Сомногенная активность непатогенных молочно-кислых бактерий - RU2262943C2
Код документа: RU2262943C2
Чертежи
Описание
Область изобретения
Настоящее изобретение касается непатогенных молочнокислых бактерий и пищевых продуктов, содержащих данные бактерии. Клеточные стенки данных молочнокислых бактерий восприимчивы к действию ферментов типа мурамидазы. Данные ферменты продуцируют фрагменты клеточных стенок, называемые мурамилпептидами, которые при приеме внутрь улучшают качество сна.
Уровень техники
В наше время многие люди трудно засыпают или страдают от нарушений сна, таких как бессонница. Для решения этих проблем разработано много фармацевтических продуктов, содержащих бензодиазепины или барбитураты. Однако данные продукты следует принимать под наблюдением врача из-за их вторичных эффектов, таких как лекарственная зависимость, сонливость в дневное время, потеря памяти и взаимодействие с другими веществами, особенно алкоголем.
Исследование инфекционных заболеваний показало, что заражение патогенными микробами вызывает, по меньшей мере, три физиологических реакции у инфицированного субъекта: иммунный ответ, лихорадку и изменение сна. Медиаторы данных реакций в организме-носителе являются компонентами клеточных стенок бактерий, ответственных за инфицирование, в частности мурамилпептидами (а также липополисахаридами в грамотрицательных бактериях). Исследование показало, что клеточные стенки патогенных бактерий, таких как Staphylococcus aureus, гидролизуются макрофагами с образованием свободных мурамилпептидов (Johannsen L. и др., 1994).
Чтобы избежать вторичных эффектов лекарственных препаратов, содержащих бензодиазепины или барбитураты, в патенте США 4698330 предлагается использование композиций на основе очищенных мурамилпептидов, которые обладают сомногенной активностью. Хотя введение таких мурамилпептидов ведет к увеличению глубины сна, называемого сном с небыстрыми движениями глаз (NREM), оно вызывает также повышение температуры тела, что требует сопутствующего введения жаропонижающих соединений.
В патентных заявках СН 654330 A, CN 1114217 А и WO 8800438 А описаны композиции, содержащие бактерии, особенно молочнокислые бактерии, которые улучшают сон. Однако данные документы не раскрывают, как молочнокислые бактерии участвуют в улучшении сна. Указано, что влияние на сон, а также другие заявленные преимущества (больше энергии, лучше аппетит и пищеварение, облегчение ревматизма и др.) таких композиций, содержащих молочнокислые бактерии, являются результатом специфического баланса питательных веществ и питательных микровеществ, содержащихся в описанных композициях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Понимание данного изобретения можно расширить, ссылаясь на имеющиеся здесь чертежи, которые не являются необходимыми для понимания данного изобретения.
На фигуре 1 графически показаны количества супероксидного аниона и IL-1β, определенные в супернатанте культуры моноцитов после контакта с бактериальной суспензией, соответствующей данному изобретению.
На фигуре 2 графически показана корреляция между концентрациями IL-1β и TNFα, определенными после воздействия на моноциты бактериальными клетками.
На фигуре 3 графически представлен процент времени, проведенного в NREM-фазе и REM-фазе, как функция времени (часы) после инъекции двух различных концентраций материала клеточных стенок, соответствующего данному изобретению.
На фигуре 4 представлен график, аналогичный графику фигуры 3, где материал стенок бактериальных клеток невосприимчив к расщеплению под действием ферментов типа мурамидазы с обеспечением растворимой фракции, содержащей мурамилпептиды.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявители данного изобретения обнаружили, что непатогенные бактерии, которые не вызывают заражения, такие как молочнокислые бактерии, могут изменять фазы сна, например увеличивать продолжительность глубокого NREM-сна. Они отмечают, что молочнокислые бактерии, которые ведут к увеличению фазы NREM-сна, представляют собой бактерии, клеточная стенка которых чувствительна к действию ферментов типа мурамидазы, таких как лизоцим или мутанолизин.
Заявители данного изобретения изучали действие мурамидазы, мутанолизина на клеточные стенки различных молочнокислых бактерий, в частности на клеточные стенки Lactobacillus gasseri 9221 (CNCM I-2131), Lactobacillus acidophilus 9223 (CNCM I-2274), Lactobacillus acidophilus 9173 (CNCM I-2132), Lactobacillus helveticus 9343 (CNCM I-2275), Streptococcus thermophilus 9340 (CNCM I-1520) и Streptococcus thermophilus 10090 (CNCM I-2272). Они заметили, что клеточные стенки Lactobacillus acidophilus 9223 (CNCM I-2274), Lactobacillus acidophilus 9173 (CNCM I-2132), Lactobacillus helveticus 9343 (CNCM I-2275), Streptococcus thermophilus 9340 (CNCM I-1520) и Streptococcus thermophilus 10090 (CNCM I-2272) гидролизуются мутанолизином, давая две фракции: растворимую фракцию, содержащую мурамилпептиды, и нерастворимую фракцию. В противоположность этому, клеточные стенки Lactobacillus gasseri 9221 (CNCM I-2131) не гидролизовались мутанолизином, и мурамилпептиды не высвобождались. После инкубации Lactobacillus gasseri 9221 (CNCM I-2131, депонирован 24/2/99) с мутанолизином могла быть получена только нерастворимая фракция.
Эффекты молочнокислых бактерий, клеточные стенки которых гидролизуются ферментами типа мурамидазы, на сон оценивали посредством изучения двух экспериментальных систем:
1) Эксперименты in vitro с моноцитами человека показали, что молочнокислые бактерии, клеточные стенки которых гидролизуются мутанолизином, давая растворимую фракцию, содержащую мурамилпептиды, способны сильно активировать моноциты, индуцируя повышенную продукцию супероксидного аниона, а также индуцируя продукцию цитокинов IL-1β и TNFα. Супероксидный анион представляет собой продуцируемый моноцитами радикал кислорода, который непосредственно включен в поражение микробов. Цитокины являются семейством белковых медиаторов воспаления, которые, как известно, включены в регуляцию сна. Данные эффекты активации моноцитов наблюдались и с Lactobacillus, и со Streptococcus, включая Lactobacillus acidophilus 9223, Lactobacillus acidophilus 9173, Lactobacillus helveticus 9343, Streptococcus thermophilus 9340 и Streptococcus thermophilus 10090.
2) Эксперименты in vivo на кроликах показывали, что молочнокислые бактерии, клеточные стенки которых гидролизуются мутанолизином, давая растворимую фракцию, содержащую мурамилпептиды, оказывают влияние на фазы сна. Сон анализировали по электроэнцефалограммам (ЭЭГ). Особенно такие мурамилпептиды увеличивали фазу сна, называемую NREM (небыстрые движения глаз), и уменьшали фазу сна, называемую REM (быстрые движения глаз).
Настоящее изобретение описывает несколько бактерий, которые улучшают качество сна, увеличивая продолжительность фазы сна с небыстрыми движениями глаз (NREM). Другим важным свойством бактерий является то, что они непатогенны для людей и их клеточные стенки чувствительны к действию ферментов типа мурамидазы, в частности к действию мутанолизина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Молочнокислые бактерии, описанные в данном изобретении, могут быть выбраны из родов, включающих Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus и Bifidobacterium. Предпочтительными бактериями являются молочнокислые бактерии, выбранные из следующих:
- Lactobacillus acidophilus 9223 (CNCM I-2274, депонирован 3/8/99); DN-112089;
- Lactobacillus acidophilus 9170 (CNCM I-2273, депонирован 3/8/99); DN-112001;
- Lactobacillus acidophilus 9173 (CNCM I-2132, депонирован 24/2/99);
- Lactobacillus helveticus 9343 (CNCM I-2275, депонирован 3/8/99); DN-119028;
- Streptococcus thermophilus 9340 (CNCM I-1520, депонирован 30/12/94);
- Streptococcus thermophilus 10090 (CNCM I-2272, депонирован 3/8/99); DN-001143.
Как правило, общедоступны другие штаммы. CNCM I-2274, CNCM I-2273, CNCM I-2132, CNCM I-2275, CNCM I-1520 и CNCM I-2272 депонированы в Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France. Данные депозиты сделаны согласно условиям Будапештского договора.
Настоящее изобретение включает также культуры молочнокислых бактерий, которые объединяют два или более штаммов молочнокислых бактерий, как описано в данном изобретении для одного штамма.
Настоящее изобретение описывает также диетические добавки или пищевые продукты, содержащие молочнокислые бактерии, которые улучшают качество сна. Диетические добавки включают молочную основу, в частности подвергнутое брожению молоко, содержащее штаммы молочнокислых бактерий, клеточные стенки которых чувствительны к действию мутанолизина. Прием внутрь таких диетических добавок или пищевых продуктов будет улучшать качество сна.
Молоко выбирают из молока различных видов животных. Молоко может быть частично или полностью обезжиренным. Молочная основа может включать продукты, полученные разбавлением или концентрированием такого молока, такие как, например, остаток ультрафильтрации или диафильтрации. Молочная основа может включать среду на основе молока, такую как основы для молочных пищевых продуктов, или молочные смеси для йогурта, или подвергнутое брожению молоко. В это молоко можно добавить лактозу, минералы, витамины, жиры, водорастворимые молочные твердые вещества, экстракты растений, вкусовые добавки и др.
В другом варианте данные диетические добавки или пищевые продукты можно также получить из растительного субстрата, такого как соевое молоко, сок или фруктовая мякоть.
Например, диетические добавки или пищевые продукты согласно данному изобретению получают, осуществляя следующий процесс: молочную основу засевают, по меньшей мере, одним штаммом молочнокислой бактерии с содержанием 106-107колониеобразующих единиц на мл. Условия инкубации варьируют в соответствии с использованным штаммом или культурой молочнокислой бактерии. Например, если культура состоит из штамма Streptococcus thermophilus или смеси, содержащей, по меньшей мере, один штамм Streptococcus thermophilus, оптимальны условия культивирования при 25-44°С в течение 3-24 час. Если культура состоит из штаммов Lactobacillus acidophilus или Lactobacillus helveticus, или смеси, содержащей, по меньшей мере, один штамм Lactobacillus acidophilus или Lactobacillus helveticus, оптимальны условия культивирования при 37-44°С в течение по меньшей мере 8-16 час.
Молочную основу, засеянную культурой, можно дополнить пептидом N3, дрожжевым экстрактом, антиоксидантами, такими как цистеин, витаминами, растворимыми волокнами, такими как олигосахариды, или другими субстратами, которые применяют в настоящее время для поощрения роста используемых штаммов молочнокислых бактерий.
Молочнокислые бактерии или диетические добавки, которые их содержат, позволяют улучшать качество сна, увеличивая NREM-фазу и/или уменьшая REM-фазу. Увеличение NREM-фазы сна соответствует увеличению продолжительности глубокого сна. Увеличение фазы глубокого сна ведет к лучшему восстановлению при усталости, большей живости днем и другим преимуществам.
Кроме того, так как молочнокислые бактерии являются непатогенными микроорганизмами, их можно вводить для улучшения качества сна без риска активации чрезмерной реакции иммунной системы. Молочнокислые бактерии положительно взаимодействуют с иммунной системой, не вызывая патологических реакций (таких как сверхпродукция цитокинов), подобных реакциям, провоцируемым патогенными бактериями.
Кроме того, применение молочнокислых бактерий для улучшения качества сна не дает вторичных эффектов, связанных с приемом барбитуратов или бензодиазепинов.
Настоящее изобретение будет легче понять при помощи примеров, иллюстрирующих свойства штаммов молочнокислых бактерий, соответствующих данному изобретению.
Эксперименты in vitro
Гидролиз клеточных стенок различных молочнокислых бактерий мутанолизином
Клеточные стенки получали из культур молочнокислых бактерий в стационарной фазе. Бактериальные клетки разрушали под прессом French press. Данный препарат обрабатывали детергентом додецилсульфатом натрия и трипсином, получая сырой экстракт депротеинизированных клеточных стенок. Затем расщепляли пептидогликан клеточной стенки из молочнокислых бактерий при помощи мутанолизина из Streptomyces globisporus (Sigma-Aldrich, St.Louis, МО). Пептидогликан 5-10 мг/мл инкубировали с 0,1-0,25 мг мутанолизина при 37°С в фосфатном буфере, рН 5,8, в течение 24 часов. Полученный гидролизат отделяли центрифугированием, используя центрифужные концентраторы (Pall Filtron Microsep™, Northborough, MA) и мембрану с порогом 10 кДа для отделения молекул с низкой молекулярной массой от остального высокомолекулярного материала.
Исследованы бактерии Lactobacillus gasseri 9221, Lactobacillus acidophilus 9223, Lactobacillus acidophilus 9173, Lactobacillus helveticus 9343, Streptococcus thermophilus 9340 и Streptococcus thermophilus 10090.
Клеточные стенки пяти исследованных бактерий частично гидролизовали мутанолизином, делая возможным выделение растворимой фракции, содержащей мурамилпептиды, и нерастворимой фракции, устойчивой к действию мутанолизина.
Только клеточные стенки Lactobacillus gasseri 9221 (CNCM I-2131, депонирован 24/2/99) не гидролизовались мутанолизином и не высвобождали мурамилпептиды.
Индуцирование молочнокислыми бактериями продукции супероксидного аниона и цитокинов в моноцитах человека
Моноциты выделяли из здоровых взрослых людей. Осаждали эритроциты высокомолекулярным декстраном. Моноядерные клетки отделяли от нейрофилов посредством градиента Histopaque (Sigma-Aldrich). Мононуклеарные клетки, которые содержали моноциты и лимфоциты, культивировали при плотности 1,5×106клеток/мл, что примерно соответствует 0,5×106 моноцитов/мл, в модифицированной среде солевого раствора Эрла в инкубаторе при 37°С с 5% CO2. В экспериментах, предназначенных для измерения продукции TNFα моноцитами, моноциты культивировали в присутствии 0,2% инактивированной нагреванием (56°С, 30 мин) сыворотки человека типа АВ.
Исследованы бактерии Lactobacillus gasseri 9221, Lactobacillus acidophilus 9223, Lactobacillus acidophilus 9173, Lactobacillus helveticus 9343, Streptococcus thermophilus 9340 и Streptococcus thermophilus 10090. Гранулы молочнокислых бактерий представляли в виде суспензии, получая концентрацию бактериальных белков 1 мг/мл (определяют, исследуя белок по Лоури). Исследовали разбавленные суспензии, содержащие от 0,1 до 300 нг/мл бактериальных белков.
Продукцию моноцитами супероксидного аниона (О2) определяли методом с цитохромом с после активации моноцитов форболмиристатацетатом (РМА) в течение 40 мин при 37°С в инкубаторе с 5% CO2. Восстановление цитохрома супероксидным анионом определяли спектрофотометрически при 550 нм. Для расчета количества продуцированного супероксидного аниона использовали коэффициент экстинции 0,021 мкМ-1.
Продукцию цитокинов определяли способом ELISA (Enzyme Link Immunosorbent Assay) на образцах среды культуры моноцитов. Использовали наборы ELISA для IL-lβ (BioSource International, Carmarillo, СА) и TNFα (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA).
На фигуре 1 показано, что Lactobacillus acidophilus 9223, Lactobacillus acidophilus 9173, Lactobacillus helveticus 9343, Streptococcus thermophilus 9340 и Streptococcus thermophilus 10090 способны сильно активировать моноциты человека, с индуцированием продукции супероксидного аниона и IL-1β. В противоположность этому, Lactobacillus gasseri 9221, клеточная стенка которого нечувствительна к действию мутанолизина, индуцирует только слабую активность в моноцитах человека. На фигуре 2 показано, что продукции IL-1β и TNFα тесно коррелируют (R2=0,95).
Эксперименты in vivo
Активность клеточных стенок молочнокислых бактерий по улучшению сна у кроликов
Эксперименты по исследованию сна проводили на кроликах, используя один из штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus 9223, который давал положительную реакцию в тесте in vitro, и один штамм Lactobacillus gasseri 9221, который давал отрицательную реакцию в тесте in vitro. Исследуемые клеточные стенки вводили путем внутривенной инъекции.
Исследуемые животные представляли собой взрослых самцов новозеландских белых кроликов (Myrtle Rabbitery, Thompson Station, TN) весом от 3,5 до 4,5 кг.
Кроликов оперировали, имплантируя систему регистрации электроэнцефалограмм (ЭЭГ). Данная система позволяла животным двигаться без стеснения. В отдельные дни исследовали каждое животное, получившее либо носитель, либо одно из исследуемых веществ. Таким образом, каждое животное служило в качестве собственного контроля. Для внутривенной инъекции использовали маргинальную ушную вену. Объем инъекции составлял 0,1 мл/кг.
Данные интерпретировали и классифицировали в соответствии с тремя состояниями бодрствования: фаза пробуждения, NREM-фаза (низкочастотная электроэнцефалограмма, электроэнцефалограмма с высокой амплитудой и отсутствие движений тела, что характеризует глубокий хороший сон) и REM-фаза (высокочастотная электроэнцефалограмма, электроэнцефалограмма с низкой амплитудой и случайные движения тела, что характеризует парадоксальный сон). Продолжительность каждой фазы выражали как процент регистрируемого времени в час.
На фигуре 3 показано, что клеточные стенки Lactobacillus acidophilus 9223, введенные при дозах 0,1 мг/кг и 1,0 мг/кг, влияют на сон, увеличивая NREM-фазу и уменьшая REM-фазу. Увеличение NREM-фазы начиналось на втором часу после инъекции и продолжалось на протяжении всего исследования. В противоположность этому, на фигуре 4 показано, что клеточные стенки Lactobacillus gasseri 9221 не оказывали существенного влияния на сон.
Терапевтическое введение
Рассматриваемый материал данного изобретения эффективно вводят млекопитающим, включая людей, перорально. Эффективные количества будут сильно меняться в зависимости от индивидуума, состояния или симптомов пациента, требуемого результата и др. Пероральный прием эффективен для млекопитающих, включая людей, так как переваривание клеточных стенок молочнокислых бактерий ферментами типа мурамидазы естественно происходит в пищеварительном тракте, начинаясь в полости рта и продолжаясь в желудке и кишечнике. Иначе, предварительно переваренные мурамилпептиды можно вводить перорально, путем инъекции или в виде суппозитория. Инъекция может быть внутривенной или внутримышечной. Из-за простоты введения и удобства пациента предпочтителен пероральный способ введения.
Активный агент (мурамилпептиды) растворим в воде. Молочнокислые бактерии, если их вводят как таковые, можно представить в любом фармацевтически приемлемом носителе и предпочтительно как элемент или добавку к пищевому продукту, предпочтительно включающему молоко или подвергнутые брожению молочные продукты. В одном предпочтительном варианте молочнокислые бактерии или предварительно расщепленные мурамилпептиды готовят в йогуртовом продукте. Йогурт может иметь или не иметь вкусовые добавки, и природа самого йогурта, безопасная для находящегося в нем активного агента, не является аспектом данного изобретения. Молочнокислые бактерии полезно вводить перорально в количестве от 1 мг до 1 г/кг веса тела в день. Улучшение сна имеет сложный механизм, и состояние подлежащего лечению пациента будет оказывать влияние на эффективную дозу. Носитель для введения, если введение производят перорально, по существу неограничен при условии, что он не содержит ферментов, расщепляющих мурамилпептиды, или, иначе, не блокирует активность активного агента данного изобретения по стимуляции продукции супероксидного аниона моноцитами, а также продукции цитокинов.
При другом способе определения эффективных количеств эффективная дозировка 1 мг/мл суспензии белков молочнокислых бактерий составляет величину в диапазоне 0,01-100 мл/кг.
Данное изобретение описано в общем виде и со ссылкой на конкретные варианты. Подразумевается, что примеры не являются и не должны толковаться как ограничивающие, если только это специально не указано. У специалистов в данной области будут возникать альтернативы, в частности, в отношении идентификации непатогенных молочнокислых бактерий, разбавителей или носителей, концентраций или суспензий или других аспектов получения. Такие альтернативы входят в объем данного изобретения, если они не исключены при изложении пунктов формулы изобретения, представленной ниже.
Реферат
Изобретение относится к медицине. Способ улучшения качества сна у млекопитающих включает введение им эффективного количества непатогенных молочнокислых бактерий, причем клеточные стенки указанных бактерий гидролизуют мутанолизином, с получением растворимой фракции, содержащей мурамилпептиды. Прием внутрь мурамилпептидов, непосредственно или путем переваривания непатогенных молочнокислых бактерий, способствует сну и улучшает качество сна, в часности, увеличивая фазу сна с небыстрыми движениями глаз. Изобретение позволяет улучшить восстановление при усталости, не вызывает патологических реакций, таких как сверхпродукция цитокинов, а также не дает побочных эффектов, как при приеме барбитуратов и других снотворных. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 ил.
