Синбиотическая пищевая композиция, содержащая тагатозу и пробиотические молочнокислые бактерии - RU2569816C1

Чертежи

Показать все 9 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к синбиотической пищевой композиции, которая представляет пищевую композицию для стимуляции активного роста в желудочно-кишечном тракте молочнокислых бактерий Lactobacillus sp., содержащую молочнокислые бактерии и тагатозу в качестве источника нутриентов для штамма бактерий.

В частности, настоящее изобретение относится к синбиотической пищевой композиции, содержащей штамм Lactobacillus casei или штамм Lactobacillus rhamnosus в качестве пробиотика и тагатозу в качестве пребиотика.

Уровень техники

Используемый здесь термин «пробиотики» относится к живым микроорганизмам, оказывающим положительное воздействие на здоровье хозяина, такого как человек, животное или аналогичное им, или его компонент, а также известно, что пробиотики оказывают положительное воздействие, например, поддерживая баланс кишечной флоры хозяина, потребляющего пробиотики.

Как правило, пробиотики включают полезные бактерии, такие как молочнокислые бактерии и Bifidobacteria, и ряд дрожжей. Среди них молочнокислые бактерии, принадлежащие к роду Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacteria, Streptococcus и аналогичное им, являются наиболее изученными и наиболее часто используемыми.

Молочнокислые бактерии (LAB), используемые для получения различных ферментированных пищевых продуктов в течение длительности периода времени, представляют признанные полностью безопасными (GRAS). Молочнокислые бактерии используют различные сахара, включающие лактозу, в качестве субстрата для превращения в молочную кислоту и подавления роста вредных бактерий, придавая кислый вкус пищевому продукту и снижая показатель pH за счет указанного выше процесса. Поскольку молочнокислые бактерии оказывают положительное воздействие на человека в различных аспектах, например, контроль кишечной микрофлоры хозяина для подавления различных желудочно-кишечных заболеваний и поддержания иммунитета, наряду с антибиотическим воздействием, возрос интерес к развитию молочнокислых бактерий в качестве различных пищевых материалов.

Как указано выше, молочнокислые бактерии, которые приведены в качестве примера, широко используются в жизни человека, например, в различных ферментированных пищевых продуктах, ферментированных соевых бобах, лекарственных средствах, кормовых добавках для домашнего скота и аналогичном им, наряду с ферментированными молочными продуктами. Недавно проведены исследования в отношении различных функциональных воздействий молочнокислых бактерий на здоровье в кишечнике хозяина дополнительно к их нутритивному воздействию.

Для повышения in vivo активности указанных выше молочнокислых бактерий было проведено исследование синбиотиков смешиванием пробиотиков, соответствующих живым бактериям, и пребиотикам, соответствующим источнику нутриентов для пробиотиков. Однако пребиотики, используемые в синбиотиках по предшествующему уровню техники, в значительной степени переваривались в желудочно-кишечном тракте хозяина, таким образом, что пребиотики не оказывали эффективного воздействия в качестве источника нутриентов для пробиотиков, а видовая специфичность пребиотиков недостаточна, таким образом, пребиотики не эффективны для повышения активности специфических молочнокислых бактерий.

Между тем тагатоза, представляющая изомер фруктозы, представляет натурально полученный низкокалорийный натуральный сахар. Тагатоза имеет сладкий вкус аналогичный сахару, и степень ее сладости составляет около 92% сахара, а ее калорийность составляет только 38% сахара, и ее гликемический индекс (GI) составляет только около 4% сахара, таким образом, тагатоза стала центром внимания в качестве сахарозаменяющего подсластителя.

Дополнительно, возможно, что тагатоза, используемая в качестве пребиотиков, была описана в корейском патенте No. 10-0620477, но почти не было исследований в части детального описания патентной заявки, таких как ряд пробиотиков, с которыми тагатоза может быть фактически применена и тому подобное.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Настоящее изобретение относится к пищевой композиции, обеспечивающей синбиотики, содержащие тагатозу в качестве пребиотика и специфические молочнокислые бактерии Lactobacillus sp., в частности, использующие тагатозу в качестве пробиотика, способствующего доминантной пролиферации специфических молочнокислых бактерий в кишечнике хозяина, потребляющего пищевую композицию по изобретению.

Решение технической проблемы

Настоящее изобретение относится к синбиотической пищевой композиции, которая представляет пищевую композицию, способствующую активному росту в кишечнике молочнокислых бактерий Lactobacillus sp., содержащей молочнокислые бактерии и тагатозу в качестве источника нутриентов для штамма бактерий.

В одном приведенном в качестве примера варианте выполнения настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей тагатозу и Lactobacillus casei.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения настоящее изобретение относится к Lactobacillus casei, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei DN114001 и Lactobacillus casei-01^®.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения компоненты композиции указаны из расчета на 100 весовых частей композиции.

Пищевой композиции, которая может содержать от более 0 до 20 весовых частей тагатозы и от более 0 до 1 весовых частей Lactobacillus casei.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей на 100 весовых частей всей композиции

от более 0 до 20 весовых частей тагатозы;

от более 0 до 1 весовых частей Lactobacillus casei;

от более 0 до 10 весовых частей сухого обезжиренного молока и

от 50 до 99 весовых частей очищенной воды.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей тагатозу и Lactobacillus rhamnosus.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения настоящее изобретение относится к Lactobacillus rhamnosus, которые могут представлять Lactobacillus rhamnosus GG.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения компоненты указаны из расчета на 100 весовых частей всей композиции.

Пищевая композиция может содержать от более 0 до 20 весовых частей тагатозы и от более 0 до 1 весовых частей Lactobacillus rhamnosus.

В другом приведенном в качестве примера варианте выполнения настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей на 100 весовых частей всей композиции

от более 0 до 20 весовых частей тагатозы;

от более 0 до 1 весовых частей Lactobacillus rhamnosus;

от 50 до 99 весовых частей сырого молока;

от более 0 до 1 весовых частей пектина и

от более 0 до 50 весовых частей очищенной воды.

Технический результат изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает синбиотический продукт, содержащий тагатозу в качестве пребиотика и специфические молочнокислые бактерии Lactobacillus sp., в частности, использующие тагатозу в качестве пробиотика, так что специфические молочнокислые бактерии могут быть доминантно пролиферированы в кишечнике хозяина, потребляющего синбиотики.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - кривая роста Lactobacillus casei.

Фиг. 2 - кривая роста Lactobacillus casei Shirota.

Фиг. 3 - кривая роста Lactobacillus casei DN114001.

Фиг. 4 - кривая роста Lactobacillus casei-01^®.

Фиг. 5 - кривая роста Lactobacillus rhamnosus.

Фиг. 6 - кривая роста Lactobacillus rhamnosus GG.

Фиг. 7 - кривая роста Pediococcus Pentosaceus.

Фиг. 8 - кривая роста Lactobacillus farciminis.

Фиг. 9 - кривая роста Lactobacillus acidophilus.

Описание предпочтительных вариантов выполнения изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более детально. Поскольку содержание, не приведенное здесь, по существу понятно и признается специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение, описание здесь опущено.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей тагатозу и молочнокислые бактерии Lactobacillus sp.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей тагатозу, молочнокислые бактерии Lactobacillus sp., сырое молоко, пектин и очищенную воду.

Пищевая композиция по изобретению по существу не имеет ограничений по применению, и может использоваться в различных пищевых продуктах или композициях пищевых продуктов.

Пищевая композиция по изобретению может использоваться предпочтительно в качестве молочного продукта, например, ферментированного молочного продукта и/или концентрированного ферментированного молочного продукта или аналогичного указанным.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к пищевой композиции, содержащей на 100 весовых частей всей композиции

от более 0 до 20 весовых частей тагатозы и

от более 0 до 1 весовых частей молочнокислых бактерий Lactobacillus sp.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к концентрированной ферментированной молочной композиции, содержащей на 100 весовых частей всей композиции

от более 0 до 20 весовых частей тагатозы;

от более 0 до 1 весовых частей молочнокислых бактерий Lactobacillus sp.;

от 50 до 99 весовых частей, более предпочтительно от 70 до 90 весовых частей сырого молока;

от более 0 до 1 весовых частей, более предпочтительно от более 0 до 0,5 весовых частей пектина и

от более 0 до 50 весовых частей, более предпочтительно от 1 до 10 весовых частей очищенной воды.

Используемый здесь термин «сырое молоко» имеет общепринятое значение в области техники, к которой относится настоящее изобретение, означающий не прошедшее технологическую обработку молоко, полученное от коровы.

Используемый здесь термин «пектин» имеет общепринятое значение в области техники, к которой относится настоящее изобретение, означающий очищенный полисахаридный углевод, широко распространенный у наземных животных и в растениях и полученный водной экстракцией, в частности, из яблок, плодов цитрусовых (лимона, лайма, апельсинов или аналогично им) или аналогичного им.

Концентрированная ферментированная молочная композиция может дополнительно содержать (в смеси) сухое обезжиренное молоко, сахар, фруктозу, глюкозу, (концентрированный) фруктовый сок, приправленный специями продукт или аналогичный указанным.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к ферментированной молочной композиции, содержащей на 100 весовых частей всей композиции:

от более 0 до 20 весовых частей тагатозы;

от более 0 до 1 весовых частей молочнокислых бактерий Lactobacillus sp.;

от более 0 до 10 весовых частей, более предпочтительно от 3 до 5 весовых частей сухого обезжиренного молока и

от более чем 50 до 99 весовых частей, более предпочтительно от более чем 80 до 95 весовых частей очищенной воды.

Используемый здесь термин «сухое обезжиренное молоко» имеет общепринятое значение в области техники, к которой относится настоящее изобретение, означает продукт, полученный в результате сепарирования и удаления жирового компонента из молока. Используемое в настоящем изобретении сухое обезжиренное молоко может представлять смешанное сухое обезжиренное молоко, где смешанное сухое обезжиренное молоко относится к продукту, полученному смешиванием, например, муки зерновых (рисовая мука или аналогичное ей), продуктов из зерновых (пшеничная мука или аналогичное ей), пищевых добавок, таких как какао-продукты, сухая сыворотка или аналогичное им, с сухим обезжиренным молоком или с сухим молоком, в котором сухое обезжиренное молоко и сухие молочные сливки смешивают друг с другом, подвергают технологической обработке с получением порошкообразной смеси.

Дополнительно ферментированная молочная композиция может содержать глюкозу, сахара, продукты, прошедшие технологическую обработку специями или аналогичное им.

Используемые в настоящем изобретении молочнокислые бактерии Lactobacillus sp. предпочтительно представляют Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus farciminis или Lactobacillus acidophilus.

Поскольку эти штаммы по сравнению с другими штаммами продемонстрировали превосходную способность использования тагатозы в качестве источника нутриентов в хозяине, то эти штаммы могут быть эффективно использованы в качестве синбиотической композиции пробиотиков, использующих тагатозу в качестве пребиотиков, таким образом, что эти штаммы сбалансированы в кишечной микрофлоре хозяина и по существу начинают доминировать в кишечнике хозяина, оказывая, таким образом, положительное воздействие на метаболизм хозяина.

Известно, что среди указанных выше молочнокислых бактерий, в частности Lactobacillus casei и Lactobacillus rhamnosus, оказывают положительное воздействие на организм человека, такое как функциональное воздействие, связанное с иммунитетом, противораковое воздействие и аналогичное им, дополнительно к регулирующему воздействию на кишечник, таким образом Lactobacillus casei и Lactobacillus rhamnosus используют во множестве различных продуктов по всему миру.

Lactobacillus casei, являющиеся известными штаммами, принадлежащими к молочнокислым бактериям, могут включать Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei DN114001 и Lactobacillus casei-01^® (Reference: Kazumasa Matsumoto et al., 「Effects of a Probiotic Fermented Milk Beverage Containing Lactobacillus Casei Strain Shirota on Defecation Frequency, Intestinal Microbiota, and the Intestinal Environment of Healthy Individuals with Soft Stools」, Journal of Bioscience and Bioengineering VOL. 110 No.5,547-552, 2010; Chu-Ting Liu et al., 「Antiproliferative and Anticytotoxic Effects of Cell Fractions and Exopolysaccharides from Lactobacillus Casei 01」, Mutation Research 721(2011)157-162; Maija Saxelin et al., 「Probiotic and Other Functional Microbes: from Markets to Mechanisms, Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:204-211; Antonis Ampatzoglou et al., 「Influence of Fermentation on the Acid Tolerance and Freeze drying Survival of Lactobacillus Rhamnosus GG」, Biochemical Engineering Journal, 52(2010) 65-70; or the like).

Используемые в настоящем изобретении Lactobacillus casei предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei DN114001 и Lactobacillus casei-01^® одного или комбинации двух или более из них.

Используемые в настоящем изобретении Lactobacillus rhamnosus предпочтительно представляют Lactobacillus rhamnosus GG.

Далее настоящее изобретение будет описано более детально со ссылкой на Примеры. Однако эти Примеры только иллюстрируют настоящее изобретение и не ограничивают его.

Пример 1

Выбор молочнокислых бактерий с превосходной способностью использования тагатозы

Оценили способность использования тагатозы известными молочнокислыми бактериями (250 коммерческих штаммов, 25 штаммов, выделенных у человека, и 110 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из молочных продуктов, представленных на рынке).

(1) Выделение штамма

Растворы чистых культур (1% раствор культуры в стационарной фазе, в которой число клеток каждого штамма составляет от около 10⁸ до 10⁹ КОЕ/мл) всех 385 штаммов молочнокислых бактерий инокулировали в селективную среду, соответственно, и культивировали в инкубаторе при температуре 37°С в течение 18 часов с последующим трехразовым субкультивированием. Затем эксперименты провели в условиях, при которых жизнеспособность штамма оптимальна.

(2) Получение культуральной среды

Для оценки способности использования тагатозы каждым из молочнокислых бактерий использовали минимальную среду, состоявшую из 5г пептона, 2,5 г натрия ацетат тригидрата, 0,5 мл магния сульфата гептагидрата, 0,5 мл магния сульфата тетрагидрата, 5 мл Tween 80, 1 г диаммония цитрата, 1г дикалия фосфата и 480 мл дистиллированной воды.

Затем среду стерилизовали при температуре 121°С в течение 15 минут и разделили на три образца, в каждый из трех образцов добавили 20 мл 50% раствора тагатозы, 20 мл 50% раствора глюкозы и 20 мл 50% раствора фруктоолигосахаридов (FOS) с получением, таким образом, жидкой среды.

(3) Культивирование

1% каждого указанного выше штамма молочнокислых бактерии инокулировали в полученную среду и культивировали в инкубаторе при температуре 37°С в течение 24 часов. Следовательно, абсорбцию каждого из культивированных штаммов измерили при использовании ELISA, и число клеток определили при использовании культуры на чашках Петри с использованием разбавляющего раствора, оценивая, таким образом, способность использовать тагатозу.

Пример 2

Определение самого лучшего штамма по результатам Примера 1

Выбрали 19 штаммов с самой лучшей способностью использования тагатозы из каждой из культивированных молочнокислых бактерий в Примере 1 и определили выделением их 16s рДНК.

Экстрагировали 2 мл культурального раствора каждой из культивированных молочнокислых бактерий (O.D(600): от 0,8 до 1,0) и центрифугировали при 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты с удалением, таким образом, супернатанта. Затем подходящим образом смешали 50 µл охлажденного пребуфера (содержащего 15 µл Рназы RNase A) и 3 µл раствора лизоцима с каждым из других и обработали этой смесью клеточную массу.

Обработанную клеточную массу переворачивали каждые 5 минут с выдержкой ее в течение 15 минут при температуре 37°С, с проведением, таким образом, реакции. Затем в нее добавили 250 µл охлажденного G-буфера (содержащего 210 µл раствора Рназы RNase A и протеиназы K) и тщательно перемешали.

Полученное в результате переворачивали каждые 5 минут с выдержкой ее в течение 15 минут при температуре 65°С с проведением, таким образом, реакции. Затем в него добавили 250 µл охлажденного связывающего буфера и тщательно перемешали.

Далее после этого клеточный лизат (800 µл или менее) поместили в колонку и центрифугировали при 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты, для промывки колонки добавили 500 µл отмывочного буфера A (содержащего 21 мл абсолюта этанола (EtOH)) и центрифуге снова при 13000 оборотов в минуту в течение 1 минуты.

Далее после удаления раствора в G-спин колонку установили новую 1,5 мл пробирки Эппендорфа. Затем непосредственно на мембрану поместили от 50 до 200 µл элюирующего буфера, оставили при комнатной температуре в течение минуты и затем центрифугировали с получением gДНК.

После экстрагирования ДНК из образцов при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали интерфейс последовательность между 16S rРНК, 23S rРНК, или 16S rРНК и 23S rРНК, являющихся характерными для бактерий. Затем после проведения секвенирования флуоресцентных терминаторов в гель выделили ДНК последовательности при использовании электрофореза и определили основную последовательность в нуклеотидном компоненте при использовании автоматического секвенатора. Затем полученную в результате основную последовательность ввели в компьютер и сравнили с основной последовательностью ДНК введенного в компьютер штамма, определяя, таким образом, штамм.

В результате селективного отбора было отобрано 19 штаммов с самой лучшей способностью использования тагатозы из всех 385 штаммов, выделили и определили указанные выше 16s rДНК, подтвердили 9 штаммов Lactobacillus casei, 6 штаммов Lactobacillus rhamnosus, 2 штамма Pediococcus pentosaceus, один штамм Lactobacillus farciminis и один штамм Lactobacillus acidophilus.

Выбранные 19 штаммов приведены в следующей Таблице 1. Как видно из Таблицы 1, среди прочих L. casei Shirota, L. casei DN114001, L. casei-01 и L. rhamnosus GG имели самую лучшую способность использования тагатозы по сравнению с другими штаммами.

Пример 3

Способность использования других пребиотиков некоторыми из молочнокислых бактерий, определенных в Примере 2

Оценили способность использования других пребиотиков за исключением тагатозы, сравнив и проанализировав при использовании 9 штаммов, обладающих самой лучшей способностью использования тагатозы среди 19 штаммов, определенных в Примере 2.

Для проведения оценки при получении среды по Примеру 1 в качестве положительного контроля использовали глюкозу для исключения тагатозы и в качестве отрицательного контроля использовали фруктоолигосахариды, лактит, лактулозу и ксилит.

Каждый из определенных в Примере 2 Lactobacillus casei (Фиг. 1), Lactobacillus casei Shirota (Фиг. 2), Lactobacillus casei DN114001 (Фиг. 3), Lactobacillus casei-01^® (Фиг. 4), Lactobacillus rhamnosus (Фиг. 5), Lactobacillus rhamnosus GG (Фиг. 6), Pediococcus pentosaceus (Фиг. 7), Lactobacillus farciminis (Фиг. 8) и Lactobacillus acidophilus (Фиг. 9) инокулировали в каждую среду и культивировали при температуре 37°С в течение 0, 5, 10, 24 и 48 часов. Затем определили количество живых клеток с получением, таким образом, кривой роста каждого из штаммов.

В результате сравнения кривых роста штаммов молочнокислых бактерий, эффективно использующих тагатозу, способность использования глюкозы, тагатозы и лактулозы была аналогична друг у друга, но способность использования фруктоолигосахаридов и лактита была низкой.

Пример 4

Получение синбиотической концентрированной ферментированной молочной композиции, содержащей тагатозу и Lactobacillus rhamnosus (молочнокислые бактерии)

Для получения синбиотической концентрированной ферментированной молочной композиции (ферментированный молочный продукт с цельным сгустком, питьевой ферментированный молочный продукт или аналогичное им), содержащей тагатозу в качестве пребиотика и штамм Lactobacillus rhamnosus GG в качестве пробиотика, использовали следующий способ с получением концентрированной ферментированной молочной композиции, представленной в Таблице 2.

Сначала сырое молоко и сухое обезжиренное молоко смешивали в соотношении для смешивания, гомогенизировали под давлением 150 бар и пропустили через теплообменник для стерилизации. Затем температуру понизили до 40°С и инокулировали в него штамм Lactobacillus rhamnosus GG, полученный в Примере 2, и Streptococcus thermophilus. Затем после ферментации в течение 6 часов при достижении pH 4,6, сгусток охладили во время прессования. В это же время в случае питьевого концентрированного ферментированного молочного продукта гомогенизацию проводят снова под давлением 150 бар с получением раствора культуры.

В то же самое время смешали по отдельности тагатозу, белый сахар (белый сахар может быть заменен на фруктозу или глюкозу), концентрированный клубничный сок или мякоть клубники, пектин, клубничный ароматизатор и очищенную воду, стерилизовали и охладили с получением сиропа или джема.

Полученный раствор культуры и сироп или джем смешали в заранее заданном соотношении и затем охладили до температуры 10°С или менее.

Пример 5

Получение синбиотической ферментированной молочной композиции, содержащей тагатозу и Lactobacillus casei (молочнокислые бактерии)

Для получения синбиотической концентрированной ферментированной молочной композиции (жидкий ферментированный молочный продукт или аналогичное им), содержащей тагатозу в качестве пребиотика и штамм Lactobacillus casei-01^® в качестве пробиотика, использовали следующий способ для получения концентрированной ферментированной молочной композиции, представленной в следующей Таблице 5.

Сначала сырое молоко и (смешанное) сухое обезжиренное молоко, гидрокристаллическую глюкозу, очищенную воду смешали друг с другом, стерилизовали при температуре 105°С в течение 90 минут и охладили до температуры 40°С и инокулировали в него штамм Lactobacillus casei-01^®, полученный в Примере 2. Затем полученный в результате продукт ферментировали в течение 5 дней и при достижении pH 3,6, температуру снизили с получением раствора культуры. Композиция раствора культуры приведена в следующей Таблице 3.

В то же самое время смешали по отдельности тагатозу, белый сахар (белый сахар может быть заменен на фруктозу) и очищенную воду, стерилизовали и охладили с получением сиропа или джема. Композиция сиропа приведена в следующей Таблице 4.

После смешивания раствора культуры и сиропа в соотношении 1:1 добавили небольшое количество йогуртного ароматизатора при перемешивании с очищенной водой при соотношении 1:1. Затем полученный в результате продукт охладили до температуры 10°С или менее.

Композиция конечной готовой ферментированной молочной композиции приведена в следующей Таблице 5.

Реферат

Изобретение относится к синбиотической пищевой композиции для стимуляции активного роста в желудочно-кишечном тракте молочнокислых бактерий Lactobacillus sp., содержащей молочнокислые бактерии и тагатозу в качестве источника нутриентов для штамма бактерий. В частности, пищевая композиция содержит штамм Lactobacillus casei-01или штамм Lactobacillus rhamnosus GG. При этом пищевая композиция, содержащая штамм Lactobacillus rhamnosus GG включает на 100 весовых частей следующие компоненты: от более 0 до 20 весовых частей тагатозы, от более 0 до 1 весовых частей Lactobacillus rhamnosus GG, от 50 до 99 весовых частей сырого молока, от более 0 до 1 весовых частей пектина и от более 0 до 50 весовых частей очищенной воды. Изобретение позволяет получить симбиотические композиции, обеспечивающие доминантную пролиферацию специфических молочнокислых бактерий в кишечнике хозяина, потребляющего эти композиции. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 5 пр.

Формула