листерии хромогенного агара для выявления количества Listeria monocytogenes (Oxoid, England).

Выявление содержания жирных кислот с короткой цепочкой в экспериментальных сырах

10 мл дистиллированной воды добавлялось в образцы сыра (10 г), гомогенизировалось в блендере, извлекалось или эстерифицировалось. Измерялось количественное содержание уксусной, пропионовой, масляной, валерьяновой, капроновой, янтарной и молочной кислот посредством газового хромотографа (HP 6890 Series GC System). Использовалась капиллярная колонка HP-INNOWax (15 m × 0.25 мм, 0.15 мкм). Программа температуры колонки: I 60°С 1 мин, 10 мин, и II 20°С/мин 120°С 80°С 1 мин, 8 мин 25°С/мин 120°С, детектор (FID) до 250°С.

Использовался цифровой измеритель рН Е6115 (Evikon MCI, Estonia) для определения pH сыров. рН измерялся в трех частях сурного блока.

Количество L. plantarum Tensia DSM 21380 увеличивалось в течение созревания для 2 заготовок. В L. monocytogenes не было обнаружено существенных изменений в контрольном сыре. В тестовом сыре, содержащим Listeria monocytogenes и L. plantarum Tensia DSM 21380, количество L. monocytogenes уменьшалось до очень низких величин, т.е. до i 2.4 log10 на 1 г сыра (Таблица 8А).

Таблица 8АВыживание Listeria monocytogenes (CFU log10/г) в экспериментальных сырах во время созреванияДобавка в экспериментальный сырКоличество L. monocytogenes CFU log10/гДень 0ДеньДень 20День 30L. plantarum Tensia DSM 21380 L. monocytogenes3.2±0.32.9±0.22.6±0.92.4±0.6L. monocytogenes4.2±0.64.0±0.94.8±2.24.2±0.2

Добавление L. plantarum Tensia DSM 21380 проявлялось в увеличении содержания янтарной кислоты во время созревания сыров (Таблица 8В).

Положительная корреляция между количеством лактобактерий и уксусной и янтарной кислот, и отрицательной корреляции между листрией и молочной кислотой проявлялось в сыре, содержащем L. plantarum Tensia DSM 21380 + L. monocytogenes.

Таблица 8ВСодержание жирных кислот, содержащих короткую цепочку (г/кг), величина рН и количество L. plantarum Tensia DSM 21380 и L. monocytogenes ATCC 13932 в течение 30 дней созревания экспериментальных сыровВыявленные параметрыСыр, содержащий L. plantarum Tensia DSM 21380Сыр, содержащий L. plantarum Tensia DSM 21380+Z. monocytogenesСыр, содержащий L. monocytogenesЖирные кислоты, содержа
щие короткую цепочку г/кгУксусная кислота0.38±0.010.3±0.060.22±0.18Пропионовая кислота0.11±0.000.11±0.000.03±0.06Масляная кислота0.09±0.090.03±0.010.02±0.00Капроновая кислота0.05±0.040.03±0.010.02±0.01Молочная кислота15.37±0.5814.34±0.8814.14±2.38Янтарная кислота0.93±0.200.88±0.370.36±0.11Выживание среди добавлен
ных микробов log10/g и рНL. plantarum Tensia DSM 213807.7±0.17.8±0.00-L. monocytogenes-2.4±0.64.2±0.2рН4.9±0.34.8±0.44.8±0.2

При исследовании противомикробного действия Lactobacillus sp на среду агара исследуемые лактобактерии не имели прямого контакта с патогеном или штаммом лактобактерий, используемым как целевой микроб, против которых его антагонистическая активность была направлена. Антагонистическая активность, зарегистрированная как ингибитор роста патогена, была основана на метаболитах (включая различные органические кислоты, включающие уксусную, молочную и янтарную кислоту), которые диффундируют в среду агара во время роста L. plantarum Tensia DSM 21380.

В продуктах питания, включая молочные продукты питсания (сыр), жизнеспособность незаквасочных лактобактерий и/или иных загрязнителей исходного необработанного молока подавляется метаболитами лактобактерий, а также непосредственным контактом со штаммом пробиотических лактобактерий. Непосредственный контакт с целевыми микробами может стимулировать при малых значениях рН, вызванный органическими кислотами, синтез других противомикробных компонентов (бактериоцинов) (Aasen I.M., Moretro Т., Katia Т., Axelsson L. and Storro I. (2000). Influence of complex nutrients, temperture and рН on bacteriocin production by Lactobacillus sakei CCUG 42687. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 159-166).

Профиль жирных кислот с короткой цепочкой L. plantarum DSM 21380 Tensia и существование противомикробного действия штамма помогает подавить Listeria sp. в пищевой среде.

Поддержка противомикробных свойств в сыре обеспечивает подавление предполагаемых патогенов пищевого происхождения, вызванное Tensia.

Определение количества Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в сыре способом DGGE

Способ. Микробную ДНК выделяли из сыра с использованием мини-набора QIAamp DNA (QIAGEN) и амплифицировали праймерами 968-GC-f(GGGAACGCGAAGAACCTTA-GC), 1401-r (CGGTGTGTACAAGACCC).

Продукты ПЦР сепарировали путем DGGE электрофореза в 30-60% арикламид-содержащем геле с использованием методики Dcode™ System (Bio-Rad, Hercules, California) (Фиг.3).

Определение биогенных аминов в сыре, содержащем L. plantarum Tensia DSM 21380

Способ. Из сыра извлекали пробы (20 мл 50% раствора метанола добавляли к 10 г сыра и выдерживали 1 час при 45°С, охлаждали до 30°С и центрифугировали), и 200 мкл верхнего слоя брали для GC анализа модифицированным методом Наковичи (Nakovich, L. 2003 Analysis of biogenic amines by GC/FID and GC/MS), эксперимент проводили на факультете микробиологии Университета Тарту.

GC анализ выполняли при помощи хроматографического газоанализатора HP 6890 Series GC System, с капиллярной колонкой НР5 1909IJ-413 (30 м × 0,32 мм; 0,25 мкм). Температурный режим колонки: 160°С 1 мин, 20°С/мин 280°С 15 мин; детектор (FID) 350°С.

Таблица 9Биогенные амины и полиамины в тест-сырах, содержащих L. plantarum Tensia DSM 21380 (производственные исследования)ПробаКоличество жизнеспособных организмов штамма, содержащихся в сыре (КОЕ/г) на 3-4 день после приготовленияАмины (мг/кг)Количество жизнеспособных организмов L. plantarum Tensia DSM 21380 в созревшем сыреТираминПутресцинCadaverineL. plantarum Tensia DSM' 21380, 1. партия6.5×1080.691.320106Контрольный сыр 1. партия-2.311.820-L. plantarum Tensia DSM 21380 2. партия4.5×1062.657.460 Контрольный сыр 2. партия-5.641.840107L. plantarum Tensia DSM 21380, 3. партия2×1065.497.290108Контрольный сыр 3. партия-000-

L. plantarum Tensia DSM 21380 вырабатывает 0.69-5.49 мг тирамина на 1 кг сыра и меньшее количество путресцина: 1.32-7.46 мг/кг.

Пример 2. Исследование безопасности Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 (эксперимент с NIH мышами)

С целью признания пробиотических штаммов и продуктов, содержащих эти штаммы, Эстонским Советом по ветеринарии и питанию их безопасность, их применение должны быть доказаны.

Способ. В экспериментальной модели с мышами NIH 3 группы мышей кормили различными сырами в течение 30 дней (контрольным сыром без добавок и сыром, содержащим Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380). Состояние мышей оставалось хорошим, применение сыра вызвало увеличение массы тела, в ходе эксперимента не было зарегистрировано каких-либо изменений в состоянии меха и со стороны пищеварения. Также не было замечено перемещения контролируемых штаммов или других микробов в кровь или органы. В ходе морфологического и гистологического исследований печени и селезенки не было выявлено патологических изменений, что подтверждает безопасность штамма Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380.

Пример 3. Влияние Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, содержащегося в сыре, на индексы крови и кишечную микрофлору здоровых волонтеров

Целью проведения клинического исследования (рандомизированного слепого переходного плацебо контролируемого) было оценить влияние и безопасность сыра, содержащего противомикробный Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, на кишечную микрофлору здоровых волонтеров.

Участники и способы: участниками эксперимента были здоровые волонтеры, мужчины и женщины, 12 человек (М/Ж 5/7; 21-43 лет). Для исключения из эксперимента волонтеров с сахарным диабетом у них определялись уровень глюкозы и гликированный гемоглобин HbAlc в сыворотке крови. Тестируемые образцы сыров содержали штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 (количество жизнеспособных организмов 5х108 КОЕ/г в сыре). Перед употреблением тест-образцы сыров выдерживали с Lactobacillus plantarum DSM 21380 Tensia в течение 30 дней при 12°С. В качестве контроля использовали обычный эстонский сыр без добавок. Исследование было рандомизированным слепым переходным плацебо контролируемым. Оно началось с 3-недельного употребления волонтерами тест-образцов сыра, за которым следовал 2-недельный период выведения, после которого контрольный сыр употреблялся в течение 3-х недель. Доза - 50 г/день.

Таблица 10Клинические данные здоровых волонтеров после употребления пробиотического сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 Пробиотический сыр с L.plantarum Tensia DSM 21380Контрольный сырЗначения РИсходный уровеньПосле воздействияИсходный уровеньПосле воздействияИндекс массы тела (кг/м2)24.1±3.624.2±3.623.8±3.523.9±3.60.625/0.399Систоличес
кое давление (мм рт.ст.)112.9±10.4107.1±10.4110.3±8.3109.3±9.40.016/0.655Диастоличес
кое давление (мм рт.ст.)78.8±7.174.3±8.874.8±5.275.7±8.30.021/0.668

Индекс массы тела (кг/м2): 19-25 кг/м2 - нормальный, 26-30 кг/м2 - избыточный вес, более 30 - ожирение.

Систолическое и диастолическое давление было значительно ниже после 3 недель потребления сыра, содержащего пробиотик L. plantarum Tensia DSM 21380 (5×108 КОЕ/г × 50 г). Трехнедельное потребление сыра, содержащего штамм Tensia DSM 21380, не увеличило индекс массы тела.

Влияние Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 на микрофлору кишечника

Способ. Использовали метод качественного анализа микрофлоры в фекалиях и видов лактобактерий, разработанный на факультете микробиологии Университета Тарту (Mikelsaar ME, Valjaots ME, Lenzner AA. Anaerobe fuhalts- und Wandmikroflora des Magen-DarmKanals. Die Nahrung, 1984, 23, 6/7, 727-733; Sepp E., Julge K., Vasar M., Naaber P., Bjorksten В., Mikelsaar M, Intestinal microflora of Estonian and Swedish infants. Acta Paediatrica, 1997, 86, 956-961).

Таблица 11Количество лактобактерий в фекалиях здоровых волонтеров (Log10 КОЕ/г фекалий) Сыр, содержащий L. plantarum Tensia DSM 21380Контрольный сырЗначения Р парного t-теста BL1 vsPRO/BL2vsPLBLI Среднее ± stdev диапазон (медианный)PRO Среднее ± stdev диапазон (медианный)BL2 Среднее ± stdev диапазон (медианный)PL Среднее ± stdev диапазон (медианный)Общее количест
во лактобак
терий Культивирование5.1 ±1.96.7±1.05.7±1.4 4.0-ND0.025/0-6.3 (5.9)4.9-8.6 (6.7)8.6 (5.3)  Общее количест
во лактобак
терий FISH8.4±0.18.4±0.38.4±0.38.3±0.30.748/0.2448.1-8.6(8.4)7.9-9.1 (8.3)8.0-8.8 (8.3)7.6-9.0 (8.2) L. plantarum* диапазон/средняя распространенность0-5.3(0)0- 8.6 (5.9)0-4.3 (0)ND0.006/ND3/1210/12§2/12  

Показатели общего количества лактобактерий и распространенность L. plantarum в фекалиях волонтеров возросли (р=0.006).

Таблица 12Распространенность L. plantarum как видов в фекалиях волонтеров в начале эксперимента (BL1), после употребления пробиотического сыра (PRO) и после периода восстановления (BL2)ГруппаBL1PROBL2Группа 1 (n=12)3/1210/122/12Группа 2 (n=12)2/123/124/12

Возрастание микроорганизмов вида L. plantarum было зарегистрировано (Fischer exact test, 3/12 vs 10112, 20 p=0.006) в группе, употреблявшей сыр с L. plantarum Tensia DSM 21380.

Таким образом, L. plantarum Tensia DSM положительно влияет на микрофлору ЖКТ человека благодаря увеличению количества полезных лактобактерий. Удивительно, но при возрастании количества факультативно гетероферментативных лактобактерий (FHEL; 4.7±1.3 vs. 5.7±1.3, р=0.029) ферментативной группы, к которой принадлежит L. plantarum Tensia DSM 21380, был замечен рост количества обязательно гетероферментативных лактобактерий (OHOL) (4.6±1.1 vs. 5.7±1.5, р=0.014). Таким образом, L. plantarum Tensia DSM 21380 значительно помогает стабилизировать микрофлору ЖКТ.

Молекулярные способы определения количества лактобактерий в фекалиях волонтеров (флуоресцентная in situ гибридизация, FISH)

Способ. Образцы фекалий разводили в соотношении 1/10 в PBS буфеном растворе. Микробные клетки фиксировали в 4% растворе формальдегида и держали при 4°С. FISH проводили по методу Хармсена с пробой Lab 158, помеченной dye Cy 3. Помеченные микробные клетки были подсчитаны методом флуоресцентной микроскопии. Результаты исследования представлены в Таблице 11 вместе с результатами бактериологических анализов.

В соответствии с результатами FISH (способ, который также регистрирует мертвые клетки), количество лактобактерий оставалось практически неизменным.

Профиль DGGE лактобактерий, содержащихся в фекалиях волонтеров, употреблявших сыр, содержащий L. plantarum Tensia DSM 21380.

Способ. Впоследствии продукты ПЦР сепарировали путем DGGE электрофореза в 30-60% арикламид-содержащем геле по методу Dcode™ System (Bio-Rad, Hercules, California). Гели анализировали при помощи программного обеспечения BioNumerics 2.5 (Applied Maths, Belgium) согласно корреляции Писони (Heilig HG, Zoetendal EG, Vaughan ЕЕ, Marteau P, Akkermans, ADL, de Vos WM. Molecular diversity of Lactobacillus ssp. and other Lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Appl Envir Microbiol 2002; 68: 114-123). На фотографиях геля (Фиг.4а, 4b, 4с) показан профиль доминантных видов лактобактерий в фекалиях волонтеров в соответствии с 16S rДНК амплификации. При помощи программного обеспечения UMPAG можно было проанализировать предполагаемую матрицу совпадений между различными гелями, т.е. определить значительную разницу (>20%) между различными гелями/различными анализами.

Таблица 13Изменения в лактофлоре в группе L. plantarum Tensia DSM 21380 в ходе клинических испытанийЧеловекДень 0День 21День 35День 561X XX2X XX4X XX5X XX7X  X8X XX10X  X12XXXX16XXXX17X  X18X  X21X X 

В Таблице 13 показано, что в группе L. plantarum Tensia DSM 21380 у 10 человек с 12 до 21 дня исследования в системе врожденной лактофлоры произошли изменения (р<0.05).

Соответствующие результаты наблюдались при изучении колонии L. plantarum бактериологическим способом. У 4 человек изменения оставались стабильными даже по прошествии 2-х недель.

Содержание полиаминов и биогенных аминов в моче волонтеров

Для оценки биогенных аминов до и после употребления сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380, а также в стабилизационный период, использовали образцы утренней мочи, анализировавшиеся методом газовой хромотографии.

Способ. Пробы мочи дериватизировали с пропилхлорформатом для проведения GC анализа по модифицированному методу Угланда (Ugland HG;Krough M, Rasmussen KE: Aqueousalkylchloroformate derivatization and solid-phase microextraction: determination of amphetamines in urine by capillary gas chromatography. J Chromatography В Biomed Sci Appl 1997, 701:29-38).

GC-анализы проводили при помощи хроматографического газоанализатора HP 6890 Series GC System (Hewlett Packard, Avondale, PA, USA), с капиллярной колонкой НР-5 1909IJ-433 (30 м × 0.25 мм; 0.25 мкм). Температурный режим колонки: 150°С 1 мин, 20°С/мин 280°С для 5 мин; детектор (FID) 250°C. Концентрацию биогенных аминов определяли по 5 ммоль/моль креатинину.

Таблица 14Содержание полиаминов в утренней моче волонтеров, употерблявших L. plantarum Tensia DSM 21380 (ммоль/моль креатинина) Пробиотический сыр с доавкой L. plantarum Tensia DSM21380Контрольный сырЗначения РBL1 Среднее ± stdev диапазон (медианный)PRO Среднее ± stdev диапазон (медианный)BL2 Среднее ± stdev диапазон (медианный)PL Среднее ± stdev диапазон (медианный)Парный t-mecm BL1 vs PRO 1BL2 vs PLPut0.110±0.1390.090±0.1200.073±0.1100.027±0.0240.496/0.2750-0.4670-0.3960-0-(0.046)(0.041)0.384 (0.037)0.055 (0.037)acPut0.607±0.5580.567±0.4310.817±1.0270.573±0.3910.510/0.6770-2.1590.191-1.7580.091-3.9160.182-1.403(0.478)(0.430)(0.550)(0.486)DAP0.148±0.1250.056±0.0840.090±0.1630.061±0.0990.016/0.8440-0.3440-0.205 (0)0-0.432 (0)0-0.246 (0)(0.159)   acSpd0.181±0.1370.227±0.1420.197±0.1480.258±0.2210.016/0.2440-0.4280.053-0.4930.039-0.4950.041-0.686(0.144)(0.182).195)(0.186)Cad0.012±0.0260.038±0.0620.041±0.0770.015±0.0370.125/00-0.084 (0)0-0.156 (0)0-0.248 (0)0-0.123(0)BL1 - исходный уровень 1, в начале эксперимента, PRO - после приема пробиотика, BL2 - исходный уровень 2, восстановление; Put - путресцин, acPut - N-acetylputrescine - N-ацетилпутресцин, DAP - 1.3-диаминпропан, acSpd - N8 - ацетилспермидин, Cad - кадаверин

Потребление пробиотического сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380, увеличило содержание ацетилированного спермидина в моче волонтеров к концу пробиотического периода, что указывает на улучшение метаболизма в крови и тканях. Концентрация DAP в моче понизилась.

Корреляции

Было обнаружено понижение систолического кровяного давления, связанное с увеличением количества лактобактерий и возрастанием путресцина в моче.

Безопасность

После окончания эксперимента значения системных маркеров воспаления (U-CRP, ультрачувствительного CRP и лейкоцитов) не изменились и находились в пределах нормальных значений (Таблица 15). Изменения значения IgE маркера аллергии отмечено не было.

Употребление пробиотического сыра не было причиной изменения количества WBC (лейкограмма): соотношение клеток к концу эксперимента оставалось неизменным по сравнению с изначальными значениями.

Таблица 15Маркеры воспаления в начале и в конце эксперимента Пробиотический сыр с L. plantarum Tensia DSM 21380Контрольный сырЗначения РСтандартные значенияДоПослеДоПослеU-CRP, мг/л1.1±0.61.0±0.31.4±0.91.6±1.30.3/0.9<5 мг/лОбщее количест
во лейкоцитов ×109/л5.2±0.85.6±1.35.1±1.15.5±1.10.6/0.144-10×109/л

Употребление пробиотического сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380, не вызвало появления дискомфорта в брюшной полости (болей в брюшной полости, газообразования, метеоризма) или возрастания индекса массы тела, уровня глюкозы, уровня содержания липидов.

Таким образом, у здоровых людей употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, не вызывает воспаления, аллергическую сенсибилизацию и не причиняет вред органам.

Таблица 15АБиохимические параметры сыворотки крови здоровых добровольцев после потребления сыра, содержащего L. plantarum DSM 21380 Пробиотический сырКонтрольный сырЗначения Р (BL1 vs BL2, PRO vs PL)BL1PROBL2PLГлюкоза, моль/л4.5±0.74.6±0.54.6±0.64.7±0.50.922/0.289 (1.0, 0.48)2.8-5.53.6-5.53.9-6.03.8-5.9(4.5)(4.5)(4.5)(4.8) Общий холестерин, моль/л4.6±0.94.6±1.14.2±0.64.5±0.90.828/0.1023.2-6.63.1-7.23.1-5.12.8-6.3(0.003, 0.671)(4.55)(4.4)(4.1)(4.4) HDL-холестерин, моль/л1.7±0.51.7±0.31.6±0.41.7±0.40.628/0.4331.0-2.61.1-2.30.9-2.31.2-2.5(0.444, 0.623)(1.7)(1.6)(1.7)(1.6) LDL-холестерин, моль/л2.7±0.82.8±1.12.6±0.72.6±0.70.296/0.8271.4-4.31.5-5.71.5-3.71.2-4.3(0.336, 0.271)(2.7)(2.5)(2.4)(2.5) Триглицери
ды, моль/л1.0±0.61.0±0.50.9±0.41.2±0.70.978/0.1400.5-2.80.4-2.10.5-1.80.5-2.6(0.306, 0.428)(0.8)(1.0)(0.8)(0.9) 

Потребление сыра, содержащего L. plantarum TENSIA DSM 21380, не приводило к нежелательным изменениям в содержании глюкозы в сыворотке крови или в параметрах липидного метаболизма (Таблица 15А). Значения общего холестерина и фракций холестерина (HDL-холестерин, LDL-холестерин и триглицериды) оставались в пределах нормы.

Пример 4. Влияние Lactobacillus plantarum DSM 21380, содержащихся в сыре, на показатели крови пожилых здоровых людей

В ходе клинического исследования (рандомизированного слепого переходного плацебо контролируемого) оценивали безопасность и влияние сыра, содержащего Lactobacillus plantarum DSM 21380, на показатели крови пожилых здоровых волонтеров.

Участники и способы. Участниками эксперимента были здоровые волонтеры, мужчины и женщины, 21 человек (М и Ж, 2/19, 61-84 лет). Для исключения из эксперимента волонтеров с сахарным диабетом у них определялись уровень глюкозы и гликированный гемоглобин HbAlc в сыворотке крови. Тестируемые образцы сыров содержали штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 (количество жизнеспособных организмов 2×107 КОЕ/г в сыре). Перед употреблением тест-образцы сыров выдерживали с Lactobacillus plantarum DSM 21380 Tensia в течение 30 дней при 12°С. В качестве контроля использовали обычный эстонский сыр без добавок. Исследование было рандомизированным слепым переходным плацебо контролируемым. Оно началось с 3-недельного употребления волонтерами тест-образцов сыра, за которым следовал 2-недельный период выведения, после которого контрольный сыр употреблялся в течение 3-х недель. Доза - 50 г/день.

Таблица 16Клинические показатели здоровых волонтеров после потребления сыра, содержащего пробиотик L. plantarum Tensia DSM 21380 Пробиотический сыр с L. plantarum Tensia DSM 21380Контрольный сырЗначения РИсходный уровеньПосле воздействияИсходный уровеньПосле воздействияИндекс массы тела (кг/м2)27.6±4.127.5±4.227.5±4.027.6±4.20.723/0.793Систолическое давление (мм рт.ст.)138.1±16.6132.2±16.2138.7±21.4135.2±21.10.038/0.185Диастоличес
кое давление (мм рт. ст.)77.2±7.773.1±8.076.4±8.974.8±9.20.004/0.246Индекс массы тела (кг/м2): 19-25 кг/м2- нормальный, 26-30 кг/м2- избыточный вес, более 30 - ожирение.

У пожилых волонтеров было отмечено понижение кровяного давления (систолического и диастолического) после 3 недель употребления сыра, содержащего пробиотик L. plantarum Tensia DSM 21380 (2×107 КОЕ/г × 50 г).

В то же время, употребление сыра с относительно высоким содержанием жиров не привело к увеличению индекса массы тела пожилых волонтеров (Таблица 16).

Безопасность

Употребление сыра, содержащего пробиотик L. plantarum DSM 21380, пожилыми людьми не вызвало появления дискомфорта в брюшной полости (болей в брюшной полости, газообразования, метеоризма). После окончания эксперимента значения системных маркеров воспаления (U-CRP, лейкоцитов) не изменились и находились в пределах нормальных значений (Таблица 17).

Таблица 17Маркеры воспаления в крови здоровых пожилых волонтеров в начале и в конце эксперимента Сыр, содержащий пробиотик L. plantarum Tensia DSM 21380Контрольный сырЗначения РСтандартные значенияДоПослеДоПослеU-CRP, mg/L0.13/0.810.13/0.810.13/0.80.13/0.810.13/0.81< 5mg/LОбщее количест
во лейкоци
тов ×109/л5.1±1.34.9±1.35.0±1.65.5±1.10.33/0.334-10×109/л

Также не было отмечено отклонений в значениях IgE маркера аллергии или почечных или печеночных маркеров (креатинина сыворотки крови, альбумина, аланинтрансаминазы (ALAT), аспартатаминотрансферазы (ASAT)). При сравнении уровня общего холестерина в период употребления сыра и в период плацебо было отмечено значительное снижение данного показателя после потребления сыра, содержащего L. plantarum DSM 21380.

Рост содержания глюкозы в сыворотке крови до 0.3 после употребления пробиотического сыра было нежелательным эффектом, но в сравнении с периодом плацебо, изменение не было статистически значимым (Таблица 18) и оставалось в пределах нормальных значений.

Таблица 18Биохимические параметры сыворотки крови здоровых пожилых волонтеров после употребления сыра, содержащего L. plantarum DSM 21380 Пробиотический сырКонтрольный сырЗначения Р (BL1 vsBL2, PROvsPL)BL1PROBL2PLГлюкоза, ммоль/л5.1±0.55.4±0.55.3±0.55.4±0.40.036/0.144(0.212, 0.757)Общий холестерин, ммоль/л5.7±0.85.6±0.85.9±0.95.7±0.80.343/0.198(0.044, 0.087)HDL-холестерин, ммоль/л1.7±0.41.6±0.41.7±0.41.7±0.50.411/0.514(0.073, 0.118)LDL-холестерин, ммоль/л3.9±0.83.8±0.74.1±0.93.8±0.70.557/0.052(0.075, 0.9187)Триглицери
ды, ммоль/л1.1±0.61.1±0.61.2±0.51.1±0.50.380/0.394(0.411, 0.097)

Таким образом, употребление сыра, содержащего Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, не вызывает воспалений, аллергической сенсибилизации и не причиняет вред органам.

Таблица 18АБиогенные амины пожилых добровольцев в утренней моче (нмоль/моль кретина) во время изучения после потребления сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 Пробиотическое лечениеКонтрольный периодЗначения Р BL1
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)PRO
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)BL2
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)PL
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее) Кадаве
рин0000NAТирамин0.006±0.0280.010±0.0440.061±0.2740.001±0.0051.0/0.37 0-0.129 (0)0-0.201 (0)0-1.256 (0)0-0.025 (0)(1.0, 1.0)Гистамин0000NABL1 - базис 1, при наборе добровольцев, PRO - после пробиотического лечения, BL 2 - базис 2, выздоровление, PL - после лечения плацебо

Потребление сыра, содержащего L. plantarum TENSIA, не вызывало роста концентрации биогенных аминов (кадаверина, гистамина, тирамина) в моче пожилых добровольцев (Таблица 18А).

Потребление сыра, содержащего L. plantarum TENSIA, в дневной дозе 1,5×108 CFU увеличило значение культивируемых лактобактерий (5,2 log10 CFU/г при наборе добровольцев vs 6,9 log10 CFU/г после 3-недельного пробиотического лечения, р=0.012) (Таблица 18В).

Таблица 18ВКоличество лактобактерий (значение ± коэффициент Стьюента/диапазон/среднее) в фекалиях пожилых добровольцев во время изучения после потребления сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 Пробиотическое лечениеКонтрольный периодЗначение Р BL1 Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)PRO Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)BL2 Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)PL Значение ± диапазон Стьюдента (среднее) Общее количест
во лактобактерий CFU/г5.2±2.76.9±1.45.4±2.96.1±2.00.012/0.2520-8.3 (6.3)4.3-10.0 (6.3)0-9.7 (5.7)0-9.1(0.850, 0.245)   (6.5)           L. plantarum3.1±3.25.2 ±2.91.1±3.03.2±3.30.079/0.1190-8.3 (3.8)0-8.3 (6.2)0-9.6 (0.0)0-9.1(0.083, 0.222)   (3.5) L. plantarum TENSIA*-5.3±2.9ND   0-8.3(6.3)        * Идентификация PCR в режиме реального времени согласно определенной последовательности штамма L. plantarum Tensia

Пробиотическое лечение увеличило преобладание L. plantarum в фекалиях (10/21 против 17/21 человек), но изменение было незначительным. Однако увеличение в количестве L. plantarum было в отрицательной корреляции с уменьшением систалического давления крови (r=-0.463, р=0.046) во время лечения пробиотическим сыром.

L. plantarum TENSIA было обнаружено в 81% участников исследования посредством молекулярных способов в образцах фекалий после пробиотического лечения. Однако после 2-недельного периода вымывания штамм не обнаруживался в фекалиях участников путем традиционного способа культивирования, объединенного с RAPD-PCR.

После 3-недельного потребления сыра, содержащего L. plantarum TENSIA, не обнаруживалось существенного изменения в содержании полиаминов в утренней моче добровольцев, хотя была тенденция к росту значений путресцина (Таблица 18С). Однако уменьшение систолического давления крови коррелировалось увеличением путресцина (r=-0.448, р=0.042).

Таблица 18СПолиамины у пожилых добровольцах в утренней моче (нмоль/моль креатина) во время изучения после потребления сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 Пробиотическое лечениеКонтрольный период  BL1
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)PRO
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)BL2
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)PL
Значение ± диапазон Стьюдента (среднее)Значения Р BL1 vs PRO/BL2 vs PL (BL1 vs BL2, PRO vs PL)Put0.87±0.780.94±0.761.63±2.571.16±1.620.452/0.1370-3.300.071-2.360.233-12.430.14-7.81(0.065, 0.759)(0.645)(0.565)(0.928)(0.717) acPut2.58±5.721.96±2.531.48±1.893.50±6.480.609/0.3740.17-26.00.23-10.20.15-7.710.13-23.70(0.973, 0.633)(0.82)(1.101)(0.64)(0.72) acSpd0.02±0.100.02±0.100.06±0.280.06±0.271.0/1.00-0.47 (0)0-0.47 (0)0-1.30 (0)0-1.24 (0)(1.0, 1.0)BL1 - базис 1, при наборе добровольцев, PRO - после пробиотического лечения, BL 2 - базис 2, выздоровление, PL - после лечения плацебо, Put - путресцин, acPut - N-ацетилпутресцин, acSpd - N8-ацетилсперм

Заключение. Эффект понижения кровяного давления при потреблении сыра, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380, может иметь потенциальное применение для контроля за кровяным давлением пожилых людей.

Пример 5. Влияние йогурта, содержащего Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, на параметры сыворотки крови и кишечной микрофлоры здоровых добровольцев

Задача клинического исследования (перекрестное рандомизированное плацебное управляемое двойное слепое исследование) заключалась в выявлении безопасности и влиянии йогурта, содержащего Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, на параметры сыворотки крови и кишечной микрофлоры здоровых добровольцев (международный регистрационный номер клинического испытания ISRCTN68198472).

Объекты и способы. Участниками являлись 25 здоровых добровольцев обоих полов (М/Ж 9/16; 31.4±10.0 лет). Глюкоза и Glucose и гликогемоглобин (HbAlc) обнаруживались из сыворотки крови для исключения возможных латентных диабетов.

Тестируемый йогурт содержал штамм Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 (5×106-107 микробиологических клеток/мл). Йогурт без пробиотической добавки служил контрольным.

Выживание Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в йогурте и повышение метаболической активности Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 в йогурте и срок хранения при добавлении в молоко для йогурта в лиофилизированной форме.

Тестовый йогурт был приготовлен с использованием лиофилизированной культуры Lactobacillus plantarum Tensia как вспомогательной добавки пробиотика в дозе 1 г/1 тонна в молоко. Йогурт был изготовлен традиционно. Йогурт был упакован в чашки по 150 г и оставлен на хранение при температуре +4°С. Выживание пробиотического штамма Lactobacillus plantarum Tensia было оценено в течение срока хранения йогурта.

 Lactobacillus plantarum Tensia (CFU/г)Лиофилизированная закваска1×1011День 7-й после изготовления1×106День 22-й после изготовления2×106День 26-й после изготовления2×106

Исследование началось с 3-недельного потребления тестируемого йогурта. Спустя период вымывания, исследуемые участники потребляли контрольный йогурт ежедневно в течение 3-х недель в дозе 108-5×109 микробиологических клеток.

Безопасность

После завершения исследования важные человеческие систематические маркеры воспаления (ультрачувствительный С-реактивный протеин и общее количество лейкоцитов) не изменились и были в пределах нормы (Таблица 19). Не наблюдалось также аномалий в важном аллергическом маркере IgE.

Таблица 19Маркеры воспаления до и после исследования Пробиотический йогурт, содержащий L. plantarum TensiaКонтрольный йогуртЗначения Р базиса vs. Пробиотический базис vs. Контрольный йогуртСтандартные значенияДоПослеДоПослеU-CRP, мг/л0.7±1.01.1±1.31.2±1.51.2±1.40.782/0.306<5 mg/LОбщее количество лейкоцитов ×10%5.8±1.26.2±1.36.0±1.46.2±1.20.101/0.4114-10×109/L

Трехнедельное потребление пробиотического йогурта не повлияло негативно на параметры липидного метаболизма (Таблица 20). Значения общего холестерина и холестириновых фракций (HDL, LDL-холестерин и триглицериды) оставались в пределах нормы.

Таблица 20Биохимические параметры сыворотки крови здоровых добровольцев послепотребления йогурта, содержащего L. plantarum Tensia DSM 21380 Пробиотический йогуртКонтрольный йогуртЗначения Р BL1PROBL2PL(ВL1 vs BL2, PRO vs PL)Глюкоза, ммоль/л5.1±0.55.4±0.55.3±0.55.4±0.40.036/0.144    (0.212,0.757)Общий холестерин, ммоль/л4.7±0.74.8±0.75.0±0.64.7±0.,60.315/0.020    (0.018, 0.271     HDL-холестерин, ммоль/л5.0±1.15.0±1.25.1±1.45.0±1.00.808/0.411    (0.676,0.411)     LDL-холестерин, ммоль/л1.7±0.31.6±0.41.6±0.41.6±0.40.158/0.432    (0.412, 0.747)Триглицериды, ммоль/л3.1±1.13.2±1.03.2±1.23.1±1.00.396/0.230    (0.449; 0.170)BL1 - в начале исследования, PRO - после потребления пробиотического йогурта, BL2 - выздоровление

После потребления пробиотического йогурта наблюдалось незначительное увеличение глюкозы в сыворотке крови (от 5,1 до 5,4 р значение = 0036), которое, однако, оставалось в пределах нормы (3,3 до 5,5 ммоль/л). Поэтому можно заключить, что йогурт, содержащий Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, не приводит к системному воспалению, общему повышению аллергической чувствительности или ослаблению работы основных органов.

Пример 6. Приготовление лиофилизированного порошка Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380.

Способ. Лиофилизированный порошок L. plantarum Tensia DSM 21380 был получен следующим образом. Штамм L. plantarum Tensia DSM 21380 засеяли из исходной культуры в биореактор Bioflo 415 (New Brunswick Scientific) и культивировали при 37°С в течение 24 часов в среде MRS. Значение рН среды поддерживалось на уровне 6.25. Когда бактериальная культура достигла максимальной массовой плотности, содержание реактора было закачено в высокоскоростную лабораторную центрифугу Z 41 (Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH). Биомасса была отделена от среды при 20000 об/мин, удалена в стерильных условиях из цилиндра центрифуги и смешана с криопротектором (2% снятого молока и 5% сахарозы). Биомасса с криопротектором была лиофилизирована (установка для сублимационной сушки Christ Delta 2-24 LSC, John Morris Scientific) в течение от 24 до 48 часов. Лиофилизированная биомасса была удалена в стерильных условиях из кювет и измельчена в порошок. Лиофилизированная бактериальная культура была упакована в чистые, закрытые контейнеры и оставлена на хранение при температуре от -18°С до 25°С. Для того чтобы получить желаемое количество жизнеспособных клеток пищевая лактоза или микрокристаллическая целлюлоза были добавлены в качестве наполнителя.

Пример 7. Влияние пищевой добавки, содержащей Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, на индексы крови и кишечной микрофлоры здоровых добровольцев.

Рандомизированное плацебное управляемое параллельное исследование (международный регистрационный номер клинического исследования ISRCTN24502121) было проведено для оценки безопасности потребления пищевой добавки с Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380. Исследование было проведено на 35 добровольцах обоих полов, потребляющих пробиотическую пищевую добавку (дневная доза Tensia 1010 CFU) или плацебо в течение 4 недель. Потребление пробиотической диетической добавки, содержащей штамм L. plantarum Tensia хорошо переносилось волонтерами, так как в процессе исследования не было обнаружено неблагоприятных желудочно-кишечных явлений (то есть отсутствовал желудочно-кишечный дискомфорт подобно болям в животе, метеоризму или вздутию, отсутствовали отрицательные сдвиги в значениях системных маркеров воспаления, отсутствовала аллергическая сенсибилизация, отсутствовал вред по отношению к основным органам, также отсутствовали нежелательные изменения уровня глюкозы в сыворотке крови или липидного обмена веществ). Контролируемый штамм L. plantarum Tensia обнаруживался при обследовании участников посредством RAPD-PCR в образцах фекалий после пробиотического лечения в диапазоне 4.0-6.0×1010 CFU.

Реферат

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности и медицине. Штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380 продуцирует конъюгированную линолиевую кислоту (CLA), перекись водорода (НO), монооксид азота (NO), содержит гены, кодирующие плантарицин, и обладает антиоксидантной активностью. Данный штамм и его лиофилизированная форма применяются для приготовления противомикробного и гипотензивного пробиотика, молочного продукта, и лекарственного средства, понижающего кровяное давление. Также данный штамм и его лиофилизированная форма используются для увеличения оборачиваемости полиаминов в организме, для достижения доминантного положения среди кишечных лактобактерий в желудочно-кишечном тракте и для увеличения срока годности молочного продукта. Применение изобретения позволяет понизить кровяное давление, подавить нежелательную микрофлору и ингибировать окислительные процессы. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 31 табл., 7 пр.

Формула

1. Изолированный штамм микроорганизма Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21380, вырабатывающий конъюгированную линолиевую кислоту (CLA), перекись водорода (Н2O2), монооксид азота (NO), который обладает антиоксидантной активностью и генами plnE, plnF, plnJ, plnK, кодирующими плантарицин.
2. Штамм микроорганизма по п.1 в лиофилизированной форме.
3. Применение упомянутого штамма микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для приготовления противомикробного и гипотензивного пробиотика.
4. Применение упомянутого штамма микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для достижения доминантного положения среди кишечных лактобактерий в желудочно-кишечном тракте после потребления молочного продукта, приготовленного с использованием упомянутого микроорганизма.
5. Применение упомянутого штамма микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для увеличения оборачиваемости полиаминов в организме.
6. Применение упомянутого штамма микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для приготовления лекарственных средств, понижающих кровяное давление.
7. Применение упомянутого штамма микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для увеличения срока годности при хранении молочных продуктов.
8. Применение упомянутого штамма микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для подавления загрязняющей микрофлоры в молочных продуктах, где названными микробами являются незаквасочные лактобактерии и/или патогены, происходящие из необработанного молока, и/или патогены, периодически загрязняющие пищу после приготовления.
9. Применение упомянутого штамма микроорганизма по п.8, причем молочным продуктом является ферментированный молочный продукт, сыр, прессованный творог, творог, йогурт, мороженое, масло, плавленый сыр.
10. Молочный продукт, содержащий штамм микроорганизма по любому из пп.1 и 2.
11. Молочный продукт по п.10, причем молочный продукт является ферментированным молочным продуктом, сыром, прессованным творогом, творогом, йогуртом, мороженым, маслом, плавленым сыром.
12. Композиция, содержащая штамм микроорганизма по любому из пп.1 и 2 для приготовления противомикробного и гипотензивного молочного продукта или лекарственного средства, понижающего кровяное давление.

Патенты аналоги

Авторы

СОНГИСЕПП Эпп (EE)
МИКЕЛСААР Марика (EE)
РЭТСЕП Мерле (EE)
ЦИЛМЕР Михкел (EE)
ХЮТТ Пире (EE)
ЮТТ Меем (EE)
ЦИЛМЕР Керсти (EE)
ЮКСТИ Яаан (EE)
КЁЛЯЛГ Сиири (EE)
SONGISEPP EHPP
MIKELSAAR MARIKA
REHTSEP MERLE
TSILMER MIKHKEL
KHJUTT PIRE
JUTT MEEM
TSILMER KERSTI
JUKSTI JAAAN
KELJALG SIIRI
SONGISEPP EHPP
MIKELSAAR MARIKA
REHTSEP MERLE
TSILMER MIKHKEL
KHJUTT PIRE
JUTT MEEM
TSILMER KERSTI
JUKSTI JAAAN
KELJALG SIIRI

Патентообладатели

OJU TERVISLIKU PIIMA BIOTEKHNOLOOGIATE ARENDUSKESKUS
OJU TERVISLIKU PIIMA BIOTEKHNOLOOGIATE ARENDUSKESKUS

Заявители

OJU TERVISLIKU PIIMA BIOTEKHNOLOOGIATE ARENDUSKESKUS
OJU TERVISLIKU PIIMA BIOTEKHNOLOOGIATE ARENDUSKESKUS

СПК: A23C9/123 A23C9/1234 A23C19/0323 A23L33/135 A23V2002/00 A23Y2220/67 A61K35/74 A61K35/747 C12N1/00 C12N1/20

МПК: A61K35/747 A61K35/74 A23C9/123

Публикация: 2013-03-20

Дата подачи заявки: 2009-05-12

0
0
0
0
Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.
Поиск по товарам
Добавить свой товар
Сообщества
Товары
Участники
Патенты
Запросов

Поставщикам
О сервисе
Блогерам
Помощь
Представьтесь