Антимикробные антибиопленочные композиции и способы их применения - RU2662764C2

Чертежи

Показать все 11 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает преимущество и приоритет предварительной заявки на патент US 61/773912, поданной 7 марта 2013, озаглавленной "АНТИМИКРОБНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ РАНЕВЫХ ИНФЕКЦИЙ"; международной заявки на патент №РСТ/СА2013/050324, поданной 26 апреля 2013, озаглавленной "АНТИМИКРОБНЫЕ-АНТИБИОПЛЕНОЧНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ"; и предварительной заявки на патент US 61/834654, поданной 13 июня 2013, озаглавленной "АНТИМИКРОБНЫЕ-АНТИБИОПЛЕНОЧНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ". Содержание указанных выше заявок на патент тем самым включено явным образом посредством ссылки в подробное описание этого документа.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение может относиться к способам применения антимикробных и антибиопленочных композиций для предупреждения и лечения раневых инфекций. Оно может дополнительно относиться к способам изготовления композиций, содержащих хелатирующие агенты, соли цинка, антимикробные средства и фармацевтически приемлемые эксципиенты, для применения в уходе за раной, дезинфицирующих средствах, косметических средствах и медицинских инструментах/устройствах. Более конкретно, изобретение может относиться к эффективному способу доставки фармацевтически приемлемой композиции, содержащей два или более хелатирующих агентов и соль цинка.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

С микробиологической точки зрения главная функция нормальной неповрежденной кожи человека и животного заключается в контроле популяций бактерий, которые живут на поверхности кожи, и в предупреждении колонизации и поражения нижележащей ткани потенциальными патогенами. Обнажение подкожной ткани (то есть рана) обеспечивает влажную, теплую и питательную среду, которая является подходящей для бактериальной колонизации и пролиферации.

Так как колонизация раны является главным образом полимикробной, вовлекающей многочисленные микроорганизмы, которые являются потенцильно патогенными, любая рана имеет некоторый риск стать инфицированной. В случае инфекции рана не заживает, пациент страдает от ухудшения травмы, а также увеличивается стоимость лечения. Общие практики обработки ран становятся более затратными. Свыше 2% населения США страдает от таких хронических незаживающих ран, и затраты системы здравоохранения США составляют 20 миллиардов долларов в год. Раны у людей, а также у животных представляют собой огромную проблему во всем мире.

Таким образом, озабоченность среди врачей медицинских учреждений относительно риска раневой инфекции является оправданной не только в показателях увеличения травмы для пациентов, но также ввиду его нагрузки на финансовые ресурсы и возросших требований к экономичной практике в системе здравоохранения. Большинство раневых инфекций вызваны Staphylococcus aureus (20%), Staphylococcus epidermidis (14%), Enterococci spp.(12%), Escherichia coli (8%), Pseudomonas aeruginosa (8%), Enterobacter spp. (7%), Proteus spp. (3%), Klebsiella pneumoniae (3%), Streptococci (3%) и Candida albicans (3%).

В ранах часто имеются разнообразные препятствия заживлению. На заживление раны и инфекцию влияет взаимосвязь между способностью бактерий создавать стабильное сообщество в раневой среде и способностью хозяина контролировать такое бактериальное сообщество. Так как бактерии способны быстро создавать свою собственную защитную микросреду (биопленку) после их присоединения к поверхности, способность хозяина контролировать эти организмы, вероятно, снижается, так как сообщество биопленки развивается. В стабильном сообществе биопленки взаимодействия между аэробными и анаэробными бактериями, вероятно, увеличивают их чистый патогенный эффект, усиливая их потенциал вызывать инфекцию и препятствовать заживлению. В течение последних нескольких лет, некоторые связывали биопленки с хроническими ранами. Микроскопия хронических ран показала хорошо организованные биопленки с внеклеточным полимерным веществом, сросшимся вокруг бактериальных колоний, у по меньшей мере 60% хронических ран.

В последние годы имели место многочисленные попытки использовать антибиотики и антимикробные средства для лечения незаживающих, клинически инфицированных ран у людей, а также у животных. Эти антимикробные агенты представляют собой различные химические композиции и могут включать пептиды, антисептики (US 6700032), антибиотики, ионы/соединения серебра (публикация заявки на патент US 2005/0035327), хитозан (публикация заявки на патент US 2006/0210613; US 6998509), нитрофуразон, висмут-тиолы и ксилит (WO 2005/058381).

Имели место различные попытки других создать устройства для ухода за раной, такие как повязки или бандажи, гели и мази, содержащие антимикробные агенты. Например, в US 3930000 раскрыто применение крема с аллантоинатом серебра-цинка для уничтожения бактерий. С микробиологической точки зрения главная функция нормальной неповрежденной кожи человека и животного заключается в контроле популяций бактерий, которые живут на поверхности кожи, и в предупреждении колонизации и поражения нижележащей ткани потенциальными патогенами. Обнажение подкожной ткани (то есть рана) обеспечивает влажную, теплую и питательную среду, которая является подходящей для бактериальной колонизации и пролиферации.

Исторически предполагается, что свойства бактерий, которые вызывают хронические инфекции, аналогичны свойствам бактерий, растущих суспендированными в жидких ростовых средах. Однако исследования последних 20 лет показали, что многие хронические инфекции являются результатом биопленочного способа роста бактерий. Бактерии в биопленке могут быть в 100-1000 раз более устойчивыми к антибиотикам/антимикробным средствам по сравнению с их планктонными эквивалентами. Современные исследования продемонстрировали биопленки как потенциальную причину, по которой не заживают хронические раны (Singh and Barbul, Wound Rep Reg. 16: 1, 2008). Кроме того, James et al. (Рана Rep Reg. 16: 37-44, 2008) в последнее время продемонстрировали наличие биопленок в случаях более 60% бактериальных инфекций, ассоциированных с хроническими ранами, такими как диабетические язвы стопы, варикозные язвы ног и пролежневые язвы.

Хронические раневые инфекции обычно представляют собой персистирующие инфекции, которые медленно развиваются, по-видимому, редко устраняются посредством иммунной защиты, и временно реагируют на антимикробную терапию. Таким образом, существует неудовлетворенная клиническая потребность в разработке продуктов по уходу за ранами как с антибиопленочной, так и с антимикробной активностью для предупреждения и лечения острых, а также хронических ран, которые вовлекают биопленки. Композиция как с антибиопленочной, так и с антимикробной активностью убивает бактерии биопленки, которые являются очень устойчивыми к антибиотикам/антимикробным средствам и к иммунной системе организма, путем ингибирования образования биопленки и/или вслед за разрушением ранее образованной биопленки. Кроме того, также существует потребность в неантибиотических средствах по уходу за ранами или в дезинфицирующей композиции, содержащей признанные безопасными (GRAS) средства.

На скотобойне или на предприятии по переработке мяса существует проблема заражения мяса и оборудования (например, мясорубки, режущих устройств, ломтерезок, миксеров, наполнительных машин или тому подобного) отравляющими пищу микробами. На обычном предприятии по переработке мяса в качестве антибактериального средства во время процесса стерилизации мяса используют гипохлорит натрия. Мясо, такое как туши, погружают в раствор гипохлорита натрия на определенное время. Однако существует проблема безопасности для организма человека из-за продуктов реакции гипохлорита натрия, прилипающих к мясу.

Таким образом, существует потребность в антибактериальном средстве для стерилизации мяса с высокой степенью безопасности для людей и длительным антибактериальным действием. Такое антибактериальное средство будет сохранять мясо свежим дольше и уменьшать или предупреждать разложение продуктов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены композиции и способы предупреждения, обеззараживания или лечения острых и хронических раневых инфекций, или дезинфекции фруктов, овощей, мясных продуктов, мяса и технологического оборудования для пищевой промышленности В одном воплощении изобретения предложена композиция, содержащая (а) один или более хелатирующих агентов и (б) одну или две соли ионов металлов.

В другом воплощении композиция по изобретению содержит: (а) небольшое количество по меньшей мере двух хелатирующих агентов, (б) небольшое количество по меньшей мере одной соли иона металла, где количество каждого из компонентов (а) и (б) является достаточным для образования эффективной противоинфекционной композиции против бактериальных инфекций в ранах и для применения в качестве дезинфицирующих средств.

В еще одном воплощении композиция по изобретению содержит: (а) небольшое количество по меньшей мере двух хелатирующих агентов, (б) небольшое количество по меньшей мере одной соли иона металла и (в) фармацевтически приемлемые эксципиенты.

В еще одном воплощении изобретения предложена противоинфекционная композиция, содержащая два хелатирующих агента и одну или две соли ионов металлов, которые являются эффективными против бактерий и грибов, вызывающих раневые инфекции (инфекции порезов, гематом, послеоперационных ран, рваных ран, ссадин, проколов, резаных ран, огнестрельных ранений, ожогов, пиодермии, атопического дерматита, экземы, пролежневых язв, венозных и артериальных язв ноги, диабетических язв стопы, и т.д.), ассоциированные с муковисцидозом (CF) инфекции, внебольничные или внутрибольничные инфекции или заболевания пищевого происхождения.

Композиции по изобретению могут быть предназначены для применения против одних или более ассоциированных с инфекцией бактерий или дрожжей, выбранных из группы, состоящей из метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA), Staphylococcus epidermidis, коагулазонегативных стафилококков (CoNS), ванкомицин-резистентных энтерококков (VRE), карбапенем-резистентного Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, метициллин-резистентного Staphylococcus pseudintermedius (MRSP), Malassezia pachydermatis, Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157:H7, Candida albicans, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Bacillus spp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Esherichia coli, Salmonella choleraesuis, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Klebsiella spp., Enterobacter spp. и Citrobacter spp.

В еще одном воплощении изобретения предложена противоинфекционная композиция, содержащая по меньшей мере два хелатирующих агента и одну или две соли ионов металлов, которая предназначена для применения против раневых инфекций у животных или ассоциированных с маститом и отитом бактерий и дрожжей.

В одном воплощении хелатирующий агент составляет от примерно 5000 мг/л до примерно 50000 мг/л композиции. В одном воплощении соль иона металла составляет от примерно 1000 мг/л до примерно 10000 мг/л композиции.

Хелатирующие агенты могут быть выбраны из группы, состоящей из EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота), EDDHA (этилендиаминдигидроксифенилуксусная кислота), IDA (иминодиацетат), CDTA (циклогексантранс-1,2-диаминтетрауксусная кислота), HEDTA (дигидроксиэтилэтилендиаминоуксусная кислота), HEIDA (2-гидроксиэтилиминодиуксусная кислота), NTA (нитрилотриацетат), цитрата натрия, цитрата калия, овотрансферрина и лактоферрина. Соли ионов металлов могут быть выбраны выбраны из группы, состоящей из хлорида цинка, лактата цинка, цитрата цинка, глюконата цинка, сульфата цинка, ацетата цинка, иона серебра или сульфадиазина серебра, сульфата серебра, нитрата серебра и карбоната серебра.

В другом воплощении хелатирующие агенты представляют собой EDTA и цитрат натрия, и соль иона металла представляет собой хлорид цинка или сульфат цинка. EDTA может присутствовать в концентрации примерно 10 мг/мл и цитрат натрия может присутствовать в концентрации примерно 10 мг/мл. Хлорид цинка или лактат цинка может присутствовать в концентрации примерно 1 мг/мл.

Композиция может дополнительно содержать один или более ингредиентов, выбранных из группы, состоящей из: воды, цитратного буфера, лимонной кислоты, стабилизирующего агента, ароматизатора, витаминов, минеральных веществ, веществ растительного происхождения, поверхностно-активного вещества, антимикробного пептида, антимикробного средства и регулятора рН.

В изобретении также предложены способы получения подходящей композиции для применения в уходе за раной различными путями, например в виде дезинфицирующего раствора, лосьона, крема, геля, спрея, термообратимого геля-спрея, пасты, бальзама, бандажа, повязки, марли, устройства для орошения ран, обертываний и растворов для обработки сосков методом окунания при лечении мастита.

В изобретении дополнительно предложены способы получения подходящих композиций для дезинфицирующих средств и косметических средств. Дезинфицирующие средства имеют применения в дезинфекции фруктов, овощей, технологического оборудования пищевой и мясоперерабатывающей промышленности, больниц, зернохранилищ, медицинских инструментов и другого промышленного и институционного оборудования. Косметические средства включают шампуни и антимикробные лосьоны и кремы для тела.

В изобретении дополнительно предложены способы предупреждения порчи мяса или обработки мяса, включающие местное использование композиции для мяса или мясных продуктов. Способ может включать одно или более из нанесения покрытия, распыления, орошения, шприцевания, замачивания, промывания, погружения и ополаскивания.

Композиции также могут включать натуральные или синтетические ароматизаторы и красители. В композиции по изобретению также могут быть добавлены загустители, такие как гуаровая камедь, карбопол, полиэтиленгликоль, плюроник F-127, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, ксантановая камедь и другие фармацевтически приемлемые загустители.

Другие композиции будут очевидны специалисту в данной области техники. Композиция по изобретению может включать антибиопленочные ферменты (целлюлаза, бета-N-ацетил-глюконаза, Дисперсии В, папаин, ДНКаза 1 и так далее), антимикробные пептиды, антибиотики (гентамицин, ципрофлоксацин, ампициллин, цефамандола нафат, рифампицин и так далее), антимикробные средства (триклозан, хлоргексидин, соединения четвертичного аммония, серебро, соли серебра, и так далее) и другие антибиопленочные соединения.

В изобретении также может предлагаться применение липосомальной системы доставки или системы доставки в виде наночастиц, которые усиливают стабильность и эффективность противоинфекционных соединений в композициях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл), по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA)

ФИГ. 2 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл), по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus pseudintermedius (MRSP)

ФИГ. 3 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл), по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки Pseudomonas aeruginosa

ФИГ. 4 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,062 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл), по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки Listeria monocytogenes

ФИГ. 5 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл), по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA)

ФИГ. 6 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus pseudintermedius (MRSP)

ФИГ. 7 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл), и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Pseudomonas aeruginosa

ФИГ. 8 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Salmonella choleraesuis АТСС 10708

ФИГ. 9 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Escherichia coli O157:Н7

ФИГ. 10 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл), по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки Escherichia coli O157:Н7

ФИГ. 11 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Staphylococcus epidermidis

ФИГ. 12 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки коагулазонегативного Staphylococci (CoNS-42)

ФИГ. 13 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Streptococcus agalactiae АТСС 12386

ФИГ. 14 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Klebsiella pneumoniae

ФИГ. 15 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Acinetobacter baumannii

ФИГ. 16 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Stenotrophomonas maltophilia

ФИГ. 17 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки ванкомицин-резистентного Enterococci (VRE)

ФИГ. 18 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Enterococcus faecalis

ФИГ. 19 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Proteus mirabilis

ФИГ. 20 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (3 мг/мл), EDTA (0,25 мг/мл) и ZnCl₂ (0,1 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Candida albicans

ФИГ. 21 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (1,5 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,05 мг/мл) по отдельности, и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Malassezia pachydermatis

ФИГ. 22 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую ингибирующее действие цитрата натрия (1,5 мг/мл), EDTA (0,125 мг/мл) и ZnCl₂ (0,05 мг/мл), по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки Malassezia pachydermatis.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Термин "антимикробный" относится к соединению или композиции, которые уничтожают или ингибируют или останавливают рост микроорганизмов, включая, без ограничения, бактерии и дрожжи.

Термин "биопленка" относится к структурированному сообществу микроорганизмов, погруженных в выделяемый ими внеклеточный полимерный матрикс и присоединенных к биотической или абиотической поверхности. Бактерии в биопленках могут быть в 1000 раз более устойчивыми к антибиотикам/антимикробным средствам по сравнению с их планктонными (свободноживущими) эквивалентами.

Термин "образование биопленки" относится к присоединению микроорганизмов к поверхностям и последующему развитию многочисленных слоев клеток.

Термин "антибиопленочный" относится к ингибированию образования бактериальной биопленки и разрушению или рассасыванию ранее образованной биопленки.

Термин "инфекция" относится к инвазии и размножению микроорганизмов, таких как бактерии, вирусы, и паразитов, которые обычно не присутствуют в организме. Инфекция может не вызывать симптомов и являться субклинической, или она может вызывать симптомы и являться клинически выраженной. Инфекция может оставаться локализованной или она может распространяться по кровеносным или лимфатическим сосудам и становиться системной (общеорганизменной). Микроорганизмы, которые обычно живут в организме, не считаются инфекциями.

Термин "рана" относится к такому типу повреждения, при котором кожа разорвана, разрезана или проколота (открытая рана), или когда травма от удара тупым предметом вызывает ушиб (закрытая рана). В патологии, он в частности относится к травмам острыми предметами, нарушениям дермы кожи.

Термин "острая рана" относится к ране, которая недавно образовалась и находится в первой фазе заживления. Острые раны характеризуются по слоям кожи, которые были проколоты или разорваны посредством внешней силы или объекта. Любая острая рана может развиться в хроническую рану, если она не заживала в течение ожидаемого периода времени или как результат плохого снабжения кровью, кислородом, питательными веществами или гигиены. Острые раны должны быть правильно обработаны, чтобы избежать инфекции, воспаления или постоянного давления. Острые раны классифицируют в зависимости от причин на рваные раны, ссадины, проколы, резаные раны, огнестрельные ранения, ожоги, и по типу в соответствии с размером и глубиной (поверхностные или глубокие).

Термин "хроническая рана" относится к ране, которая совсем не заживает сама в течение длительного времени. Хронические раны часто считаются "застрявшими" в одной из фаз заживления раны, и наиболее часто наблюдаются у пожилых людей. Обычно, если рана не заживает, как ожидается, в течение 2-3 месяцев, она считается хронической. Хронические раны включают пролежневые язвы (например, пролежни), артериальные и венозные язвы ног и диабетические язвы.

Термин "дезинфицирующие средства" относится к веществам, которые наносят на неживые объекты для уничтожения микроорганизмов, которые живут на этих объектах. Дезинфекция не обязательно убивает все микроорганизмы, особенно устойчивые бактериальные споры; она менее эффективна, чем стерилизация, которая представляет собой экстремальный физический и/или химический процесс, который уничтожает все формы жизни. Дезинфицирующие средства отличаются от других антимикробных агентов, таких как антибиотики, которые уничтожают микроорганизмы внутри организма, и антисептики, которые уничтожают микроорганизмы на живой ткани. Дезинфицирующие средства также отличаются от биоцидных средств, которые предназначены для уничтожения всех форм жизни, не только микроорганизмов. Дезинфицирующие средства действуют путем разрушения клеточных стенок/мембран микробов или препятствуют метаболизму и росту.

Термин "ингибирование" относится по меньшей мере к уменьшению роста и образования биопленки ассоциированных с раной бактерий.

Термин "млекопитающее" для целей лечения относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, животных из зоопарка, животных для занятий спортом или домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, крупный рогатый скот, свиньи, овцы и так далее.

Термин "предупреждение" относится по меньшей мере к предупреждению состояния, ассоциированного с бактериями, которые встречаются у млекопитающего, особенно когда обнаружено, что млекопитающее предрасположено к такому состоянию, но пока такое состояние не было диагностировано.

Термин "субъект" относится к живому позвоночному, такому как млекопитающее (предпочтительно человек и комнатные животные), нуждающееся в лечении.

Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству композиции, достаточно высокому, чтобы получать значительную положительную модификацию состояния(й) субъекта(ов), подлежащего(их) лечению.

"Превентивное количество", при использовании в данном описании изобретения, включает профилактическое количество, например, количество, эффективное для предупреждения или защиты от ран, кожных инфекций и родственных заболеваний и их симптомов, и количества, эффективные для облегчения или заживления ран, кожных инфекций, родственных заболеваний и их симптомов. При введении пептида, подходящего для применения в способах по изобретению, одновременно с антимикробным средством, пептид и/или антимикробное средство может быть введено в меньшей дозировке, чем дозировка, необходимая при введении антимикробного средства в качестве единственного активного ингредиента. При введении активного ингредиента в более низких дозировках, могут быть уменьшены ассоциированные с этим побочные эффекты.

Термин "лечение" относится к вмешательству, выполненному с целью предупреждения дальнейшего развития или изменения патологии существующего расстройства. Таким образом, "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мероприятиям. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет инфекцию, а также тех, у которых предупреждают инфекцию. Что касается раневых инфекций, "обработка или лечение" предназначены для обозначения по меньшей мере облегчения состояний заживления раны, ассоциированных с бактериальными инфекциями, у субъекта, такого как млекопитающее, включая, без ограничения, человека, которое по меньшей мере частично поражено этим состоянием, и включает, без ограничения, модулирование, ингибирование состояния и/или облегчение состояния.

Термин "соль иона металла" относится к соли иона металла, такой как хлорид цинка, лактат цинка, цитрат цинка, глюконат цинка, сульфат цинка, ацетат цинка, ион серебра или сульфадиазин серебра, сульфат серебра, нитрат серебра и карбонат серебра.

В настоящем изобретении предложены противоинфекционные композиции, проявляющие антимикробную и антибиопленочную активность, содержащие комбинации хелатирующих агентов с другими антимикробными агентами, такими как, например, антимикробные средства/антибиопленочные соединения, соли ионов металлов с гелеобразующими агентами, поверхностно-активные вещества или стабилизирующие агенты.

Новые композиции комбинируют хелатирующие агенты вместе с солями ионов металлов так, чтобы для достижения значительного ингибирования бактериального роста и биопленок использовать меньшие количества хелатирующих агентов и/или солей ионов металлов, чем может требоваться обычно для антимикробной композиции. Можно использовать более высокие концентрации этих соединений, если это желательно для конкретного применения.

Количество хелатирующих агентов для использования в антимикробной композиции по данному изобретению может составлять от 10000 до 100000 мг/л. Верхний предел этого установленного интервала можно использовать для получения концентрированного продукта, который может быть разбавлен перед применением. Для неконцентрированных продуктов количество, подлежащее использованию в данном изобретении, составляет предпочтительно от примерно 5000 до 10000 мг/л. Предпочтительно, интервал представляет собой от примерно 1000 до 5000 мг/л.

Количество используемых хелатирующих агентов должно составлять от примерно 1000 до 5000 мг/л. Верхний предел этого установленного интервала можно использовать, если композиции готовили в виде концентрата. Для неконцентрированных продуктов количество хелатирующего агента, подлежащее использованию в данном изобретении, составляет предпочтительно от примерно 500 до 5000 мг/л. Предпочтительно, интервал равен от примерно 1000 до 3000 мг/л, более предпочтительно от примерно 2000 до 3000 мг/л.

Получение

С помощью одного способа, если составляют двухкомпонентную композицию, содержащую один или два хелатирующих агента и соль иона металла, эти соединения можно комбинировать следующим образом. При хорошем перемешивании хелатирующий агент может быть растворен в воде с последующим растворением соли иона металла. Следует отметить, однако, что порядок добавления может быть обратным.

Кроме того, антимикробные средства/антимикробные пептиды, антибиотики, антибиопленочные соединения, четвертичного аммония и поверхностно-активного вещества также можно предпочтительно комбинировать с хелатирующими агентами в антимикробной композиции. Композиция по изобретению содержит: (а) небольшое количество по меньшей мере одного или двух хелатирующих агентов; (б) небольшое количество соли иона металла или связывающего железо гликопротеина или антимикробного пептида или антибиотика или антибиопленочного соединения; и (в) умеренное количество по меньшей мере одно соединения из группы, состоящей из стабилизирующего агента и/или гелеобразующего агента и/или поверхностно-активного вещества, где количество каждого компонента (а), (б) и (в) является достаточным для образования, в комбинации, эффективной противоинфекционной композиции для предупреждения и лечения острых и хронических раневых инфекций (инфекций порезов, гематом, послеоперационных ран, рваных ран, ссадин, проколов, резаных ран, огнестрельных ранений, ожогов, пиодермии, атопического дерматита, экземы, пролежневых язв, венозных и артериальных язв ног, диабетических язв стоп и так далее).

Концентрацию активных компонентов в композициях можно варьировать по желанию или при необходимости для уменьшения времени, в течение которого композицию по изобретению применяют для предупреждения или лечения раневых инфекций и для дезинфекции. Эти вариации концентрации активных компонентов легко определяются специалистом в данной области техники.

Композиции

Настоящее изобретение может включать уникальные и усиленные противоинфекционные композиции для предупреждения и лечения раневых инфекций, содержащие по меньшей мере два хелатирующих агента и одну соль иона металла.

В одном воплощении композиция, содержащая два хелатирующих агента и соль иона металла, включает антимикробное соединение. Содержащая хелатирующие агенты и соль иона металла композиция с антимикробным и антибиопленочным соединением обладает усиленным ингибирующим действием на рост бактерий, ассоциированных с раневой инфекцией, и образование биопленки. Кроме того, добавление антимикробного соединения к композиции, содержащей хелатирующие агенты и соль иона металла, может сделать композицию эффективной против патогенов, ассоциированных с раневыми инфекциями, и бактериального заражения, служащего причиной заболеваний пищевого происхождения.

В одном воплощении изобретения усиленная антимикробная-антибиопленочная композиция содержит по меньшей мере один или два хелатирующих агента, одну соль иона металла и один или более антимикробных агентов, содержащих антисептики (например, триклозан, соль хлоргексидина, цетилпиридиния хлорид и так далее), антибиотики и бактериоцины (например, низин, эпидермин, галлиденнин (gallidennin), циннамицин, дурамицин, лактицин 481 и так далее) и связывающие железо гликопротеины (овотрансферрин, лактоферрин и серротрансферрин (serrotransferrin)). Дополнительно, композиции по уходу за раной или дезинфицирующие композиции могут содержать ингредиенты, такие как цитрат (например, лимонную кислоту, цитрат цинка, цитрат натрия, цитрат калия и так далее), минеральные вещества (например, минеральные соли, такие как хлорид цинка, глюконат цинка, лактат цинка, цитрат цинка, сульфат цинка, ацетат цинка, серебро, сульфат серебра, сульфадиазин серебра, нитрат серебра, карбонат серебра и так далее) и тритерпеноиды (например, олеаноловую кислоту и урсоловую кислоту) и хитозан.

В одном воплощении композиция содержит антибиотик и один или два хелатирующих агента, а также одну соль иона металла. Антибиотики хорошо известны. Группы антибиотиков включают, но без ограничения, ингибиторы β-лактамов (например пенициллин, ампициллин, амоксициллин, метициллин и так далее), цефалоспорины (например цефалотин, цефамицин и так далее), аминогликозиды (например стрептомицин, тобрамицин и так далее), полиены (например амфотерицин, нистатин и так далее), макролиды (например эритромицин и так далее), тетрациклины (например тетрациклин, доксициклин и так далее), нитроимидазол (например метронидазол), хинолоны (например налидиксовую кислоту), рифамицины (например рифампин) и сульфонамиды (например сульфаниламид), нитроароматические средства (например хлорамфеникол) и пиридины (например изониазид).

В одном воплощении композиция содержит антисептик, один или два хелатирующих агента и одну соль иона металла. Антисептики представляют собой агенты, которые ослабляют или ингибируют рост микроорганизмов на наружных поверхностях тела. Антисептики включают, без ограничения, триклозан, соль хлоргексидина и цетилпиридиния хлорид.

В одном воплощении композиция содержит антибиопленочное соединение, один или два хелатирующих агента и соль иона металла. Антибиопленочные соединения включают, без ограничения, Дисперсии В, ДНКазу I, протеиназу К, апиразу, цис-2-деценовую кислоту, альгинат лиазы, лактоферрин, галлий, целлюлазу и 5-фторурацил.

В одном воплощении композиция является эффективной в ингибировании роста и образование биопленки у бактерий, ассоциированных с раневой инфекцией и заболеванием пищевого происхождения. Композиция также является эффективной в разрушении или рассасывании ранее образованных биопленок, что делает включенные в биопленки бактерии более чувствительными к антимикробному уничтожению. При подходящих условиях окружающей среды, таких как влажность и рН, инфекции можно модулировать, используя воплощения изобретения.

Одно воплощение изобретения также может включать другие фармацевтически приемлемые средства доставки, разбавители и добавки, такие как антиоксиданты, противовоспалительные соединения, витамины, деградирующие ткань ферменты, буферы и растворенные вещества, которые приводят композицию в состояние, изотоничное предполагаемому реципиенту; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества и загустители.

Композиции по уходу за раной

Композиция по изобретению может быть добавлена в целый ряд препаратов, подходящих для нанесения/доставки композиции к ранам, включая, но без ограничения, дезинфицирующие растворы, лосьоны, кремы, гели, спреи, гель-спрей, бандаж, повязки, обертывания, марли, клейкие ленты, лейкопластыри и устройства для орошения ран. Для получения таких препаратов композицию по данному изобретению комбинируют с одним или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Композиции, включающие, без ограничения, фармацевтически приемлемые композиции, содержащие один или два хелатирующих агента и соль иона металла в комбинации с антисептиком, антибиотиком, антимикробном средством, связывающим железо гликопротеином, бактериоцин, внеклеточным матриксом или хитозаном, можно готовить посредством любого известного способа.

В общем, способы изготовления противоинфекционных композиций могут включать комбинирование фармацевтически приемлемого носителя и эффективного количества как хелатирующих агентов, так и соли иона металла с антисептиком, антибиотиком, бактериоцином, антимикробным пептидом или хитозаном.

Хорошо известен целый ряд носителей и эксципиентов, которые можно использовать для изготовления в виде фармацевтического препарата воплощения данного изобретения. Такие фармацевтически приемлемые средства доставки включают, без ограничения, воду, этанол, увлажнители, такие как полипропиленгликоль, глицерин и сорбит, гелеобразующие агенты, такие как производные целлюлозы, блок-сополимеры полиоксипропилен/полиоксиэтилен, карбоксиметилцеллюлоза, плюроник F-127, альгинат натрия, полиэтиленгликоль, загустители, такие как Карбопол™ 934.

Способ лечения

Другой аспект данного изобретения может включать способ лечения раневых инфекций, а также обеззараживание поверхностей раны, а также технологического оборудования пищевой /мясоперерабатывающей промышленности. В общем, раневые инфекции можно лечить посредством нанесения на инфицированную рану пациента эффективного количества одного или более хелатирующих агентов и соли иона металла в комбинации с одним или более антимикробными агентами, эффективными в ослаблении раневых инфекций.

Перед продажей мяса, такого как куриное мясо, говядина и свинина, для употребления в пищу, необходимо остановить или замедлить рост патогенных микроорганизмов, а лучше уничтожить патогенные микроорганизмы, такие как бактерии, которые могут приводить к пищевому отравлению из-за их присутствия в мясе. Таким образом, в изобретении предложен способ предупреждения порчи мяса или его обработки, включающий местное использование композиции по изобретению на мясе или мясных продуктах. Мясо или мясные продукты могут представлять собой одно или более из говядины, свинины, баранины, козлятины, конины, куриного мяса и рыбы. Мясо или мясные продукты могут включать кишки или части кишечника свиней, крупного рогатого скота, овец, коз и лошадей, используемые для изготовления колбасных оболочек. Они могут дополнительно включать коллаген или целлюлозу, используемые для изготовления искусственных колбасных оболочек.

Композиции можно наносить путем одного или более из нанесения покрытия, распыления, орошения, шприцевания, замачивания, промывания, погружения и ополаскивания. Промывание может включать промывание линий воды или линий по переработке мяса и очистку оборудования на мясоперерабатывающих и упаковочных установках.

Для применения в лечении или дезинфекции мяса предпочтительный интервал концентраций ингредиентов может включать:

1) Цитрат натрия: (а) 50000 мг/л - 100000 мг/л, (б) 25000 мг/л - 50000 мг/л, (в) 10000 мг/л - 25000 мг/л, (г) 5000 мг/л - 10000 мг/л и (д) 1000 мг/л - 5000 мг/л.

2) Двунатриевая соль EDTA: (а) 10000 мг/л - 25000 мг/л, (б) 5000 мг/л - 10000 мг/л, (в) 1000 мг/л - 5000 мг/л, (г) 500 мг/л - 1,000 мг/л и (д) 100 мг/л - 500 мг/л

3) Хлорид цинка: (а) 1000 мг/л - 5000 мг/л, (б) 500 мг/л - 1000 мг/л, (в) 100 мг/л - 500 мг/л и (г) 10 мг/л - 100 мг/л.

В одном воплощении один или более хелатирующих агентов и соль иона металла вместе изготавливают в виде фармацевтически приемлемого лекарственного средства, как описано в данном описании изобретения, содержащего носитель и эффективное количество композиции, содержащей один или более хелатирующих агентов и соль иона металла в качестве активных ингредиентов.

Типичным режимом дозирования композиции по настоящему изобретению по уходу за раной является нанесение композиции на поверхность раны субъекта (животного или человека) по меньшей мере один раз или дважды. Согласно данному воплощению, субъект может наносить композицию по изобретению на поверхность раны от одного до трех раз в сутки в зависимости от типа раны и серьезности инфекции. Для животных или комнатных животных композицию по изобретению можно применять в виде лосьона или крема, или геля или спрея, или повязки дважды или трижды в сутки.

В еще одном воплощении изобретения, улучшенная противоинфекционная композиция для ран не имеет каких-либо проблем с резистентностью к антибиотику и вопросов биосовместимости/безопасности. Также, композиция по данному изобретению, содержащая один или два хелатирующих агента (EDTA и цитрат натрия) и соль иона металла (хлорид цинка, или сульфат цинка, или лактат цинка) имеет статус GRAS (признанный безопасным), и все эти ингредиенты представляют собой пищу, а также кормовые добавки.

Настоящее изобретение можно лучше понять со ссылкой на следующие примеры. Данные примеры предназначены представлять собой типичные конкретные воплощения изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и хлорида цинка, по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA)

Бульонную культуру S. aureus выращивали в TSB (триптон-соевом бульоне) в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и вместе (хлорид натрия + EDTA + хлорид цинка), вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленку измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Композиция, содержащая цитрат натрия, EDTA и хлорид цинка, показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA, или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 1).

Пример 2: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и хлорида цинка, по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus pseudintermedius (MRSP)

Бульонную культуру метициллин-резистентного S. pseudintermedius выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и вместе (хлорид натрия + EDTA + хлорид цинка), вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленку измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет ридер. Композиция, содержащая цитрат натрия, EDTA и хлорид цинка, показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA, или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 2).

Пример 3: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и хлорида цинка, по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки Pseudomonas aeruginosa

Бульонную культуру P. Aeruginosa выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и вместе (хлорид натрия + EDTA + хлорид цинка), вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленку измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Композиция, содержащая цитрат натрия, EDTA и хлорид цинка, показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 3).

Пример 4: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и хлорида цинка, по отдельности и в комбинации, на рост и образование биопленки Listeria monocytogenes

Бульонную культуру L. Monocytogenes выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и вместе (хлорид натрия + EDTA + хлорид цинка), вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Композиция, содержащая цитрат натрия, EDTA и хлорид цинка, показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA, или хлорида цинка по отдельности (ФИГ. 4).

Пример 5: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus aureus [MRSA]

Бульонную культуру S. aureus (MRSA) выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия или EDTA или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинации цитрат натрия + EDTA и цитрат натрия + ZnCl₂ показывали усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 5).

Пример 6: Действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки метициллин-резистентного Staphylococcus pseudintermedius (MRSP)

Бульонную культуру MRSP выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂) вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ показывали усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 6).

Пример 7: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на рост и образование биопленки Pseudomonas aeruginosa

Бульонную культуру P. aeruginosa выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночные микропланшеты, содержащие TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок лунки, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинации цитрат натрия + EDTA и EDTA + ZnCl₂ показывали усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 7).

Пример 8: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Salmonella choleraesuis АТСС 10708

Бульонную культуру S. choleraesuis АТСС 10708 выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 8).

Пример 9: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnC₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Escherichia соli Ρ157:H7

Бульонную культуру Е. coli O157:Н7 выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ показывали усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 9).

Пример 10: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂, по отдельности и в комбинации, на Escherichia coli O157:Н7

Бульонную культуру Ε. coli O157:Н7 выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и вместе (хлорид натрия + EDTA + хлорид цинка), вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Композиция, содержащая цитрат натрия, EDTA и ZnCl₂, показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA, или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 10).

Пример 11: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Staphylococcus epidermidis

Бульонную культуру S. epidermidis выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 11).

Пример 12: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на коагулазонегативный Staphylococci (CoNS-42)

Бульонную культуру CoNS-42 выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удалением среды из лунок, ополаскиванием лунки три раза водой и окрашиванием связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, применяя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA, взятым отдельно (ФИГ. 12).

Пример 13: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на Streptococcus agalactiae АТСС 12386

Бульонную культуру S. agalactiae выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 13).

Пример 14: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Klebsiella pneumoniae

Бульонную культуру К. pneumonia выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 14).

Пример 15: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, на Acinetobacter baumannii

Бульонную культуру A. baumannii выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 15).

Пример 16: Ингибирующее действие цитрата анатрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Stenotrophomonas maltophilia

Бульонную культуру S. maltophilia выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, применяя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 16).

Пример 17: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на ванкомицин-резистентный Enterococci (VRE)

Бульонную культуру VRE выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 17).

Пример 18: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Enterococcus faecalis

Бульонную культуру Ε. faecalis выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, применяя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 18).

Пример 19: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на Proteus mirabilis

Бульонную культуру P. mirabilis выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ комбинаций вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя Labsystems Multiskan Ascent микропланшетный ридер. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой, и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты, и оптическую плотность при 630 нм определяли, используя микротитровальный планшет-ридер. Цитрат натрия + EDTA комбинация показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки, по сравнению с цитрат натрия, или EDTA по отдельности (ФИГ. 19).

Пример 20: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ на Candida albicans

Бульонную культуру С. albicans выращивали в TSB в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинация цитрат натрия + EDTA показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия или EDTA по отдельности (ФИГ. 20).

Пример 21: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и комбинаций цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂, и EDTA + ZnCl₂ на Malassezia pachydermatis

Бульонную культуру Malassezia pachydermatis выращивали в декстрозном бульоне Сабуро в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂, вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Комбинации цитрат натрия + EDTA, цитрат натрия + ZnCl₂ и EDTA + ZnCl₂ показывали усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлорида цинка по отдельности (ФИГ. 21).

Пример 22: Ингибирующее действие цитрата натрия, EDTA и ZnCl₂ по отдельности и в комбинации на Malassezia pachvdermatis

Бульонную культуру Malassezia pachydermatis выращивали в декстрозном бульоне Сабуро в течение ночи и использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий TSB в отсутствие и в присутствии каждого соединения (цитрата натрия, или EDTA, или хлорида цинка) отдельно и вместе (натрия хлорид + EDTA + хлорид цинка) вносили посевной материал и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Рост планктонных клеток определяли на основе оптической плотности при 600 нм, используя микропланшетный ридер Labsystems Multiskan Ascent. Биопленки измеряли путем удаления среды из лунок, ополаскивания лунок три раза водой и окрашивания связанных клеток кристаллическим фиолетовым. Затем краситель солюбилизировали при помощи 33% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность при 630 нм, используя микротитровальный планшет-ридер. Композиция, содержащая цитрат натрия, EDTA и ZnCl₂, показывала усиленное ингибирующее действие на образование биопленки по сравнению с цитратом натрия, или EDTA или хлоридом цинка по отдельности (ФИГ. 22).

Реферат

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой композицию для ингибирования роста или образования биопленок бактерий, ассоциированных с раневыми инфекциями, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту в концентрации от 100 до 500 мг/л композиции, и цитрат натрия в концентрации от 1000 до 5000 мг/л композиции. Изобретение обеспечивает эффективное ингибирования роста бактерий за счет неожиданного синергетического эффекта, получаемого при использовании комбинации этилендиаминтетрауксусной кислоты и цитрата натрия при низких концентрациях. 7 н. и 25 з.п. ф-лы, 22 пр., 22 ил.

Формула