Морозостойкие дрожжи и их применение - RU2756307C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к новым морозостойким штаммам пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) и к их применению, например, для приготовления свежих или замороженных продуктов из теста, например, хлеба. Настоящее изобретение относится к морозостойким штаммам пекарских дрожжей, которые могут быть получены, например, из конкретных депонированных штаммов, например, путем скрещивания этих штаммов друг с другом или с другими штаммами Saccharomyces cerevisiae. Настоящее изобретение также относится к способам применения указанных штаммов или к способам приготовления теста или продуктов из теста или дрожжевого теста, а также к применению таких продуктов.

Продукты, удобные для домашнего употребления, и коммерчески доступные полуфабрикаты, замороженное тесто или продукты из теста, например, хлеб, рулеты или кондитерские изделия, становятся все более и более востребованными. В соответствии с этим, все более важным параметром является качество морозостойких пекарских дрожжей. Классические дрожжевые штаммы могут быть использованы для приготовления замороженного теста, но обычно, для приготовления такого теста используется двух-трехкратный избыток дрожжей, что может негативно влиять на запах хлебобулочного изделия.

Кроме того, срок хранения замороженных дрожжевых продуктов значительно превышает срок хранения незамороженных, свежих или сухих дрожжей. Для такого применения, важную роль также играет морозостойкость дрожжей.

Специальные морозостойкие дрожжевые штаммы уже существуют (см., например, патент США 5352606 B1, EP1 209225 A1, EP 1541671 A1), однако, необходимо получить штаммы пекарских дрожжей, которые были бы еще более адаптированы к замораживанию, например, имели бы большую продолжительность жизни и/или обладали бы более ценными свойствами, такими как повышенная феремнтативная активность после замораживания.

Эта проблема может быть решена с помощью настоящего изобретения, а в частности, с помощью заявленного предмета изобретения.

Настоящее изобретение относится к дрожжевому штамму, получаемому из штамма OL-01, депонированного как NCYC 4095, S3-02, депонированного как NCYC 4094, FL-03, депонированного как NCYC 4105, IS-310, депонированного как NCYC 4106, CC-05, депонированного как NCYC 4128 и KF-06, депонированного как NCYC-4129. Дрожжевым штаммом согласно изобретению может быть штамм пекарских дрожжей.

Так, например, штамм согласно изобретению может быть получен путем скрещивания первого штамма, выбранного из группы, состоящей из OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06 и второго штамма Saccharomyces cerevisiae, который может также представлять собой штамм пекарских дрожжей. Для скрещивания могут быть также использованы пивные дрожжи, если желательно использовать морозостойкий штамм, подходящий для пивоварения. Однако, предпочтительно, чтобы обоими штаммами, используемыми для скрещивания, были штаммы пекарских дрожжей. Второй штамм Saccharomyces cerevisiae может быть также выбран из группы, включающей OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06. Так, например, OL-01 может быть использован для скрещивания с OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06 или с другим штаммом пекарских дрожжей. S3-02 может быть использован для скрещивания с OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06 или с другим штаммом пекарских дрожжей. FL-03 может быть использован для скрещивания с OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06 или с другим штаммом пекарских дрожжей. IS-310 может быть использован для скрещивания с OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06 или с другим штаммом пекарских дрожжей. CC-05 может быть использован для скрещивания с OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06 или с другим штаммом пекарских дрожжей. KF-06 может быть использован для скрещивания с OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06 или с другим штаммом пекарских дрожжей. Скрещивание может представлять собой, например, гибридизацию спор со спорами или спор с клетками, или клеток с клетками. Другим штаммом пекарских дрожжей может быть морозостойкий штамм, например, штамм, описанный в патенте США US 5352606 B1, EP 1209225 A1, EP1 541671 A1, такой как FTY-3 (BP FERM 2363). Он может также представлять собой неморозостойкий штамм, обладающий другими специфическими свойствами, например, осмотолерантностью, и этот штамм может быть использован для сообщения указанных специфических желательных свойств дрожжам согласно изобретению. При этом, предпочтительно, чтобы после межвидового скрещивания (например, гибридизации) были проведены один или более раундов отбора на морозостойкость.

Очевидно, что таким штаммом может быть один из депонированных штаммов OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 или KF-06. Предпочтительно, чтобы таким штаммом был OL-01, а более предпочтительно, CC-05.

Настоящее изобретение также относится к штамму пекарских дрожжей согласно изобретению, например, OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 или KF-06, где, предпочтительно, указанным штаммом является CC-05, и где указанный штамм содержит мутации по меньшей мере в двух генах, выбранных из группы, состоящей из:

a) гена YDL248W, обозначенного COS7 и локализованного в хромосоме IV, где мутацией, предпочтительно, является делеция;

b) гена YJR155W, обозначенного AAD10 и локализованного в хромосоме X, где мутацией, предпочтительно, является делеция;

c) гена YDL245C, обозначенного HXT15 и локализованного в хромосоме IV, где мутацией, предпочтительно, является делеция;

d) гена YJR151C, обозначенного DAN4 и локализованного в хромосоме X, где мутацией, предпочтительно, является делеция и/или геномная реаранжировка и/или введение стоп-кодона;

e) гена YDR420W, обозначенного HKR1 и локализованного в хромосоме IV, где мутацией, предпочтительно, является по меньшей мере одна точковая мутация, приводящая к замене аминокислот,

где мутации присутствуют во всех аллелях указанных генов.

Предпочтительно, чтобы дрожжевой штамм содержал мутации в трех или более или в четырех или более или в пяти указанных генах. Наиболее предпочтительно, чтобы дрожжевой штамм содержал все указанные мутации.

Предпочтительно, чтобы штамм согласно изобретению содержал мутации по меньшей мере в двух генах, выбранных из группы, состоящей из:

a) гена YDL248W, обозначенного COS7 и локализованного в хромосоме IV, где мутацией является делеция, расположенная ниже положения 2232 (где делеция имеет, например, длину по меньшей мере 150 пар оснований);

b) гена YJR155W, обозначенного AAD10 и локализованного в хромосоме X, где мутацией является делеция, расположенная ниже положения 727404 (где общая длина делеции(й) составляет, например, по меньшей мере 360 пар оснований);

c) гена YDL245C, обозначенного HXT15 и локализованного в хромосоме IV, где мутацией является по меньшей мере одна делеция, расположенная ниже положения 11657 (где общая длина делеции(й) составляет, например, по меньшей мере 400 пар оснований);

d) гена YJR151C, обозначенного DAN4 и локализованного в хромосоме X, где мутацией является введение одного или двух стоп-кодонов, предпочтительно, в положении аминокислоты 342 (замена серина на стоп-кодон) и/или в положении аминокислоты 53 (замена тирозина на стоп-кодон) и/или по меньшей мере одна неполная делеция и/или геномная реаранжировка, например, между координатами хромосомы X:714902-715267;

e) гена YDR420W, обозначенного HKR1 и локализованного в хромосоме IV, где мутацией является по меньшей мере одна точковая мутация, приводящая к аминокислотным заменам, где указанная мутация, предпочтительно, выбрана по меньшей мере из одной, а предпочтительно, всех мутаций в группе, состоящей из мутации в положении 1308583 и в положении 1308589, которые приводят к замене серина на пролин, и/или мутации в положении 1308951 и в положении 1309390, которые приводят к замене фенилаланина на лейцин,

где мутации присутствуют во всех аллелях указанных генов.

Предпочтительно, чтобы дрожжевой штамм содержал мутации в двух или более, в трех или более, или в четырех или более или в пяти указанных генах. Наиболее предпочтительно, чтобы дрожжевой штамм содержал все указанные мутации.

В контексте настоящего изобретения, точковые мутации, приводящие к аминокислотной замене, предпочтительно, означают изменение биохимических свойств аминокислоты, и предпочтительно, такими мутациями являются неконсервативные мутации (как определено Zhang, J. Mol. Evol. 2000, 50(1): 56-68). Такие точковые мутации могут приводить к функциональной инактивации генного продукта.

Очевидно, что делеции и/или стоп-кодон, присутствующие в анализируемых штаммах, способствуют функциональной инактивации соответствующих генных продуктов, и мутации, приводящие к такой функциональной инактивации, являются предпочтительными в настоящем изобретении. Разумеется, что инактивация генного продукта может быть осуществлена посредством различных мутаций. Следовательно, в одном из вариантов осуществления изобретения, дрожжевой штамм согласно изобретению содержит мутации, приводящие к функциональной инактивации генных продуктов во всех аллелях по меньшей мере в двух (предпочтительно, в трех или более, четырех или более или во всех) нижеследующих генах:

a) в гене YDL248W, обозначенном COS7 и локализованном в хромосоме IV, где мутацией, предпочтительно, является делеция;

b) в гене YJR155W, обозначенном AAD10 и локализованном в хромосоме X, где мутацией, предпочтительно, является делеция;

c) в гене YDL245C, обозначенном HXT15 и локализованном в хромосоме IV, где мутацией, предпочтительно, является делеция;

d) в гене YJR151C, обозначенном DAN4 и локализованном в хромосоме X, где мутацией, предпочтительно, является введение стоп-кодона и/или делеция и/или геномная реаранжировка;

e) в гене YDR420W, обозначенном HKR1 и локализованном в хромосоме IV, где мутацией, предпочтительно, является по меньшей мере одна точковая мутация, приводящая к замене аминокислот.

В соответствии с этим, предпочтительные дрожжевые штаммы согласно изобретению могут быть идентифицированы и дифференцированы из стандартных дрожжевых штаммов путем анализа на присутствие мутаций, определенных в настоящей заявке, например, с помощью ПЦР.

Предпочтительные штаммы пекарских дрожжей согласно изобретению (например, CC-05 или KF-06) содержат по меньшей мере две последовательности, выбранные из группы, состоящей из:

i) последовательности SEQ ID NO: 7 или ее варианта, имеющих замену максимум в трех, а предпочтительно, максимум в двух или максимум в одной паре оснований, где указанная последовательность или один из вариантов указанной последовательности присутствуют в каждом аллеле,

ii) последовательности SEQ ID NO: 8 или ее варианта, имеющих замену максимум в трех, а предпочтительно, максимум в двух или максимум в одной паре оснований, где указанная последовательность или один из вариантов указанной последовательности присутствуют в каждом аллеле и

iii) последовательности SEQ ID NO: 9 или ее варианта, имеющих замену максимум в трех, а предпочтительно, максимум в двух или максимум в одной паре оснований, где указанная последовательность или один из вариантов указанной последовательности присутствуют в каждом аллеле,

где, предпочтительно, указанный штамм содержит все три указанных последовательности. В одном из вариантов осуществления изобретения, указанный штамм является гомозиготным по SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 и гетерозиготным по SEQ ID NO: 7.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, штамм содержит три последовательности, выбранных из группы, состоящей из:

i) последовательности SEQ ID NO: 7 или ее варианта, имеющих замену максимум в одной паре оснований, где указанная последовательность или один из вариантов указанной последовательности присутствуют в каждом аллеле,

ii) последовательности SEQ ID NO: 8 или ее варианта, имеющих замену максимум в одной паре оснований, где указанная последовательность или один из вариантов указанной последовательности присутствуют в каждом аллеле, и

iii) последовательности SEQ ID NO: 9 или ее варианта, имеющих замену максимум в одной паре оснований, где указанная последовательность или один из вариантов указанной последовательности присутствуют в каждом аллеле.

В одном из вариантов осуществления изобретения, указанный штамм содержит две последовательности, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 во всех аллелях, а SEQ ID NO: 7 присутствует по меньшей мере в одном аллеле, где вариант имеет замену в одной паре оснований по меньшей мере в одном другом аллеле.

Указанный дрожжевой штамм согласно изобретению, предпочтительно, является морозостойким и может быть использован в хлебопекарной промышленности, например, для выпечки хлеба.

Настоящее изобретение также относится к штамму пекарских дрожжей согласно изобретению, где указанный штамм способен выживать в условиях, включающих заморажевание и оттаивание с выживаемостью по меньшей мере 1%, где указанные условия могут включать:

a) культивирование дрожжевого штамма в среде YPD в течение 15 часов в шейкерном инкубаторе при 30°C и при 200 об/мин,

b) сбор и ресуспендирование дрожжевой культуры в среде YPD до концентрации OD₆₀₀=5,

c) инкубирование 5 мл дрожжевых суспензий в 50 мл-пробирках (обычно, центрифужных пробирках) при -20°C в течение 48 -72 часов,

d) последущее проведение четырех циклов замораживания/оттаивания, где каждый цикл замораживания/оттаивания проводят в течение 1,5 часа при 30°C и при 200 об/мин и по меньшей мере в течение 1 часа при -20°C,

где выживаемость определяют как число жизнеспособных дрожжевых колоний после проведения указанных циклов замораживания/оттаивания, деленное на число жизнеспособных дрожжевых колоний до проведения указанных циклов замораживания/оттаивания × 100%, и где число жизнеспособных дрожжевых колоний вычисляют путем посева дрожжевых суспензий в десятичном разведении на планшеты с YPD-агаром и инкубирования при 30°C в течение 48 часов.

Дрожжевые штаммы, имеющие выживаемость по меньшей мере 0,5% в указанных условиях, являются предпочтительными морозостойкими штаммами согласно изобретению. Предпочтительно, выживаемость в указанных условиях составляет по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,25%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 1,75%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 3,5% или по меньшей мере 4%, например, 0,5%-4,5%. Авторами настоящего изобретения было показано, что выживаемость дрожжевых штаммов согласно изобретению в указанных условиях составляет по меньшей мере 1,2% или по меньшей мере 1,5%, тогда как выживаемость коммерчески доступных дрожжей для приготовления замороженного теста и морозостойкого штамма FTY3 (FERM BP 2363, см. патент США 5352606 B1) составляет только 0,12% или 0,26% и 0,17%, соответственно (фиг. 1).

Предпочтительно, выживаемость дрожжевого штамма, полученного из любых штаммов OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06, например, путем их скрещивания как описано выше в указанных условиях составляет по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 1,25%, по меньшей мере 1,5%, по меньшей мере 1,75%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 2,5%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 3,5% или по меньшей мере 4%, например, 0,5%-4,5%.

Выживаемость дрожжевого штамма, полученного из любых штаммов OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06, например, путем их скрещивания как описано выше, составляет предпочтительно, по меньшей мере 54%, предпочтительно, по меньшей мере 64%, предпочтительно, по меньшей мере 74%, а более предпочтительно, по меньшей мере 84% от средней выживаемости исходных родительских штаммов.

Настоящее изобретение также относится к способу получения морозостойкого дрожжевого штамма, а в частности, штамма пекарских дрожжей согласно изобретению, где указанный способ включает стадии:

a) скрещивания дрожжевого штамма согласно изобретению, такого как OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06, и второго дрожжевого штамма, выбранного из группы, включающей OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06; и

b) отбора полученных дрожжевых штаммов на морозостойкость и, необязательно,

c) отбора полученных морозостойких дрожжевых штаммов на их ферментативную активность.

Ферментативные свойства дрожжевого штамма согласно изобретению могут быть преиимущественно оценены в жидкой мучной суспензии (LFS), например, методом, кратко описанным ниже, или более подробно описанным в Примере 5. В этом тесте преимущественно оценивают морозостойкость и ферментативные свойства.

Ферментативные свойства могут быть, например, протестированы методом, включающим размножение дрожжевых культур на 5 мл субстрата YPD в течение 15 часов в шейкерном инкубаторе при 30°C и при 200 об/мин, а затем замораживание культур в течение 3 дней при -18°C. Одну культуру от каждого тестируемого штамма сразу анализировали на ферментативные свойства в LFS, например, в жидкой мучной суспензии, не содержащей сахара, как описано в Примере 5. Вкратце, культуры два раза промывали дистилированной водой и инкубировали с LFS в течение 1,5 часа. Через некоторое время, образец LFS образовывал две фазы, то есть, мучной осадок на дне и жидкую фазу в верхней части. Другую тестируемую культуру после замораживания анализировали аналогичным образом. Ферментативные свойства дрожжей оценивали через 90 минут по шкале баллов 0-5 по следующим параметрам:

Время: Дрожжевым штаммам, которые инициировали ферментацию после инкубирования в течение 30 минут, присваивали балл 1, дрожжевым штаммам, которые инициировали ферментацию через 60 минут, присваивали балл 0,5, а дрожжевым штаммам с замедленной инициацией через 90 минут, не присваивали никакого балла.

Пузырьки: Образцам, в жидкой фазе которых не наблюдалось пузырьков, не присваивали никакого балла, образцам с небольшим количеством пузырьков, присваивали балл 0,5, а образцам с большим количеством пузырьков, присваивали балл 1.

Поры: Образцам, не содержащим пор в твердой фазе, не присваивали никакого балла. Образцам с небольшими порами присваивали балл 0,5, а тесту с крупными порами присваивали балл 1. Образцам с крупными соединенными порами присваивали балл 1,5.

Пена: Образцам, не имеющим пены в верхней части жидкой фазы, не присваивали никакого балла. Образцам с тонким слоем пены присваивали балл 0,5, образцам с толстым слоем пены присваивали балл 1, а образцам со слоем пены выше 0,5 см, присваивали балл 1,5.

Предпочтительно, дрожжевой штамм согласно изобретению оценивают на ферментативную активность по баллам по меньшей мере 1, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 после замораживания. Более предпочтительно, снижение ферментативной активности после замораживания по сравнению с ферментативной активностью до замораживания составляет максимум на 2 балла, или максимум на 1,5 балла, или максимум на 1 балл.

Предпочтительно, чтобы дрожжевой штамм, полученный из любых штаммов OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06, например, путем их скрещивания как описано выше, продемонстрировал ферментативную активность после замораживания, которая максимум на 1 балл, а предпочтительно, максимум на 0,5 баллов была бы ниже, чем (средняя) ферментативная активность родительского штамма, а более предпочтительно, чтобы такая активность была бы равна ферментативной активности родительских штаммов, а наиболее предпочтительно, превышала активность родительских штаммов.

Предпочтительно, чтобы дрожжевой штамм, полученный из любых штаммов OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06, например, путем их скрещивания как описано выше, обнаруживал снижение ферментативной активности после замораживания, которая не превышала бы снижение ферментативной активности родительских штаммов (в среднем) более, чем на на 1 балл, а предпочтительно, чтобы такое снижение активности было таким же, как и у родительских штаммов, или более предпочтительно, чтобы такое снижение активности было ниже, чем снижение активности родительских штаммов. Наиболее предпочтительно, чтобы снижение активности вообще не наблюдалось.

Штамм пекарских дрожжей согласно изобретению также преимущественно обладает превосходной ферментативной активностью. Ферментативная активность может быть определена в соответствии с протоколом, описанным в Примере 3, если используется незамороженное тесто, или в Примере 4, если представляет интерес ферментативная активность после замораживания.

Предпочтительно, чтобы ферментативная активность дрожжевого штамма согласно изобретению в незамороженном тесте была по меньшей мере сравнимой (до ±20%) с ферментативной активностью коммерчески доступных дрожжевых штаммов, таких как FTY-3 (BP FERM 2363). Дрожжевой штамм согласно изобретению может также иметь наилучшее отношение ферментативной активности теста, содержащего сахар (в частности, теста с высоким содержанием сахара, например, 11% сахара или более), к ферментативной активности теста без сахара. Авторами настоящего изобретения было показано, что в предпочтительных дрожжевых штаммах согласно изобретению, например, OL-01 или, в частности, CC-05, ферментативная активность теста с высоким содержанием сахара была исключительно высокой, что является уникальным свойством для дрожжевых штаммов, используемых для приготовления замороженного теста, и при этом, предпочтительно, чтобы отношение «ферментативная активность теста с 11% сахара/ ферментативная активность теста без сахара» составляло по меньшей мере 1,2, а предпочтительно, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,7 или по меньшей мере 1,9. Было показано, что OL-01 имеет особенно высокую ферментативную активность в тесте с высоким содержанием сахара, и что, в частности, CC-05 может преимущественно обладать высокой ферментативной активностью в тесте с низким и высоким содержанием сахара.

Что касается ферментативной активности замороженного теста, то, например, штамм согласно изобретению может обладать по меньшей мере 90%, а предпочтительно, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95% ферментативной активности после хранения теста, приготовленного с использованием указанного дрожжевого штамма, при -20°C в течение 4 недель, а предпочтительно, в течение 8 недель по сравнению с ферментативной активностью указанного штамма после хранения теста при -20°C в течение 1 дня.

Альтернативно или дополнительно, штамм может иметь по меньшей мере 75%, предпочтительно, по меньшей мере 78% по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, или по меньшей мере 84% ферментативной активности после хранения теста, приготовленного с использованием указанного дрожжевого штамма, при -20°C в течение 4 недель, при проведении по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или по меньшей мере 25 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения (предпочтительно по меньшей мере 10 циклов замораживания/оттаивания), где тесто переносят в помещение при 25°C (например, на 30 минут), снова замораживают до -20°C (например, по меньшей мере в течение 2 часов) и проводят один цикл замораживания/оттаивания, по сравнению с ферментативной активностью указанного теста после его хранения при -20°C в течение 1 дня.

Дрожжевой штамм согласно изобретению может обладать способностью к ферментации глюкозы и сахарозы, а также, но необязательно, мальтозы, галактозы и раффинозы. Дрожжи могут обладать способностью ассимилировать углерод из глюкозы и сахароза, а также, но необязательно, из мальтозы, галактозы и/или раффинозы, как может быть определено методом, описанным в Примере 2. Обычно, мелибиоза и, необязательно, галактоза и/или раффиноза не могут ассимилироваться. Каждый штамм согласно изобретению продемонстрировал типичный спектр ассимиляции сахара и способности расти в его присутствии.

Настоящее изобретение также относится к дрожжевому продукту, содержащему штамм пекарских дрожжей согласно изобретению, где дрожжевой продукт выбран из группы, включающей спрессованные дрожжи, измельченные дрожжи, кремообразные дрожжи, активные полусухие дрожжи, сухие дрожжи, такие как активные сухие дрожжи, сухие дрожжи в виде полуфабриката или активные сухие дрожжи в виде полуфабриката и замороженные дрожжи. Дрожжевой продукт может иметь содержание твердых веществ 10-99%.

Кремообразные дрожжи, также называемые жидкими дрожжами, используются, главным образом, в хлебопекарной промышленности. Основным преимуществом этого продукта является то, что он может быть непосредственно доставлен в охлажденные контейнеры для хлебопечения и может подаваться с помощью автоматического насоса в дозируемых количествах. Кремообразные дрожжи должны храниться на холоде, а содержание сухих веществ должно составлять приблизительно 20% (T. Boekhout (Author, Editor), V. Robert (Editor), Yeasts in Food: Beneficial and Detrimental Aspects, Woodhead Publishing Series in Food Science, Technology and Nutrition, 2003, page 297).

Спрессованные дрожжи, также называемые свежими спрессованными дрожжами, приготавливают из кремообразных дрожжей. Фильтрация с использованием фильтра-пресса или роторного вакуумного фильтра обычно применяется для удаления части воды, содержащейся в кремообразных дрожжах. Содержание сухих веществ этого продукта варьируется от 28 до 35% и зависит от страны и привычек хлебопеков. Спрессованные дрожжи с низким содержанием сухих веществ имеют более темный цвет и замес с достаточно упругой консистенцией. При высоком содержании сухих веществ, спрессованные дрожжи приобретают беловатый оттенок и быстрее крошатся. Свежие дрожжи должны храниться в холодных помещениях, например, при температуре приблизительно 4°C или менее, но они могут быть также замороженными. При нарушении холодильной цепи и при повышении температуры, свежие дрожжи быстро теряют свою активность. Этот продукт может быть получен в различных формах, таких как небольшие кубики для домашней выпечки, блоки по 500 граммов или 1 кг и пакеты по 25 кг. Срок хранения такого продукта составляет приблизительно 5 недель (T. Boekhout (Author, Editor), V. Robert (Editor), Yeasts in Food: Beneficial and Detrimental Aspects, Woodhead Publishing Series in Food Science, Technology and Nutrition, 2003, Page 297). Спрессованные дрожжи, предпочтительно, представляют собой дрожжи согласно изобретению, а в частности, дрожжи для промышленного применения.

Измельченные дрожжи представляют собой свежие дрожжи, разрезанные на кусочки неправильной формы приблизительно 1 см × 5-10 см, а затем упакованные в пакеты весом 25-50 фунтов, и хранящиеся в холодильнике для гарантии их стабильности в процессе хранения приблизительно в течение 4 недель. Несмотря на эти предупредительные меры, потеря ферментативной активности на 3-5% в неделю при 5-8°C является неизбежной, а поэтому упакованные продукты могут быть также заморожены (Byong H. Lee, Fundamentals of Food Biotechnology, 2014, Wiley-Blackwell, page 184).

Активные полусухие дрожжи имеют содержание твердых веществ 70-80% (масс/масс). Они обычно хранятся при 0-6°C, но могут быть также заморожены.

Активные сухие дрожжевые продукты обычно имеют содержание твердых веществ 90% (масс/масс) или более. Все формы активных полусухих или сухих дрожжей могут храниться при комнатной температуре или в холодильнике. Замораживания обычно не требуется даже при длительном хранении, но оно все же возможно. Эти продукты, предпочтительно, упаковывают в вакууме или в атмосфере инертного газа (такого как азот).

Дрожжевые штаммы согласно изобретению могут быть также использованы для приготовления сухих дрожжевых продуктов, то есть, активных сухих дрожжей (ADY), сухих дрожжей в виде полуфабрикатов (IDY), активных сухих дрожжей в виде полуфабрикатов (ADY в виде полуфабрикатов) и защищенных активных сухих дрожжей (PADY). Спрессованные брикетированные дрожжи могут быть обработаны технологическими добавками или антиоксидантами перед сушкой, а затем подвергнуты экструзии с получением нитей, напоминающих спагетти. После нарезания нитей длиной до 1,5-3 см, их сушат, например, в туннельной сушилке типа конвейерной ленты, например, в сушилке с жидким слоем. Путем сушки такого типа получают ADY. Для активации ADY необходимо провести отдельную стадию регидратации водой.

ADY в виде полуфабрикатов с более высокой активностью, чем ADY, требуют более осторожной сушки, которую осуществляют в псевдоожиженном слое или путем подачи воздуха. Высокая активность ADY в виде полуфабрикатов обусловлена высокой пористостью, а поэтому этот продукт не подвергают регидратации и обычно добавляют непосредственно в тесто. PADY содержит эмульгаторы, и эти дрожжи подвергают сушке особым способом до уровня влажности 5-6%. Использование антиоксидантов в этом продукте позволяет снижать побочное действие кислорода и избежать необходимости хранения в специальной упаковке (Karel Kulp‏, Klaus Lorenz (ed.), Handbook of Dough Fermentations, 2003, CRC Press, ISBN 9780824742645).

Дрожжевым продуктом могут быть замороженные дрожжи, например, замороженные активные полусухие дрожжи, имеющие 70-85%, а в частности, 74-80% (масс/масс) сухого вещества, например, в форме сухой замороженной «лапши». Замороженные активные полусухие дрожжи могут быть непосредственно добавлены в муку, без предварительного оттаивания. Замороженные дрожжи могут также представлять собой замороженный активный полусухой дрожжевой продукт, имеющий диаметр менее, чем 3 мм, где содержание сухого вещества составляет от 70 до 85% (масс/масс), предпочтительно, 70-80% (масс/масс), как описано в EP 1209225 A1 и CA 1299435. Замороженные дрожжи могут быть использованы, например, для приготовления замороженного теста. Замороженные дрожжевые продукты являются стабильными в течение по меньшей мере четырех недель, а предпочтительно, в течение по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 12 недель, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 20 недель, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 года или по меньшей мере 2 лет.

Настоящее изобретение также относится к способу приготовления дрожжевого продукта, включающему культивирование штамма пекарских дрожжей согласно изобретению и, необязательно замораживание дрожжей.

Дрожжевые продукты согласно изобретению содержат дрожжевой штамм согласно изобретению. Эти продукты могут дополнительно содержать другие пекарские дрожжи, то есть, в виде смеси различных дрожжевых штаммов.

Настоящее изобретение также относится к тесту или к продуктам из теста, содержащим штамм пекарских дрожжей или дрожжевой продукт согласно изобретению. Концентрация используемых дрожжей (для спрессованных дрожжей, имеющих по меньшей мере 30% сухого вещества) может составлять, например, 0,5%-10% (по массе муки), 1-7% или 2-5%. Такая концентрация обычно сравнима с концентрацией традиционных дрожжей, используемых для приготовления соответствующих продуктов, или меньше этой концентрации. В частности, если дрожжи и/или тесто или продукты из теста являются замороженными, то, предпочтительно использовать меньшую концентрацию дрожжей, а более предпочтительно, приблизительно 30-90%, 30-85%, 40-80%, 45-75% или 50-70% от классического рекомендованного количества, так, чтобы это значительно не влияло на консистенцию полученного продукта, выпеченного из теста.

Тесто приготавливают путем смешивания дрожжей согласно изобретению по меньшей мере с одним ингредиентом, выбранным из группы, включающей муку и жидкость, с добавлением или без добавления сахара. Обычно, дрожжи смешивают по меньшей мере с мукой и жидкостью. Типичные ингредиенты, используемые в тесте, а также подходящие концентрации хорошо известны специалистам. Добавляемой жидкостью могут быть, например, вода, молоко, пахта, пиво и, необязательно, масло. Вместо молока могут быть использованы вода и сухое молоко.

Другими необязательными ингредиентами теста являются, например, сахар, соль, яйца и/или жир. Предпочтительно, чтобы тесто содержало соль. Вместо свежих яиц может быть использован яичный порошок. Жир может представлять собой, например, растительное масло, сливочное масло или маргарин. Тесто может также содержать и другие ингредиенты, такие как заквашенное тесто или нетестовая смесь, содержащие по меньшей мере один микроорганизм, специи (например, корицу, ваниль, перец, чеснок и/или зелень), измельченную лимонную кожуру, улучшитель для хлебобулочных изделий, фермент и/или соль. Фрукты и/или овощи, например, в сухом или перетертом виде могут представлять собой дополнительные ингредиенты теста, например, изюм для приготовления сладких булочек или пирожных. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, например, для приготовления хлеба или рулетов используют заквашенное тесто.

Тесто или продукт из теста могут содержать, например, 0-40% сахара, а в частности, это тесто может не содержать сахара, может иметь низкое содержание сахара (1-10% сахара) или высокое содержание сахара (более, чем 10% сахара, а предпочтительно, до 25% или более). Авторами настоящего изобретения было показано, что дрожжи согласно изобретению имеют ферментативную активность, сравнимую с ферментативной активностью дрожжей для приготовления теста без сахара и теста с низким содержанием сахара, а также коммерчески доступных дрожжевых штаммов, и эти дрожжи, а в частности, OL-01, имеют очень высокую ферментативную активность в тесте с высоким содержанием сахара. Таким образом, дрожжевые штаммы, предпочтительно, используются для приготовления теста с высоким содержанием сахара, а в частности, например, для приготовления замороженного теста с высоким содержанием сахара. Это тесто содержит, но необязательно, до 25% жира.

При использовании замороженного дрожжевого продукта согласно изобретению, а в частности, если указанный дрожжевой продукт имеет небольшой размер частиц, то для приготовления теста, оттаивания не требуется, но замороженный продукт может быть непосредственно добавлен к ингредиентам теста или по меньшей мере к одному другому ингредиенту (например, к муке). Однако, замороженный дрожжевой продукт может быть сначала оттаян при температуре 0-37°C, например, при температуре приблизительно 0-8°C или при комнатной температуре (предпочтительно, 20-25°C), или при 30-37°C, или с постадийным повышением температуры, например, сначала приблизительно до 0-8°C, а затем до комнатной температуры или до более высоких температур.

Мука представляет собой порошок, полученный путем измельчения необработанного зерна злаковых культур или других семян или корней. Обычно, мука представляет собой пшеничную муку, ржаную муку, муку из спельты, кукурузную муку, овсяную муку, гречневую муку, муку без глютена или рисовую муку или их смесь, а предпочтительно, пшеничную муку. Мука может быть выбрана из группы, включающей кондитерскую муку, муку универсального применения, сильную муку, очень сильную муку и/или темную пшеничную муку или муку любого типа, классифицированную по содержанию микроэлементов в соответствии с DIN 10355, например, типа 405, типа 550, типа 650, типа 812, типа 1050 и/или типа 1600. Мука может содержать аскорбиновую кислоту. Мука может быть обработана, но необязательно, отбеливающими агентами и/или агентами для созревания. Если тесто содержит сахар, а в частности, если используется тесто с высоким содержанием сахара, то кондитерскую муку (соответствующую типу 405) или муку типа 550 получают из пшеницы.

Настоящее изобретение также относится к замороженному тесту или к продуктам из замороженного теста. Слово «замороженный» означает хранящийся при -18°C или менее или при -20°C. Тесто может быть заморожено путем его переноса в холодильник с соответствующей температурой, или, предпочтительно, с применением методов более быстрого снижения температуры теста, например, в холодильнике с продувкой.

В одном из вариантов осуществления изобретения, замороженное тесто или продукт из теста получают путем смешивания замороженного дрожжевого продукта согласно изобретению, необязательно после оттаивания, по меньшей мере с одним из вышеописанных ингредиентов теста.

В другом варианте осуществления изобретения, замороженное тесто или продукт из теста получают путем смешивания кремообразных дрожжей или спрессованного дрожжевого продукта согласно изобретению (предпочтительно, спрессованного дрожжевого продукта) по меньшей мере с одним из вышеописанных ингредиентов теста.

В контексте настоящего изобретения, продуктом из теста является сформованный кусок теста. Такой продукт может быть сырым, полусырым (то есть, частично выпеченным) или выпеченным. Он может быть также замороженным, а в частности, он может представлять собой сырой замороженный кусок теста. Полусырые или выпеченные куски теста могут быть также замороженными, но морозостойкость дрожжей является наиболее релевантной, если сырое тесто или продукты из этого теста являются замороженными. В одном из вариантов осуществления изобретения, продуктом из теста является продукт, выпеченный из теста, а именно, продукт, выпеченный из замороженного теста, или, предпочтительно, продукт, выпеченный из замороженного теста согласно изобретению.

Тесто или продукт из теста согласно изобретению могут представлять собой тесто для выпечки хлеба, тесто для рулетов, тесто для пиццы, тесто для пирожных, тесто для круассанов, тесто для кренделей, тесто для бубликов, а предпочтительно, уже готовые изделия, такие как хлеб, рулеты, пицца, круассаны, крендели, бублики и пирожные. Хлеб может представлять собой, например, багет, чиабатту, хлеб из темной пшеничной муки, хлебную смесь, ржаной хлеб или сладкий хлеб, например, плетенку из дрожжевого теста. Пирожными являются, например, пироги, круглые пышки или печенье.

Настоящее изобретение также относится к способу приготовления теста или продуктов из теста согласно изобретению, где указанный способ включает стадии:

а) смешивания штамма пекарских дрожжей согласно изобретению или дрожжевого продукта согласно изобретению по меньшей мере с одним ингредиентом, выбранным из группы, включающей муку и жидкость, такую как вода или молоко, с добавлением или без добавления сахара.

Затем могут быть добавлены и другие ингредиенты, например, описанные выше, в результате чего получают тесто. Стадия смешивания может представлять собой смешивание всех ингредиентов теста. Альтернативно, при постадийном смешивании, дрожжи сначала смешивают с одним из ингредиентов, например, с мукой или с жидкостью, где указанная жидкость, предпочтительно, имеет температуру 20-37°C, если используются активные сухие дрожжи и, предпочтительно, 0-25°C, если используются спрессованные дрожжи, в результате чего получают первую смесь, и например, через 0-30 минут, эту первую смесь смешивают с другими ингредиентами. Стадия смешивания обычно включает замешивание теста, например, в течение 1-15 минут, а предпочтительно, 2-10 минут. Замешивание влияет на консистенцию теста, что обусловлено образованием глютеновой сети. Замешивание обычно осуществляют при комнатной температуре, но эту температуру можно также поддерживать, например, при 16°C-30°C, и температуру теста можно также поддерживать, например, при 16-37°C. В частности, для приготовления замороженного теста, температура должна быть ниже 25°C, например, приблизительно 16-23°C.

Способ приготовления теста или продуктов из теста согласно изобретению включает, но необязательно, одну или более дополнительных стадий, выбранных из группы, включающей:

b) формование теста;

c) расстойку теста;

d) замораживание теста;

e) оттаивание теста; и/или

f) выпекание теста.

Стадии b), c) и d) могут быть осуществлены в любом порядке, а повторные стадии расстойки могут быть проведены для получения оптимального продукта. Если осуществляют стадию e), то ее проводят после стадии d). Стадию f) обычно осуществляют в последнюю очередь, но после нее может быть проведена стадия замораживания и, необязательно стадия оттаивания.

В контексте настоящего изобретения, расстойка означает процесс, при котором дрожжи превращают ферментируемые сахара, присутствующие в тесте, в диоксид углерода и этанол. Это приводит к увеличению объема теста и влияет на его реологические свойства, например, консистенция полученного продукта становится нежнее. Расстойку обычно осуществляют при температуре 20°C-37°C, предпочтительно, при комнатной температуре или приблизительно при температуре 25°C. Повышенная влажность является предпочтительной, например, относительная влажность, предпочтительно, составляет по меньшей мере 75% или по меньшей мере 85%. Достижение желательных свойства продукта и, соответственно, условий расстойки зависит от типа продукта.

Поскольку дрожжи согласно изобретению имеют ферментативную активность, сравнимую с ферментативной активностью коммерчески доступных дрожжей, или более высокую ферментативную активность, то условия могут быть легко оптимизированы самим специалистом.

Расстойку теста, например, в течение 15-90 минут, обычно осуществляют после замешивания. Перед расстойкой, тесто может быть сформовано. Однако, обычно, после стадии расстойки, тесто снова обрабатывают или обминают и, необязательно, формуют. После этого может быть проведена другая стадия расстойки, например, в течение 15-90 минут.

Сырой или замороженный продукт из теста может вообще не подвергаться расстойке, либо он может быть подвергнут полной или частичной расстойке. В соответствии с этим, замораживание может быть осуществлено после замешивания, после частичной расстойки (обычно после формования) или после полной (максимальной) необходимой расстойки. Замораживание предпочтительно, осуществляют после полной необходимой расстойки. В соответствии с настоящим изобретением, для удобства, предпочтительно, чтобы замороженным был сформованный продукт из теста, а не тесто до его формования.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, для приготовления замороженных продуктов из теста, не подвергнутого расстойке, продукты из теста замораживают после формования. После оттаивания, это тесто может быть подвергнуто расстойке с последующим его выпеканием.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, для приготовления замороженных продуктов из теста, подвергнутого расстойке или по меньшей мере частичной расстойке, продукты из теста формуют, подвергают расстойке (приблизительно на 60-100%, а обычно приблизительно на 70-80% от типичного общего требуемого объема расстойки) и замораживают. После оттаивания и, необязательно, после дополнительной расстойки, это тесто может быть подвергнуто выпеканию.

После замораживания, тесто или продукт из теста могут быть оттаяны до выпекания (при 0°C-37°C, предпочтительно, при 20°C-32°C), и необязательно, может быть проведена стадия расстойки. Эта стадия может быть особенно подходящей для приготовления сильного теста, такого как тесто, содержащее сахар и/или жир. Однако, при использовании дрожжей согласно изобретению, в этом нет необходимости, то есть, тесто или продукты из теста могут представлять собой замороженное тесто или продукты из теста, подходящие для выпекания без оттаивания, например, замороженное тесто в форме багета.

Предпочтительно, чтобы замороженное тесто или продукты из теста согласно изобретению были стабильными в течение по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 8 недель, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере одного года при температуре замораживания -18°C. В контексте настоящего изобретения, стабильность означает, что данный продукт еще пригоден для употребления в пищу и сохраняет свойства, по меньшей мере сравнимые со свойствами соответствующего свежего продукта.

В любое время после формования, например, после формования, после расстойки, после замораживания, после оттаивания или после выпекания могут быть проведены дополнительные стадии украшения изделия, например, стадии нанесения декорирующих агентов, такой как глазирование путем добавления яичного желтка, молока, сахара, мармелада или их смеси или фруктов.

Продуктами из теста согласно изобретению могут быть также хлебобулочные изделия. Выпекание может быть осуществлено путем обработки паром, например, при температуре приблизительно 160-220°C в течение 15-60 минут или без такой обработки. Такие условия, как температура и время выпекания зависят от свойств продукта (например, типа теста и его размера и нужной консистенции мякиша), и эти условия могут быть легко определены специалистом. В контексте настоящего изобретения, хотя выпекание обычно осуществляют в печи, однако, оно может быть осуществлено и другими способами нагревания продукта из теста до температур инактивации дрожжей, например, такими как обработка паром, нагревание в микроволновой печи, обжаривание, запекание и/или варка.

Тесто или продукт из теста согласно изобретению могут быть также упакованы, например, в банку или фольгу. Упаковка может быть осуществлена в условиях вакуума или в модифицированной атмосфере, предпочтительно, с пониженным содержанием кислорода или в отсутствии кислорода. Упаковка может включать инструкции по приготовлению готового продукта из теста, например, инструкции по проведению дополнительных стадий приготовления теста и выпекания этого теста.

Так, например, замороженный продукт из теста может быть получен путем смешивания ингредиентов, замешивания, расстойки теста (например, в течение 15-30 минут при комнатной температуре, а предпочтительно, приблизительно при 25°C), повторной обработки и формования теста, и необязательно, дополнительной расстойки теста при комнатной температуре, а предпочтительно, приблизительно при 25°C, в течение 15-45 минут, например, в течение 30-40 минут, и замораживания (например, при температуре от -18°C до -20°C). Перед выпеканием, замороженный продукт из теста может быть оставлен для оттаивания (например, при 32°C, и при относительной влажности 75%) по меньшей мере на 5 минут или по меньшей мере на 10 минут, например, приблизительно на 30-45 минут. Предпочтительно, чтобы такое оттаивание было достаточным для достижения консистенции теста, гарантирующей максимальный объем продукта. Однако, продукт из теста может выпечен непосредственно из теста, взятого из холодильника без оттаивания.

Настоящее изобретение также относится к применению штамма пекарских дрожжей согласно изобретению или дрожжевого продукта согласно изобретению для приготовления теста или продуктов из теста, где такое тесто или продукты из теста могут представлять собой замороженное тесто или продукты из этого теста.

Настоящее изобретение более подробно описано на нижеследующих примерах, которые приводятся для иллюстрации настоящего изобретения, но не рассматриваются как ограничение объема изобретения. Все цитируемые здесь документы во всей своей полноте и во всех целях вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Фиг. 1 Выживаемость дрожжевых штаммов согласно изобретению по сравнению с выживаемостью стандартных коммерчески доступных дрожжевых штаммов. Штаммы Saccharomyces cerevisiae OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06, коммерчески доступный штамм пекарских дрожжей для приготовления замороженного теста и морозостойкий штамм FTY-3 (FERM BP 2363 (US 5352606 B1)) культивировали в среде YPD, собирали и ресуспендировали в свежей среде YPD до концентрации OD₆₀₀=5. Дрожжевые суспензии инкубировали при -20°C в течение 48-72 часов, а затем подвергали четырем циклам замораживания/оттаивания (1,5 часа при 30°C/по меньшей мере 1 час при -20°C). Число жизнеспособных дрожжей определяли путем посева дрожжевых суспензий в десятичном разведении на планшеты с YPD-агаром и инкубирования при 30°C в течение 48 часов. Выживаемость определяли по следующей формуле: Выживаемость=Конечное число дрожжевых колоний/начальное число дрожжевых колоний × 100%.

Фиг. 2. Объем замороженных образцов дрожжевого штамма согласно изобретению для приготовления теста без сахара в виде небольшого батона по сравнению с объемом стандартных коммерчески доступных дрожжевых штаммов.Штамм культуры Saccharomyces cerevisiae OL-01, полученный как описано в Примере 3, коммерчески доступные пекарские дрожжи для приготовления замороженного теста и коммерчески доступные пекарские дрожжи для универсального применения использовали для приготовления теста без сахара. Полученное тесто разделяли на части по 50 г, формовали и замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет, а затем хранили в холодильнике при -20°C до 4 недель. В день помещения на хранение при -20°C и после хранения в течение 4 недель при -20°C при проведении циклов замораживания/оттаивания после приготовления теста, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут, подвергали расстойке и выпекали в формах для выпечки небольших батонов. Кажущийся объем небольших батонов измеряли после охлаждения до комнатной температуры методом вытеснения твердых веществ, применяемым для измерения объема нежелательных твердых веществ (Physical Properties of Foods, Serpil Sahin‏, Servet Gülüm Sumnu‏, page 20) с использованием семян мака.

Фиг. 3. Объем замороженных образцов дрожжевого штамма согласно изобретению для приготовления теста перед расстойкой в виде небольшого батона по сравнению с объемом стандартных коммерчески доступных дрожжевых штаммов. Образцы теста без сахара (50-80 г), полученные как описано в Примере 4,2, после их хранения в течение 1 дня при -20°C и после хранения в течение 4 недель при 20°C в виде замороженных небольших батонов перед расстойкой выпекали непосредственно без проведения стадии оттаивания как описано в Примере 7.2. Кажущийся объем небольших батонов измеряли после охлаждения до комнатной температуры методом вытеснения твердых веществ, применяемым для измерения объема нежелательных твердых веществ (Physical Properties of Foods, Serpil Sahin‏, Servet Gülüm Sumnu‏, page 20) с использованием семян мака.

Примеры

Пример 1. Новые дрожжевые штаммы и их морфология

Новые морозостойкие штаммы Saccharomyces cerevisiae OL-01 (NCYC 4095), S3-02 (NCYC 4094), FL-03 (NCYC 4105), IS-310 (NCYC 4106), CC-05 (NCYC 4128) и KF-06 (NCYC 4129) отбирали и депонировали в NCYC в соответствии с Будапештским договором. FL-03 и IS-310 получали путем скрещивания потомства OL-01 и S3-02. CC-05 получали путем скрещивания потомства OL-01 и S3-02.

Каждый дрожжевой штамм размножали в среде YPD (см. Таблицу 2) и наблюдали под микроскопом для оценки морфологических свойств. Дрожжевые колонии культивировали на YPD-агаре (см. Таблицу 2) и наблюдали для оценки морфологических свойств.

Споруляция: дрожжи, культивируемые на планшетах с YPD-агаром, снова высевали на планшеты с SPO-агаром (см. Таблицу 2) и инкубировали при 25°C в течение 7-10 дней. Споруляцию подтверждали путем наблюдения под микроскопом.

Таблица 1: Морфологические свойства новых дрожжевых штаммов

Таблица 2: Состав среды

Другие морозостойкие дрожжевые штаммы согласно изобретению могут быть получены путем скрещивания любых OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06.

Морозостойкие дрожжевые штаммы могут быть получены стандартными методами улучшения качества дрожжей без GMO, такими как неспецифический мутагенез, и методами скрещивания, включающими половую рекомбинацию и перестановку генома. Эти методы подробно описаны в двух статьях: Giudici P. Solieri L. Pulvirenti A M.. Cassanelli S. 2005 Appl Microbiol Biotechnol 66: 622-628. Steensels J. Snoek T., Meersman E, Nicolino M. P., Voordeckers K. M & Verstrepen K. J. 2014 FEMS Microbiol Rev 38 947-995.

Указанные дрожжи могут быть получены посредством неспецифического мутагенеза с использованием мутагенов (например, химического мутагена или УФ) для продуцирования генетического разнообразия в дрожжевой популяции с последующим отбором на нужный признак как описано Matsutani, K., Y. Fukuda, K. Murata, A. Kimura, I. Nakamura and N. Yajima. 1990. J. Ferment. Bioeng. 70:275-276.

Альтернативно, половую рекомбинацию, которая включает скрещивание дрожжевых штаммов, обычно проводят с применением одного из нижеследующих методов: культивирование односпоровой культуры после прорастания как описано Nakagawa, S. and Ouchi, K. 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60, 3499-3502, и культивирование рандомизированных гамет как описано Giudici P. Solieri L. Pulvirenti A M.. Cassanelli S. 2005 Appl Microbiol Biotechnol 66: 622-628.

Кроме того, указанные дрожжи могут быть получены методом перестановки генома, проводимым путем повторяющейся рекомбинации между множеством родителей с последующим скринингом как описано Paolo Giudici, Lisa Solieri, Andrea M. Pulvirenti, Stefano Cassanelli 2005 Appl Microbiol Biotechnol 66: 622-628.

Метод скрининга на морозостойкость может облегчать проведение каждого метода скрещивания. При этом, могут быть протестированы штаммы на морозостойкость путем оценки их жизнеспособности после повторного проведения циклов замораживания/оттаивания (до 200) в тесте или после замораживания в среде YPD как описано Teunissen A, et al. 2002. Applied and Environmental Microbiology 68: 4780-4787 и Tanghe A, et al., 2002. Applied and Environmental Microbiology 68 5981-5989.

Пример 2. Ассимиляция источника углерода

Ассимиляцию углеводов анализировали следующим образом. Штаммы Saccharomyces cerevisiae OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05 и KF-06 культивировали в среде YPD в течение 15 часов при перемешивании (200 об/мин), собирали и два раза промывали стерилизованной водой путем центрифугирования, а затем ресуспендировали до концентрации 0,5 OD/мл в среде YNB с различными углеводами (2% масс/об) соответственно. Суспензии инкубировали при 30°C с перемешиванием при 200 об/мин в течение 18 часов (OL-01, S3-02, FL-03, IS-310) или при 37°C с перемешиванием при 100 об/мин в течение 20 часов (CC-05, KF-06). Мутность культур оценивали по оптической плотности на 600 нм для подтверждения роста дрожжей через 13 часов и через 18 часов. Оценку способности к росту вычисляли по сравнению с ростом на глюкозе и в отсутствии какого-либо сахара. Типы сахаров, при которых дрожжевой штамм достигал концентрации по меньшей мере 80% по сравнению с ростом на глюкозе, обозначали «+». Типы сахаров, при которых дрожжевой штамм достигал концентрации, которая более, чем на 20% превышала его концентрацию по сравнению с ростом в отсутствии любого сахара, и которая менее, чем на 80% превышала его концентрацию по сравнению с ростом на глюкозе, обозначали «±». Типы сахаров, при которых концентрация дрожжевого штамма не более, чем на 20% превышала его концентрацию в отсутствии любого сахара, обозначали «-».

Таблица 3. Ассимиляция источника углерода новыми дрожжевыми штаммами

Этот эксперимент показал, что дрожжи согласно изобретению имели типичный паттерн ассимиляции углерода.

Пример 3. Ферментативная активность незамороженного теста

3.1 Культивирование новых штаммов Saccharomyces cerevisiae

Полную петлю свежих дрожжей переносили из планшета с YPD-агаром в 250 мл-колбу Эрленмейера, содержащую 60 мл мелассы 12,5° Bx (по Бриксу), и инкубировали в шейкерном инкубаторе при 30°C с перемешиванием при 200 об/мин в течение 24 часов. Двадцать миллилитров полученной дрожжвой суспензии асептически переносили в 1-литровую колбу Эрленмейера, содержащую 105 мл мелассы 12,5° Bx, и инкубировали в тех же условиях в течение 48 часов с получением маточных дрожжей для основной ферментации в 5-литровом ферментере.

Затем культуральный раствор инокулировали в 7-литровый ферментер, содержащий 2,5 л среды с мелассой (см. Таблицу 4), и культивировали в условиях, описанных в Таблице 4, с получением маточных дрожжей для культивирования в 5-литровом ферментере.

Главную культуральную среду, представленную в Таблице 4, получали в объеме 5 литров в 7-литровом ферментере, и инокулировали в 7-литровый ферментер вместе с целым объемом посевной культуры, культивированной в 2,5 л среды с мелассой, а затем культивировали в следующих условиях.

Таблица 4: Условия ферментации

После завершения ферментации, дрожжевые клетки промывали стерильной водой и разделяли путем центрифугирования с последующим ресуспендированием в воде с получением кремообразных дрожжей (18-23% сухого вещества) или разделяли путем центрифугирования и фильтровали с получением спрессованных дрожжей с 28-35% сухого вещества.

Процедура ферментации, проиллюстрированная выше, описана, например, в руководстве по отбору дрожжевых штаммов под редакцией Chandra J. Panchal, 1990, page 140, которое вводится в настоящее описание посредством ссылки, или в US4232045, US3617306A, EP 0237427B2, полное описание которых также вводится в настоящее описание посредством ссылки.

3.2. Ферментативная активность незамороженного теста

3.2.1. Образцы теста двух типов получали для каждого образца дрожжей, состав которого приводится в Таблице 5, с использованием белой пшеничной муки типа 550 (полученной по стандартам, утвержденным в Германии, то есть, содержание золы 0,50-0,58%, степень экстракции ~72%, содержание глютена 9-11%).

Сразу после приготовления, образцы теста анализировали на ферментативную активность с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF (K. Müller-Auffermann et al, 2014. Brewing Science 67:72-80). Измерения проводили при 30°C в течение 60 минут. Эта система позволяет определить уровни продуцирования CO₂ в пекарских дрожжах по давлению и температуре, достаточных для получения нужного объема CO₂. Полученные результаты представлены в Таблице 6.

Таблица 5: Состав теста

Таблица 6: Ферментативная активность (мл CO₂) незамороженного (свежего) теста

3.2.2. Образцы теста двух типов получали для каждого образца дрожжей, состав которого приводится в Таблице 7, с использованием ярко-белой пшеничной муки, где содержание золы составляет ~0,4%, содержание белка составляет ~11%, а содержание сырого глютена составляет ~ 29%.

Сразу после приготовления, образцы теста анализировали на ферментативную активность с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF (K. Müller-Auffermann et al, 2014. Brewing Science 67:72-80). Измерения проводили при 30°C в течение 60 минут. Эта система позволяет определить уровни продуцирования CO₂ в пекарских дрожжах по давлению и температуре, достаточных для получения нужного объема CO₂. Полученные результаты представлены в Таблице 8.

Таблица 7: Состав теста

Таблица 8: Ферментативная активность (мл CO₂) незамороженного (свежего) теста

3.2.3. Образцы теста двух типов получали для каждого образца дрожжей, состав которого приводится в Таблице 9, с использованием ярко-белой пшеничной муки, где содержание белка составляет ~11%, а содержание сырого глютена составляет ~ 32%.

Сразу после приготовления, образцы теста анализировали на ферментативную активность с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF (K. Müller-Auffermann et al, 2014. Brewing Science 67:72-80). Измерения проводили при 28°C в течение 60 минут. Эта система позволяет определить уровни продуцирования CO₂ в пекарских дрожжах по давлению и температуре, достаточных для получения нужного объема CO₂. Полученные результаты представлены в Таблице 10.

Таблица 9: Состав теста

Таблица 10: Ферментативная активность (мл CO₂) незамороженного (свежего) теста

Эксперименты 3.2.1, 3.2.2 и 3.2.3 показали, что тестируемые новые штаммы обладают ферментативной активностью, по меньшей мере сравнимой с ферментативной активностью коммерчески доступных дрожжевых штаммов в свежем незамороженном тесте. В предпочтительных дрожжевых штаммах согласно изобретению, ферментативная активность теста с высоким содержанием сахара является исключительно высокой, то есть, уникальной для дрожжевых штаммов, применяемых для приготовления замороженного теста, а предпочтительно, отношение ферментативной активности теста с 11% сахара/ферментативной активности теста без сахара составляет 1,2, а предпочтительно, по меньшей мере 1,3, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 1,7 или по меньшей мере 1,9. Предпочтительно, чтобы снижение ферментативной активности теста с 16% сахара по сравнению с тестом без сахара составляло по меньшей мере менее, чем 30%, предпочтительно, менее, чем 25%, предпочтительно, менее, чем 20%, а более предпочтительно, 17% или менее. Было показано, что OL-01 обладает очень высокой ферментативной активностью в тесте с высоким содержанием сахара. Этот эксперимент показал, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению, а в частности, CC-05, могут преимущественно обладать высокой ферментативной активностью в тесте с низким и высоким содержанием сахара.

Пример 4. Ферментативная активность замороженного теста

4.1. Замороженное тесто без сахара

4.1.1. Дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступные дрожжевые продукты были использованы для приготовления теста без сахара, содержащего приблизительно 2% (по массе муки) соли, 4% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 53% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки. Полученное тесто разделяли на части по 50 г, формовали и замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет, а затем хранили в холодильнике при -20°C до 4 недель. Через один день и через 4 недели после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 90-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Эта система позволяет определить уровни продуцирования CO₂ в пекарских дрожжах по давлению и температуре, достаточных для получения нужного объема CO₂. Затем проводили измерения и оценивали общий объем газа после хранения образцов в течение 1 дня и 4 недель при -20°C. Для тестирования способности теста сохранять свои свойства при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, в параллельном эксперименте было проведено 10 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения, где тесто переносили на 30 минут в помещение при 25°C, а затем снова оставляли по меньшей мере на 2 часа при температуре -20°C и проводили один цикл замораживания/оттаивания. Полученные результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11: Сохранение ферментативной активности в течение 4 недель после замораживания, представленное как % от данных измерений на день 1

Этот эксперимент показал, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению могут преимущественно сохраняться при их длительном хранении в замороженном виде, необязательно при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, лучше, чем коммерчески доступные дрожжевые штаммы, например, эти новые штаммы сохраняют по меньшей мере 90%, предпочтительно, по меньшей мере 91%, предпочтительно, по меньшей мере 93% или по меньшей мере 97% ферментативной активности после их хранения в течение 4 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после их хранения в течение 1 дня при -20°C, и по меньшей мере 70%, по меньшей мере 73%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 84% после хранения в течение 4 недель при -20°C после проведения циклов замораживания/оттаивания по сравнению с с ферментативной активностью после 1-дневного хранения при -20°C.

4.1.2. Образцы теста без сахара (50 г), полученные как описано в Примере 4.1.1., хранили при -20°C до 12 недель. Образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 60-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем продуцированного газа после хранения образцов в течение 1 дня, 8 недель и 12 недель при -20°C. Полученные результаты представлены в таблице 12А.

В отдельном эксперименте, образцы теста без сахара (50 г) получали как описано в Примере 4.1.1. и хранили при -20°C до 24 недель. Образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 90-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Для тестирования способности теста сохранять свои свойства при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, в параллельном эксперименте было проведено 10 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения, где тесто переносили на 30 минут в помещение при 25°C, а затем снова оставляли по меньшей мере на два часа при -20°C и проводили один цикл замораживания/оттаивания. Полученные результаты представлены в таблице 12В.

Таблица 12А: Сохранение ферментативной активности в течение 8 и 12 недель после замораживания, представленное как % от данных измерений на день 1

Таблица 12B:Сохранение ферментативной активности в течение 4, 8 и 24 недель после замораживания, представленное как % от данных измерений на день 1

Этот эксперимент показал, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению могут преимущественно сохраняться при их длительном хранении в замороженном виде лучше, чем коммерчески доступные дрожжевые штаммы, например, эти новые штаммы сохраняют по меньшей мере 77%, по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 87% или по меньшей мере 90% ферментативной активности после их хранения в течение 8 и 12 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C. Альтернативно или дополнительно, дрожжевые штаммы согласно изобретению обладают ферментативной активностью по меньшей мере 60%, предпочтительно, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 72% после хранения в течение 24 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при температуре -20°C.

4.2. Замороженное тесто без сахара перед расстойкой

4.2.1. Дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста без сахара, содержащего приблизительно 1,5% (по массе муки) соли, 2% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ) и 62% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 50 г, формовали, подвергали расстойке в течение 1 часа в камере для расстойки при 30°C, а затем замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при температуре -20°C до 4 недель. Через один день, 2 недели и 4 недели после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 60-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем продуцируемого газа после хранения образцов в течение 1 дня, 2 недель и 4 недель при -20°C. Для тестирования способности теста сохранять свои свойства при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, в параллельном эксперименте было проведено 10 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения, где тесто переносили на 30 минут в помещение при 25°C, а затем снова оставляли по меньшей мере на 2 часа при -20°C и проводили один цикл замораживания/оттаивания. Полученные результаты представлены в таблице 13А.

Таблица 13А: Сохранение ферментативной активности в течение 2 и 4 недель после замораживания теста перед расстойкой, представленное как % от данных измерений на день 1 с использованием 2% дрожжей (30% твердых веществ)

В альтернативном варианте, дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста без сахара, содержащего приблизительно 1% рапсового масла (по массе муки), 2,5% (по массе муки) соли, 5% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 56% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 50 г, формовали, подвергали расстойке в течение 70 минут при 20°C, а затем замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при -20°C до 2 недель. Через один день и 2 недели после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 60-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем продуцируемого газа после хранения образцов 1 день и 4 недели и при -20°C. Полученные результаты представлены в таблице 13В.

Таблица 13В: Сохранение ферментативной активности в течение четырех недель после замораживания теста перед расстойкой, представленное как % от данных измерений на день 1 с использованием 5% дрожжей (30% твердых веществ)

4.2.2. Длительное хранение образцов теста перед расстойкой. Дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста без сахара, содержащего приблизительно 1% рапсового масла (по массе муки), 2,5% (по массе муки) соли, 5% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 56% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 80 г, формовали, подвергали расстойке в течение 70 минут при 20°C, а затем замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при -20°C до 20 недель. Через один день, 12 и 20 недель после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 90-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем продуцируемого газа после хранения образцов в течение 1 дня и 4 недель при -20°C. Результаты, полученные в этом эксперименте, систематизированы в таблице 14.

Таблица 14: Сохранение ферментативной активности в течение 12 и 20 недель после замораживания теста перед расстойкой, представленное как % от данных измерений на день 1 с использованием 5% дрожжей (30% твердых веществ)

Этот эксперимент показал, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению преимущественно лучше сохраняются при их длительном хранении перед расстойкой замороженного теста без сахара, необязательно, при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, по сравнению с коммерчески доступными дрожжевыми штаммами, например, эти новые штаммы сохраняют по меньшей мере 94%, предпочтительно, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% ферментативной активности после их хранения в течение 2 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C, и по меньшей мере 65%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75% ферментативной активности после хранения в течение 2 недель при -20°C с проведением циклов замораживания/оттаивания по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C. Кроме того, новые дрожжевые штаммы продемонстрировали преимущественно по меньшей мере 70%, предпочтительно, 80% или по меньшей мере 90% ферментативной активности после хранения замороженного теста без сахара перед расстойкой в течение 4 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C. Указанные штаммы также продемонстрировали преимущественно по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 80% ферментативной активности после хранения замороженного теста без сахара перед расстойкой в течение 12 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C, и по меньшей мере 55%, предпочтительно, 60% или по меньшей мере 65% ферментативной активности после хранения в течение 20 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C.

4.3. Замороженное тесто с 1% сахара перед расстойкой

Дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста с небольшим количеством сахара, содержащего приблизительно 1% (по массе муки) сахара, 2% (по массе муки) соли, 5% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 1% (по массе муки) рапсового масла, 56% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 70 г, формовали, подвергали расстойке в течение 40 минут при комнатной температуре, а затем помещали в холодильник при -20°C. Замороженные образцы теста перед расстойкой переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при -20°C до 8 недель. Через один день, 4 недели и 8 недель после приготовления, образцы теста оттаивали при 32°C в течение 30-35 минут при относительной влажности приблизительно 75% и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 90-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем газа после хранения образцов в течение 1 дня, 4 недель и 8 недель при -20°C. Для тестирования способности теста сохранять свои свойства при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, в параллельном эксперименте было проведено 10 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения, где тесто переносили на 30 минут в помещение при 25°C, а затем снова оставляли по меньшей мере на 2 часа при температуре -20°C и проводили один цикл замораживания/оттаивания. Полученные результаты представлены в таблице 15А.

Таблица 15А: Сохранение ферментативной активности в течение 1 дня, 4 недель и 8 недель после замораживания теста с 1% сахаром перед расстойкой с использованием 5% дрожжей (30% твердых веществ)

В альтернативном испытании, дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста с небольшим количеством сахара, содержащего приблизительно 1% (по массе муки) сахара, 2% (по массе муки) соли, 5% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 1% (по массе муки) масла, 56% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 70 г, формовали, подвергали расстойке в камере для расстойки в течение 10 минут при 35°C и 10 минут при комнатной температуре, а затем помещали в холодильник с продувкой. Замороженные образцы теста перед расстойкой переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при -20°C до 4 недель. Через один день и 4 недели после приготовления, образцы теста оттаивали при 32°C в течение 30-35 минут при относительной влажности приблизительно 75% и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 60-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем продуцируемого газа после хранения образцов в течение 1 дня и 4 недель при -20°C. Для тестирования способности теста сохранять свои свойства при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, в параллельном эксперименте было проведено 10 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения, где тесто переносили на 30 минут в помещение при 25°C, а затем оставляли по меньшей мере на 2 часа при -20°C и проводили один цикл замораживания/оттаивания. Полученные результаты представлены в таблице 15В.

Таблица 15В: Сохранение ферментативной активности в течение 1 дня и 4 недель после замораживания теста с 1% сахаром перед расстойкой с использованием 7% дрожжей (30% твердых веществ)

Этот эксперимент показал, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению при их длительном хранении в замороженном тесте с 1% сахаром перед расстойкой и необязательно при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, могут преимущественно сохраняться лучше, чем коммерчески доступные дрожжевые штаммы, например, эти новые штаммы сохраняют по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% ферментативной активности после их хранения в течение 4 недель при -20°C при проведении циклов замораживания/оттаивания по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C.

4.4. Замороженное тесто с 6% сахара перед расстойкой в виде небольших батонов

Дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста с большим количеством сахара, содержащего приблизительно 6% (по массе муки) сахара, 1,5% (по массе муки) соли, 3,5% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 5% (по массе муки) жира, 52% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 75 г, формовали, подвергали расстойке в камере для расстойки в течение 25 минут при 35°C и 25 минут при комнатной температуре, 20°C, а затем замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при -20°C до 8 недель. Через один день, 2 недели, 4 недели и 8 недель после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 90-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем газа в свежем тесте после хранения образцов в течение 1 дня, 2, 4 и 8 недель при -20°C. Полученные результаты представлены в таблице 16.

Таблица 16: Сохранение ферментативной активности в течение 2, 4 и 8 недель после замораживания теста с 6% сахаром перед расстойкой в виде небольших батонов

4.5. Замороженное тесто с 15% сахара

4.5.1. Дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, были использованы для приготовления теста с большим количеством сахара, содержащего приблизительно 15% (по массе муки) сахара, 1,5% (по массе муки) соли, 6% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 50% (по массе муки) воды, с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто разделяли на части по 50 г, формовали, и несколько образцов свежего теста тестировали на высвобождение CO₂, а другие образцы замораживали до -20°C в холодильнике с продувкой, переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при -20°C до 12 недель. Через один день, 2, 8 и 12 недель после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 60-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем газа в свежем тесте после хранения образцов в течение 1 дня, 2, 8 и 12 недель при -20°C. Для тестирования способности теста сохранять свои свойства при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, в параллельном эксперименте было проведено 10 циклов замораживания/оттаивания в течение первых 2 недель хранения, где тесто переносили на 30 минут в помещение при 25°C, а затем снова оставляли по меньшей мере на 2 часа при -20°C и проводили один цикл замораживания/оттаивания. Полученные результаты представлены в таблице 17А.

Таблица 17А: Сохранение ферментативной активности в течение 2, 8 и 12 недель после замораживания теста с 15% сахаром с использованием 6% дрожжей (30% твердых веществ)

4.5.2. В альтернативном испытании, дрожжевые культуры, полученные в Примере 3, и коммерчески доступный дрожжевой продукт были использованы для приготовления теста с большим количеством сахара, содержащего приблизительно 15% (по массе муки) сахара, 2,5% (по массе муки) соли, 7% (по массе муки) дрожжей (30% твердых веществ), 6% (по массе муки) яиц, 14% (по массе муки) жира, 25% (по массе муки) воды и 25% (по массе муки) молока с использованием ярко-белой пшеничной муки.

Полученное тесто помещали на 20 минут для хранения при комнатной температуре, разделяли на части по 50 г, формовали и инкубировали в холодильнике при -20°C в течение 2 часов, а затем переносили в полиэтиленовый пакет и хранили в холодильнике при температуре -20°C до 20 недель. Через один день и 2, 11 и 20 недель после приготовления, образцы теста оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и тестировали на высвобождение CO₂ в течение 90-минутного инкубирования при 37°C с использованием системы измерения уровня продуцирования газа ANKOM^RF. Затем проводили измерения и оценивали общий объем газа после хранения образцов в течение 1 дня, 2, 11 и 20 недель при -20°C. Полученные результаты представлены в таблице 17В.

Таблица 17В: Сохранение ферментативной активности в течение 2, 11 и 20 недель после замораживания теста с 15% сахаром с использованием 7% дрожжей (30% твердых веществ)

Этот эксперимент показал, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению могут преимущественно лучше сохраняться при их длительном хранении в замороженном тесте с высоким содержанием сахара (например, с 15% сахара), необязательно, при проведении множества циклов замораживания/оттаивания, по сравнению с коммерчески доступными дрожжевыми штаммами, например, эти новые штаммы сохраняют по меньшей мере 80%, предпочтительно, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% ферментативной активности после их хранения в течение 2 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C, и по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80% ферментативной активности после хранения в течение 2 недель при -20°C с проведением циклов замораживания/оттаивания по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C, и по меньшей мере 65%, предпочтительно, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 75% ферментативной активности после хранения в течение 8 недель при -20°C с проведением циклов замораживания/оттаивания по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C, или по меньшей мере 60%, предпочтительно, по меньшей мере 63% или по меньшей мере 65% ферментативной активности после хранения в течение 12 недель при -20°C с проведением циклов замораживания/оттаивания по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C. Кроме того, новые дрожжевые штаммы также продемонстрировали преимущественно по меньшей мере 68%, предпочтительно, 72%, предпочтительно, 78% или по меньшей мере 82% ферментативной активности после хранения замороженного теста с 15% сахаром в течение 11 недель при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C. Указанные штаммы также продемонстрировали предпочтительно, по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 63% ферментативной активности после хранения в течение 20 недель в замороженном тесте с 15% сахаром при -20°C по сравнению с ферментативной активностью после хранения в течение 1 дня при -20°C.

Пример 5. Оценка ферментативной активности

5.1. Дрожжевые культуры размножали в 5 мл YPD-субстрата в течение 15 часов в шейкерном инкубаторе при 30°C и 200 об/мин, собирали и суспендировали в свежей YPD-среде до концентрации OD₆₀₀₌5. 5 мл дрожжевых суспензий в 50-миллилитровой центрифужной пробирке (PP, Miniplast, Ein Shemer)замораживали при -18°C в течение 3 дней, оттаивали в течение 20 минут при комнатной температуре и тестировали на ферментативную активность в жидкой мучной суспензии (LFS). Образцы дрожжей два раза промывали дистиллированной водой путем центрифугирования при 4°C и при 1300g в течение 8 минут. Культуры суспендировали в 10 мл обедненной LFS (то есть, без сахара) (7,2 г воды, 0,23 г соли, 2,57 г ярко-белой пшеничной муки) и инкубировали в шейкерном инкубаторе при 37°C и при 100 об/мин. Образцы LFS оценивали (необязательно) каждые 30 минут, а конечный результат брали через 90 минут. Ферментативную активность дрожжей оценивали через 90 минут по шкале баллов 0-5 по следующим параметрам: оценку проводили по 4 параметрам: время (балл 1), пузырьки в водной фазе (балл 1), поры в мучном осадке (балл 1,5) и пена в верхней части водной фазы (балл 1,5).

Время: Дрожжевым штаммам, которые инициировали ферментацию после инкубирования в течение 30 минут, присваивали балл 1, дрожжевым штаммам, которые инициировали ферментацию через 60 минут, присваивали балл 0,5, а дрожжевым штаммам с замедленной инициацией через 90 минут не присваивали никакого балла. Инициацию ферментации визуально оценивали по мучному осадку и по наличию пор.

Пузырьки: Образцам, в жидкой фазе которых не наблюдалось пузырьков, не присваивали никакого балла; образцам с небольшим количеством пузырьков (то есть, где один пузырек высвобождался в жидкую фазу через каждые 5-10 секунд) присваивали балл 0,5, а образцам LFS с большим количеством пузырьков (то есть, где один пузырек высвобождался в жидкую фазу через каждые 2-5 секунд) присваивали балл 1.

Поры: Образцам LFS, не содержащим пор в твердой фазе, не присваивали никакого балла. Образцам LFS с небольшими порами (диаметром менее 1,5 мм) присваивали балл 0,5, а образцам LFS с крупными порами (диаметром 1,5-2,5 мм) присваивали балл 1. Образцам LFS с крупными соединенными порами (диаметром более 5 мм) присваивали балл 1,5.

Пена: Образцам LFS, не имеющим пены в верхней части жидкой фазы, не присваивали никакого балла. Образцам LFS с тонким слоем пены ниже 3 мм присваивали балл 0,5; образцам LFS с толстым слоем пены (3-5 мм) присваивали балл 1, а образцам LFS со слоем пены выше 5 мм присваивали балл 1,5.

Результаты представлены в Таблице 18.

Таблица 18: Оценка ферментативной активности новых дрожжей с улучшенными свойствами

5.2. В альтернативном варианте, дрожжевые клетки размножали в 50 мл YPD-субстрата в течение 18-24 часов в шейкерном инкубаторе при 30°C и 200 об/мин, собирали и два раза промывали холодной дистиллированной водой путем центрифугирования при 4°C и при 1300g в течение 8 минут. Плотность промытых культур измеряли, и часть клеток с плотностью приблизительно 32 OD₆₀₀ суспендировали в 10 мл LFS (как описано в 5.1). Для каждой дрожжевой культуры, один образец LFS тестировали сразу, а другой образец инкубировали при -20°C в течение 2-3 дней, оттаивали в течение 45 минут при комнатной температуре, встряхивали, и способность дрожжей к ферментации LFS тестировали для оценки ферментативной активности. Образцы LFS инкубировали в шейкерном инкубаторе при 37°C и при 100 об/мин в течение 1 часа. Ферментативную активность дрожжей оценивали по шкале баллов 0-9 по следующим четырем параметрам: пузырьки, высвобождаемые в водную фазу (балл 1,5), поры в мучном осадке и губчатый вид теста (балл 4), пена в верхней части водной фазы (балл 1,5) и разделение фаз (балл 2).

Пузырьки: Образцам, в жидкой фазе которых не наблюдалось пузырьков, не присваивали никакого балла; образцам с небольшим количеством пузырьков (то есть, если пузырьки не высвобождались в жидкую фазу, но небольшое количество пузырьков детектировалось в верхней части водной фазы) присваивали балл 0,5, образцам со средним количеством пузырьков (то есть, где один пузырек высвобождался через каждые 5 секунд) присваивали балл 1, а образцам LFS с большим количеством пузырьков (то есть, где по меньшей мере два пузырька высвобождались в жидкую фазу через каждые 5 секунд) присваивали балл 1,5.

Поры: Образцам LFS, не содержащим пор в твердой фазе, не присваивали никакого балла. Образцам LFS с небольшим числом небольших пор (диаметром менее 1,5 мм) присваивали балл 0,5, образцам с большим числом небольших пор присваивали балл 1, образцам LFS с небольшим числом крупных пор (диаметром 1,5-2,5 мм) присваивали балл 1,5, а образцам LFS с большим числом крупных пор присваивали балл 2. Образцам LFS с губчатым тестом (с соединенными порами, имеющими диаметр более 5 мм) с не более, чем 25% LFS присваивали балл 2,5. Образцам LFS с пористым тестом на ограниченной области присваивали балл 3. Образцам LFS со средней пористостью (где приблизительно половина среды имеет губчатый внешний вид) присваивали балл 3,5. Образцам LFS с полной губчатостью присваивали балл 4. Пена: Образцам LFS, не имеющим пены в верхней части жидкой фазы, не присваивали никакого балла. Образцам LFS с тонким слоем пены ~1 мм присваивали балл 0,5; образцам LFS со средним слоем пены (1-3 мм) присваивали балл 1, а образцам LFS с толстым слоем пены толще 3 мм присваивали балл 1,5.

Разделение фаз: Разделение фаз представляет собой ситуацию, при которой пузырьки и кусочки жидкого теста, помимо твердой и жидкой фазы, образуют третий слой. Образцам, в которых наблюдается разделение фаз с третьим слоем толщиной менее, чем 0,5 см, присваивали балл 1, образцам, в которых наблюдается разделение фаз с третьим слоем толщиной от 0,5 до 1 см, присваивали балл 1,5, а образцам, в которых наблюдается разделение фаз с третьим слоем толщиной более 1 см, присваивали балл 2.

Результаты представлены в Таблице 19.

Таблица 19: Оценка ферментативной активности новых дрожжей с улучшенными свойствами

Пример 6. Тест на выживаемость дрожжей

Штаммы Saccharomyces cerevisiae OL-01, S3-02, FL-03, IS-310, CC-05, KF-06, коммерчески доступный штамм пекарских дрожжей, используемые для приготовления замороженного теста, и морозостойкий штамм FTY-3 (FERM BP 2363 (US 5352606 B1)) культивировали в среде YPD, собирали и ресуспендировали в свежей среде YPD до концентрации OD₆₀₀=5. Образец брали из каждой дрожжевой суспенции и сразу высевали на планшеты с YPD-агаром для определения исходного числа колоний. 5 мл дрожжевых суспензий в 50-миллилитровой пробирке (PP, например, от Miniplast, Ein Shemer) инкубировали при -20°C в течение 48-72 часов, а затем подвергали четырем циклам замораживания/оттаивания (1,5 часа при 30°C/по меньшей мере 1 час при -20°C). Число жизнеспособных дрожжей определяли путем посева дрожжевых суспензий в десятичном разведении на планшеты с YPD-агаром и инкубирования при 30°C в течение 48 часов.

Выживаемость определяли по следующей формуле:

Выживаемость=конечное число дрожжевых колоний/начальное число дрожжевых колоний × 100%.

Результаты представлены на фиг. 1A и B.

Пример 7. Тест на хлебопекарные свойства замороженного теста

7.1. Объем теста в виде небольшого батона

Образцы теста без сахара (50 г), полученные в Примере 4.1.1 после их хранения в течение 1 дня при -20°C и 4 недель при -20°C с циклами замораживания и оттаивания (как описано в Примере 4.1), оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и подвергали расстойке в камере для расстойки при относительной влажности выше 85% при 35°C в течение 70 минут, а затем выпекали в формах для выпечки небольших батонов при 195°C в течение 7-8 минут. Кажущийся объем небольших батонов измеряли после охлаждения до комнатной температуры методом вытеснения твердых веществ, применяемым для измерения объема нежелательных твердых веществ (Physical Properties of Foods, Serpil Sahin‏, Servet Gülüm Sumnu‏, page 20) с использованием семян мака. Результаты представлены на фиг. 2.

7.2. Объем небольших батонов перед расстойкой

Образцы теста без сахара (50-80 г), полученные в Примере 4.2 после их хранения в течение 1 дня при -20°C и 4 недель при температуре -20°C в виде замороженных небольших батонов перед расстойкой, выпекали непосредственно без проведения стадии оттаивания по следующей программе выпекания:

Кажущийся объем небольших батонов измеряли после охлаждения до комнатной температуры методом вытеснения твердых веществ, применяемым для измерения объема нежелательных твердых веществ (Physical Properties of Foods, Serpil Sahin‏, Servet Gülüm Sumnu‏, page 20) с использованием семян мака. Результаты представлены на фиг. 3.

7.3. Время расстойки небольших батонов

Образцы теста без сахара (50 г), полученные в Примере 4.1. после их хранения в течение 4 недель при -20°C необязательно с циклами замораживания и оттаивания (как описано в Примере 4.1), оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и подвергали расстойке в камере для расстойки при 35°C до тех пор, пока они не достигали предварительно определенной высоты 3,5 см в прозрачных пластиковых коробках размером максимум 5,8×8,6×4,5W×L×H [см³], в течение 120 минут. Результаты представлены в Таблице 20.

Таблица 20A: Время расстойки после замораживания в течение 4 недель и после замораживания в течение 4 недель с циклами замораживания и оттаивания

В альтернативном варианте, образцы теста без сахара (50 г), полученные в Примере 4.1, после их хранения в течение 24 недель при -20°C, оттаивали при 25°C в течение 20-30 минут и подвергали расстойке в камере для расстойки при 35°C до тех пор, пока они не достигали предварительно определенной высоты 3,5 см в прозрачных пластиковых коробках размером максимум 5,8×8,6×4,5W×L×H [см³], в течение 120 минут. Результаты представлены в Таблице 20В.

Таблица 20B: Время расстойки после замораживания в течение 24 недель

Описанные выше хлебопекарные свойства лишь подтвердили данные, полученные в предыдущих примерах и указывающие на то, что новые дрожжевые штаммы согласно изобретению могут лучше сохраняться в течение длительного периода хранения в замороженном виде, необязательно, с проведением множества циклов замораживания/оттаивания, чем коммерчески доступные дрожжевые штаммы, например, эти новые штаммы обнаруживают наименьшее снижение объема в тесте в виде небольших батонов после хранения в течение 4 недель при -20°C с циклами замораживания/оттаивания и наименьшее время расстойки после хранения в течение 4 недель при -20°C и 4 недель при -20°C с циклами замораживания/оттаивания по сравнению с коммерчески доступными дрожжевыми штаммами, представленными выше.

Пример 8

Были проанализированы геномные маркеры полученных дрожжевых штаммов. Геномную ДНК получали для секвенирования с использованием набора Nextera XT (Illumina, San Diego, CA) в соответствии с инструкциями производителей. После процессинга оценивали размер библиотек с использованием автоматического устройства для электрофореза Agilent TapeStation 2000 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) и концентрацию с использованием флуориметра Qubit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Библиотеки ДНК объединяли в эквимолярных отношениях и секвенировали на секвенаторе Illumina NextSeq500 путем считывания оснований со спаренными концами 2×150. Неочищенные риды, происходящие от новых геномов, картировали по эталонному дрожжевому геному S288C (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/15?genome_assembly_id=22535). Был проведен биоинформационный анализ контигов длиной по меньшей мере 1000 п.о. с охватом по меньшей мере 250×. Изменение числа копий оценивали отдельно для каждого генома исходя из их охвата, а затем оценивали крупномасштабные флуктуации по медиане по всей ширине генома. Затем оценивали делетированные области генома новых штаммов.

Было обнаружено, что новые штаммы CC-05, KF-06 и OL-01 характеризуются наличием мутаций, а в большинстве случаев, делеций фрагментов геномных ДНК в одних и тех же генах во всех аллелях, как описано ниже, и/или инактивацией одних и тех же генов во всех аллелях. В противоположность этому, в дрожжевом штамме S288C, используемом для системного секвенирования в базе данных геномов Saccharomyces, в указанных генах отсутствуют делеции или инактивирующие мутации. Все мутации или модификации приводятся здесь по отношению к S288C.

- Ген YDL248W, обозначенный COS7 и локализованный в хромосоме IV, является частично делетированным в положении ниже положения 2232 (делеция имеет длину по меньшей мере 150 п.о.);

- Ген YJR155W, обозначенный AAD10 и локализованный в хромосоме X, является частично делетированным в положении ниже положения 727404 (делеция имеет общую длину по меньшей мере 360 п.о.);

- Ген YDL245C, обозначенный HXT15 и локализованный в хромосоме IV, является частично делетированным в положении ниже положения 11657 во всех аллелях (общая длина делеции составляет по меньшей мере 400 п.о.);

- Ген YJR151C, обозначенный DAN4 и локализованный в хромосоме X, содержит мутации, приводящие к замене двух стоп-кодонов в положении аминокислоты 342 (замена серина на стоп-кодон) и в положении аминокислоты 53 (замена тирозина на стоп-кодон), и по меньшей мере одну неполную делецию и/или геномную реаранжировку, например, между координатами хромосомы X:714902-715267 (указаны координаты для эталонного штамма S288C);

- Ген YDR420W, локализованный в хромосоме IV, содержит ряд отдельных мутаций, приводящих к аминокислотным заменам, таких как мутации в положении 1308583 и в положении 1308589, которые приводят к замене серина на пролин, и мутации в положении 1308951 и в положении 1309390, которые приводят к замене фенилаланина на лейцин.

Пример 9

Предпочтительные дрожжевые штаммы согласно изобретению, например, штаммы CC-05 и KF-06, могут быть охарактеризованы как штаммы, содержащие все из нижеследующих трех сегментов ДНК, подробно описанных в Таблице 21, с необязательными модификациями между аллелями максимум в трех, а предпочтительно, максимум в одной паре оснований. Последовательности получали с помощью полимерназной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием по Сэнгеру. Секвенирование по Сэнгеру осуществляли с использованием секвенирующего терминатора Big-Dye на устройстве для капиллярного электрофореза 3730×1 (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific). ПЦР осуществляли на основе амплификации специфических праймеров, сконструированных в целях амплификации указанных фрагментов геномной ДНК, описанных ниже. В таблице 21 представлены хромосома и положение, уникальные серии используемых праймеров и три амплифицированных фрагмента геномной ДНК, присутствующих в CC-05 и KF-06. Все аллели указанных штаммов содержат последовательности, представленные в Таблице 21, с необязательными модификациями в одной паре оснований, где такая модификация, предпочтительно, присутствует в одном аллеле одного из генов.

Таблица 21: Результаты ПЦР-анализа ПЦР-ампликонов для геномов штаммов CC-05 и KF-06

ПЦР осуществляли после получения ДНК из дрожжей в соответствии со стандартными протоколами (DreamTaq Green PCR Master Mix (2X), ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), с использованием 1,4 нг ДНК в следующих условиях: начальная денатурация при 95°C в течение 5 минут, затем 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C или 60°C в течение 45 секунд, и удлинение при 72°C в течение 1 минуты.

Реферат

Группа изобретений относится к морозостойким штаммам пекарских дрожжей и к их применению. Предложены штамм пекарских дрожжей OL-01, депонированный как NCYC 4095, штамм пекарских дрожжей S3-02, депонированный как NCYC 4094, штамм пекарских дрожжей FL-03, депонированный как NCYC 4105, штамм пекарских дрожжей IS-310, депонированный как NCYC 4106, штамм пекарских дрожжей CC-05, депонированный как NCYC 4128, штамм пекарских дрожжей KF-06, депонированный как NCYC-4129. Указанные штаммы могут быть использованы для приготовления продукта из теста, а также для получения дрожжевого продукта. Предложены также способ приготовления продуктов из теста, способ получения дрожжевого продукта, а также применение любого из указанных штаммов пекарских дрожжей или дрожжевого продукта, содержащего любой из указанных штаммов, для приготовления продукта из теста. Предложенные морозостойкие штаммы дрожжей имеют большую продолжительность жизни и/или обладают повышенной ферментативной активностью после замораживания. 11 н. и 5 з.п ф-лы, 3 ил., 21 табл., 9 пр.

Формула